KR102065053B1 - 장출혈성 대장균의 검출 및 식별 방법 - Google Patents

장출혈성 대장균의 검출 및 식별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 유전자 마커 Z1151 , Z1153 , Z1154 , Z1155 , Z1156 , Z6065, Z2098 , ureD 또는 espV와의 연관으로 유전자 espK의 검출 및/또는 혈청형-특이적인 CRISPR 서열의 검출을 통하여 샘플이 적어도 하나의 O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] 또는 O104:[H4] 혈청형의 장출혈성 대장균 (EHEC)을 함유하는지 여부를 예측하는 방법, 및 상기 혈청형을 식별하는 방법에 관한 것이다.

Description

장출혈성 대장균의 검출 및 식별 방법 {METHOD FOR DETECTING AND IDENTIFYING ENTEROHEMORRHAGIC ESCHERICHIA COLI}
본 발명은 인류 건강에 심각한 위험으로 여겨지는 시가 독소를 생산하는 대장균 (Shiga toxin producing E. coli, STEC)에 관한 것이다.
시가 독소를 생산하는 대장균 (Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)은 400가지 이상의 대장균 O:H 혈청형 (serotypes)에 속하는 대장균의 다양한 그룹이며, 이들 중 몇몇은 설사에서부터 출혈성 대장염 (hemorrhagic colitis, HC)에 이르는 식중독 (foodborne illness)의 발발 및 산발적 질환과 출혈성 요독증 (haemolytic uremic syndrome, HUS)을 야기한다. 그들의 인간 병원성에 따라, 후자의 균주는 또한 장출혈성 대장균 (EHEC)으로 지정되었다 (Levine 1987, Nataro 및 Kaper 1998). HC 및 HUS의 많은 경우가 EHEC 혈청형 O157:H7 균주 때문인 것으로 여겨져 왔으나, 이제는 STEC의 다른 혈청형이 EHEC 그룹에 속하는 것으로 인식되었다.
따라서, 수많은 나라에서 축적된 증거는 인간 STEC 감염의 최대 30-60%가 비-O157 STEC에 의해 야기되며 다섯 내지 일곱 종류의 적은 수의 STEC의 "우선 (priority)" 혈청형이 HC 및 HUS의 발발 및 산발적 질환에 연루되어 있다는 것을 나타내고 있다. 이들은 혈청형 O26:[H11], O45:[H2], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O145:[H28], O157:[H7] 및 그들의 비-운동성 (non-motile) 유도체를 포함한다. 또한, O104:[H4]의 이례적인 균주가 2011년에 세계적으로 HC 및 HUS의 가장 큰 발발과 관련되었다 (Scheutz et al., 2011; Frank et al., 2011; Struelens et al., 2011; Gault et al., 2011).
결과적으로, 많은 사법기관들은 식품 검사 프로그램의 시행이 인간에게 높은 독성을 갖는 이러한 STEC 균주로부터 대중을 보호하는 것으로 여기고 있다. 위험-기반 식품 검사 프로그램의 일부로서, 이러한 장출혈성 대장균 (EHEC) 균주의 검출을 위한 합리적인 접근은 우선 (priority) STEC의 뚜렷한 (hallmark) 특징 (예를 들어, 혈청군 (serogroup), 혈청형, 독성 및 기타 마커들)의 명확한 정의 및 식품 내의 이러한 병원성 (pathogenic) STEC를 검출 (detect)하기 위한 효율적인 접근을 필요로 한다. 비-O157 EHEC의 검출은 그들이 동일한 생태적 적소 (niches)를 공유하는 무해한 다수의 공생 (commensal) 대장균과 그들을 구별시키는 구체적인 특징을 지니지 않으므로 특히 어렵다. 질병의 심각성, 질병 발발의 빈도 및 관련성에 기초하여 식품 유래 질병의 발발과 연관된 가장 중요한 O-혈청군을 식별하기 위한 기틀로서 혈청병원형 (seropathotype) 분류가 카말리 (Karmali) 등 (2003)에 의해 제안되었으나, 다양한 STEC 균주들 간의 독성 차이의 원인은 여전히 불명확한 것으로 남아있다. 이러한 차이는 STEC 균주가 갖는 독성 유전자의 유형 차이에 기인하는 것일 가능성이 있으며, 이를 입증하고 적절한 분자적 마커를 식별하는 연구가 요구된다.
예를 들어 장병원성 대장균 (enteropathogenic E. coli, EPEC)에서 최초로 식별된 위치 (locus)인 LEE (장세포 소실 위치 (locus of enterocyte effacement))에 위치하는 stx1/stx2 유전자 및 eae 유전자의 존재를 검출함으로써 샘플 내의 STEC 오염의 존재를 결정할 수 있는 기법이 존재한다. 그러나 STEC 병원성의 유전적 기초는 이들 유전자의 하나 또는 둘 모두의 존재 또는 부존재보다 매우 더 복잡하다. 균주의 혼합물 (예를 들어, STEC 및 EPEC 균주의 혼합)을 포함할 수 있는 복합 샘플 (예를 들어, 식품, 배설물, 환경적 샘플) 내에서, 상기 stx1 /2 및 eae 유전자의 존재는 이러한 샘플 내의 EHEC의 존재를 나타내는 것이 아니다.
그러나, 몇몇 STEC 균주가 인간에게 매우 심각한 건강 문제를 야기할 수 있다는 점을 고려하면, 이러한 STEC이 인간 건강에 위해를 가하지 않을지라도, 식료품 내에 존재하는 STEC 균주의 검출에 따라 상기 식료품을 폐기하게 된다. 비-병원성 STEC 균주와 EHEC 균주를 구별하지 못함에 따라 이는 많은 낭비를 초래하게 된다.
상기 stx1 / stx2 및 eae 마커와 더불어, EHEC 균주를 선택적으로 검출하고 이들을 비-병원성 STEC 균주와 구별하기 위하여 다른 유전자 마커를 사용할 것이 제안되어 왔다. 예를 들어, PCT WO　2011/018762는 샘플 내의 EHEC의 존재를 예측하기 위하여 유전자 stx1, stx2, eae, nleB 및 espK의 결합된 검출을 수반하는 방법이 기술되어 있다.
그러나, 비-O157 EHEC를 포함하는 EHEC의 존재에 대하여 구별적인 스크리닝 및 특히 "상위 일곱 개의" 혈청형 O26:[H11], O45:[H2], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O145:[H28], O157:[H7]의 경우에 관련된 EHEC 혈청형의 특이적인 검출을 허용하는 신뢰할만한 테스트가 여전히 요구된다.
본 발명자들은 드디어 인류 건강에 심각한 위험으로 여겨지는 몇몇 STEC 균주와 연관된 구별적인 유전자 마커 (discriminative genetic markers)를 식별 (identified)하였다. 특히, 본 발명자들은 인간에게 높은 독성을 갖는 EHEC 균주의 CRISPRs (규칙적으로 간격을 둔 다발성 단편 회문 반복 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)) 서열 내에 위치하는 유전자 마커를 식별하였다.
CRISPRs는 대장균을 포함하는 많은 세균 종들의 게놈 내에 존재한다. 그들은 21 내지 47bp 길이의 정방향 반복 (direct repeats)을 함유하고 비슷한 크기의 스페이서 (spacers)에 의해 분리된 탠덤 서열 (tandem sequences)로 이루어진다. 스페이서는 파아지 (phages) 또는 플라스미드 (plasmids)와 같은 핵산으로부터 유래되며, 그들은 상동성 (homologous) 파아지 및 플라스미드에 의한 계속적인 감염으로부터 세균을 보호할 수 있다고 가정되어 왔다.
본 발명자들은 세상에서 가장 빈번한 임상 예와 관련된 다양한 EHEC 균주의 CRISPR 위치를 서열 분석하였으며, 인간의 대다수의 EHEC 감염의 원인인 EHEC 혈청형 O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O45:[H2], O26:[H11], O104:[H4] 및 그들의 비운동성 유도체의 특이적 식별에 사용될 수 있는 서로 다른 스페이서를 식별했다.
본 발명의 하나의 목적은 샘플 내에 존재하는 것으로 의심되는 장출혈성 대장균 (enterohemorrhagic Escherichia coli , EHEC)의 혈청형(들)을 식별 (identifying)하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 샘플이 EHEC O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] 및 O104:[H4] 혈청형 중 적어도 하나의 EHEC를 함유하는지 여부를 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 샘플 내에 존재하는 것으로 의심되는 장출혈성 대장균 (enterohemorrhagic Escherichia coli , EHEC)의 혈청형(들)을 식별 (identifying)하는 방법은 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 (isolated) DNA 내의 하기 대장균 CRISPR 서열:
a) EHEC O157:[H7]을 식별하기 위한 것으로서,
- 하나 이상의 서열의 존재가 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3의 CRISPR 서열; 및/또는
- 서열의 존재가 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 4의 CRISPR 서열; 중에서 선택되는 CRISPR 서열;
b) EHEC O145:[H28]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O145:[H28]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 5의 CRISPR 서열;
c) EHEC O111:[H8]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O111:[H8]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 6의 CRISPR 서열;
d) EHEC O121:[H19]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O121:[H19]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 7의 CRISPR 서열;
e) EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 8의 CRISPR 서열;
f) EHEC O104:[H4]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O104:[H4]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 9의 CRISPR 서열; 및
g) EHEC O26:[H11]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O26:[H11]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 10의 CRISPR 서열;의 존재 또는 부존재를 검출 (detecting)하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따른 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법은 상기 CRISPR 서열을 표적으로 하는 프라이머의 조합을 이용하여 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 DNA의 PCR 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법에 있어서, 상기 프라이머의 조합은
a) EHEC O157:[H7]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 CRISPR 서열 모두를 표적으로 하며, 하기 서열:
GGGAACACAAACCGAAACACA (서열번호 11)
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC (서열번호 12)에 의하여 정의되는 프라이머 세트;
- 서열번호 3의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT (서열번호 13);
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC (서열번호 14)에 의하여 정의되고, 여기에서 적어도 하나의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 프라이머 세트; 및/또는
- 서열번호 4의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GAACACAAACCGAAACACACG (서열번호 15)
ATAAACCGTCACCAAAACAGTG (서열번호 16)에 의하여 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;
b) EHEC O145:[H28]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 5의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GAACTTGAGCCCTGCCAGAA (서열번호 17)
ACCGCGATCTTTTCCTACCTG (서열번호 18)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O145:[H28]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;
c) EHEC O111:[H8]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 6의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GTGACCGCCTGTACACGC (서열번호 19)
CGGATATTTGGGCGTAATACC (서열번호 20)
CTGCCGCGAGTGGTTTCAC (서열번호 21)에 의해 정의되고, 여기에서 적어도 하나의 서열번호 19 및 서열번호 20 또는 서열번호 19 및 서열번호 21의 프라이머 쌍에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O111:[H8]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;
d) EHEC O121:[H19]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 7의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
CGGGGAACACTACAGGAAAGAA (서열번호 22)
GGCGGAATACAGGACGGGTGG (서열번호 23)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O121:[H19]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;
e) EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 8의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GAGTCTATCAGCGACACTACC (서열번호 24)
AACCGCAGCTCGCAGCGC (서열번호 25)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;
f) EHEC O104:[H4]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 9의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GGAACTCACCGAGCGCCG (서열번호 26);
GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC (서열번호 27)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O104:[H4]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머; 및
g) EHEC O26:[H11]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 10의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 제1 프라이머 세트는 하기 서열:
ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG (서열번호 28)
GATAAACCGTGGTACGGAACA (서열번호 29)에 의해 정의되고, 제2 프라이머 세트는 하기 서열:
TGAAACCACTCGCGGCAGAT (서열번호 30);
