CN110106178B - 用于鳗弧菌识别和切割的DNAzyme及筛选方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种用于鳗弧菌特异性识别和RNA切割的DNAzyme，所述的DNAzyme为2条，分别为VAE‑1和VAE‑2。本发明利用磁性分离技术和体外筛选技术筛选得到的RNA特异性切割的DNAzyme。本发明还对该DNAzyme进行了碱基突变改造，共计得到6条具有活性的突变体DNAzymes。本发明还公开了该DNAzyme的筛选用途。本发明提供了多条特异性强，切割能力高，检测线低的鳗弧菌依赖性DNA‑zyme，能够快速、有效的对鳗弧菌进行检测，可广泛的应用于与水产养殖中鳗弧菌病原微生物的快速检测，有效地保护水体免遭该病原菌污染，在水产养殖以及水体防污方面具有广泛的应用价值。

Description

用于鳗弧菌识别和切割的DNAzyme及筛选方法与用途
技术领域
本发明属海洋病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于鳗弧菌特异性RNA切割DNAzyme，本发明还涉及该DNAzyme的筛选方法与用途。
背景技术
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是革兰氏阴性细菌，有鞭毛，能运动。依据血清型分类可分为23种不同的血清型菌株，不同的血清型表现出不同的发病机制，因此具有不同的经济重要性。鳗弧菌是海水中常见菌群，也是海生鱼、淡水生鱼、甲壳类和双壳类等多种水生生物的主要致病菌，其流行区域广泛，引起的水产养殖动物疾病可在世界范围内流行，在至少28个不同的国家中共有90多种易感水生生物，常给水产养殖业造成巨大的经济损失。水生动物极易遭受鳗弧菌感染，恶劣的养殖环境、过度的刺激或体表损伤均可诱发该病的发生。受鳗弧菌感染的宿主所引起的疾病被称为弧菌病，其可引起内外溃疡、腹胀、瘀点、肉腐烂、嗜睡、食欲减退、坏死、红斑、动脉鞘和循环性出血、视觉病变等症状，最终死亡。有研究调查显示，经鳗弧菌侵染的鱼类外部特征变化为：体表局部褪色，背鳍、尾鳍、腹鳍及鳍基部充血发红，肛门肿大，肌肉组织开始溃烂并伴有弥散性出血，体表发黑，鳍部溃烂化脓；解剖学显示其腹腔中含有粘稠状腹水，肠粘膜组织腐烂脱落，部分鱼肝脏坏死。因此，鳗弧菌引起的死亡导致的水产养殖损失极具有破坏性，并且水产养殖量的这种损失每年可造成多达几千万美元甚至更多的财产流失。
DNAzyme是Breaker和Joyce在1994年利用金属离子设计的一种体外筛选技术，该技术主要用于分离催化嵌合在单链DNA分子中的核糖核苷酸剪切的DNA分子，使得该DNA分子在目标金属离子的存在下特异性的作用于基质链。DNAzyme一般是从1013～1016个随机DNA文库中筛选得到的具有RNA特异性切割功能的单链DNA序列。这些用于体外筛选的随机文库两端为固定的引物序列，中间由固定数目的A、T、G、C四种碱基随机排布。在金属离子的作用下，DNAzyme完成催化切割的主要作用机理是：存在于DNA链中的核糖核苷碱基上的磷酸二酯键将与之相毗邻的脱氧核糖核苷碱基上的2’-OH作为亲和集团并攻击磷酸二酯键中的磷原子使其电位发生转变，从而DNA链发生断裂，达到切割的效果。其筛选流程主要包括：随机文库和引物的设计与合成；初始筛选文库的连接与纯化；正筛选(反筛选)；聚合酶链式扩增(PCR)和克隆测序。一般DNAzyme的筛选过程持续4～20个循环(视筛选目标而定)，期间不断引入反筛选以提高所得目标序列的特异性。
