CN101967509A - 检测常见牛致病性大肠杆菌的方法、基因芯片及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测常见牛致病性大肠杆菌的方法、基因芯片及检测试剂盒。该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，上述寡聚核苷酸探针包含从主要的与引起牛败血病和腹泻相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因中选取的DNA片段。利用该基因芯片和设计的引物可进行检测，并可制成试剂盒。利用本发明的产品和方法可以达到检测常见的牛致病性大肠杆菌血清型的目的，操作简便，高通量，准确性高，重复性强，对于流行病学研究和诊断具有重要意义。

Description

检测常见牛致病性大肠杆菌的方法、基因芯片及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测大肠杆菌的方法、基因芯片及检测用试剂盒，尤其涉及一种用于检测引起牛败血病和腹泻的大肠杆菌血清型的方法、基因芯片及检测试剂盒

背景技术

大肠杆菌是重要的牛致病菌，能够引起牛败血症、腹泻等疾病，已经成为牲畜业的严重威胁。它是在世界范围内引起幼畜和婴儿腹泻的一类重要的病原菌，每年肠致病性大肠杆菌感染给畜牧业造成了巨大损失，尤其是由它所引起的幼畜腹泻症的发病率和死亡率近年来呈上升趋势。

引起牛败血病和腹泻的大肠杆菌血清型主要有：O78和O35。大肠杆菌O78在许多大肠杆菌导致的病灶中都可以分离到，它可在不同宿主中引起多种肠内或肠外疾病(Ewers，2004)。牛败血病是导致牛高死亡率的原因之一(Dassouli-Mrani-Belkebir，1988；Cherifi，1994；Fecteau，2001)，研究表明大肠杆菌O78与这种病有密切的联系。目前在许多患有腹泻的牛体内也分离得到大肠杆菌O78，也有报道表明O78也可以导致鸟类患病(Ron，2006)，并且可以引起人尿道疾病以及新生儿的脑膜炎(Ron，2006；Mokady，2005)。大肠杆菌O35在几乎所有患有败血病的牛血液内都可以分离到(Linton，1988)。世界范围内报道的由大肠杆菌引起的牛脑膜炎还包括其他的血清型，主要有O15，O26，O86，O115和O119(Orskov，1952；Johnston，1977；Glantz，1967；Fecteau，2001)。在患有腹泻的牛体内或粪便中可以分离到大肠杆菌O8，O9和O101，它们是产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)(Franck，1998)。

国标中检测致病菌的方法多是采用传统的分离培养和生化鉴定的方法，报告检验结果大致需5～7天，加之检验方法繁琐、费时费力，不仅成为检验部门的一项沉重负担，而且越来越不能满足食品安全和日益发展的国际贸易的需要。

传统的大肠杆菌血清学分型方法为免疫法，这种方法虽然操作简单，但费时费力。但由于大肠杆菌的血清型较多(目前仅按O抗原分型就有180多种)，与之对应的抗血清种类一般不全；不同的血清型之间易产生交叉反应；临床分离株常常存在从光滑型向粗糙型的转变，因而容易产生假阴性(Chitrita DebRoy等，2005)；大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难，这些缺点造成免疫学方法灵敏度低、漏检率高、准确性也差。

现在普遍认为传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。分子生物学方法主要包括PCR方法和近几年发展起来的基因芯片技术。PCR方法是比较成熟的方法，快速、简单、敏感，其缺点是一次检测信息量有限，不适用于对大量样品的检测，而发展中的基因芯片技术正可以弥补这些不足。

1997年7月，Affymetrics，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人发明的第6,228,575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。该技术综合运用了分子生物学、集成电路制造、计算机、半导体、共聚焦激光扫描、荧光标记等技术，使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌的鉴定，不仅可以大大简化检测手段，提高检测速度，而且具有高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强等诸多优点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测引起牛败血症及腹泻的大肠杆菌血清型的基因芯片，以弥补传统检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。

本发明的另一目的是提供一种检测引起牛败血症及腹泻的大肠杆菌血清型的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提出一种用于引起牛败血症及腹泻的大肠杆菌血清型检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，这些寡聚核苷酸探针包含从主要的与引起牛败血症及腹泻的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因中选取的DNA片段。

其中，上述从主要的与引起牛败血症及腹泻相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因中选取的DNA片段选自如SEQ ID NO：2-NO：41所示的核苷酸序列；