ATAAACCGATCTCCTCATCCTC (서열번호 31)에 의해 정의되며, 여기에서 적어도 하나의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O26:[H11]의 존재를 나타내는 것인 두 개의 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 샘플이 EHEC O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] 및 O104:[H4] 혈청형 중 적어도 하나의 EHEC를 함유하는지 여부를 예측하는 방법은 espK 유전자 및 하기:espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, 및 Z6065 중 어느 하나 이상의 표적 유전자를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따른 샘플이 적어도 하나의 EHEC를 함유하는지 여부를 예측하는 방법은 espK 유전자, espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 중에서 선택된 적어도 하나의 유전자, 및 Z6065 유전자를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 샘플이 적어도 하나의 EHEC를 함유하는지 여부를 예측하는 방법은 espK로부터 유래된 프라이머 세트 및 espV , ureD , Z2098 , Z1151, Z1153 , Z1154 , Z1155 , Z1156 및 Z6065 중 적어도 하나로부터 유래된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머의 조합을 이용하여 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 DNA의 PCR 분석을 수행하는 단계 및 상기 조합의 각각의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 샘플이 적어도 하나의 EHEC를 함유하는지 여부를 예측하는 방법은 stx1로부터 유래된 프라이머 세트 및 stx2로부터 유래된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머의 조합을 이용하여 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 DNA의 PCR 분석을 수행하는 단계 및 상기 조합의 각각의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법은 상기 샘플이 EHEC O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] 및 O104:[H4] 혈청형 중 적어도 하나의 장출혈성 대장균 (EHEC)을 함유하는지 여부를 예측하기 위한 전단계를 포함하며, 상기 전단계는 상기 다양한 구현 예에 따른 샘플이 적어도 하나의 EHEC를 함유하는지 여부를 예측하는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트는 상기 정의된 프라이머 세트, 및 선택적으로 상기 각각의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브 (probes)를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따른 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트는 espK로부터 유래된 프라이머 세트, 및 Z2098로부터 유래된 프라이머 세트, Z1151로부터 유래된 프라이머 세트, Z1153으로부터 유래된 프라이머 세트, Z1154로부터 유래된 프라이머 세트, Z1155로부터 유래된 프라이머 세트, Z1156으로부터 유래된 프라이머 세트, Z6065로부터 유래된 프라이머 세트: 중에서 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트와 선택적으로 상기 각각의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따른 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트는 stx1 및 stx2를 표적으로 하는 프라이머 세트와 선택적으로 stx1의 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브 및 stx2의 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법 및 샘플이 EHEC O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] 및 O104:[H4] 혈청형 중 적어도 하나의 EHEC를 함유하는지 여부를 예측하는 방법과 본 발명에 따른 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트는 신속하고 간편하며, 민감도 및 특이성이 매우 높은 장점을 갖는다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 샘플 내에 존재하는 것으로 의심되는 장출혈성 대장균 (enterohemorrhagic Escherichia coli , EHEC)의 혈청형(들)을 식별 (identifying)하는 방법을 제공하는 것이며,
상기 방법은 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 (isolated) DNA 내의 하기 대장균 CRISPR 서열:
a) EHEC O157:[H7]을 식별하기 위한 것으로서,
- 하나 이상의 서열의 존재가 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3의 CRISPR 서열; 및/또는
- 서열의 존재가 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 4의 CRISPR 서열; 중에서 선택되는 CRISPR 서열;
b) EHEC O145:[H28]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O145:[H28]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 5의 CRISPR 서열;
c) EHEC O111:[H8]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O111:[H8]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 6의 CRISPR 서열;
d) EHEC O121:[H19]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O121:[H19]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 7의 CRISPR 서열;
e) EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 8의 CRISPR 서열;
f) EHEC O104:[H4]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O104:[H4]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 9의 CRISPR 서열; 및
g) EHEC O26:[H11]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O26:[H11]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 10의 CRISPR 서열;의 존재 또는 부존재를 검출 (detecting)하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 방법은 상기 CRISPR 서열을 증폭시키기 위하여 설계된 프라이머를 이용하여 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 DNA의 PCR 분석을 수행하는 단계, 및 상응하는 증폭 산물의 존재를 확인하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 PCR 분석은
a) EHEC O157:[H7]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 CRISPR 서열 모두를 표적으로 하며, 하기 서열:
GGGAACACAAACCGAAACACA (서열번호 11)
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC (서열번호 12)에 의하여 정의되는 프라이머 세트;
- 서열번호 3의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT (서열번호 13);
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC (서열번호 14)에 의하여 정의되고, 여기에서 적어도 하나의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 프라이머 세트; 및/또는
- 서열번호 4의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GAACACAAACCGAAACACACG (서열번호 15)
ATAAACCGTCACCAAAACAGTG (서열번호 16)에 의하여 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;
b) EHEC O145:[H28]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 5의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GAACTTGAGCCCTGCCAGAA (서열번호 17)
ACCGCGATCTTTTCCTACCTG (서열번호 18)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O145:[H28]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;
c) EHEC O111:[H8]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 6의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GTGACCGCCTGTACACGC (서열번호 19)
CGGATATTTGGGCGTAATACC (서열번호 20)
CTGCCGCGAGTGGTTTCAC (서열번호 21)에 의해 정의되고, 여기에서 적어도 하나의 서열번호 19 및 서열번호 20 또는 서열번호 19 및 서열번호 21의 프라이머 쌍에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O111:[H8]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;
d) EHEC O121:[H19]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 7의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
CGGGGAACACTACAGGAAAGAA (서열번호 22)
GGCGGAATACAGGACGGGTGG (서열번호 23)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O121:[H19]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;
e) EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 8의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GAGTCTATCAGCGACACTACC (서열번호 24)
AACCGCAGCTCGCAGCGC (서열번호 25)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;
f) EHEC O104:[H4]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 9의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
GGAACTCACCGAGCGCCG (서열번호 26);
GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC (서열번호 27)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O104:[H4]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머; 및
g) EHEC O26:[H11]를 검출하기 위한 것으로서,
- 서열번호 10의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 제1 프라이머 세트는 하기 서열:
ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG (서열번호 28)
GATAAACCGTGGTACGGAACA (서열번호 29)에 의해 정의되고, 제2 프라이머 세트는 하기 서열:
TGAAACCACTCGCGGCAGAT (서열번호 30);
ATAAACCGATCTCCTCATCCTC (서열번호 31)에 의해 정의되며, 여기에서 적어도 하나의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O26:[H11]의 존재를 나타내는 것인 두 개의 프라이머 세트;로 구성되는 프라이머;를 포함하는 프라이머의 조합을 이용하여 수행된다.
상기 증폭 산물은 PCR 산물의 검출을 위한 모든 적절한 방법에 의하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 그들은 각자의 표적 유전자로부터 유래된 프로브 (probes)를 이용하여 검출될 수 있다.
바람직한 프로브의 예로는 하기:
- 서열번호 1 및 서열번호 2로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하며, 하기 서열: CGATCAATCCGAATATGAGCGGT (서열번호 32)에 의해 정의되는 프로브, 및 서열번호 3으로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하며, 하기 서열: CACTGTTTTGGTGACGGTTTATCC (서열번호 33)에 의해 정의되는 프로브, 및/또는 서열번호 4로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하며, 하기 서열: ACAAAAACTGTCACCAAAGTGTTC (서열번호 34)에 의해 정의되는 프로브;
- 서열번호 5로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하며, 하기 서열:
TGGGGCCTCTTTTGTACCCGG (서열번호 35)에 의해 정의되는 프로브;
- 서열번호 6으로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하며, 하기 서열:
TGTAATGGCTCACCGGTTTATCCCC (서열번호 36)에 의해 정의되는 프로브;
- 서열번호 7로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하며, 하기 서열:
TCCGCCAACGGCGACAGGGG (서열번호 37)에 의해 정의되는 프로브;
- 서열번호 8로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하며, 하기 서열:
TCGGAACGTGGCGCTATAGGTG (서열번호 38)에 의해 정의되는 프로브;
- 서열번호 9로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하며, 하기 서열:
CTGGGAGGCGTATCTCACGTTCGGT (서열번호 39)에 의해 정의되는 프로브;
- 서열번호 10으로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하며, 하기 서열:
TGCTGTCTATATTTCGACCAGTGTTCC (서열번호 40)에 의해 정의되는 프로브;
- 서열번호 10으로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하며, 하기 서열:
CCAGCTACCGACAGTAGTGTGTTCC (서열번호 41)에 의해 정의되는 프로브;를 들 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명은 샘플이 (본 명세서에서 stx 및 eae에 모두 양성인 대장균 균주로 정의되는) 전형적인 장출혈성 대장균 (EHEC), 및/또는 stx에는 양성이고 eae에는 음성으로 테스트된 비전형적인 EHEC O104:H4를 함유하는지 여부를 예측하는 방법을 제공한다. 전형적인 EHEC 균주는 특히 EHEC O157:H7, O145:H28, O103:H2, O111:H8, O121:H19, O26:H11 및 O45:H2 혈청형과 그들의 비-운동성 유도체를 포함한다.
상기 방법은 espK 유전자 및 하나 이상의 하기 표적 유전자: espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, 및 Z6065를 검출하는 단계를 포함한다.
이러한 대장균 유전자 표적은 다양한 게놈 O-아일랜드 (O-islands): OI-43, OI-44, OI-50, OI-57 및 OI-71로부터 유래된 비 LEE-인코딩 타입 Ⅲ 이펙터 (non LEE-encoded type Ⅲ effectors)에 대응된다.
본 발명자들에 의하여 추정되는 독성 마커의 몇몇 조합 중에서 espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, 및 Z1156, 중 하나 이상과 espK의 조합이 전형적인 EHEC (stx 및 eae 양성 대장균 균주), 특히 혈청형 EHEC O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11] 또는 O45:[H2]의 EHEC 균주의 존재를 더욱 예측 가능하게 하는 것으로 식별되었다. Z6065와 sespK의 조합은 비전형적인 EHEC O104:H4의 존재를 예측가능하게 한다.
특히 바람직한 조합은 하기:
- espV, ureD, Z2098 중 하나 이상과 espK;
- Z6065와 espK;
- espV, ureD, Z2098 중 하나 이상 또는 Z6065과 espK;를 들 수 있다.
본 발명의 특정 구현 예에 따라, 상기 방법은 espK로부터 유래된 프라이머 세트와 espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, 및 Z6065 중 적어도 하나로부터 유래된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조합을 이용하여 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 DNA의 PCR분석을 수행하는 단계; 및
상기 조합의 각각의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 바람직한 구현 예에 따라, 프라이머의 조합은 stx1로부터 유래된 프라이머 세트 및 stx2로부터 유래된 프라이머 세트를 더욱 포함한다. 이는 HC 및 HUS의 발발 및 산발적 발병과 연관된 우선 (priority) STEC 혈청형과 관련하여, 상기 둘 모두의 stx 유전자에 대하여 STEC의 마커로서 그리고 상기 열거된 추가적인 유전자 마커에 대하여 샘플을 스크리닝하는 것을 허용한다.
종래의 방법과 대조적으로, 본 발명에 따른 방법은 eae 유전자의 검출을 필요로 하지 않는다.
espK, espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, Z6065, stx1 또는 stx2로부터 유래되고 본 발명의 PCR 분석에 사용하기에 적합한 프라이머는 이러한 프라이머를 이용하여 획득되는 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브와 마찬가지로, 예를 들어 접근번호 AE005174.2로 GenBank에서 이용가능한 대장균 O157:H7 (EDL933 균주)의 주석화된 (annotated) 서열 내에서와 같이, 데이터베이스 내에서 이용가능한 이러한 유전자의 서열에 기초하여 당업자에 의하여 용이하게 설계될 수 있다.
이러한 PCR 분석에 사용하기 위한 바람직한 프라이머 세트의 제한적이지 않은 예시는 하기:
- 하기 서열:
GCAGRCATCAAAAGCGAAATCACACC (서열번호 42)
TCGTTTGGTAACTGTGGCAGATACTC (서열번호 43)에 의해 정의되며 espK를 표적으로 하는 프라이머 세트
- 하기 서열:
TCAGGTTCCTCGTCTGATGCCGC (서열번호 44)
CTGGTTCAGGCCTGGAGCAGTCC (서열번호 45)에 의해 정의되며 espV를 표적으로 하는 프라이머 세트
- 하기 서열:
GCAATAATTGACTCTGATTGCC (서열번호 46)
GCTGCTGCGGTAAAATTTACT (서열번호 47)에 의해 정의되며 ureD를 표적으로 하는 프라이머 세트
- 하기 서열:
CTGAAAAGAGCCAGAACGTGC (서열번호 48)
TGCCTAAGATCATTACCCGGAC (서열번호 49)에 의해 정의되며 Z2098을 표적으로 하는 프라이머 세트
- 하기 서열:
CGATCATTGTGGGCATGTTATGCC (서열번호 50)
CCTGAATTCACACGGTGATGCG (서열번호 51)에 의해 정의되며 Z1153을 표적으로 하는 프라이머 세트
- 하기 서열:
GCCTTTTTATGTTCATTATTGCGGTTG (서열번호 52)
GTATAGTTTTAGCAATACCTTCCTGC (서열번호 53)에 의해 정의되며 Z1154를 표적으로 하는 프라이머 세트
- 하기 서열:
GATTGTGGCGATTAATGGGGG (서열번호 54)