目前国内外对鳗弧菌的研究主要体现在其血清型(Serotype)、基因型(Genotype)、产酶特性(Enzyme production)、毒力因子(Virulence factor)及免疫特性(Immune characteristics)等方面的研究。国内外对鳗弧菌的检测方法有很多，例如：间接荧光抗体技术、ELISA技术、聚合酶链反应(PCR)检测等，但大都存在检测时间较长、过程复杂、成本高等问题，不能广泛的应用于基层养殖渔场。目前，DNAzyme的筛选主要集中在金属离子、微生物细胞、蛋白质以及小分子等方面。尽管已有大量的和细菌相关的DNAzyme被研究报道，但将鳗弧菌与DNAzyme切割原理相结合的应用研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的用于鳗弧菌特异性RNA切割的DNAzyme。
本发明的另一个目的是提供所述DNAzyme的筛选方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：本发明是一种鳗弧菌特异性RNA切割的DNAzyme，所述DNAzyme的核苷酸序列为下述中所示的DNA片段的核苷酸序列(5’-3’)中的一种：
VAE-1：
TTTCGCCATCTTAGCGAAGCGGGTGGTATCGCAGATGGGAGCTGAGTAAACGTAGTGACGGTAAGCTT，
VAE-2：
TTTCGCCATCTTCGATGGGTACCGCAGCTGGACCCGATGGTTCGACCCG
TTATAGTGACGGTAAGCTT。
本发明所要解决的技术方案还可以通过以下的技术方案来进一步实现。
以上所述的用于鳗弧菌特异性识别和RNA切割的DNAzyme，其特点是，对VAE-2进行碱基突变改造得到的以下用于鳗弧菌特异性识别和RNA切割的突变体：
VAE-2-M1：
TTTCGCCATCTTCGATGGGTACCGCAGCTGGACCCGATCGTTATAGTGACGGTAAGCTT，
VAE-2-M2：
TTTCGCCATCTTCGATGGGTACCGCAGCTGGACCCATCGTTATAGTGACGGTAAGCTT，
VAE-2-M3：
-TTTCGCCATCTTCGATACCGCAGCTGGATCGTTATAGTGACGGTAAGC
TT-3’，
VAE-2-M4：
TTTCGCCATCTTCGATCCGCAGCTGGATCGTTATAGTGACGGTAAGCTTVAE-2-M5：
TTTCGCCATCTTCGATCGCAGCTGATCGTTATAGTGACGGTAAGCTT。
VAE-2-M6：
TTTCGCCATCTTCTCGCAGCTGAGTTATAGTGACGGTAAGCTT。
以上所述的鳗弧菌特异性切割DNAzyme或者其突变体可以用于鳗弧菌特异性识别和RNA切割。
本发明还公开了一种如以上技术方案所述的鳗弧菌特异性切割DNAzyme的筛选方法，其特点是，其步骤如下：
(1)由上海生工合成含有40个随机碱基的寡核苷酸文库和含有切割位点及生物素标签的引物；
(2)将要检测的鳗弧菌在LB液体培养基中进行培养；
(3)将上述菌悬液进行浓度梯度稀释并涂琼脂板以检测菌体数；
(4)将步骤(2)所得菌体离心，保留上清液即胞外产物；
(5)将初始文库通过PCR反应进行连接，引入切割位点和生物素标签，醇沉法纯化回收；
(6)将步骤(5)所得PCR产物和链霉素包被的磁珠37℃连接30分钟；
(7)连接结束后磁性分离弃去上清，磁珠用亲和素反应缓冲液清洗；
(8)用0.2N的NaOH洗涤磁珠，磁性分离以制备单链；
(9)去离子水清洗磁珠使pH接近于中性；
(10)将等体积的鳗弧菌胞外产物与2×筛选缓冲液混合，37℃孵育切割1小时，磁
性分离，醇沉法回收上清；
(11)PCR扩增步骤(10)所得产物并用于下一轮筛选；
(12)高通量测序和DNA序列分析；
(13)候选DNAzyme活性及性质检测，筛选得到VAE-1和VAE-2。
以上所述的鳗弧菌特异性切割DNAzyme的筛选方法中：对VAE-2的碱基序列突变改造，再进行DNAzyme切割速率测定，得到所述的突变体。
作为本发明进一步的方案：Biotin生物素标签均标记在DNA序列的5’端。