其中，上述主要的引起牛败血症及腹泻相关的大肠杆菌血清型包括O8、O9、O15、O26、O35、O78、O86、O101、O115和O119。

上述的寡聚核苷酸探针还包含从细菌16s rDNA保守区中选取的DNA片段，其优选为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

其中SEQ ID NO：2-NO：41所示的核苷酸序列为从上述10种主要的与引起牛败血症及腹泻相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因或寡糖单位处理酶基因中选取的DNA片段，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为从细菌16s rDNA保守区中选取的在相关文献中已经报道DNA片段(Nadkarni等，2002)。

其中，上述寡聚核苷酸探针还包含阳性对照探针，上述的阳性对照探针为从细菌16s rDNA保守区中选取的DNA片段。

本发明还提出一种检测引起牛败血症及腹泻相关的大肠杆菌血清型的方法，包括以下步骤：

a.根据与引起牛败血病和腹泻相关的大肠杆菌血清型的O-抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因序列，以及细菌16s rDNA保守区序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；

b.制备待测样品的基因组DNA，使用步骤a中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化靶序列；

c.用荧光素标记步骤b中得到的靶序列；

d.将标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；

e.用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，获得引起牛败血病和腹泻的大肠杆菌血清型。

其中，上述步骤a中所述主要的引起牛败血症及腹泻相关的大肠杆菌血清型包括O8、O9、O15、O26、O35、O78、O86、O101、O115和O119。

上述步骤a所述的用于PCR扩增的引物为选自如SEQ ID NO：42-63所示的核苷酸序列。其中，SEQ ID NO：44-63所示的核苷酸序列为根据上述10种主要的与引起牛败血症及腹泻相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇中糖基转移酶基因或寡糖单位处理酶基因序列设计的引物；SEQ IDNO：42-43为根据文献报道(Dorsch等，1992；Labrenz等，2004)选取的细菌16s rDNA保守区的上、下游引物序列。

本发明还提出一种检测引起牛败血症及腹泻的大肠杆菌血清型的试剂盒，其中包含有上述的基因芯片，即：该基因芯片包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，这些寡聚核苷酸探针包含从主要的与引起牛败血症及腹泻相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因以及细菌16s rDNA保守区中选取的DNA片段。

该试剂盒还包含PCR扩增引物，这些PCR扩增引物选自如SEQ IDNO：42-63所示的核苷酸序列的扩增引物。

该试剂盒，还可以包含杂交盒、杂交液或分析鉴定结果用的判读软件。

由上述的技术方案可见，本发明首次将基因芯片技术引入引起牛败血症及腹泻的大肠杆菌血清型检测领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的检测引起牛败血症及腹泻大肠杆菌血清型和毒力因子的基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到检测常见的引起牛败血症及腹泻大肠杆菌血清型和毒力因子的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，对于流行病学研究和诊断具有重要意义。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为本发明基因芯片的结构外形示意图；

图2为本发明基因芯片的单一点阵探针排布规律示意图(点阵上每一条探针的序列及其功能参见表1)；

图3为利用本发明基因芯片的一个实施例检测10种主要的牛致病性大肠杆菌血清型的Multiplex PCR结果，结果图上面标出了所检测的血清型；

图4A为利用本发明基因芯片的一个实施例检测牛致病性大肠杆菌血清型O8时的杂交结果；

图4B为利用本发明基因芯片的一个实施例检测牛致病性大肠杆菌血清型O9时的杂交结果；

图4C为利用本发明基因芯片的一个实施例检测牛致病性大肠杆菌血清型O15时的杂交结果；

图4D为利用本发明基因芯片的一个实施例检测牛致病性大肠杆菌血清型O26时的杂交结果；

图4E为利用本发明基因芯片的一个实施例检测牛致病性大肠杆菌血清型O35时的杂交结果；

图4F为利用本发明基因芯片的一个实施例检测牛致病性大肠杆菌血清型O78时的杂交结果；

图4G为利用本发明基因芯片的一个实施例检测牛致病性大肠杆菌血清型O86时的杂交结果；

图4H为利用本发明基因芯片的一个实施例检测牛致病性大肠杆菌血清型O101时的杂交结果；

图4I为利用本发明基因芯片的一个实施例检测牛致病性大肠杆菌血清型O115时的杂交结果；

图4J为利用本发明基因芯片的一个实施例检测牛致病性大肠杆菌血清型O119时的杂交结果。

具体实施方式

为进一步说明本发明的用于检测引起牛败血症和腹泻大肠杆菌血清型的基因芯片及其检测方法，特举以下较佳实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。