ACACCGATCTGGTCATTGGCG (서열번호 55)에 의해 정의되며 Z1155를 표적으로 하는 프라이머 세트
- 하기 서열:
AAACGCCTTTAAAATCTGCGTCT (서열번호 56)
TGCCGTGCGCACAGTCATAAG (서열번호 57)에 의해 정의되며 Z1156을 표적으로 하는 프라이머 세트
- 하기 서열:
GCCCATGGCTCCACATCCTG (서열번호 58)
CCAAAAAAGTTATGATGATTGCACTG (서열번호 59)에 의해 정의되며 Z1151을 표적으로 하는 프라이머 세트
- 하기 서열:
GCACTGGCCCTTGTTGCTCAGGC (서열번호 60)
GCTCTTCCAGTGAGAATGTCTTTCCGG (서열번호 61)에 의해 정의되며 Z6065를 표적으로 하는 프라이머 세트
- 하기 서열:
TTTGTYACTGTSACAGCWGAAGCYTTACG (서열번호: 62)
CCCCAGTTCARWGTRAGRTCMACRTC (서열번호 63)에 의해 정의되며 stx1 및 stx2를 표적으로 하는 프라이머 세트와 같다.
상기 증폭 산물의 검출을 위한 프로브의 제한적이지 않은 예시는 하기:
- 하기 서열:
ATTCAGATAGAAGAAGCGCGGGCCAG (서열번호 64)에 의해 정의되며, espK로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
CTTGCAACACGTTACGCTGCCGAGTATT (서열번호 65)에 의해 정의되며, espV로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
TACGCTGATCACCATGCCTGGTGC (서열번호 66)에 의해 정의되며, UreD로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
TAACTGCTATACCTCCGCGCCG (서열번호 67)에 의해 정의되며, Z2098로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
TGTAACACCCAGACGGTCAGCAACATG (서열번호 68)에 의해 정의되며, Z1153으로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
TCACTTCCAGTTTCTGGTGATGTTTTGAT (서열번호 69)에 의해 정의되며, Z1154로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
TGGGTGAGGTTAAAATATAAAGAACGATTGC (서열번호 70)에 의해 정의되며, Z1155로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
TAAGATATTTTCTGACTTTCCGCATGCGCTT (서열번호 71)에 의해 정의되며, Z1156으로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
AAAGAGCCAGCGCAGAGCTGACCAG (서열번호 72)에 의해 정의되며, Z1151로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
TTCGCTGGAAGCAGAGCCCGTGC (서열번호 73)에 의해 정의되며, Z6065로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
CTGGATGATCTCAGTGGGCGTTCTTATGTAA (서열번호 74)에 의해 정의되며, stx1로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 하기 서열:
TCGTCAGGCACTGTCTGAAACTGCTCC (서열번호 75)에 의해 정의되며, stx2로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;와 같다.
유리하게도, 본 발명은 샘플이 EHEC O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11] 및 O45:[H2] 혈청형 중 적어도 하나의 전형적인 장출혈성 대장균 (EHEC)을 함유하는지 여부를 예측하고, 상기 EHEC의 혈청형(들)을 더욱 식별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
- 상기 샘플이 전술된 바와 같이, O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] 및 O104:H4 혈청형 중 적어도 하나의 EHEC를 포함하는지 여부 및 상기 PCR 분석의 결과가 양성인지 여부를 평가하기 위한 PCR 분석을 수행하는 단계,
- 전술된 바와 같이, 상기 EHEC의 혈청형(들)을 식별하기 위한 PCR 분석을 수행하는 단계:를 포함한다.
본 발명의 PCR 분석은 식품 샘플, 물 샘플, 토양 샘플 등과 같이, 잠재적으로 EHEC를 함유하는 모든 물질의 샘플에 대하여 사용될 수 있다.
본 발명의 PCR 분석은 이러한 목적에 적합한 모든 다양한 자연적인 또는 합성된 효소를 이용하여 표적 서열의 PCR 증폭에 적합한 모든 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 핵산 서열-기반 증폭 (nucleic acid sequence-based amplification, NASBA), 분기형 DNA (branched DNA), 사슬 치환 증폭 (strand displacement amplification) 또는 루프-매개 등온 증폭 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 방법 (Compton 1991, Chang 1991, Walker et al.1992, Notomi et al., 2000)과 같이 대체적인 방법도 사용될 수 있다.
특히 바람직한 방법은 "미생물학의 실시간 PCR: 진단부터 특성화까지"(2007) Caister Academic 출판사, Norfolk, UK에서 Ian M. Mackay에 의하여 기술된 바와 같이 실시간 (real time) PCR 증폭을 수반하는 것들이다.
정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 (quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR) 또는 동역학적 중합효소 연쇄반응 (kinetic polymerase chain reaction)으로도 불리는 실시간 PCR은 표적 DNA 분자를 증폭시킴과 동시에 정량하기 위하여 사용된다. 이는 DNA 샘플 내의 특이적 서열의 검출 및 (DNA 입력 또는 추가적인 정규화 (normalizing) 유전자에 대하여 정규화 (normalized)되었을 때의 사본의 절대값 또는 상대량으로) 정량하는 것 모두를 가능하게 한다. 상기 절차는 중합효소 연쇄반응의 일반적인 이론을 따르며, 그 주요한 특징은 증폭된 DNA가 상기 반응에서 축적됨에 따라 매 증폭 사이클 후에 실시간으로 정량화된다는 것이다 (Mackay 2007). 두 개의 일반적인 정량 방법은 이중-가닥 DNA에 삽입되는 형광 염료, 및 상보적 DNA와 결합 될 때 형광을 발하는 변형된 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것이다 (Mackay 2007). 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 상기 두 가지의 방법 중 두 번째 방법을 나타내었으나, 삽입되는 형광 염료에 기반하는 PCR 산물을 정량하는 기타의 다른 방법 또한 본 발명의 범주에 속하는 것이다.
적절한 형광 라벨의 제한적이지 않은 예시는 6-카르복실-플루오레신 (6-carboxyl-fluorescein, FAM), 테트라클로로-6-카르복시플루오레신 (trachloro-6-carboxyfluorescein, TET), 6-카르복시-X-로다민 (6-carboxy-X-rhodamine, ROX)을 포함한다. 이중-표지된 (dual-labelled) 프로브를 라벨링하기 위한 적절한 ?쳐 (quenchers)의 제한적이지 않은 예시는 6-카르복시-테트라메틸-로다민 (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine, TAMRA), 댑실 (DABCYL), 블랙홀 ?쳐 패밀리 (Black Hole Quencher family, BHQ)와 같은 또는 마이너 그루브 바인더 그룹 (minor groove binder group, MGB)을 포함하는 비-형광성 ?쳐를 포함한다.
본 발명의 PCR 분석은 각각 검출될 각각의 표적 서열에 대하여 별도의 PCR 반응을 수행함으로써 실시할 수 있다 (단일 PCR (simplex PCR)). 그러나, 많은 경우에는 단일 반응에서 다수의 표적 서열의 증폭을 허용하는 복합 PCR (multiplex PCR)을 실시하는 것이 바람직할 것이다. 유리하게도, 매크로에레이 (macroarray) 즉, 원하는 DNA 프라이머가 그 위에 점점이 뿌려진 (spotted) 기질과 같이 미리 형성된 구조체를 사용하는 것이 가능하다. 이러한 매크로에레이는 본 명세서에 기술된 복합 PCR 분석의 일정하고 반복적인 수행을 가능하게 한다. 일례로, 예를 들어 필요한 표적을 검출 및 정량하기 위해 요구되는 반응제가 미리 투입된 반응 마이크로챔버 내에서 다중 표적의 동시 검출을 허용하며 Beutin 등 (Beutin et al.2009)에 의해 기술된 GeneDisc® 매크로어레이 (Pall-GeneDisc Technology, Bruz, 프랑스)를 사용할 수 있다.
상기 분석의 결과가 상기 샘플의 진정한 내용물을 대표한다는 점을 확실하게 하기 위하여, 상기 분석은 검출된 모든 산물이 진정한 양성이라는 점을 확인하기 위한 음성 증폭 대조구 (negative amplification control)를 포함할 수 있고, 또한 상기 샘플로부터 나온 DNA가 증폭될 수 있으며 그에 따라 거짓 음성반응이 생성되지 않았다는 점을 확인하기 위한 억제 대조구 (inhibition control)를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 최종적으로 PCR 반응을 수행하기 위한 반응제와 관련되며, 본 발명의 PCR 분석을 수행하는 것을 허용하는 상기 정의된 프라이머 세트 및 프로브와 이러한 프라이머 세트 및 이러한 프로브와 연관된 키트를 포함한다. 이러한 키트는 또한 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 지침서를 포함할 수도 있다. 본 발명의 프라이머를 이용한 증폭 산물 또한 본 발명의 일부를 구성한다.
제1 구현 예에 따른 본 발명의 키트는
- 서열번호 11 및 서열번호 12의 서열에 의해 정의되는 프라이머 세트 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 서열에 의해 정의되는 프라이머 세트, 및/또는 서열번호 15 및 서열번호 16의 서열에 의해 정의되는 프라이머 세트
- 서열번호 17 및 서열번호 18의 서열에 의해 정의되는 프라이머 세트;
- 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21의 서열에 의해 정의되는 프라이머 세트;
- 서열번호 22 및 서열번호 23의 서열에 의해 정의되는 프라이머 세트;
- 서열번호 24 및 서열번호 25의 서열에 의해 정의되는 프라이머 세트;
- 서열번호 26 및 서열번호 27의 서열에 의해 정의되는 프라이머 세트;
- 서열번호 28 및 서열번호 29의 서열에 의해 정의되는 프라이머 세트;
- 서열번호 30 및 서열번호 31의 서열에 의해 정의되는 프라이머 세트:를 포함하는 프라이머의 조합을 포함한다.
바람직하게는, 상기 키트는 또한
- 앞서 정의된 바와 같이 서열번호 1 및 서열번호 2로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브, 및 서열번호 3으로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브, 및/또는 서열번호 4로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 앞서 정의된 바와 같이 서열번호 5로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 앞서 정의된 바와 같이 서열번호 6으로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 앞서 정의된 바와 같이 서열번호 7로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 앞서 정의된 바와 같이 서열번호 8로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 앞서 정의된 바와 같이 서열번호 9로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브;
- 앞서 정의된 바와 같이 서열번호 10으로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 두 개의 프로브:를 포함한다.
제2 구현 예에 따른 본 발명의 키트는
- espK로부터 유래된 프라이머 세트, 및
- espV로부터 유래된 프라이머 세트, ureD로부터 유래된 프라이머 세트, Z2098로부터 유래된 프라이머 세트, Z1151로부터 유래된 프라이머 세트, Z1153으로부터 유래된 프라이머 세트, Z1154로부터 유래된 프라이머 세트, Z1155로부터 유래된 프라이머 세트, Z1156으로부터 유래된 프라이머 세트, Z6065로부터 유래된 프라이머 세트: 중에서 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함한다.
바람직하게는, 상기 키트는 또한 espK로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브와 espV로부터 유래된 증폭산물의 검출을 허용하는 프로브, ureD로부터 유래된 증폭산물의 검출을 허용하는 프로브,또는 Z2098로부터 유래된 증폭산물의 검출을 허용하는 프로브, Z1151로부터 유래된 증폭산물의 검출을 허용하는 프로브, Z1153로부터 유래된 증폭산물의 검출을 허용하는 프로브, Z1154로부터 유래된 증폭산물의 검출을 허용하는 프로브, Z1155로부터 유래된 증폭산물의 검출을 허용하는 프로브, Z1156로부터 유래된 증폭산물의 검출을 허용하는 프로브, Z6065로부터 유래된 증폭산물의 검출을 허용하는 프로브:중에서 선택된 하나 이상의 프로브(들)을 포함한다.
전술된 제2 구현 예에 따른 키트는 stx1을 표적으로 하는 프라이머 세트 및 stx2를 표적으로 하는 프라이머 세트와 바람직하게는 stx1으로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브 및 stx2로부터 유래된 증폭 산물의 검출을 허용하는 프로브를 를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명을 더욱 명확하게 이해하고 본 발명이 효과적으로 수행되는 방법을 제공하기 위하여, 이하에서는 단지 예시로써, 본 발명에 따른 구체적인 구현, 방법 및 절차를 제시한다.
실시 예 1: 장출혈성 대장균 (EHEC)의 특이적인 식별을 위한 대장균의 CRISPRs 위치로부터 유래된 DNA 서열의 식별
재료 및 방법
세균 균주
고 처리용량 실시간 PCR (high throughput real-time PCR)에 의하여 그들의 CRISPR 위치가 조사된 대장균 균주들 (n = 955)은 하기 표 1 (대장균 균주)에 나타난 바와 같다.
EHEC* (n = 331)
O103:[H25] (n=6), O103:H2 (n=38), O111:H8 (n=49), O118:[H16] (n=3), O119:[H25] (n=4), O121:H19 (n=12), O123:H11, O127:H8s, O145, O145:[H28] (n=29), O156:H21, O156:H25 (n=10), O157:[H7] (n=75), O165:H25, O172:[H25], O172:H25, O172:NM, O177 (n=2), O177:[H25], O182:[H25], O26:[H11] (n=76), O3, O45:H2, O49:H16, O5 (n=8), O55, O76:H51, O84:H2, Ont:[H2], Or:H16, OX186:[H2]
EPEC (n = 344)
O100:[H25] (n=2), O102:H19, O103:H21, O103:H8, O108:H9 (n=6), O109:H25, O111, O111:B4, O111:H11, O111:H19 (n=3), O111:H2 (n=13), O111:H25 (n=2), O111:H47, O111:H9 (n=3), O113:H6 (n=2), O114:H2 (n=6), O114:H49 (n=5), O115:H38 (n=3), O117:H25, O117:H40b (n=3), O118:H5, O118:H8a (n=3), O119:[H25], O119:H2 (n=3), O119:H6 (n=4), O119:H8 (n=2), O119:H9, O119s:H2, O123/O4:H45 (n=2), O123:H25, O125:H6, O125ac:H6 (n=3), O126:H27, O126:H6, O127, O127:H19, O127:H40 (n=4), O127:H40b (n=2), O127:H6 (n=2), O128:[H2] (n=12), O128:H8, O128ac:H2, O142:H34, O142:H6 (n=3), O145:H34 (n=5), O15:H11, O15:H2 (n=3), O153:H14, O156, O156:[H8] (n=7), O156:H1 (n=2), O156:H25 (n=3), O157, O157:[H45] (n=2), O157:H16 (n=5), O157:H2, O157:H26 (n=2), O157:H39, O157:H45 (n=3), O177:H26, O186:[H45], O2:[H40] (n=2), O2:H40b, O2:H8, O21:H25, O22:H7, O26:[H11] (n=38), O26:H31, O26:H34, O28:H28 (n=4), O3:H40b, O3:H5, O3:H8a (n=3), O37:H10, O4:H16, O45, O45:H7, O45:H9, O49:[H10] (n=2), O49:H-, O5:H11, O51:H49 (n=3), O55:[H51], O55:[H7] (n=26), O55:H6 (n=5), O62:H9, O63:H6 (n=2), O66:H8/8a, O69:[H2], O69:H16 (n=2), O70/O86:H2, O70:H11 (n=5), O71:H40b, O76:H41, O76:H7 (n=5), O80:[H2] (n=3), O84:[H2], O86:[H34] (n=4), O86:H11 (n=2), O86:H40, O86:H8 (n=4), O86:H8a, O88:H8a, O89:[H2], O9:H10, OK8:H10, Ont:[H10], Ont:[H6], Ont:H11, Ont:H14, Ont:H2 (n=2), Ont:H21, Or:H40b, Or:H8a, Or:H9, OX177:H11 (n=2), OX177:H6
STEC** (n = 160)