作为本发明筛选方法的进一步优选的技术方案或者技术特征是：所使用的鳗弧菌菌体浓度为4×108CFU每毫升。所有结合和切割反应均在1.5毫升无菌离心管中进行。DNA切割片段浓度测定中使用的仪器为超微量紫外分光光度计(Q5000，美国)。DNAzyme切割荧光强度检测实验的仪器为全波长多功能微孔板检测仪(M1000 Pro，瑞士)。DNAzyme切割和磁性分离的磁珠直径为0.5μm。
本发明通过借助鳗弧菌来筛选基于鳗弧菌特异性的DNAzyme，并以其他菌株为阴性对照对所得的DNAzyme进行特异性和敏感性等性质研究，以期获得基于鳗弧菌的超敏感性和特异性生物传感器，为鳗弧菌的检测和鉴定提供简单、快速、精确的方法，同时为鳗弧菌菌体引起的疾病的诊断与治疗提供实验基础和理论依据。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
本发明提供了多条特异性强，切割能力高，检测线低的鳗弧菌依赖性DNA-zyme，能够快速、有效的对鳗弧菌进行检测，可广泛的应用于与水产养殖中鳗弧菌病原微生物的快速检测，有效地保护水体免遭该病原菌污染，在水产养殖以及水体防污方面具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为本发明在进行体外筛选时对每轮切割片段浓度的检测图；
图2为本发明中高通量测序得到的前10条DNA序列及其占比图；
图3为本发明中所设计的荧光模拟分子信标原理切割图；
图4为本发明中对候选DNA序列的切割活性检测图；
图5为本发明中筛选得到的两条鳗弧菌特异性RNA切割DNAzymes的二级结构模拟图；
图6为本发明中得到的两条具有切割活性的DNAzyme的活性大小比对图；
图7为本发明中对鳗弧菌胞外产物反应浓度优化图；
图8为本发明中DNAzyme切割影响pH优化图；
图9为本发明中筛选缓冲液中Na+、Mg2+浓度优化图；
图10为本发明中不同金属离子对DNAzyme切割活性的检测图；
图11为本发明中对VAE-2DNAzyme具有切割活性的K+、Ba2+浓度优化图；
图12为本发明中以Na+-Mg2+和K+-Ba2+为反应缓冲液时的动力学比较图；
图13为本发明中VAE-2DNAzyme菌种特异性检测图；
图14为本发明中VAE-2DNAzyme敏感性检测图；
图15为本发明中鳗弧菌胞外产物靶标分子性质测定图；
图16为本发明中鳗弧菌胞外产物靶标物分子量测定图；
图17为本发明中VAE-2突变体碱基序列排布图；
图18为本发明中VAE-2及其突变体DNAzyme活性检测对比图；
图19为本发明中VAE-2–M7突变体DNAzyme活性验证图；
图20为本发明中VAE-2及突变体VAE-2–M1 DNAzyme切割速率比对图。
具体实施方式：
下面结合附图和具体实施方式，对本发明进行详细说明。
实施例1，用于鳗弧菌特异性RNA切割的DNAzyme的筛选及性质鉴定：
一、筛选前准备
(1)由上海生工合成含有40个随机碱基的DNA筛选文库及相关体外筛选用DNA序列(5’-3’)：
初始文库：pGGAAGATGGCGAAACATCTT-N40-TAGTGACGGTAAGCTT
引物1：AAGCTTACCGTCACTA
引物2：Biotin-GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAACA
FAM-Substrate：FAM-GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAA
(2)采用LB液体培养基对鳗弧菌进行培养，待其OD接近于1时停止培养，利用梯度稀释涂布法确定每毫升细菌数量。
(3)将所有培养液按1mL的量平均分装到1.5mL的无菌离心管中，室温11000g离心5min，收集上清并于-20℃冰箱保存备用。
(4)所有初始DNA文库及相关引物均需要经过10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(dPAGE)进行纯化。
