CN105821124A - 一种大肠杆菌 o26、o45、o121血清型三重pcr检测试剂盒及其引物组 - Google Patents

一种大肠杆菌 o26、o45、o121血清型三重pcr检测试剂盒及其引物组 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒及其检测方法。本发明所述试剂盒3对引物组能在同一反应体系能进行有效扩增。实验表明，本发明所述含该引物组的检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌O26、O45、O121血清分型检测方法上的不足，可以满足当前大肠杆菌O26、O45 O121血清型分型的检测需求，易于大范围推广应用，适用于食源性致病菌的初筛选，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。

Description

一种大肠杆菌 O26、O45、O121血清型三重PCR检测试剂盒及其引物组
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒及其引物组。
背景技术
大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)通常被称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜(禽)，常引起严重腹泻和败血症。产志贺氏毒素大肠杆菌是重要的食源性致病源，严重危害公共健康。O157:H7可以导致腹泻、出血性肠炎，尿毒血症等临床症状。近年来，产志贺毒素而非O157的大肠杆菌，尤其是被美国农业部称为“theBigSix”的6种大肠杆菌在诸多国家及地区暴发流行，严重威胁人类的健康，越来越受到世界各国的关注。“theBigSix”包括大肠杆菌O26、O45、O103、O111、O121、O145等6种血清型。
据统计，在美国由non-O157STEC引起的患病病例中，有71％是由O26、O45、O103、O111、O121、O145血清型引起的。为了保障人类的健康和牛肉市场的正常供应，2011年9月，美国农业部颁布了一项禁止出售带有大肠杆菌“theBigSix”(O26、O45、O103、O111、O121、O145)牛肉制品的法令。基于我国目前掌握的食源性疾病和风险监测资料，对高危食品(牛肉制品和即食果蔬)和高致病性血清型(O157：H7)进行了严格的规定和限量要求，但未对其他血清型的STEC作明确的要求。有助于开展大肠杆菌O26,O45,O103,O111,O121,O145血清型风险监测和风险评估的检测技术相对滞后。
大肠杆菌抗原复杂，主要有菌体抗原(O)、荚膜抗原(K)、鞭毛抗原(H)和菌毛抗原(F)等，大肠杆菌表面抗原O-抗原是刺激机体产生先天性免疫和获得性免疫的重要毒力因子，在大肠杆菌的致病性过程中起着重要的作用。针对于O抗原的传统血凝试验是检测血清型的主要方法，该方法费时、费力，PCR检测技术在大肠杆菌血清型检测过程得到发展和应用，目前国内，针对O26、O45、O121血清型多重PCR检测方法还未见报道，因此，本发明研究人员研究一种多重PCR检测方法应用于O26、O45、O121血清型的检测，该方法省时、省力、特异性和敏感性高，适用于推广应用。
本发明公开了一种大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒及其检测方法。本发明所述试剂盒3对引物组能在同一反应体系能进行有效扩增。现有技术中虽然也有其它检测试剂盒，但实验表明，本发明所述含该引物组的检测试剂盒及其检测方具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌O26、O45、O121血清分型检测方法上的不足，可以满足当前大肠杆菌O26、O45、O121血清型分型的检测需求，易于大范围推广应用，适用于食源性致病菌的初筛选，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
发明内容
本发明要解决的技术问题寻找一种能够快速、准确、特异性和灵敏性高的大肠杆菌O26、O45、O121血清型的引物组，实现对O26、O45、O121血清型的高通量检测，并组装成试剂盒，便于推广应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测大肠杆菌O26、O45、O121血清型的引物组，包括以下引物，其核苷酸序列分别为：O26-F:5'-TTCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA-3',O26-R:5'-TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG-3'；O45-F:5'-CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC-3',O45-R:5'-TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC-3'；O121-F:5'-ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC-3',O121-R:5'-ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA-3'；
其特异性扩增的目的片段大小分别为：若电泳结果出现159bp条带为大肠杆菌O26血清型；出现241bp条带为大肠杆菌O45血清型；出现632bp条带为大肠杆菌O121血清型。
所述引物组在制备检测大肠杆菌O26、O45、O121血清型试剂盒中的应用。
4.在一些实施例中，所述大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒还含有商品化的2×PCR反应液试剂。
另一方面，本发明还提供所述试剂盒在用于检测大肠杆菌O26、O45、O121血清型的检测方法，大肠杆菌菌液或其DNA提取物作为模板，用所述的O抗原特异性引物进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，电泳结果出现159bp条带为大肠杆菌O26血清型；出现241bp条带为大肠杆菌O45血清型；出现632bp条带为大肠杆菌O121血清型。
所述PCR反应体系为50μL时含有：2×PCRBuffer25μL、终浓度为10uM引物混合液5μL、模板1μL、超纯水19μL。