O100:NM (n=2), O101:H- (n=3), O104:H7, O105:H18, O109:H-, O110:H28, O111, O111:H10, O113:H4, O115:H18 (n=2), O116:H28, O117 (n=2), O117:H7 (n=2), O118:H12 (n=3), O125, O126, O126:H8, O128ab:H2, O130:H11, O136 (n=2), O138, O139, O139:H1, O141:[H4], O141ac, O146:H21, O146:H28 (n=2), O146:H8, O147, O149:H19, O15:H16, O153:H25 (n=3), O165:H11, O168:H8, O17/77:H41, O171:H-, O171:H2, O172:H21, O174:[H21] (n=11), O174:H2, O174:H8 (n=4), O176:H-, O178:H19, O179:H8, O181:H49, O2:H25, O2:H27, O21:H21 (n=3), O22/O83, O22:H16 (n=2), O22:H8 (n=3), O23:H15, O3, O39:H48, O40:21, O40:H8, O46:H38 (n=2), O48:H21, O5, O5:[H19], O53, O6 (n=7), O6:H10 (n=2), O6:H34 (n=2), O68:H12, O73:H18, O74:H42, O75:H8, O76, O76:H19 (n=3), O77 (n=2), O79, O79:H48, O8:H10, O8:H19 (n=6), O8:H8, O85:H11, O86, O88:H25, O91 (n=6), O91:[H21] (n=5), O91:H10 (n=3), O91:H14 (n=2), O92,O107:H-, O92,O107:H48, O96:H19, Ont:H-, Ont:H7, Or:[H16], Or:H12, Or:H29, Or:H33, Or:H4, Or:H48, OX178:H19, OX185:H28, OX187:Hbev, OX3:H-, OX3:H2, OX3:H21, OX7:H16
비병원성 대장균 (n = 120)
O103 (n=2), O103:H8, O104:H7, O110, O111:H12, O111:H21, O121:[H45], O126 (n=33), O126:H11, O126:H27 (n=3), O127 (n=8), O127:H10, O127:H21, O142 (n=8), O145:H2 (n=2), O150:H8, O153:H12, O156:H33, O156:H47, O156:H56, O157 (n=5), O157:H27, O180:H-, O26:H? (n=4), O26:H21/32, O26:H32 (n=6), O26:NM, O4:H5, O41:H7, O45:H7, O55 (n=8), O55:H19, O55:H21, O6:H4, O62:H30 (n=2), O8/O104:H10, O8/O104:H45, O86 (n=6), O86/O125ac, O86:H2, O86:H27, O88, O9:K9:H12, OX183:H18
각각의 혈청형에 대하여, 다른 언급이 없는 한 n=1
* (Bugarel et al. 2010)에 기술된 바와 같이 EHEC 유도체를 포함. ** 비전형적인 EHEC를 포함
대장균 균주를 시가-독소 생산 대장균 (Shiga-toxin producing E. coli) 또는 STEC (n = 160), 장병원성 대장균 (enteropathogenic E. coli) 또는 EPEC (n = 344), 장출혈성 대장균 (enterohaemorrhagic E. coli) 또는 EHEC (n = 331) 및 비병원성 대장균 (apathogenic E. coli) (n = 120)으로 나누었다. 상기 STEC/EHEC 유형은 stx- 및 eae-유전자의 존재에 의해 정의되었다. STEC는 단지 stx만을 가진 (harboured) 것인 반면, EHEC 균주는 stx 유전자 둘 다 (stx1 및/또는 stx2)를 갖는 (harbouring) 것으로서 정의되었다. STEC는 혈청형 O91:[H21], O113:[H21], O104:[H21]의 stx-양성 및 eae-음성 대장균 균주를 포함하였으며, 다른 EHEC보다 출혈성 질환에는 덜 관련되나, 종종 설사의 원인이 되는 비전형적인 EHEC로 명명되었다. EHEC 균주의 Stx-음성 유도체는 EHEC-유사 (EHEC-like)로 지정되었으며, 유전자 espK 및 그들의 arcA 유전자에 대한 대립유전자 타입 2의 존재에 기초하여 식별된 혈청형 O26:H11의 상기 EHEC-유사 균주를 제외하고는, Bugarel 등 (2010; 2011)에 의해 기술된 바와 같이 그들의 nle 유전자 프로파일, eae 서브타입 및 혈청형에 기초하여 정의되었다 (Bugarel et al., 2011). EPEC 균주는 Bugarel 등 (2011)에 의하여 기술된 바와 같이 정의되었다. 비병원성 대장균은 stx - 및 eae-음성 균주로 정의되었다.
본 연구에서 조사된 모든 균주는 대장균 O (LPS) 및 H (편모성) 항원으로 식별되었으며, 기존에 보고된 바와 같이 stx- 및 eae- 유전자로 특징지어졌다 (Bugarel et al. 2010). 실험을 위하여, 루리아-브로스 프레이트 (Luria-Broth Plates) 상에서 세균을 단일 콜로니로 배양하였으며, 37℃에서 하룻밤 동안 생장시켰다. 하나의 콜로니를 골라 고 처리용량 실시간 PCR 테스트 전에 InstaGene 매트릭스 (Bio-Rad Laboratories, Marnes La Coquette, 프랑스)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
DNA 서열분석
하기 표 2에 열거된 프라이머를 이용하여 대장균 균주의 CRISPR 위치를 증폭하였다. 하기 표 2에 열거된 서열분석 프라이머를 이용하여 Eurofins MWG Operon (Courtaboeuf, 프랑스)에 의해 상기 CRISPR 증폭체 (amplicons)의 이중 가닥 DNA 서열분석이 수행되었다.
프라이머
명칭		 전방향 프라이머 (forward primer) 및 역방향 프라이머 (reverse primer) 서열 (5'-3')
서열번호
접근번호
서열 내의 위치
CRISPR-Ⅰ-F GGTGAAGGAGYTGGCGAAGGCGTC 76 AE005174 3665412-3665435
CRISPR-Ⅰ-R CCGGTGGATTTGGATGGGTTACG 77 AE005174 3665885-3665863
CRISPR-Ⅱ-F TGTGAACCTCTCTGGCATGGAG 78 AP010953 3786919-3786940
CRISPR-Ⅱ-R TAAAGTTGGTAGATTGTGACTGGC 79 AP010953 3787672-3787649
고-처리용량 실시간 PCR
고-처리용량 실시간 PCR 증폭을 수행하기 위하여 LightCycler® 1536 (Roche, Meylan, 프랑스)를 사용하였다. LightCycler® 1536 멀티웰 플레이트의 PCR 준비를 위하여, 칠러 (chiller) 및 PlateLoc 열 마이크로플레이트 실러 (thermal microplate sealer) (Agilent Technologies)가 구비된 Bravo 액체 분배기 오토매트 (liquid dispenser automat) (Agilent Technologies, Massy, 프랑스)가 사용되었다. 상기 PCR 반응은 0.5㎕의 샘플과 (0.7×최종산물에 상응하는) 1×RealTime 준비 DNA Probes 마스터 (Roche), (각각 200nM의 최종산물에 상응하는) 300nM의 각각의 프라이머 및 300nM의 각각의 프로브를 함유하는 1㎕의 마스터 믹스 (master mix)를 함유했다. 증폭은 FAM- 또는 HEX-표지된 TaqMan® 프로브를 이용하여 수행되었다. PCR 증폭에 사용된 프라이머 및 프로브를 하기 표 3에 열거하였다. LightCycler® 1536 실시간 PCR 시스템은 1분 동안 95℃ 후에 0초 동안 95℃로 35 사이클 (기울기: 4.8℃/초) 및 30초 동안 60℃ (기울기: 2.5℃/초) 및 30초 동안 40℃의 최종 냉각단계:의 열 프로파일로 사용되었다. 소프트웨어 세팅은 이중 색상 가수분해 (Dual color hydrolysis) 프로브/UPL 프로브 및 Master Control로 하였다.
전방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브 서열 (5'-3') 서열번호 표적 서열
SP_O157_A GAACACAAACCGAAACACACG
ATAAACCGTCACCAAAACAGTG
[FAM]-ACAAAAACTGTCACCAAAGTGTTC-[BHQ1]		 15
16
34		 (서열번호 4)
SP_O157_B GGGAACACAAACCGAAACACA
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC
[HEX]-CGATCAATCCGAATATGAGCGGT-[BHQ1]		 11
12
32		 (서열번호 1 및 2)
SP_O157_C GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC
[HEX]-CACTGTTTTGGTGACGGTTTATCC-[BHQ1]		 13
14
33		 (서열번호 3)
SP_O121 CGGGGAACACTACAGGAAAGAA
GGCGGAATACAGGACGGGTGG
[HEX]-TCCGCCAACGGCGACAGGGG-[BHQ1]		 22
23
37		 (서열번호 7)
SP_O45 GAGTCTATCAGCGACACTACC
AACCGCAGCTCGCAGCGC
[HEX]-TCGGAACGTGGCGCTATAGGTG-[BHQ1]		 24
25
38		 (서열번호 8)
SP_O145 GAACTTGAGCCCTGCCAGAA
ACCGCGATCTTTTCCTACCTG
[HEX]-TGGGGCCTCTTTTGTACCCGG-[BHQ1]		 17
18
35		 (서열번호 5)
SP_O104 GGAACTCACCGAGCGCCG
GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC
[HEX]-CTGGGAGGCGTATCTCACGTTCGGT-[BHQ1]		 26
27
39		 (서열번호 9)
SP_O26_C ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG
GATAAACCGTGGTACGGAACA
[HEX]-TGCTGTCTATATTTCGACCAGTGTTCC-[BHQ1]		 28
29
40		 (서열번호 10)
SP_O26_D TGAAACCACTCGCGGCAGAT
ATAAACCGATCTCCTCATCCTC
[HEX]-CCAGCTACCGACAGTAGTGTGTTCC-[BHQ1]		 30
31
41		 (서열번호 10)
SP_O111 GTGACCGCCTGTACACGC
CGGATATTTGGGCGTAATACC
CTGCCGCGAGTGGTTTCAC
[HEX]-TGTAATGGCTCACCGGTTTATCCCC-[BHQ1]		 19
20
21
36		 (서열번호 6)
결과
EHEC O157:H7의 CRISPRs를 표적으로 하는 특이적인 DNA 서열의 식별
다양한 EHEC O157:[H7] 균주의 CRISPR 위치를 서열 분석하는 것은 이러한 혈청형에 대하여 이러한 위치의 다형성 (polymorphism)을 나타내었다. EHEC O157:[H7] 균주의 CRISPR 위치의 서열 특징은 서열번호 1, 2, 3 및 4에 나타나 있다. 이러한 서열 및 균주 EDL933 (접근번호 AE005174)의 CRISPR 위치에 기초하여, EHEC O157:[H7]을 검출하기 위하여 다양한 실시간 PCR 분석이 설계되었다 (SP_O157_A, SP_O157_B 및 SP_O157_C). 상기 분석의 특이성 (specificity) 및 민감도 (sensitivity)가 EHEC O157:[H7]의 75 개의 균주를 포함하는 955 개의 대장균 균주의 패널에 대하여 테스트 되었다 (표 1). 상기 PCR 테스트는 EHEC O157:[H7]에 대하여 민감도가 매우 높고 매우 특이적인 것으로 증명되었다. 상기 분석의 민감도는 92.0% 내지 97.3%의 범위를 나타내었으며 단지 소수의 O157:[H7] 균주가 각각의 분석에 의해 검출되지 않았다. PCR 테스트의 특이성은 높았으며, 99.6 내지 100%의 범위를 나타내었다. PCR 분석 SP_O157_B는 혈청군 O55의 매우 소수의 균주로 교차 반응을 나타내는 특이한 테스트였다. PCR 분석 SP_O157_B 및 SP_O157_C를 결합시킴으로써 모든 75 개의 EHEC O157:[H7] 균주가 정확하게 검출되었으며 (100% 민감도) 단지 3 개의 혈청군 O55의 분리체 (isolates) 만이 교차 반응하였다 (99.6% 특이성).
EHEC O145:H28의 CRISPR 위치를 표적으로 하는 특이적인 DNA 서열의 식별
대장균에서 식별된 두 개의 CRISPR 위치 중 하나를 서열분석 함으로써 EHEC O145:H28의 CRISPR 위치가 특징지어졌다 (서열번호 5). EHEC O145:[H28]를 표적으로 삼기 위하여 이러한 CRISPR 서열로부터 PCR 분석 (SP_O145)이 설계되었다. 이러한 PCR 테스트로 조사된 955 개의 대장균 균주들 중에서, 단지 29 개의 EHEC O145:[H28] 및 4개의 EPEC O28:H28 균주만이 양성으로 테스트 되었다. 상기 PCR 분석 SP_O145의 민감도 및 특이성은 각각 100% 및 99.5%였다.
EHEC O111:H8의 CRISPR 위치를 표적으로 하는 특이적인 DNA 서열의 식별
EHEC O111:H8을 검출하기 위하여 EHEC O111:H8의 CRISPR 위치의 서열 (서열번호 6)에 기초하여 실시간 PCR 분석 (SP_O111)이 설계되었다. PCR 분석 SP_O111에 의한 980 개의 대장균 균주의 조사는 테스트된 49 개의 O111:[H8] 균주 중에서 47 개의 EHEC O111:[H8]에 대하여 양성 결과를 나타내었다. 단지 하나의 혈청형 O45:H7의 EPEC 균주만이 양성으로 테스트 되었다. 이러한 PCR 분석의 민감도 및 특이성은 각각 95.9% 및 99.9%로 높았다.
EHEC O121:H19의 CRISPR 위치를 표적으로 하는 특이적인 DNA 서열의 식별
상기 EHEC O121:[H19]의 CRISPR 위치가 본 연구에서 서열분석되었다 (서열번호 7). EHEC O121:[H19]를 표적으로 삼기 위하여 이러한 서열로부터 PCR 분석 (SP_O121)이 설계되었다. 상기 PCR 분석 SP_O121에 의하여 테스트된 955 개의 대장균 균주 중에서, 단지 하나의 O104:H7 및 12 개의 EHEC O121:[H19] 균주만이 양성으로 테스트 되었으며, 이는 이러한 PCR 테스트의 민감도가 매우 높고 (100%) 특이적임 (99.9%)을 나타낸다.
EHEC O103:H2 및 O45:H2의 CRISPR 위치를 표적으로 하는 특이적인 DNA 서열의 식별
EHEC O45:[H2]의 CRISPR 위치의 서열 결정 (서열번호 8) 및 균주 12009 (접근번호 AP010958)로부터 분양된 EHEC O103:H2의 CRISPR 위치의 서열에 기초하여, PCR 분석 (SP_O45)이 설계되었으며 하나의 EHEC O45:H2 균주와 본 연구에서 조사된 모든 38 개의 EHEC O103:H2 균주가 양성인 것으로 테스트 되었다. 따라서, 상기 PCR 분석 SP_O45는 EHEC O103:[H2] 및 O45:[H2]에 대하여 높은 민감도를 나타내었다. 이러한 테스트는 대장균의 대형 패널 상에서 수행되는 경우 98.6%의 민감도를 가지며, 하기 혈청형: O118:H8, O128:[H2], O128:H8, O128:H2, O89:[H2], O46:H38, O8:H8, O142, O145:H2의 몇몇 균주와 단지 미미한 교차반응을 나타내며, 하나의 O103 균주가 편모 H2에 대하여 음성으로 나타났다.
EHEC O104:H4의 CRISPR 위치를 표적으로 하는 특이적인 DNA 서열의 식별
본 연구에서 EHEC O104:[H4]의 CRISPR 위치가 서열 분석되었다 (서열번호 9). EHEC O104:[H4]를 표적으로 삼기 위하여 이러한 서열로부터 PCR 분석 (SP_O104)이 설계되었다. 대장균 O104:H4의 CRISPR 위치를 표적으로 하는 PCR 분석이 공지된 O-혈청군 및 56 H-타입을 포함하는 대장균의 1303 개의 균주의 패널 상에서 평가되었다. 이러한 PCR 분석은 2011년 5월에 발생한 발발과 연관된 (한 개의 Or:H4 분리체 (isolate)를 포함하는) 48 개의 O104:H4 분리체 및 2001년에 보고된 하나의 O104:H4 임상 분리체에 대하여 양성 결과를 나타내었다. H4와 다른 H-타입을 갖는 대장균 O104의 39 개의 균주가 음성으로 테스트 되었다. 교착 (agglutination)에 의해 항-O104 혈청과 교차 반응하는 K9 피막항원 (capsular antigen) (O8:K9:H10, O8:K9:H45, O9:K9:H1, O9:K9:H12 및 O9:K9:H51)을 지니고 있는 대장균 균주가 모두 음성으로 테스트 되었다. 결국, 186 개의 공지의 O-혈청군 및 56 개의 H-타입을 포함하는 다른 대장균 균주 중에서, 혈청형 Ont :H2, O43:H2, O141:H2, 및 O174:H2에 속하는 단지 5 개의 분리체만이 EHEC O104:H4의 CRISPR 위치에 설계된 프라이머 및 프로브와 교차 반응하였다. 따라서 추가적인 O174:H2, O141:H2 및 O43:H2 균주가 CRISPR-O104에 대하여 테스트 되었다. 3/4의 O43:H2 및 1/8의 O141:H2와 더불어, 열두 개의 O174:H2 중 세 개가 양성으로 테스트 되었다. 상기 자료는 모두 이러한 PCR 테스트는 민감도가 매우 높고 (100%) 매우 특이적 (99.6%)이라는 것을 나타내었다.
EHEC O26:H11의 CRISPR 위치를 표적으로 하는 특이적인 DNA 서열의 식별
다양한 EHEC O26:[H11] 균주의 CRISPR 위치에 대한 서열분석은 이러한 혈청형에 대하여 이와 같은 위치의 다형성을 나타내었다. EHEC O26:[H11]의 CRISPR 위치의 서열 특징이 서열번호 10에 나타나 있다. 이러한 서열 및 EHEC O26:H11 균주 11368 (접근번호 AP010953, NC_013361)의 CRISPR 위치에 기초하여, EHEC O26:[H11]을 검출하기 위하여 두 가지의 실시간 PCR 분석이 설계되었다 (SP_O26_C, 및 SP_O26_D). 상기 분석의 특이성 및 민감도가 77 개의 EHEC O26:[H11] 및 EHEC-유사 O26:[H11] 균주를 포함하여, 980 개의 대장균 균주 패널에 대하여 테스트 되었다. 상기 두 가지의 PCR 테스트는 EHEC O26:[H11]에 대하여 민감하고 특이적인 것으로 증명되었다. SP_O26_D PCR 분석의 민감도가 90.9%인 반면, SP_O26_C PCR 분석의 민감도는 87.0%였다. 단지 몇몇의 O26:[H11] 균주만이 각각의 분석에 의하여 검출되지 않았다. PCR 테스트 SP_O26_D의 민감도는 (17 개의 균주가 교차반응하는) 98.1%인 반면, PCR 테스트 SP_O26_C의 민감도는 (12 개의 균주가 교차반응하는) 98.7%였다. 상기 PCR 분석 SP_O26_C 및 SP_O26_D를 결합함으로써 77 개의 EHEC-유사 및 EHEC O26:[H11] 균주 중에서 단지 4 개의 EHEC-유사 O26:H11 균주만이 검출되지 않았으며 (94.8% 민감도) 단지 26 개의 대장균만이 교차반응하였다 (97.1% 특이성).
결론:
하기 표 4 (민감도 및 특이성)에 본 연구의 결과를 요약하였다.
혈청형 숫자 PCR 민감도 특이성 교차반응