实施例1探针的设计和制备

1.序列获得：

(1)细菌16s rDNA序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到16s rDNA序列。

(2)大肠杆菌O8，O9，O15，O26，O86的O抗原合成基因簇序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到的5种O抗原血清型大肠杆菌O抗原合成基因簇序列。

(3)大肠杆菌O35，O78，O101，O115和O119的O抗原特异基因序列的获得：大肠杆菌O35，O78，O101，O115和O119的O抗原合成基因簇序列已由本发明人所在单位完成测序。

2.探针设计：

将上述序列导入OligoArray2.0软件中，参照该软件的使用说明进行探针的设计。

在本发明的优选实施例中，选择了43条由OligoArray2.0软件设计的探针，并通过杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，探针SEQ ID NO：1选自细菌16s rDNA的保守区，作为正对照探针。探针编号为NO.2的探针为荧光探针，用于对点阵上的探针进行定位。探针编号为NO.3的探针为多聚T片段，用作负对照探针。

表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及在检测中的作用

3.探针合成：将表1中的探针序列的5’端延长10个T(表1所示的荧光探针序列中没有包含延长的10个T)并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。

4.探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。

实施例2引物的设计和制备

1.序列获得：同前设计探针的序列。

2.设计引物：

将上述序列导入引物设计软件Primer Premier 5.0软件中，参照该软件的使用说明进行引物的设计。

在本发明的优选实施例中，选取了既包含探针又适合Multiplex PCR的用于扩增引起牛败血症和腹泻的主要的大肠杆菌血清型(O8、O9、O15、O26、O35、O78、O86、O101、O115和O119)的引物11对，为适应MultiplexPCR，经生物信息学初筛并通过大量Multiplex PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物。

表2用于10种常见牛致病性大肠杆菌检测的PCR扩增的引物序列

3.引物合成：将表2中的引物序列委托引物合成公司(北京奥科)合成，备用。

实施例3基因芯片制备——芯片点样

1.溶解探针：将实施例1中合成的探针分别溶解于50％DMSO溶液中，稀释使探针的终浓度达到1μg/μl。

2.加板：将溶解好的探针加入384孔板的相应位置，每孔10μl。

3.点样：将如图1所示的57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的洁净的醛基化玻片(CEL Associates，Inc.)放到芯片点样仪(Spotarray 72)的载物台上，使用SpotArray的控制软件(Tele chem smp3 stealty pin)，运行程序，按图2所示的排布方式点在醛基化的玻片上4.5mm×4.5mm的点样区内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的六个点阵区内阵列排布规律相同。点阵区域尺寸3mm×2.25mm，该点阵内点间距250μm，矩阵：12×9，12×250μm＝3mm，9×250μm＝2.25mm，标准片基尺寸：75.5mm×25.5mm×1mm。

4.干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小时。

5.交联：用交联仪(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)600J交联2次。将交联好的芯片放回洁净芯片盒中，备用。

由图2可见，每个点样区内为10(行)×15(列)个探针点。每个位置上固定的探针的序列及其功能见表1。

实施例4利用基因芯片快速检测大肠杆菌血清型

1.提取基因组：将分离到的待测大肠杆菌单菌落用LB培养基，37℃摇床180rpm过夜培养，按照常规提取普通革兰氏阴性菌基因组的方法提取大肠杆菌培养物的基因组DNA。

2.扩增靶序列：各取上述提取到的100ng/μl基因组DNA 1μl加入Multiplex PCR反应混合液中，用于扩增大肠杆菌血清型基因和16s rDNA，PCR反应混合液配方如下表3所示。(注：以下表3-表4中的PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均购自Sangon公司)

表3Multiplex PCR反应混合液配方(30μl体系)