PCR反应参数：95℃预变性15min；95℃30s，55℃1min30s，72℃1min30s，30个循环；72℃10min。
本发明所述试剂盒在用于检测大肠杆菌O26、O45、O121血清型的方法，包括下列步骤：
1)大肠杆菌模板的制备
将待测大肠杆菌菌株菌液接种至商品化的VIB液体培养基，37℃过夜摇菌，取1mL菌液，分别用煮沸法和商品化细菌基因组提取试剂盒，进行模板制备；
2)特异性引物的制备所述的O抗原特异性引物O26-F、O26-R、O45-F、O45-R、O121-F和O121-R的使用浓度为10uM；引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；
3)PCR反应体系的建立和扩增
取PCR管，分别加2×PCR反应混合液25μL、引物O26-F、O26-R、O45-F、O45-R、O121-F和O121-R混合液5μL、模板1.0μL、超纯水19.0μL，混匀；PCR反应参数：95℃预变性15min；95℃30s，55℃1min30s，72℃1min30s，30个循环；72℃10min；
4)PCR检测结果判定
取10μLPCR产物，点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，120V电压，电泳20min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结果出现159bp条带为大肠杆菌O26血清型；出现241bp条带为大肠杆菌O45血清型；出现632bp条带为大肠杆菌O121血清型。
大肠杆菌经典检测技术是血清凝集试验，缺点是交叉反应多，敏感性低。本发明基于大肠杆菌O抗原基因，设计可以在同一检测体系进行以O26、O45、O121血清型大肠杆菌O抗原基因的特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)判定该菌大肠杆菌的血清型。所述检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌血清型检测方法上的不足，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
附图说明
图1大肠杆菌O26、O45、O121血清型PCR检测
图2大肠杆菌O26、O45、O121血清型PCR检测试剂盒特异性测试
图3以大肠杆菌培养物为模板的PCR检测试剂盒灵敏度测试
图4以大肠杆菌基因组DNA为模板的PCR检测试剂盒灵敏度测试
具体实施方式
下列实施例中所有的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业化途径得到。
实施例1
大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测引物组的设计
设计的3对血清型特异性引物。根据设计的引物组分别扩增159bp、241bp和632bp的O26、O45、O121血清型特异性片段。
2.大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒的制备
(1)大肠杆菌模板的制备
将大肠杆菌菌株接种至VIB液体培养基，37℃增菌过夜。各取1mL菌液，制成模板备用。
(2)特异性引物的制备
本试剂盒检测的大肠杆菌O26、O45、O121血清型特异性引物扩增的目的片段大小分别为：159bp(O26)、241bp(O45)和632bp(O121)。各条引物使用浓度为10uM，引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；可根据如下引物序列人工合成。：O26-F:5'-TTCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA-3',O26-R:5'-TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG-3'；O45-F:5'-CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC-3',O45-R:5'-TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC-3'；O121-F:5'-ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC-3',O121-R:5'-ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA-3'；
(3)PCR反应体系的建立和扩增
取PCR管，取PCR管，分别加2×PCR反应混合液25μL、引物O26-F、O26-R、O45-F、O45-R、O121-F和O121-R混合液5μL、模板1.0μL、超纯水19.0μL，混匀；PCR反应参数：95℃预变性15min；95℃30s，55℃1min30s，72℃1min30s，30个循环；72℃10min；
(4)PCR检测结果判定
取10μLPCR产物，点样于1.5％琼脂糖凝胶电泳板孔中，120V电压，电泳20min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现。
具体判定方法：电泳结果出现159bp条带为大肠杆菌O26血清型(图1第1泳道)；出现241bp条带为大肠杆菌O45血清型(图1第2泳道)；出现632bp条带为大肠杆菌O121血清型(图1第3泳道)。
3.大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒的特异性和敏感性评价
本实施例中对实施例1中制备的大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒特异性、敏感性和重复性等主要特征分别进行了测评。
(1)试剂盒特异性试验