O157:[H7]a


75

 SP_O157_A 92.0% 100% -
SP_O157_B 97.3% 99.6% O55:[H7]a, O55:[H7] (n=2)b
SP_O157_C 94.7% 100% -
SP_O157_B+C 100% 99.6% O55:[H7]a, O55:[H7] (n=2)b


O103:H2 a,

O45:H2 a

38

1


SP_O45


100%


98.6%		 O118:H8a (n=3)b, O128:[H2]b, O128:H8b, O128ac:H2b, O89:[H2]b, O46:H38c, O8:H8c, O103d, O142d, O145:H2d
O111:H8 a 49 SP_O111 95.9% 99.9% O45:H7 (n=1)b
O121:H19 a 12 SP_O121 100% 99.9% O104:H7d
O145:[H28]a 29 SP_O145 100% 99.5% O28:H28 (n=4)b

O104:[H4] a
49
SP_O104
100%
99.6%		 Ont :H2, O43:H2 (n=4), O141:H2 (n=2), and O174:H2 (n=4)









O26:[H11] a









77


SP_O26_C


87%


98.7%		 O111:H11b, O111:H47b, O118:H16 (n=2)a, O118:H8a (n=3)b, O128:H8b, O26:H11b, O118:H2a, O103:H11a, O111b


SP_O26_D

90.9%

98.1%		 O118:H16 (n=3)a, O123:H11a, O26:H11 (n=9)b, O118:H2 (n=2)a, O86:H11 (n=2)b, O103:H11a



SP_O26_C+D


94.8%


97.1%		 O111:H11b, O111:H47b, O118:H16 (n=4)a, O118:H8a (n=3)b, O123:H11a, O128:H8b, O26:H11 (n=10)b, O86:H11 (n=2)b, O118:H2 (n=2)a, O103:H11a, O111b
다른 언급이 없는 한, 각각의 혈청형에 대하여 n=1
a)EHEC ＆ EHEC-유사; b)EPEC; c)STEC ＆ 비전형적인 EHEC; d)비병원성 대장균
다양한 EHEC 균주의 CRISPR 위치의 서열분석은 세계에서 가장 빈번하게 발생하는 임상 예와 관련된 EHEC로부터 나온 CRISPR 서열의 유전적 다양성을 나타내었다. CRISPR 위치의 단편 회문 반복 서열들 사이에 위치한 스페이서 (spacer) 서열의 분석은 높은 민감도 및 특이성으로 EHEC 균주를 검출하기 위하여 유용한 유전자 마커를 식별하는 것을 허용했다. 고 처리용량 실시간 PCR 접근법에 기초하여, EHEC, EPEC, STEC 및 비병원성 대장균으로 구성된 매우 큰 대장균 균주의 패널을 그들의 CRISPR 위치 함유물 (content)에 관하여 조사하였다. 결국, EHEC O145:H28 (n=29), O103:H2 (n=38), O121:H19 (n=12), O104:H4 (n=49) 및 O45:H2 (n=1)가 이러한 EHEC 혈청형으로부터 유래된 다양한 CRISPR 서열을 표적으로 하는 각각의 PCR 분석으로 100% 민감도로 검출되었다. EHEC O157 CRISPR의 두 개의 서로 다른 서열을 표적으로 하는 PCR 분석 SP_O157_B 및 SP_O157_C를 결합시킬 때, EHEC O157:[H7] (n=75)가 100% 민감도로 검출되었다. EHEC O111:[H8] (n=49)가 95.9% 민감도로 검출되었다 (47/49 O111:[H8] 이 검출되었으며, 단지 둘이 검출되지 않았다). O26 CRISPR 위치의 두 개의 서로 다른 서열을 표적으로 하는 PCR 분석 SP_O26_C 및 SP_O26_D를 결합시킬 때, EHEC O26:[H11] (n=77)가 94.8% 민감도로 검출되었다 (73/77 O26:[H11]가 검출되었으며; 검출되지 않은 단지 4 개의 균주는 EHEC-유사 O26:H11 균주였다).
세계에서 가장 빈번한 임상 예와 관련된 EHEC의 CRISPR 위치를 표적으로 하는 본 연구에서 개발된 PCR 분석은 또한 매우 특이적이었다. 이러한 분석은 대장균 균주의 매우 큰 패널 상에서 테스트 되었을 때, 97.1% 내지 100% 특이성을 가졌으며, 단지 매우 소수만이 교차 반응했다 (표 4).
실시 예 2: 인간에 대한 맹독성과 관련된 시가 독소를 생산하는 대장균 (STEC)을 식별하기 위한 유전자 마커의 식별
비 LEE 인코딩 타입 Ⅲ 이펙터의 확장된 목록 (Tobe et al., 2006; Creuzburg et al., 2011) 및 어드헤신 (adhesins) (Spears et al., 2006; Cergole-Novella et al., 2007;)이 가장 가능성 있는 STEC 독성 결정인자 원 (source)을 나타낸다. 그러나, 분자적 위험 평가 접근을 가장 잘 지지하는 유전자 표적이 여전히 정의되어야만 한다. 식품 내에서 EHEC를 모니터링하기 위해 특히 EPEC 균주로부터 EHEC를 명확하게 구별할 수 있는 유전자 마커를 선택하는 것이 필요하다.
그러한 요인을 식별하기 위한 노력을 통하여, 우리는 인류 건강에 심각한 위험을 야기하는 STEC 균주를 EPEC 및 심각하고 만연하는 질병과 무관한 STEC과 구별하기 위한 후보로서 게놈 O-아일랜드 OI-43, OI-44, OI-50, OI-57 및 OI-71로부터 유래된 특정 nle 유전자의 적합성을 탐색하였다. 상기 실시간 PCR 증폭에 사용된 대장균 유전자 표적은 하기 표 5에 나타나 있다.
유전자
(염색체인 경우는 ORF 명칭)a 		인코딩되는 단백질 또는
패밀리 이펙터		 유전적 서포트
(이동체)a
ureD (Z1142 , Z1581) 우레아제 (Urease)-연관 단백질 UreD OI-43 ＆ OI-48
Z1151 가설단백질 (Hypothetical protein) OI-43
Z1153 가설단백질 OI-43
Z1154 콜리신 (Colicin) 면역단백질 OI-43
Z1155 추정되는 막단백질 OI-43
Z1156 가설단백질 OI-43
espV ( Z1387 ) AvrA 패밀리 이펙터 OI-44
espK ( Z1829 ) 류신풍부반복(Leucine-rich repeats) OI-50
Z2098 가설단백질 OI-57
Z6065 가설단백질 OI-71
a) ORFs 및 이동체 (mobile elements)는 대장균 O157:H7 EDL933 (GenBank AE005174)의 서열과 관계됨
1) 유전자 마커 espK , Z1151 , Z1153 , Z1154 , Z1155 , Z1156 및 Z6065 .
인간에게 맹독성을 갖는 STEC 균주와의 그들의 관련성을 평가하기 위하여 OI-43 (Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156), OI-50 (espK) 및 OI-71 (Z6065)로부터 유래된 유전자 마커의 분포가 다양한 대장균 병원군 (pathogroups) 중에서 시험 되었다.
재료 및 방법
본 연구에서 조사된 1252 개의 대장균 균주가 stx- 및 eae-유전자의 존재에 기초하여 장출혈성 대장균 또는 EHEC (n = 466), 장병원성 대장균 또는 EPEC (n = 468), 시가-독소 생산 대장균 또는 STEC (n = 179) 및 비병원성 대장균 (n = 139)으로 나뉘었다. STEC 균주는 단지 stx만을 지녔다. EPEC 균주는 eae만을 지녔다. 비병원성 대장균 (n=139)은 stx - 및 eae -음성 균주로 정의되었다.
상기 실시 예 1에 기술된 바와 같이 고 처리용량 실시간 PCR 시험이 수행되었다.
유전자 마커 espK , Z1151 , Z1153 , Z1154 , Z1155 , Z1156 및 Z6065의 PCR 증폭에 사용된 프라이머 및 프로브가 표 6에 열거되어 있다. stx1, stx2 및 eae의 검출을 위한 프라이머 및 프로브가 앞서 서술되었다 (Bugarel et al. 2010). 유전자 stx1, stx2 및 eae의 증폭이 내부 대조구로서 그리고 그룹 배정 목적으로 사용되었다.
전방 프라이머, 후방 프라이머 및 프로브 서열
(5' - 3')		 서열번호
espK (1829) GCAGRCATCAAAAGCGAAATCACACC
TCGTTTGGTAACTGTGGCAGATACTC
[6FAM]-ATTCAGATAGAAGAAGCGCGGGCCAG-[BHQ1]		 42
43
64
Z1153 CGATCATTGTGGGCATGTTATGCC
CCTGAATTCACACGGTGATGCG
[6FAM]-TGTAACACCCAGACGGTCAGCAACATG-[BHQ1]		 50
51
68
Z1154 GCCTTTTTATGTTCATTATTGCGGTTG
GTATAGTTTTAGCAATACCTTCCTGC
[6FAM]-TCACTTCCAGTTTCTGGTGATGTTTTGAT-[BHQ1]		 52
53
69
Z1155 GATTGTGGCGATTAATGGGGG
ACACCGATCTGGTCATTGGCG
[6FAM]-TGGGTGAGGTTAAAATATAAAGAACGATTGC-[BHQ1]		 54
55
70
Z1156 AAACGCCTTTAAAATCTGCGTCT
TGCCGTGCGCACAGTCATAAG
[6FAM]-TAAGATATTTTCTGACTTTCCGCATGCGCTT-[BHQ1]		 56
57
71
Z1151 GCCCATGGCTCCACATCCTG
CCAAAAAAGTTATGATGATTGCACTG
[6FAM]- AAAGAGCCAGCGCAGAGCTGACCAG -[BHQ1]		 58
59
72
Z6065 GCACTGGCCCTTGTTGCTCAGGC
GCTCTTCCAGTGAGAATGTCTTTCCGG
[6FAM]-TTCGCTGGAAGCAGAGCCCGTGC-[BHQ1]		 60
61
73
결과:
대장균 병원군 중 espK , Z1151 Z1153 , Z1154 , Z1155 , Z1156 , 및 Z6065와 이들의 조합의 분포
서로 다른 대장균 병원군 가운데서 서로 다른 유전자 마커 espK , Z1151 , Z1153, Z1154 , Z1155 , Z1156 및 Z6065의 분포가 하기 표 7에 나타나 있다. 전반적으로, 조사된 유전자 마커는 51.9% (Z6065) 내지 90.8% (espK) 범위의 빈도로 대부분 EHEC 균주에서 검출되었다. 이러한 마커들은 17.7% (Z1154) 내지 53.8% (Z1155) 범위의 빈도로 EPEC 균주와 덜 연관되었으며, STEC (3.4 내지 20.7%) 및 비병원성 대장균 (3.6 내지 9.4%)에서는 거의 검출되지 않았다.
유전자 마커 espK , Z1151 , Z1153 , Z1154 , Z1155 , Z1156 , 및 Z6065 중 어떤 것도 그 스스로는 신뢰할 수 있을 정도로 모든 EHEC 균주를 식별하지는 못하였다. 그러나, espK가 OI-43 (Z1151 , Z1153 , Z1154 , Z1155 및 Z1156), 또는 OI-71 (Z6065) 중 어떤 유전자 마커와 결합 될 때, 대부분의 EHEC 균주가 95.5% (espK/Z6065) 내지 98.3% (espK/Z1155)의 빈도로 검출되었다. 동일한 조합이 EPEC 균주를 31.2% (espK/Z1156) 내지 61.8% (espK/Z1155) 범위의 빈도로, STEC 균주를 6.7% 내지 23.5%의 빈도로, 그리고 비병원성 대장균 균주를 7.9% 내지 13.7%의 빈도로 검출하였다.
유전자 마커 EHEC
(n=466)		 EPEC
(n=468)		 STEC
(n=179)		 EC
(n=139)
Z1151 79.8% 20.3% 20.7% 7.9%
Z1153 89.3% 23.9% 12.3% 9.4%
Z1154 83.3% 17.7% 3.4% 3.6%
Z1155 79.4% 53.8% 16.8% 8.6%
Z1156 88.8% 18.8% 12.8% 6.5%
Z6065 519% 20.1% 5.0% 8.6%
espK 90.8% 28.0% 3.4% 5.0%
espK / Z1151 972% 34.0% 23.5% 12.2%
espK / Z1153 97.4% 35.7% 15.1% 13.7%
espK / Z1154 97.0% 31.8% 6.7% 7.9%
espK / Z1155 98.3% 61.8% 19.6% 12.9%
espK / Z1156 97.4% 31.2% 15.6% 10.1%
espK / Z6065 95.5% 36.8% 8.4% 13.7%
espK / Z1151는 espK 및/또는 Z1151에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / Z1153는 espK 및/또는 Z1153에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / Z1154는 espK 및/또는 Z1154에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / Z1155는 espK 및/또는 Z1155에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / Z1156는 espK 및/또는 Z1156에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / Z6065는 espK 및/또는 Z6065에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄
장출혈성 대장균에서 유전자 마커의 분포
각각의 유전자 마커 espK , Z1151 , Z1153 , Z1154 , Z1155 , Z1156 및 Z6065의 분포는 EHEC 혈청형에 따라 매우 상이했다 (표 8). 흥미롭게도, 상기 유전자 마커 Z6065는 2011년의 독일 대량 발발과 관련된 EHEC O104:H4 (stx 양성, eae 음성, aggR 양성)를 검출할 수 있는 유일한 (unique) 유전자 마커이다.
EHEC O45:[H2] 및 테스트된 19 개의 O121:[H19] 중 18 개에서 존재하지 않는 Z6065 중 어떤 것에서도 검출되지 않은 Z1151를 제외하고는 (5.3%), 다른 모든 조사된 유전자 마커가 상위 7 개 혈청형의 EHEC 균주에서 발견되었다.
하기 OI-43: Z1151 , Z1153 , Z1154 , Z1155 및 Z1156의 유전자 마커 중 하나와 espK를 결합시킴으로써, 상위 7 개의 EHEC 혈청형의 대부분의 EHEC 균주가 검출되었다. 따라서, 어떤 조합의 유전자 마커를 사용하더라도, espK / Z1154 및 espK/Z6065 각각에 음성으로 테스트 된 1 내지 2 개의 EHEC O121:[H19] 균주; espK/Z1154로 검출되지 않은 하나의 O103:[H2] 균주 및 테스트된 모든 유전자 마커의 연관에 음성으로 밝혀진 7 내지 8 개의 EHEC O26:[H11] 균주;를 제외하고는 상위 7 개의 혈청형의 모든 EHEC 균주가 양성으로 테스트 되었다. 따라서, 단지 몇몇의 EHEC 균주만이 본 연구에서 테스트된 유전자 마커와 반응하지 않았다. 이들은 전통적인 EHEC 유형을 대표하지 않는 변종 (aberrant) 균주일 것이다. 이들 입증되지 않은 (anecdotal) 균주의 다른 유전자를 탐색하고 그들의 게놈을 서열 분석하는 것은 그들의 지위와 관련하여 이해를 더욱 명확해지도록 할 것이다. 우리는 이론적으로 특정 혈청형의 모든 구성원이 EHEC일 것임이 반드시 요구되는 것은 아니라고 추정한다.
흥미롭게도, 상위 7 개의 혈청형과 다른 혈청형을 갖는 다른 EHEC 균주는 87.5% 내지 95.5% 범위의 빈도로 매우 잘 검출되었다. 이러한 발견은 유전자 마커의 테스트된 조합이 전형적인 EHEC (stx 및 eae 모두 양성인 대장균 균주) 를 매우 높은 민감도로 검출할 수 있었음을 나타내었다. 유전자 마커 Z6065의 도입은 2011년의 독일 대량 발발에 연관되어 온 EHEC O104:H4 (stx 양성, eae 음성, aggR 양성)를 추가적으로 검출할 수 있도록 허용한다.
유전자
마커		 O26:H11
(n=117)		 O45:H2
(n=19)		 O103:H2
(n=61)		 O111:H8
(n=33)		 O121:H19
(n=19)		 O145:H28
(n=31)		 O157:H7
(n=98)		 기타
EHEC (n=88)
Z1151 105/117 (89.7%) 0/19
(0%)		 44/61 (72.1%) 33/33 (100%) 5/19 (26.3%) 30/31 (96.8%) 91/98 (92.9%) 64/88 (72.7%)
Z1153 107/117 (91.5%) 19/19 (100%) 48/61 (78.7%) 33/33 (100%) 18/19 (94.7%) 31/31 (100%) 91/98 (92.9%) 69/88 (78.4%)
Z1154 87/117 (74.4%) 19/19 (100%) 48/61 (78.7%) 31/33 (93.9%) 15/19 (78.9%) 29/31 (93.5%) 91/98 (92.9%) 68/88 (77.3%)
Z1155 75/117 64.1% 16/19 (84.2%) 41/61 (67.2%) 33/33 (100%) 14/19 (73.7%) 25/31 (80.6%) 97/98 (99.0%) 69/88 (78.4%)
Z1156 106/117 (90.6%) 19/19 (100%) 48/61 (78.7%) 33/33 (100%) 18/19 (94.7%) 31/31 (100%) 91/98 (92.9%) 68/88 (77.3%)
Z6065 18/117 (15.4%) 19/19 (100%) 59/61 (96.7%) 7/33 (21.2%) 1/19 (5.3%) 6/31 (19.4%) 85/98 (86.7%) 47/88 (53.4%)
espK 108/117 (92.3%) 19/19 (100%) 60/61 (98.4%) 33/33 (100%) 17/19 (89.5%) 31/31 (100%) 92/98 (93.9%) 63/88 (71.6%)
espK/Z1151 110/117 (94.0%) 19/19 (100%) 61/61 (100%) 33/33 (100%) 19/19 (100%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 82/88 (93.2%)
espK/Z1153 110/117 (94.0%) 19/19 (100%) 61/61 (100%) 33/33 (100%) 19/19 (100%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 83/88 (94.3%)
espK/Z1154 110/117 (94.0%) 19/19 (100%) 60/61 (98.4%) 33/33 (100%) 18/19 (94.7%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 83/88 (94.3%)
espK/Z1155 113/117 (96.6%) 19/19 (100%) 61/61 (100%) 33/33 (100%) 19/19 (100%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 84/88 (95.5%)
espK/Z1156 110/117 (94.0%) 19/19 (100%) 61/61 (100%) 33/33 (100%) 19/19 (100%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 83/88 (94.3%)
espK/Z6065 109/117 (93.2%) 19/19 (100%) 61/61 (100%) 33/33 (100%) 17/19 (89.5%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 77/88 (87.5%)
espK / Z1151는 espK 및/또는 Z1151에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / Z1153는 espK 및/또는 Z1153에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / Z1154는 espK 및/또는 Z1154에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / Z1155는 espK 및/또는 Z1155에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / Z1156는 espK 및/또는 Z1156에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / Z6065는 espK 및/또는 Z6065에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄
2) 유전자 마커 espK, espV , Z2098 및 UreD
장출혈성 대장균 (EHEC)에 의한 시가 독소 (Stx)의 생산은 출혈성 대장염 (Hemorrhagic colitis, HC) 및 출혈성 요독증 (Hemolytic Uremic Syndrome, HUS)의 원인인 1차적인 독성 특성이지만, Stx를 생산하는 많은 대장균 균주 (STEC)는 HC 및 HUS를 유발하지 않는다. 한 가지 유형 이상의 시가 독소를 생산하는 능력 외에도, 인간 감염에 연관된 STEC 균주는 인류 건강에 중대한 위험을 야기하는 STEC 균주를 심각하고 만연하는 질병과 연관되지 않는 STEC 균주와 구별하는 데 사용될 수도 있는 다른 요인을 갖는다. 그러한 요인을 식별하려는 노력을 통하여, 우리는 인류 건강에 중대한 위험을 야기하는 STEC 균주를 심각하고 만연하는 질병과 연관되지 않는 EPEC 및 STEC 균주와 구별하기 위한 후보로서 게놈 O-아일랜드 OI-43, OI-44, OI-50, 및 OI-57로부터 유래된 특정 nle 유전자의 적합성을 탐색하였다. 우리는 OI-43 및/또는 OI-48에 의해 인코딩되는 ureD (요소분해효소 활성), OI-50에 의해 운반되는 espK (EspK), 경구 접종된 송아지의 장 내에서 EHEC O157:H7의 지속과 관련된 위치에 초점을 두었다 (Vlisidou et al. 2006). 또한, 우리는 Z2098, OI-57로부터 유래된 서열, 인간에 대한 STEC 균주의 증가된 독성과 연관될 수 있는 게놈 아일랜드에 초점을 두었다 (Coombes et al., 2008; Imamovic et al, 2010; Bugarel et al., 2011). EHEC 균주 (EHEC O157:H7, O111, O103 및 O26)의 게놈 서열분석은 또한 질병관 관련한 역할이 평가되지 않은 espV와 같은 다른 유전자 마커를 나타내었다. 이 유전자는 EHEC O157:H7의 OI-44에 위치하지만 다른 대장균 병원군 내에서의 그 분포 정도 (prevalence)는 아직 발표된 바가 없다. 이러한 연구에서, 우리는 인간에서 맹독성을 갖는 STEC 균주와 그들의 연관성을 평가하고 EHEC를 다른 대장균 병원군과 명확하게 구별하는 데 있어서 그들의 적합성을 테스트하기 위하여, 다양한 대장균 병원군 내에서의 ureD, espV, espK , 및 Z2098의 분포를 평가하였다.
재료 및 방법
본 연구에 사용된 대장균 균주 (n=1100)는 주로 상기 연구들에서 기술된 것들이다. EHEC 타입 균주 (n=340)는 stx- 및 eae-유전자의 존재로 정의되었다. STEC 균주 (n=193)는 stx만을 지녔다. EPEC 균주 (n=392)는 eae만을 지녔다. 비병원성 대장균 (n=175)은 stx- 및eae- 음성 균주로서 정의되었다. 세균의 배양 및 DNA의 준비는 전술된 바와 같이 수행되었다.
고 처리용량 실시간 PCR 증폭 또한 전술된 바와 같이 수행되었다.
stx1, stx2 , 및 eae의 PCR 증폭에 사용된 프라이머 및 FAM-표지된 TaqMan® 프로브는 앞서 기술되었다 (Bugarel al. 2010). ureD, espK , Z2098 및 espV를 표적으로 삼기 위하여 사용된 프라이머 및 프로브가 하기 표 9에 열거되었다.
표적
유전자a 		전방 프라이머, 후방 프라이머 및
프로브 서열 (5'-3')		 서열번호 서열 AE005174 내의 위치
espK
(Z1829)		 GCAGRCATCAAAAGCGAAATCACACC
TCGTTTGGTAACTGTGGCAGATACTC
[6FAM]-ATTCAGATAGAAGAAGCGCGGGCCAG-[BHQ]		 42
43
64		 1673422-1673397
1673312-1673338
1673395-16673370
espV
(Z1387)		 TCAGGTTCCTCGTCTGATGCCGC
CTGGTTCAGGCCTGGAGCAGTCC
[6FAM]-CTTGCAACACGTTACGCTGCCGAGTATT-[BHQ]		 44
45
65		 1295446-1295424
1295360-1295382
1295422-1295395
ureD
(Z1142)		 GCAATAATTGACTCTGATTGCC
GCTGCTGCGGTAAAATTTACT
[6FAM] -TACGCTGATCACCATGCCTGGTGC-[BHQ]		 46
47
66		 1078824-1078845
1078892-1078872
1078847-1078870
Z2098 CTGAAAAGAGCCAGAACGTGC
TGCCTAAGATCATTACCCGGAC
[HEX]TAACTGCTATACCTCCGCGCCG[BHQ]		 48
49
67		 1888173-1888193
1888308-1888287
1888286-1888265
a) EDL933에서와 같이 넘버링함
결과
대장균 병원군 내에서 ureD, espV, espK , 및 Z2098와 그들의 조합의 분포
서로 다른 대장균 병원군 가운데 유전자 마커 ureD , espV , espK , 및 Z2098의 분포가 표 10에 나타나 있다. 전반적으로, 조사된 유전자 마커는 대부분 84.4% (espV) 내지 92.4% (espK) 범위의 빈도로 EHEC 균주에서 검출되었다. 이들 마커는 18.1% (ureD) 내지 45.2% (espV) 범위의 빈도를 갖는 EPEC 균주와 덜 연관되었으며, STEC (0.5 내지 3.6%) 및 비병원성 대장균 (0.6 내지 2.9%)에서는 거의 검출되지 않았다. 전반적으로, 우리는 적어도 하나의 조사된 유전자 마커에 대하여 양성으로 테스트된 EPEC 균주의 26.5%가 상위 7 개의 EHEC 혈청형에 속하였음을 관찰하였다. 따라서, espK에 양성인 57/113 EPEC 균주가 상위 7 개의 EHEC 혈청형에 속하였다는 점을 주목할 만하다. 마찬가지로 espV에 대하여 양성인 59/177 EPEC 균주가 상위 7 개의 EHEC 혈청형에 속했다. Z2098에 대하여 양성인 68/91 EPEC와 ureD에 대하여 양성인 58/71 EPEC 균주도 마찬가지로 상위 7 개의 EHEC 혈청형에 속하였다는 점 또한 주목할 만하다. 흥미롭게도, O55:H7, O103:H25 및 O156:H25와 같은 공지의 EHEC 혈청형을 갖는 다른 EPEC 균주 또한 이들 유전자 마커의 적어도 하나에 대하여 양성인 것으로 밝혀졌다 (데이터 미표시). 이러한 발견들은 이러한 분리체들이 EHEC-유사 균주로도 지정된 EHEC의 Stx-음성 유도체일 수 있다는 점을 나타낼 것이다 (Bugarel et al. 2011). 우리는 이러한 분리체들이 그들의 혈청형 및 nle 유전자 내용에 따라 EHEC-유도체였으나 그들은 또한 우리가 아직 EHEC 유도체와 구별하지 못하는 EPEC 균주일 것이라고 추정하였다. 앞으로 전체 게놈 서열분석을 이용한 추가적인 조사가 이들 균주의 정확한 지정을 명확하게 할 것이다.
유전자 마커 ureD , espV , espK , 및 Z2098 중 어떤 것도 그 자체로 신뢰할 만한 정도로 모든 EHEC 균주를 식별할 수 없다. 이러한 유전자 마커의 조합이 최고의 특이성으로 EHEC를 검출하는 것들을 식별하기 위하여 탐색 되었다. 그 결과를 표 10에 나타내었다. 조합으로 그들 유전자 마커는 97.9% (espK/Z2098) 내지 98.8% (espK/ureD) 범위의 빈도로 EHEC와 매우 연관되었다. 동일한 조합이 EPEC 균주를 33.4% (espK/ureD) 내지 54.1% (espK/espV) 범위의 빈도로, STEC 균주를 1.6% 내지 3.6%의 빈도로, 그리고 비병원성 대장균 균주를 1.1% 내지 3.4%의 빈도로 검출하였다.
유전자 마커 EHEC
(n=340)		 EPEC
(n=392)		 STEC
(n=193)		 EC
(n=175)
espK 92.4% 28.8% 0.5% 1.1%
ureD 89.4% 18.1% 3.1% 2.9%
Z2098 87.4% 23.2% 3.6% 1.1%
espV 84.4% 45.2% 1.6% 0.6%
espK / espV 98.5% 54.1% 1.6% 1.1%
espK / ureD 98.8% 33.4% 3.6% 3.4%
espK / Z2098 97.9% 36.7% 3.6% 2.3%
espK / espV는 espK 및/또는 espV에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / ureD는 espK 및/또는 ureD에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK/Z2098는 Z2098 및/또는 espK에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄
EHEC 혈청형 가운데 ureD, espV, espK, espN, Z2098 및 espM1와 그들의 조합의 분포
각각의 유전자 마커 ureD, espV, espK, 및 Z2098의 분포는 EHEC 혈청형에 따른 매우 상이했다. 다양한 EHEC 혈청형에서의 각각의 유전자 마커의 분포가 표 11에 나타나 있다. 어떠한 EHEC O45:[H2]에서도 검출되지 않은 espV를 제외하고는, 조사된 모든 다른 유전자 마커가 71.4% (O103:[H2]에서의 ureD의 분포 정도) 내지 100% 범위의 빈도로, 상위 7 개 혈청형의 EHEC 균주에 매우 널리 분포되어 있다는 점이 밝혀졌다.