(5)将随机文库、引物1和引物2按照以下方案进行PCR扩增以制备符合RNA切割要求的初始DNA文库：
50μL的PCR体系包括：1μL随机文库(终浓度为20ng～100ng)，2μL 10μM/L的引物1和引物2，1μL 10mM/L的dNTP混合液，5μL 10×PCR反应预混液，1μL 5U/μL Taq DNA聚合酶，38μL超纯水。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，57.5℃
退火30s，72℃延伸1min，扩增14个循环，最终72℃延伸2min。
(6)通过醇沉法纯化回收所有产物并作为初始筛选文库进行体外筛选。
二、体外筛选
(1)取50μL浓度为50mg/mL的链霉素包被的磁珠(直径0.5μm)于1.5mL无菌离心管中并用500μL亲和素反应缓冲液洗涤磁珠三次。
亲和素反应缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl，0.01％～0.1％
Tween-20，pH 7.5
(2)将500μL用亲和素反应缓冲液溶解的PCR纯化产物(含有生物素标签)与清洗后的磁珠进行混合(此时磁珠浓度为5mg/mL)，将该反应管置于DNA混合仪上37℃连接30min。
(3)利用磁性分离器去除没有结合的DNA(上清)，500μL亲和素反应缓冲液清洗两次。
(4)加入500μL的0.2N NaOH，混合均匀，室温静置2min后进行磁性分离以去除不含生物素的DNA链并重复该步骤1次。
(5)去离子水对磁珠进行多次清洗以确保其pH值维持在7.0左右。
(6)加入150μL鳗弧菌胞外产物混合液(CEM-VA)和等体积的2×筛选缓冲液，混合均匀后置于DNA混合仪上37℃切割反应1h。
2×筛选缓冲液：100mM HEPES，300mMNaCl，30mM MgCl2，0.02％Tween-20，
pH7.0
(7)磁性分离，醇沉法回收反应所得切割片段(上清)，Q5000紫外分光光度计检测浓度。
(8)醇沉产物干燥后经PCR扩增后用于下一轮筛选。
体外筛选DNA切割片段浓度监测如图1所示。
高通量测序分析：
高通量测序有上海生工采用IIIumina公司的Miseq技术完成，共得到4万余条DNA原始序列，根据序列长度和所占百分比由高到低选择了前10条进行分析。
序列占比图如图2所示。
候选DNA序列活性检测：
1、荧光法。依据图3设计方案进行切割结果检测。根据测序结果选择合适的DNA序列进行合成。将3μL 100μM/L的FAM-Substrate，2μL 100μM/L的合成DNA序列(含淬灭集团)和35μL 2×筛选缓冲液混合均匀，90℃变性1min，自然冷却至室温以形成基质-DNAzyme复合物(终浓度为5μM/L)。取2μL 5μM/L DNAzyme复合物，23μL CEM-VA和25μL 2×筛选缓冲液于96孔板中(每个样品含3个平行样)，吹打混合均匀，以不含淬灭集团的DNA作为空白对照，37℃避光切割反应60min。反应结束后利用酶标仪读取各自荧光值变化(激发波长488nm，入射波长520nm)并分别记其荧光值为F(样品组)和F0(空白对照)，根据F/F0的比例大小判断各序列活性的高低(比值越大，活性越高，最大为1)。最终将各反应混合物用尿素终止液终止反应后通过15％dPAGE电泳检测，利用凝胶成像仪进行数据分析并量化切割产物以确定切割率，利用公式Yt＝Yo+a(1-e-kx)进行线性拟合，其中Yt和Yo分别代表在不同的反应时间和反应时间为0时切割片段强度，k代表实时切割比率。
15％dPAGE配方如下：
15％dPAGE储存液 7mL
10％过硫酸铵 32μL
TEMED 5μL
2、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法(15％dPAGE)。