将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

80℃2分钟

95℃10分钟

95℃30秒

54℃45秒

72℃1分钟10秒回到第三步，共35个循环

72℃5分钟

4℃20分钟

Multiplex PCR反应的结果如图3所示。

3.纯化：将上述获得的PCR扩增产物用纯化柱(MILIPORE公司)纯化，具体步骤如下：

(1)将PCR产物转移至纯化柱中，加水补足至400μl。

(2)25℃、6000rpm离心15分钟，丢弃收集管。

(3)将纯化柱转移到新的1.5ml的离心管中，加入25μl的超纯水(MilliQ)，37℃放置5分钟。

(4)将纯化柱倒置放在1.5ml的离心管上，6000rpm离心2分钟，收集产物。

4.标记靶序列：取5μl纯化产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4所示。

表4标记混合液配方

将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

95℃5分钟

95℃30秒

50℃30秒

72℃1分钟回到第二步，共35个循环

72℃5分钟

4℃20分钟

5.烘干：将标记产物置65℃烘箱烘干。

6.杂交：向杂交盒(博奥公司)内预加入70μl ddH₂O以保持湿度。12μl杂交液(配方如下所示)回溶烘干产物并加在实施例三中制备的奶粉及奶制品中常见致病菌检测基因芯片的探针阵列区域，盖上定制的盖片(博奥公司)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，40℃水浴锅中杂交16小时。

7.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。

杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)；6×SSPE

洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS

洗液B：0.05×SSC

洗液C：95％乙醇

8.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下：

软件及版本：GenePix Pro 6.0

official name：575DF35

PMT Gain：550

扫描分辨率：10μm

扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式

用本发明的基因芯片分别检测10株与牛败血症和腹泻相关的大肠杆菌血清型时的杂交扫描结果如图4A-4J所示。

实施例5对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测

对实施例3中制备的用于检测引起牛败血症和腹泻的大肠杆菌血清型基因芯片的特异性进行鉴定如下：

用具有不同血清型的大肠杆菌以及其他细菌来鉴定实施例三中制备的用于引起牛败血症和腹泻大肠杆菌血清型的基因芯片的特异性。在该特异性鉴定试验中，使用了230株菌(包括186株大肠杆菌的标准株、24株已知血清型的大肠杆菌临床分离株以及10株其它种的细菌)利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，均显示了正确的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有良好的特异性。在该特异性鉴定试验中，使用的所有菌株情况见表5。

表5：特异性试验用到的菌株

对实施例3中制备的用于检测引起牛败血症和腹泻的大肠杆菌血清型的基因芯片的灵敏度进行检测如下：

该基因芯片的检测灵敏度经过80次杂交实验的验证，10ng/ml的微量基因组DNA就可保证具有上述血清型的大肠杆菌具有稳定、良好的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有很高的检测灵敏度。

根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。

序列表

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>检测常见牛致病性大肠杆菌的方法、基因芯片及检测试剂盒

<130>9P13002-CN

<160>63

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>基于细菌16s rDNA的保守区设计并人工合成的探针序列

<400>1

ttgtacacac cgcccgtcac accat    25

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O8的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>2

tttgattcag aaaatccttg ctatc    25

<210>3

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<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O8的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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ttttgttgac taactctgct tatac    25

<210>4

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<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O8的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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caatgtttga ctgatgatac tttcc    25

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<213>基于大肠杆菌O8的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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ctactactta cagaaagttg agtgg    25

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<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O9的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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tcgtgtttga ttatgacttt gattg    25

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<213>基于大肠杆菌O9的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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aatcattgat tatcacatcc aaagc    25

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<213>基于大肠杆菌O9的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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taaaagtacg ttactgaaac tgcta    25

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<213>基于大肠杆菌O9的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O15的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O15的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O15的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O26的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O26的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O26的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O26的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O35的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O35的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O35的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O35的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O78的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O78-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O78-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<213>基于大肠杆菌O78的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<210>26

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<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O86的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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cattttctct agcttttgtt caatc    25

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<213>基于大肠杆菌O86的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O86的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

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<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O86的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>29

tattttaaag aaggaggaag tttcg    25

<210>30

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O101的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>30

tatgatcgta gctgttaact tgatc    25

<210>31

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O101的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>31

aaatgctatg gcgaaatttt atgat    25

<210>32

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O101的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>32

ttggtttatt gagattattc gatcg    25

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O101的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>33

ctccaatatt attttctgga acaat    25

<210>34

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O115的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>34

tataatttta tttggtgtgg ggatt    25

<210>35

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O115的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>35

cagtcatcaa tggattagtt acatg    25

<210>36

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O115的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>36

tgctcttttg aagtcattaa gataa    25

<210>37

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O115的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>37

ttatatttta gataggttgg gtgtt    25

<210>38

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O119的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>38

cttttggtct acttttgtaa ggtac    25

<210>39

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O119的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>39

gctgtcacag ttttacctgc tttga    25

<210>40

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O119的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>40

cttctttgta aatacacggt tttat    25

<210>41

<211>25

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O119的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列