유전자
마커
상위 7
EHEC
혈청형

O103:H2

O111:H8

O121:H19

O145:H28

O157:H7

O26:H11

O45:H2		 기타
EHEC
(신규
등장
EHEC)a


전체
EHEC
Z2098 250/277
(90.3%)		 49/49
(100%)		 47/51
(92.2%)		 17/20
(85.0%)		 30/30
(100%)		 49/66
(74.2%)		 44/44
(100%)		 14/17
(82.4%)		 47/63
(74.6%)		 297/340
(87.4%)
espK 269/277
(97.1%)		 48/49
(98.0%)		 51/51
(100%)		 19/20
(95.0%)		 29/30
(96.7%)		 61/66
(92.4%)		 43/44
(97.7%)		 17/17
(100%)		 45/63
(71.4%)		 314/340
(92.4%)
espV 248/277
(89.5%)		 48/49
(98.0%)		 51/51
(100%)		 20/20
(100%)		 30/30
(100%)		 65/66
(98.5%)		 34/44
(77.3%)		 0/17
(0%)		 39/63
(61.9%)		 287/340
(84.4%)
ureD 257/277
(92.8%)		 35/49
(71.4%)		 51/51
(100%)		 16/20
(80.0%)		 30/30
(100%)		 64/66
(97.0%)		 44/44
(100%)		 17/17
(100%)		 47/63
(74.6%)		 304/340
(89.4%)
a) O103:[H25] (n=2), O118:[H16] (n=4), O118:H2, O119:[H25] (n=5), O123:H11, O127:H8s, O145, O145:[H25] (n=5), O156:H21, O156:H25 (n=11), O165:H25 (n=2), O172:[H25] (n=2), O172:NM, O177 (n=2), O177:[H25], O182:[H25], O3, O49:H16, O5 (n=11), O55:[H7] (n=2), O76:H51, O84:H2, Ont:[H2], Ont:H25 (n=2), Or:H16, OX186:[H2].
이들 유전자 마커의 서로 다른 조합에 기초한 상위 7 개의 EHEC 혈청형의 검출이 표 12에 나타나 있다. espK 및/또는 Z2098의 검출은 인간 감염에 연관된 대부분의 EHEC 혈청형을 검출할 수 있게 했다. 따라서, 97.0%의 O157:[H7] 및 95%의 O121:[H19]가 양성으로 테스트 된 반면, 모든 EHEC O111:[H8], O26:[H11], O45:[H2], O103:[H2] 및 O145:[H28] 균주는 espK 및/또는 Z2098에 대하여 양성 결과를 나타내었다. espV 또는 ureD에 대한 espK의 연관성은 상위 7 개의 EHEC 혈청형 중 대부분의 균주를 검출할 수 있게 허용하기도 하였다. 따라서, 혈청형 O157:[H7], O145:[H28], O111:[H8], O103:[H2], O45:[H2] 및 O121:[H19]의 모든 균주가 espK 및/또는 espV에 대하여 양성 결과를 나타내었으며, 97.7%의 O26:[H11]가 espK 및/또는 espV에 대하여 양성 결과를 나타내었다. ureD와 관련하여 espK를 테스트할 때 데이터가 매우 유사했다. 그 경우, 상위 7 개의 EHEC 혈청형의 모든 균주는 espK 및/또는 ureD에 대하여 양성 결과를 나타내었다.