选取大肠杆菌O26、O45、O121、O103、O145、O113、O111、O157、O78、O101、鼠伤寒沙门氏菌(CVCC3384)、肠炎沙门氏菌(CVCC1805)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC519)、鸭沙门氏菌(CAU0118)、禽巴氏杆菌(CVCC493)、鸡毒支原体(CVCC1651)、禽支原体(CVCC274)、金黄色葡萄球菌(CVCC543)、禽波氏菌(ATCC菌株IPDH591-77)、猪2型链球菌。按照试剂盒使用说明操作进行PCR，产物于1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。大肠杆菌O26、O45、O121可扩增到特异性条带，其它菌株的PCR结果均为阴性(如图2)，泳道1-20分别为：O26、O45、O121、O103、O145、O113、O111、O157、O78、O101、鼠伤寒沙门氏菌(CVCC3384)、肠炎沙门氏菌(CVCC1805)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC519)、鸭沙门氏菌(CAU0118)、禽巴氏杆菌(CVCC493)、鸡毒支原体(CVCC1651)、禽支原体(CVCC274)、金黄色葡萄球菌(CVCC543)、禽波氏菌(ATCC菌株IPDH591-77)、猪2型链球菌。
(2)以细菌培养物为模板的试剂盒灵敏度试验
分别接种大肠杆菌O26、O45、O121至VIB液体培养基中，37℃增菌过夜，各取1mL菌液，分别制备菌液，浓度为106CFU/μL、105CFU/μL、104CFU/μL、103CFU/μL、102CFU/μL、10CFU/μL、1CFU/μL。各吸取1μL加入PCR反应体系，按照试剂盒操作说明进行PCR，根据试验结果测定试剂盒的灵敏度。结果表明，本发明建立的大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测方法可以检测出100CFU的O26和O121血清型大肠杆菌，能检测出10CFU的O45血清型大肠杆菌(如图3)。
(3)以细菌基因组DNA为模板的试剂盒灵敏度试验
分别接种大肠杆菌O26、O45、O121至VIB液体培养基中，37℃增菌过夜，各取1mL菌液提取细菌基因组DNA，分别稀释浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、500pg/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL。各吸取1μL加入PCR反应体系，按照试剂盒操作说明进行PCR，根据试验结果测定试剂盒的灵敏度。结果表明，本发明建立的大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测方法可以检测出10pg的O26、O45、O121血清型大肠杆菌基因组DNA(如图4)
通过条件优化，确定了最佳的PCR反应体系和反应参数，组装了大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒。对实验室已保存的阳性菌株进行扩增，均可扩增到特异性条带，而其他细菌标准菌株等对照样品均未扩增到，说明该试剂盒具有很好的特异性。灵敏性检测表明，试剂盒具有较高的灵敏性，其最低检测灵敏度可达到10CFU细菌菌液及10pg细菌基因组DNA。研究结果表明，本发明研制的大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒具有灵敏、特异、快速的优点，为大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测及流行病学调查提供了新的技术手段。
以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于检测大肠杆菌O26、O45、O121血清型的引物组，其特征在于，包括以下引物，其核苷酸序列分别为：
O26-F:5'-TTCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA-3',
O26-R:5'-TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG-3'；
O45-F:5'-CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC-3',
O45-R:5'-TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC-3'；
O121-F:5'-ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC-3',
O121-R:5'-ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA-3'；
任选的，含有或者不含有其它引物。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，大肠杆菌O26、O45、O121血清型特异性引物扩增的目的片段大小分别为：159bp、241bp和632bp。
3.权利要求1或2所述引物组在制备检测大肠杆菌O26、O45、O121血清型试剂盒中的应用。
4.一种含权利要求1或2所述引物组的大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒。
5.根据权利要求4所述的大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒，其特征在于，其还含有商品化的2×PCR反应液。
6.权利要求4-5任意一项所述试剂盒在检测大肠杆菌O26、O45、O121血清型中的应用，其特征在于，所述应用中，采用先将待测大肠杆菌菌液或待测大肠杆菌的DNA提取物作为模板，用所述引物进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若电泳结果出现159bp条带为大肠杆菌O26血清型；出现241bp条带为大肠杆菌O45血清型；出现632bp条带为大肠杆菌O121血清型；优选的，所述的检测是非诊断目的的。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，PCR反应体系为50μL时含有：2×PCRBuffer25μL、各条引物终浓度为10uM引物混合液5μL、模板1μL、超纯水19μL。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，PCR反应参数：95℃预变性15min；95℃30s，55℃1min30s，72℃1min30s，30个循环；72℃10min。
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