a.添加25μL 2×筛选缓冲液、23μL CEM-VA(OD600>0.7)和2μL 5μM的酶链复合物，混合均匀后37℃避光切割反应60min。
b.向上述反应液中加入5μL 3M的NaOAc和135μL的冰乙醇(100％)，混合均匀后置于-20℃保藏至少1小时。15000g离心20min，清除上清并向沉淀中加入500μL的70％的乙醇(预冷)，15000g再次离心10min。
37℃真空干燥15-30min。
c.15μL去离子水溶解干燥产物并加入5μL 3×尿素终止缓冲液，200V电泳80min。
d.Gel DocTM EZ凝胶成像分析。
检测结果如图4所示。VAE-1和VAE-2表现出活性，其随时间变化的荧光变化与dPAGE检测结果见图6。
二级结构分析：
利用IDT Oligonanlyzer 3.1(https://sg.idtdna.com/UNAFold)寡核苷酸结构分析软件模拟了VAE-1和VAE-2DNA序列的二级结构，结果发现这两条DNAzyme均含有一个特殊的茎环结构(图5)，该茎环上红色部分的序列在VAE-1和VAE-2上高度保守，且似乎这些保守序列在VAE-2结构上排列更为集中。因此，我们猜测该茎环可能与CEM-VA活性区域有关，基于此，我们通过对核心区域进行碱基剔除来判断其是否是靶标结合位点并找出催化区的关键碱基作用位点。
胞外产物浓度优化：
在相同浓度VAE-1的条件下以等体积的不同OD600(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9)值的CEM-VA为横坐标，通过线性曲线方程拟合公式F＝Y0+a*x进行线性曲线拟合，其中F为不同OD600浓度下VAE-2切割片段强度，Y0是OD600为0时所对应的片段强度，a为常数。以切割产物片段荧光比值为纵坐标监测绘制如图7所示对比图。结果显示，随着OD600值的增加切割片段强度也逐渐的加强并与OD600等于0.7时进入平衡期，其相关系R2数为0.9981，说明OD值与切割片段强度之间具有很好的相关性。
切割反应pH优化：
以OD600等于0.7时所对应的CEM-VA浓度为恒量，研究探测不同pH条件下VAE-2切割活性。由于反应液中的Mg2+在碱性环境中易形成沉淀从而影响实验的精确性，因此我们选择pH4.5-8为优化范围。如图8所示，在酸性环境中VAE-2活性较弱或受到抑制(如pH 4.5和5)，而在较高的pH下(如pH 7.5和8)时显示出相对较高的切割活性，因此，我们选择pH 8.0为该DNAzyme反应最佳pH并以此来完成该酶的其他化学性能鉴定。
筛选缓冲液中Na+、Mg2+浓度优化:
DNAzyme在特异性金属离子的存在下能够展现出较强的催化切割活性，不同浓度和比例的金属离子能显著的影响DNAzyme的活性。因此，接下来我们测试了不同Na+和Mg2+浓度(0，30，60,90，120，150，180，210，240，270，300，360，450和600mM)对VAE-2DNAzyme的活性的影响。结果如图9所示，VAE-2DNAzyme的活性随着Na+浓度的增加而不断升高；同时，Mg2+浓度在0至300mM时VAE-2DNAzyme活性呈递增趋势，但其浓度超过300mM时活性急剧降低，这或许可能是DNA序列在高离子浓度下三维结构发生变化所致。随后，我们评估了不同金属离子对切割活性的影响。首先以八种一价金属离子(Li+，Na+，K+，Ag+，Tl+)来进行测试，结果显示只有K+和Li+在1h之内具有明显的切割活性(图10)，且其活性大小排列为K+>Li+>Na+。接下来，在Na+存在下我们测试了不同二价金属离子(Ca2+，Cu2+，Ba2+，Hg2+，Mn2+，Mg2+，Pb2+，Zn2+)对该酶活性的影响。在此之前，我们先判断了VAE-2DNAzyme发生切割时是否需要二价金属离子的辅助，因此我们用EDTA先对反应缓冲液进行预处理，使其二价离子与EDTA形成络合物，随后与VAE-2进行反应，结果证明VAE-2要产生切割作用必须要二价离子的辅助，否则DNAzyme的活性将受到抑制(图10)。检测结果表明在Ca2+、Ba2+和Mn2+存在时VAE-2DNAzyme均具有切割活性，其活性大小排布为Ba2+>Mg2+>Ca2+>Mn2+。我们分析了这些金属离子，发现Li+、Na+