<400>41

tataaacgcg ttaaattttc tagtg    25

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>基于细菌16s rDNA的保守区设计并人工合成的上游引物

<400>42

agagtttgat cctggctcag          20

<210>43

<211>20

<212>DNA

<213>基于细菌16s rDNA的保守区设计并人工合成的下游引物

<400>43

ccgtcaattc ctttgagttt          20

<210>44

<211>18

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O8orf469设计并人工合成的上游引物

<400>44

caatcgccag aggcataa            18

<210>45

<211>18

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O8orf469设计并人工合成的下游引物

<400>45

tctggctgcc cttgtgag      18

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O9wzt设计并人工合成的上游引物

<400>46

tgggtgttga aaggcatcaa    20

<210>47

<211>17

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O9wzt设计并人工合成的下游引物

<400>47

cccagaaatc catgctc       17

<210>48

<211>18

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O15wzx设计并人工合成的上游引物

<400>48

attttcacga ggcatagc      18

<210>49

<211>18

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O15wzx设计并人工合成的下游引物

<400>49

aagactcaca atcgcacc      18

<210>50

<211>18

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O26wzx设计并人工合成的上游引物

<400>50

gctaaaattc aatgggcg      18

<210>51

<211>18

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O26wzx设计并人工合成的下游引物

<400>51

acataagcaa ttgcagcg      18

<210>52

<211>20

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O35wzx设计并人工合成的上游引物

<400>52

gtttcccaga taatctcctc        20

<210>53

<211>19

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O35wzx设计并人工合成的下游引物

<400>53

aaataccctg tcactaccg        19

<210>54

<211>18

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O78wzx设计并人工合成的上游引物

<400>54

ggtatgggtt tggtggta        18

<210>55

<211>19

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O78wzx设计并人工合成的下游引物

<400>55

agaatcacaa ctctcggca       19

<210>56

<211>21

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O86wzy设计并人工合成的上游引物

<400>56

gagttatttt ggttcaccct t    21

<210>57

<211>21

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O86wzy设计并人工合成的下游引物

<400>57

tagcccacct atgaatagagc

                           21

<210>58

<211>22

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O101wzm设计并人工合成的上游引物

<400>58

gtgttacttt catatcgtcc ag    22

<210>59

<211>18

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O101wzm设计并人工合成的下游引物

<400>59

atgcaatgcg gtttctac         18

<210>60

<211>20

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O115wzx设计并人工合成的上游引物

<400>60

tctagatggt gttctgaggt       20

<210>61

<211>19

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O115wzx设计并人工合成的下游引物

<400>61

gtccatgacg ataaacctg        19

<210>62

<211>22

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O119wzx设计并人工合成的上游引物

<400>62

gttaacaatc agctcgataa ac    22

<210>63

<211>22

<212>DNA

<213>基于大肠杆菌O119wzx设计并人工合成的下游引物

<400>63

tttgcaagta aacaccctaa ac    22

Claims (10)

1.一种检测常见牛致病性大肠杆菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述寡聚核苷酸探针包含从主要的与引起牛败血病和腹泻相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因中选取的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的从主要的与引起牛败血病和腹泻相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因中选取的DNA片段选自如SEQ ID NO：2-41所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于所述主要的与引起牛败血病和腹泻相关的大肠杆菌血清型包括O8，O9，O15，O26，O35，O78，O86，O101，O115和O119。

4.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸探针还包含从细菌16s rDNA保守区中选取的DNA片段。

5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于所述的从细菌16srDNA保守区中选取的DNA片段为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

6.一种检测引起牛败血病和腹泻的大肠杆菌血清型的方法，其特征在于包括以下步骤：

a.根据与引起牛败血病和腹泻相关的大肠杆菌血清型的O-抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因序列，以及细菌16s rDNA保守区序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；

b.制备待测样品的基因组DNA，使用步骤a中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化靶序列；

c.用荧光素标记步骤b中得到的靶序列；

d.将标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；

e.用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，获得引起牛败血病和腹泻的大肠杆菌血清型。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤a中用于PCR扩增的引物选自如SEQ ID NO：42-63所示的核苷酸序列。

8.一种检测引起牛败血病和腹泻相关的大肠杆菌血清型的试剂盒，其特征包含权利要求1所述的基因芯片。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于还包含选自如SEQ IDNO：42-63所示的核苷酸序列的PCR扩增引物。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，还包括杂交盒、杂交液。

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