유전자
연관
상위 7
EHEC
혈청형

O103:H2

O111:H8

O121:H19

O145:H28

O157:H7

O26:H11

O45:H2		 기타
EHEC
(신규
등장
EHEC)a

전체
EHEC
espK / espV 276/277
(99.6%)		 49/49
(100%)		 51/51
(100%)		 20/20
(100%)		 30/30
(100%)		 66/66
(100%)		 43/44
(97.7%)		 17/17
(100%)		 59/63
(93.7%)		 335/340
(98.5%)
espK / ureD 277/277
(100%)		 49/49
(100%)		 51/51
(100%)		 20/20
(100%)		 30/30
(100%)		 66/66
(100%)		 44/44
(100%)		 17/17
(100%)		 59/63
(93.7%)		 336/340
(98.8%)
espK / Z2098 275/277
(99.3%)		 49/49
(100%)		 51/51
(100%)		 19/20
(95.0%)		 30/30
(100%)		 65/66
(98.5%)		 44/44
(100%)		 17/17
(100%)		 59/63
(93.7%)		 334/340
(98.2%)
a) O103:[H25] (n=2), O118:[H16] (n=4), O118:H2, O119:[H25] (n=5), O123:H11, O127:H8s, O145, O145:[H25] (n=5), O156:H21, O156:H25 (n=11), O165:H25 (n=2), O172:[H25] (n=2), O172:NM, O177 (n=2), O177:[H25], O182:[H25], O3, O49:H16, O5 (n=11), O55:[H7] (n=2), O76:H51, O84:H2, Ont:[H2], Ont:H25 (n=2), Or:H16, OX186:[H2].
espK / espV는 espK 및/또는 espV에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK / ureD는 espK 및/또는 ureD에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄; espK/Z2098는 Z2098 및/또는 espK에 대하여 양성 결과를 보이는 균주를 나타냄
3) 요약:
상기 연구는 전형적인 EHEC 균주와 특히 인간 감염에 있어서 세계적으로 보고된 일곱 가지의 주요한 EHEC 혈청형에 속하는 것들의 검출에 유용한 유전자 마커 Z1151, Z1153 , Z1154 , Z1155 , Z1156 , Z6065, ureD, espV, espK 및 Z2098를 선별하는 것을 허용했다. 이들 서로 다른 유전자 마커의 분포가 서로 다른 대장균 병원군 가운데서 조사되었으며, 이에 따라 이들 마커의 최적의 서브-조합을 디자인할 수 있게 되었다. 이하 이러한 연구의 결과를 요약하였다.
EHEC 혈청형 가운데서 유전자 마커 ureD, espV, espK, Z2098 , Z1151, Z1153, Z1154, Z1155 , Z1156 및 Z6065가 서로 다른 빈도로 검출되었다. 우리는 EHEC를 검출하는데 있어서 더욱 높은 특이성 및 민감도를 나타내는 최상의 마커의 조합을 조사하기 위하여 이러한 유전자 마커의 다양한 연관을 탐색하였다. 다른 아홉 개의 유전자 마커 중 하나와 유전자 마커 espK의 연관은 대부분의 전형적인 EHEC 균주와 특히 상위 7 개의 EHEC 혈청형에 속하는 것들을 검출하는 것을 허용했다. 유전자 마커 espV, ureD 및 Z2098가 EHEC를 검출하기 위하여 espK와 결합 될 최고의 후보인 것으로 나타났다. 각각 개별적으로 적용했을 때, 그들은 상위 7 개의 모든 EHEC 균주를 검출할 수가 없었으나, 연관시켰을 때 그들은 99.3% 내지 100%의 상위 7 개의 EHEC 균주를 검출하였다. espK를 espV, ureD 또는 Z2098의 어느 것과 연관시키는 것이 더욱 특이적이고 민감도가 높은 EHEC 검출을 위한 최상의 조합임이 증명되었다. 따라서, 인간 감염에서 세계적으로 보고된 7 가지의 주요한 혈청형에 속하는 EHEC 균주의 99.6%에서 espK 및/또는 espV에 대한 양성 결과가 관찰되었다 (단지 하나의 EHEC O26:H11 분리체만이 음성으로 테스트 되었다). 또한, 상위 7 개의 혈청형과 다른 혈청형을 갖는 EHEC의 93.7%가 espK 및/또는 espV에 대하여 양성으로 테스트 되었다. 최종적으로, 하나의 서브세트 (54.1%)의 EPEC 균주만이 espK 및/또는 espV에 대하여 양성인 것으로 테스트 되었다. 대부분의 STEC 및 비독성 대장균 균주는 espK 및 espV 모두에 대하여 음성인 것으로 밝혀졌다. 또 다른 흥미로운 접근은 Z2098에 espK를 연관시키는 것이었다. 이러한 유전자 마커의 조합으로 일곱 개의 주요 EHEC 혈청형에 속하는 99.3%의 EHEC 균주와 상위 7 개의 혈청형과 다른 혈청형을 갖는 93.7%의 EHEC 균주를 검출할 수 있었다. 단지 36.7%의 EPEC, 3.6%의 STEC 및 2.3%의 비병원성 대장균 균주에 대하여만 espK 및/또는 Z2098의 검출이 보고되었다. EHEC를 검출하기 위한 가장 높은 특이성 및 민감도를 갖는 최고의 접근은 espK 및 ureD를 결합시키는 것이었다. 이러한 연관은 상위 7 개 혈청형을 갖는 EHEC 100%와 다른 혈청형을 갖는 EHEC 균주 93.7%를 검출할 수 있도록 하였다. 단지 33.4%의 EPEC, 3.6%의 STEC 및 3.4%의 비병원성 대장균 균주에 대한 espK 및/또는 ureD의 검출이 또한 보고되었다.
이러한 발견들은 espV, ureD 또는 Z2098와 espK의 결합된 검출은 ≥99%의 신뢰도로 세계의 가장 빈번한 임상 예와 관련된 EHEC 혈청형을 식별하기 위한 민감도가 매우 높고 매우 특이적인 접근이라는 점을 나타내었다. 복합 샘플 (식품 또는 배설물 표본)에서 stx와 결합하여 이들 유전자 마커를 검출하는 것은 단지 stx 및 eae를 결합시키는 것보다 더욱 EHEC-표적화된 진단을 제공할 것이다. 흥미롭게도, 검출 전략에 Z6065를 도입하는 것은 유럽에서 발생한 심각하고 가장 광범위한 STEC 발발과 관련되었던 비전형적인 EHEC O104:H4의 검출을 가능하게 한다. 이들 PCR 분석의 신속함을 고려할 때, 이러한 접근은 상위 7 개의 EHEC 감시 및 발발 조사에 주요한 영향을 미칠 것이며, 공중 보건에 유익할 것이다. 또한, 상위 7 개의 EHEC 혈청형을 갖는 것들과 다른 혈청형을 갖는 93.7%의 EHEC 균주에서 이들 유전자 마커 세트를 검출하는 것은 새롭게 등장하는 EHEC 균주를 식별하는 데 도움이 될 것이다.
결론
우리는 병원성 STEC 균주를 특징짓는 유전적 특성을 식별하려는 시도에 있어서 서로 다른 대장균 병원군 (pathogroups)의 독성체 (virulome)를 탐색하기 위하여 고 처리용량 PCR 접근을 사용하였다. EHEC, EPEC, STEC 및 비병원성 대장균 균주를 포함하는 대장균의 대형 패널에서 열 개의 유전자 마커 (Z1151 , Z1153 , Z1154, Z1155 , Z1156 , Z6065 , ureD , espV, espK 및 Z2098)의 분포가 조사되었다. 이들 유전자 마커의 분포는 대장균 병원군 간에 그리고 혈청형에 따라 다양했다.
전반적으로, 다른 아홉 개의 유전자 (Z1151 , Z1153 , Z1154 , Z1155 , Z1156 , Z6065, ureD , espV, 및 Z2098)와 espK의 연관은 인간 감염에 있어서 세계적으로 보고된 일곱 개의 주요한 EHEC의 혈청형에 속하는 EHEC 균주 검출을 위한 최상의 조합을 나타내었다. 이들 발견은 단지 하나의 EPEC 균주의 서브세트만이 교차반응하였고, 대부분의 EHEC 균주의 유전자의 이러한 관련된 조합의 사용은 양성으로 테스트 되었음을 나타내었다. 또한, 그러한 접근법을 사용하였을 때, 단지 매우 적은 STEC 및 비독성 대장균 균주만이 교차 반응하였다. 전형적인 EHEC 균주의 검출과 더불어, espK / Z6065 조합은 2011년에 유럽에서 발생한 HC 및 HUS의 더 큰 만연질병 (epidemy)과 관련된 비전형적인 EHEC O104:H4 (stx 양성, eae 음성, aggR 양성)를 검출가능하게 한다.
참고문헌
Beutin, L., S. Jahn, and P. Fach. 2009. Evaluation of the 'GeneDisc' real-time PCR system for detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O26, O103, O111, O145 and O157 strains according to their virulence markers and their O- and H-antigen-associated genes. J. Appl. Microbiol. 106(4): 1122-1132.
Bugarel M, Martin A, Fach P, Beutin L. 2011. Virulence gene profiling of enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli strains: a basis for molecular risk assessment of typical and atypical EPEC strains. BMC Microbiol. Jun 21;11:142.
Bugarel M, Beutin L, Scheutz F, Loukiadis E, Fach P. 2011. Identification of genetic markers for differentiation of Shiga toxin-producing, enteropathogenic, and avirulent strains of Escherichia coli O26. Appl Environ Microbiol. Apr;77(7):2275-81.
Bugarel M, Beutin L, Martin A, Gill A, Fach P. 2010. Micro-array for the identification of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) seropathotypes associated with Hemorrhagic Colitis and Hemolytic Uremic Syndrome in humans. Int J Food Microbiol. Sep 1;142(3):318-29.
Bugarel M, Beutin L, Fach P. 2010. Low-density macroarray targeting non-locus of enterocyte effacement effectors (nle genes) and major virulence factors of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC): a new approach for molecular risk assessment of STEC isolates. Appl Environ Microbiol. Jan;76(1):203-11.
Cergole-Novella MC, Nishimura LS, Dos Santos LF, Irino K, Vaz TM, Bergamini AM, Guth BE. 2007. Distribution of virulence profiles related to new toxins and putative adhesins in Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from diverse sources in Brazil. FEMS Microbiol Lett. Sep;274(2):329-34. Epub 2007 Jul 25.
Chang, C. 1991 "Branched DNA Amplification Multimers for the Sensitive, Direct Detection of Human Hepatitis Viruses," Nucleic Acids Symposium Series, no. 24: 197-200.
Compton, J. 1991 "Nucleic Acid Sequence-Based Amplification," Nature 350, no. 6313: 91-92.
Coombes BK, Wickham ME, Mascarenhas M, Gruenheid S, Finlay BB, Karmali MA. 2008. Molecular analysis as an aid to assess the public health risk of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli strains. Appl Environ Microbiol. Apr;74(7):2153-60.
Creuzburg K, Middendorf B, Mellmann A, Martaler T, Holz C, Fruth A, Karch H, Schmidt H. 2011. Evolutionary analysis and distribution of type III effector genes in pathogenic Escherichia coli from human, animal and food sources. Environ Microbiol. Feb;13(2):439-52.
Frank C, Werber D, Cramer JP, Askar M, Faber M, an der Heiden M, Bernard H, Fruth A, Prager R, Spode A, Wadl M, Zoufaly A, Jordan S, Kemper MJ, Follin P, Muller L, King LA, Rosner B, Buchholz U, Stark K, Krause G; HUS Investigation Team. Epidemic profile of Shiga-toxin-producing Escherichia coli O104:H4 outbreak in Germany. N Engl J Med. 2011 Nov 10;365(19):1771-80.
Gault G, Weill FX, Mariani-Kurkdjian P, Jourdan-da Silva N, King L, Aldabe B, Charron M, Ong N, Castor C, Mace M, Bingen E, Noel H, Vaillant V, Bone A, Vendrely B, Delmas Y, Combe C, Bercion R, d'Andigne E, Desjardin M, de Valk H, Rolland P. Outbreak of haemolytic uraemic syndrome and bloody diarrhoea due to Escherichia coli O104:H4, south-west France, June 2011. Euro Surveill. 2011 Jun 30;16(26).
Imamovic L, Tozzoli R, Michelacci V, Minelli F, Marziano ML, Caprioli A, Morabito S. 2010. OI-57, a genomic island of Escherichia coli O157, is present in other seropathotypes of Shiga toxin-producing E. coli associated with severe human disease. Infect Immun. Nov;78(11):4697-704.
Karmali, M. A., M. Mascarenhas, S. Shen, K. Ziebell, S. Johnson, R. Reid-Smith, J. Isaac-Renton, C. Clark, K. Rahn, and J. B. Kaper. 2003. Association of genomic O island 122 of Escherichia coli EDL 933 with verocytotoxin-producing Escherichia coli seropathotypes that are linked to epidemic and/or serious disease. J. Clin. Microbiol. 41: 4930-4940.
Levine, M. M. 1987. Escherichia coli That Cause Diarrhea - Enterotoxigenic, Enteropathogenic, Enteroinvasive, Enterohemorrhagic, and Enteroadherent. J. Infect. Dis. 155: 377-389.
Mackay, I. 2007. Real-time PCR in Microbiology, from diagnosis to characterization. Caister Academic Press, Norfolk, UK.
Nataro, J. P. and J. B. Kaper. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiol . Rev . 11: 142-201.
Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., and Hase, T. 2000 Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Research 28, no. 12: E63.
Scheutz F, Nielsen EM, Frimodt-Moller J, Boisen N, Morabito S, Tozzoli R, Nataro JP, Caprioli A. Characteristics of the enteroaggregative Shiga toxin/verotoxin-producing Escherichia coli O104:H4 strain causing the outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, May to June 2011. Euro Surveill. 2011 Jun 16;16(24).
Spears KJ, Roe AJ, Gally DL. 2006. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiol Lett. Feb;255(2):187-202.
Struelens MJ, Palm D, Takkinen J. Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli O104:H4 outbreak: new microbiological findings boost coordinated investigations by European public health laboratories. Euro Surveill. 2011 Jun 16;16(24).
Tobe T, Beatson SA, Taniguchi H, Abe H, Bailey CM, Fivian A, Younis R, Matthews S, Marches O, Frankel G, Hayashi T, Pallen MJ. 2006. An extensive repertoire of type III secretion effectors in Escherichia coli O157 and the role of lambdoid phages in their dissemination. Proc Natl Acad Sci U S A. Oct 3;103(40):14941-6.
Vlisidou I, Marches O, Dziva F, Mundy R, Frankel G, Stevens MP. 2006. Identification and characterization of EspK, a type III secreted effector protein of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. FEMS Microbiol Lett. Oct;263(1):32-40.
Walker, G., Fraiser, M., Schram, J., Little, M., Nadeau, J., and Douglas P. Malinowski, D. 1992 Strand Displacement Amplification-An Isothermal, In Vitro DNA Amplification Technique, Nucleic Acids Research 20, no. 7: 1691-1696.
SEQUENCE LISTING <110> AGENCE NATIONALE DE SECURITE SANITAIRE DE L'ALIMENTATION, DE L'ENVIRONNEMENT ET DU TRAVAIL FACH, Patrick DELANNOY, Sabine BEUTIN, Lothar <120> Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli <130> MJP-ll-F1159-8PCT <150> EP 12171941.3 <151> 2012-06-14 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 334 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 gggtgttcta ccgcaggggc ggggaattct aagtgatatc catcatcgca tccagtgcgc 60 ccggtttatc cccgctgatg cggggaacac agcggcacgc tggattgaac aaatccctgg 120 gccggtttat ccccgctggc gcggggaaca ctttatacac ggatcctgtg tgccgtggac 180 cgccggttta tccccgctgg cgcggggaac acgagctggc gatagccctg aatgaactgg 240 cagacggtta atccccgctg gcgcggggaa cacaaaccga aacacacgat caatccgaat 300 atgagcggtt tatccccgct ggcgcgggga acac 334 <210> 2 <211> 212 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 gggtgttcta ccgcaggggc ggggaattct aagtgatatc catcatcgca tccagtgcgc 60 ccggtttatc cccgctgatg cggggaacac agcggcacgc tggattgaac aaatccctgg 120 gccggtttat 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<212> DNA <213> Escherichia coli <400> 64 attcagatag aagaagcgcg ggccag 26 <210> 65 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 65 cttgcaacac gttacgctgc cgagtatt 28 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 66 tacgctgatc accatgcctg gtgc 24 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 67 taactgctat acctccgcgc cg 22 <210> 68 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 68 tgtaacaccc agacggtcag caacatg 27 <210> 69 <211> 29 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 69 tcacttccag tttctggtga tgttttgat 29 <210> 70 <211> 31 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 70 tgggtgaggt taaaatataa agaacgattg c 31 <210> 71 <211> 31 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 71 taagatattt tctgactttc cgcatgcgct t 31 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 72 aaagagccag cgcagagctg accag 25 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 73 ttcgctggaa gcagagcccg tgc 23 <210> 74 <211> 31 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 74 ctggatgatc tcagtgggcg ttcttatgta a 31 <210> 75 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 75 tcgtcaggca ctgtctgaaa ctgctcc 27 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 76 ggtgaaggag ytggcgaagg cgtc 24 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 77 ccggtggatt tggatgggtt acg 23 <210> 78 <211> 22 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 78 tgtgaacctc tctggcatgg ag 22 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 79 taaagttggt agattgtgac tggc 24