和K+来自一个族，它们在元素周期表中都属于ⅠA家族，其在核外电子排列上具有一定的相似性；Ca2+，Ba2+和Mg2+来自ⅡA族，都是碱土金属。Mn2+是过度金属，此外，已有研究报道Mn2+具有强烈的荧光淬灭效果，因此，在使用荧光计对其检测使可显著的弱化荧光强度。由此可见，除固有的Na+、Mg2+之外还存在其他的更适合于DNA三维结构催化核心区域结合的金属离子。
不同金属离子对DNAzyme切割活性的检测:
为了确定最优的K+、Ba2+反应离子浓度，接下来我们分别研究了不同浓度下K+、Ba2+对VAE-2DNAzyme活性的影响。图11显示600mM和120mM分别是K+、Ba2+最佳反应浓度。此外，在只有Ba2+(无其他金属离子)存在时，VAE-2DNAzyme活性高达69.13％，其活性远高于原始反应缓冲液中的切割活性(Na+-Mg2+组，pH 8.0)。尽管VAE-2的切割活性随着K+浓度的增加而不断的上升，但是在进行荧光实验时高浓度金属离子会干扰荧光值的精确性，因此，我们选择300mM的K+作为辅助金属离子来完成后续实验。
Na+-Mg2+和K+-Ba2+为反应缓冲液时动力学动力学对比：
图12显示了VAE-2DNAzyme分别以Na+-Mg2+组(100mM HEPES,300mM NaCl,300mMMgCl2,pH8.0)和K+-Ba2+组(100mM HEPES,300mM KCl,120mM BaCl2,pH8.0)作为反应缓冲液时在4h内的活性比较。结果证明VAE-2DNAzyme在Na+-Mg2+组缓冲液中具有更好的切割活性，这是因为Mg2+浓度高于Ba2+，此结果与Nicholas R等在2005年的报道一致，即适度高浓度的Mg2+能够稳定脱氧核酶的结构并能提升DNAzyme的切割活性。因此，我们以100mM HEPES,300mM NaCl,300mM MgCl2和pH8.0为最佳切割条件进行后续VAE-2DNAzyme的性质研究。
特异性检测：
本方案以鳗弧菌胞外产物(CEM-VA)的混合物为筛选靶标，因此，除去细菌自身代谢产物之外，培养基成分是影响反应的最大因素，为了消除由培养基引起切割的可能性，我们将DNAzyme和基质链混合物与不含CEM-VA的空白培养基一起温育进行验证。同时，我们也验证了VAE-2在不同细菌CEM中的特异性。如图13所示，结果证明空白培养基不能诱导切割反应(标记LB)，这表明我们的DNAzyme靶标的确来自鳗弧菌细胞外产物。同时，我们还测试了VAE-2在7种细菌中的选择性，这些细菌分别是创伤弧菌、迟钝爱德华氏菌、副溶血性弧菌、杀鲑气单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。结果证明除创伤弧菌能诱导部分切割之外，其余对照菌株均不能诱导切割，而创伤弧菌之所以能诱导切割可能是因为鳗弧菌和创伤弧菌均是海洋细菌，其可能含有某些共同的产物，此外，本实验中以创伤弧菌为反筛选靶标，富集的文库中或许含有能识别这些共有物质的DNA序列，但是在相同的时间内其只能完成有限的切割反应，且鳗弧菌所诱导的切割高于创伤弧菌引起的切割约300％倍(图13A)。同时，我们采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对该数据进行了验证，结果与图13B所述一致。因此，VAE-2DNAzyme对鳗弧菌具有高度特异性，其在经过修饰之后可制备成用于鳗弧菌特异性检测的生物传感器，为今后鳗弧菌的检测提供便利。
敏感性检测：