Claims (13)

  1. 샘플 내에 존재하는 것으로 의심되는 장출혈성 대장균 (enterohemorrhagic Escherichia coli , EHEC)의 혈청형(들)을 식별하는 방법으로서,
    상기 방법은, 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 DNA에서, 하기 대장균 CRISPR 서열의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함하는 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법:
    a) EHEC O157:[H7]을 식별하기 위한 것으로서,
    - 하나 이상의 서열의 존재가 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3의 CRISPR 서열; 및/또는
    - 서열의 존재가 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 4의 CRISPR 서열; 중에서 선택되는 CRISPR 서열;
    b) EHEC O145:[H28]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O145:[H28]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 5의 CRISPR 서열;
    c) EHEC O111:[H8]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O111:[H8]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 6의 CRISPR 서열;
    d) EHEC O121:[H19]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O121:[H19]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 7의 CRISPR 서열;
    e) EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 8의 CRISPR 서열;
    f) EHEC O104:[H4]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O104:[H4]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 9의 CRISPR 서열; 및
    g) EHEC O26:[H11]를 식별하기 위한 것으로서, 서열의 존재가 EHEC O26:[H11]의 존재를 나타내는 것인 서열번호 10의 CRISPR 서열.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은 상기 CRISPR 서열을 표적으로 하는 프라이머의 조합을 이용하여 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 DNA의 PCR 분석을 수행하는 단계를 포함하는 것인 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 프라이머의 조합은:
    a) EHEC O157:[H7]를 검출하기 위한 것으로서,
    - 서열번호 1 및 서열번호 2의 CRISPR 서열 모두를 표적으로 하며, 하기 서열:
    GGGAACACAAACCGAAACACA (서열번호 11)
    CTTAGTGTGTTCCCCGCGC (서열번호 12)에 의하여 정의되는 프라이머 세트 및
    - 서열번호 3의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
    GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT (서열번호 13);
    CTTAGTGTGTTCCCCGCGC (서열번호 14)에 의하여 정의되고, 여기에서 적어도 하나의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 프라이머 세트; 및/또는
    - 서열번호 4의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
    GAACACAAACCGAAACACACG (서열번호 15)
    ATAAACCGTCACCAAAACAGTG (서열번호 16)에 의하여 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O157:[H7]의 존재를 나타내는 프라이머 세트로 구성되는 프라이머; 및
    b) EHEC O145:[H28]를 검출하기 위한 것으로서,
    - 서열번호 5의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
    GAACTTGAGCCCTGCCAGAA (서열번호 17)
    ACCGCGATCTTTTCCTACCTG (서열번호 18)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O145:[H28]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트로 구성되는 프라이머; 및
    c) EHEC O111:[H8]를 검출하기 위한 것으로서,
    - 서열번호 6의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
    GTGACCGCCTGTACACGC (서열번호 19)
    CGGATATTTGGGCGTAATACC (서열번호 20)
    CTGCCGCGAGTGGTTTCAC (서열번호 21)에 의해 정의되고, 여기에서 적어도 하나의 서열번호 19 및 서열번호 20 또는 서열번호 19 및 서열번호 21의 프라이머 쌍에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O111:[H8]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트로 구성되는 프라이머; 및
    d) EHEC O121:[H19]를 검출하기 위한 것으로서,
    - 서열번호 7의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
    CGGGGAACACTACAGGAAAGAA (서열번호 22)
    GGCGGAATACAGGACGGGTGG (서열번호 23)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O121:[H19]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트로 구성되는 프라이머; 및
    e) EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]를 검출하기 위한 것으로서,
    - 서열번호 8의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
    GAGTCTATCAGCGACACTACC (서열번호 24)
    AACCGCAGCTCGCAGCGC (서열번호 25)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O103:[H2] 및/또는 EHEC O45:[H2]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트로 구성되는 프라이머; 및
    f) EHEC O104:[H4]를 검출하기 위한 것으로서,
    - 서열번호 9의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 하기 서열:
    GGAACTCACCGAGCGCCG (서열번호 26);
    GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC (서열번호 27)에 의해 정의되고, 여기에서 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O104:[H4]의 존재를 나타내는 것인 프라이머 세트로 구성되는 프라이머; 및
    g) EHEC O26:[H11]를 검출하기 위한 것으로서,
    - 서열번호 10의 CRISPR 서열을 표적으로 하며, 제1 프라이머 세트는 하기 서열:
    ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG (서열번호 28)
    GATAAACCGTGGTACGGAACA (서열번호 29)에 의해 정의되고, 제2 프라이머 세트는 하기 서열:
    TGAAACCACTCGCGGCAGAT (서열번호 30);
    ATAAACCGATCTCCTCATCCTC (서열번호 31)에 의해 정의되며, 여기에서 적어도 하나의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재는 EHEC O26:[H11]의 존재를 나타내는 것인 두 개의 프라이머 세트로 구성되는 프라이머를 포함하는 것인 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법.
  4. 청구항 1 내지 3의 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 샘플이 EHEC O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] 및 O104:[H4] 혈청형 중 적어도 하나의 장출혈성 대장균 (enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)을 함유하는지 여부를 예측하기 위한 전단계를 포함하며,
    상기 방법은 espK 유전자 및 하기: espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, 및 Z6065 중 어느 하나 이상의 표적 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 샘플이 EHEC O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] 및 O104:[H4] 혈청형 중 적어도 하나의 장출혈성 대장균 (enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)을 함유하는지 여부를 예측하기 위한 전단계는 espK 유전자 및 하기: espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, 및 Z6065 중 어느 하나 이상의 표적 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법.
  6. 청구항 4에 있어서,
    상기 샘플이 EHEC O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] 및 O104:[H4] 혈청형 중 적어도 하나의 장출혈성 대장균 (enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)을 함유하는지 여부를 예측하기 위한 전단계는 espK로부터 유래된 프라이머 세트 및 espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 및 Z6065 중 적어도 하나로부터 유래된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머의 조합을 이용하여 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 DNA의 PCR 분석을 수행하는 단계, 및 상기 조합의 각각의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함하는 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법.
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 샘플이 EHEC O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] 및 O104:[H4] 혈청형 중 적어도 하나의 장출혈성 대장균 (enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)을 함유하는지 여부를 예측하기 위한 전단계는 stx1로부터 유래된 프라이머 세트 및 stx2로부터 유래된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머의 조합을 이용하여 상기 샘플 또는 그로부터 분리된 DNA의 PCR 분석을 수행하는 단계 및 상기 조합의 각각의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 더욱 포함하는 장출혈성 대장균의 혈청형(들)을 식별하는 방법.
  8. 청구항 3에 정의된 상기 프라이머 세트를 포함하는 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 키트는 청구항 3에 정의된 상기 각각의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브 (probes)를 더욱 포함하는 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 키트는 espK로부터 유래된 프라이머 세트, 및
    espV로부터 유래된 프라이머 세트, ureD로부터 유래된 프라이머 세트, Z2098로부터 유래된 프라이머 세트, Z1151로부터 유래된 프라이머 세트, Z1153으로부터 유래된 프라이머 세트, Z1154로부터 유래된 프라이머 세트, Z1155로부터 유래된 프라이머 세트, Z1156으로부터 유래된 프라이머 세트, Z6065로부터 유래된 프라이머 세트: 중에서 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트를 더욱 포함하는 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 키트는 청구항 10에 정의된 상기 각각의 프라이머 세트에 대한 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브 (probes)를 더욱 포함하는 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트.
  12. 청구항 8 또는 9에 있어서,
    상기 키트는 stx1 및 stx2를 표적으로 하는 프라이머 세트를 더욱 포함하는 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 키트는 stx1의 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브 및 stx2의 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브를 더욱 포함하는 장출혈성 대장균 (EHEC)의 혈청형(들) 식별용 키트.
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Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
PE20190843A1 (es) 2012-05-25 2019-06-17 Emmanuelle Charpentier Arn de direccion a adn generico
EP3363902B1 (en) 2012-12-06 2019-11-27 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
CA2905432C (en) 2013-03-14 2021-09-14 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
EP3741868B1 (en) 2013-03-15 2024-05-22 The General Hospital Corporation Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
CA2956224A1 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2016087621A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 Qiagen Gmbh Highly specific and sensitive methods for detecting enterohemorrhagic escherichia coli serotypes o157:h7 and/or o145:h28
WO2016115441A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Kansas State University Research Foundation Co-detection and association of multiple genes from the same genome in a sample
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CA2996888A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases
EP4269577A3 (en) 2015-10-23 2024-01-17 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
CN105779584A (zh) * 2015-12-18 2016-07-20 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 大肠杆菌o111检测用的引物和探针组、试剂盒及pcr检测方法
CN105821124A (zh) * 2016-04-06 2016-08-03 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种大肠杆菌 o26、o45、o121血清型三重pcr检测试剂盒及其引物组
IL264565B1 (en) 2016-08-03 2024-03-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
EP3601562A1 (en) 2017-03-23 2020-02-05 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
BR112019021719A2 (pt) 2017-04-21 2020-06-16 The General Hospital Corporation Variantes de cpf1 (cas12a) com especificidade para pam alterada
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN111093714A (zh) 2017-05-25 2020-05-01 通用医疗公司 使用分割型脱氨酶限制不需要的脱靶碱基编辑器脱氨
EP3658573A1 (en) 2017-07-28 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace)
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
US10597714B2 (en) 2017-12-29 2020-03-24 Clear Labs, Inc. Automated priming and library loading device
SG11201903333SA (en) * 2017-12-29 2019-08-27 Clear Labs Inc Automated priming and library loading services
US20190203267A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Clear Labs, Inc. Detection of microorganisms in food samples and food processing facilities
CN108950033B (zh) * 2018-07-26 2022-01-11 江苏省农业科学院 同时检测肠出血性大肠杆菌o45和o145的纳米pcr试剂盒及其应用
WO2020051301A1 (en) * 2018-09-06 2020-03-12 Hygiena, Llc Sequences and their use for detection and characterization of escherichia coli serotype o157:h7
CN111100862B (zh) * 2018-10-26 2023-09-29 厦门大学 一种检测细菌血清型的方法
EP3921417A4 (en) 2019-02-04 2022-11-09 The General Hospital Corporation ADENINE DNA BASE EDITOR VARIANTS WITH REDUCED OFF-TARGET RNA EDITING
WO2020191246A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
GB2614813A (en) 2020-05-08 2023-07-19 Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
CN116903710B (zh) * 2023-09-12 2023-11-14 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 噬菌体靶向蛋白分子及其在鉴定o103抗原血清型的产志贺毒素大肠杆菌中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003062464A2 (en) * 2002-01-23 2003-07-31 Her Majesty, The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Health Major virulence factor detection and verocytotoxin type 2 subtype from clinical e. coli isolates using a one-step multiplex pcr

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002355074A (ja) * 2001-01-24 2002-12-10 Univ Tsukuba 腸管出血性病原性大腸菌ｏ１５７：ｈ７に特異的な核酸分子およびポリペプチド並びにこれらの使用方法
EP2292799A1 (en) 2009-08-11 2011-03-09 Agence Française de Securité Sanitaire des Aliments An assay for determining a molecular risk assessment of stec isolates

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003062464A2 (en) * 2002-01-23 2003-07-31 Her Majesty, The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Health Major virulence factor detection and verocytotoxin type 2 subtype from clinical e. coli isolates using a one-step multiplex pcr

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dorothea Orth et al., International Journal of Hygiene and Environmental Health, 209(6), p.513-520, 2006.*
Marie Bugarel et al., Applied and Environmental Microbiology, 77(7), p.2275-2281, 2011.*

Also Published As

Publication number Publication date
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