为了构建用于鳗弧菌特异性检测的VAE-2DNAzyme荧光生物传感器，我们采用梯度稀释法来稀释鳗弧菌初始培养液(4×108cfu/mL)以收集不同浓度下鳗弧菌的胞外产物，从而以此来检测该传感器对鳗弧菌的有效检测范围。首先将不同稀释度的CEM与相同浓度的VAE-2DNAzyme复合物在上述确定的最佳条件下于37℃进行切割反应。参照图3所设计的分子信标生物传感器原理，当有CEM-VA存在时基质链会被切割成两段并促使淬灭集团和荧光集团分离，释放荧光信号。通过多功能全波长酶标仪来实时监测每个样品在1h内的荧光值变化(图14A)。结果表明，随着鳗弧菌浓度从1×103增加到1×108cfu/mL，切割所产生的荧光强度也逐渐增强；同时，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果也显示VAE-2DNAzyme的检测限可低至103cfu/mL(图14B)，也说明该生物传感器可适用于基层养殖区对鳗弧菌的先期检测和预防。
靶标性质及分子量预测:
Yingfu Li等人利用大肠杆菌(E.coli)和艰难梭菌(C.diffcile)进行DNAzyme筛选时发现其胞外产物中与DNAzyme作用的靶标物质类型为蛋白质。因此，为了对CEM-VA中能与VAE-2DNAzyme结合的靶标物进行大致的种类判断，我们首先假设它是一类蛋白质。随后，我们选择用胰蛋白酶对CEM-VA进行预处理，然后再使用这些CEM-VA在上述所确定的最佳条件下与VAE-2DNAzyme进行孵育。通过两种不同方法的检测，结果显示经胰蛋白酶处理后的CEM-VA不能诱导切割(图15)。这证明响应VAE-2DNAzyme的靶标是一种或多种蛋白质。接下来，我们尝试使用不同孔径的离心过滤管来估量该蛋白质的分子量，我们分别使用了10K(1万道尔顿)、30K、50K和100K的离心柱过滤CEM-VA，并将滤液分别于VAE-2进行孵育，结果显示仅100K的滤液可以诱导VAE-2的切割，其他均不能引起切割反应(图16)，该数据显示目标蛋白的分子量在5万道尔顿和10万道尔顿之间。
突变体研究：
VAE-2的催化核心序列含有40个碱基，并形成了两个未配对的loop环和一个成对的发夹结构(图17A)。参考我们先前设想的结构，可以通过去除部分核苷酸来缩减核心序列的碱基数目以便得到更小且具有相对活性的简易DNAzyme。因此，我们首先尝试着删除了VAE-2核心区域的第27之35号碱基并将其命名为VAE-2-M1(图17B)。同时，我们发现如果剔除VAE-2-M1上的第24位碱基G，则第1至4号碱基将与第25至28号碱基配对并形成更简单的二级结构(VAE-2-M2，图17C)。在新形成的结构中含有一个较长的发夹结构，其中含有多个互补配对的重复碱基，因此我们选择性地删除第4至7和21至24号碱基(VAE-2-M3，图17D)；于此，最初VAE-2中的40个碱基已被逐步缩减到22个，接下来，我们继续移除了VAE-2-M3的5号碱基以进一步缩小loop环(VAE-2-M3，图17E)，结构如图17E所示，一个新的长发卡结构出现了，我们继续逐步地去除了多余的碱基，直到形成一个更简单的结构(图17F和G)；最后，我们删除了整个loop环，以此来判断它是否是金属离子或CEM-VA的结合中心图(图17H)。
为了实现这些突变体活性的比较，我们接下来分别采用两种方法测量了它们在100mM HEPES，300mM NaCl，300mM MgCl2，pH8.0反应缓冲液中反应1小时后的活性。结果如图18A、B所示，其中VAE-2-M1、VAE-2-M2和VAE-2-M3的活性均高于原始VAE-2的活性，且活性有高到低排列为：VAE-2-M1>M2≈M3>VAE-2>M4≈M5>M6>M7。同时这些结果还表明，第27号至第35号碱基是多余的，第9号、第24号碱基对VAE-2催化核心区域的金属离子或CEM-VA靶标的结合具有一定的辅助作用。此外，在删除整个loop环之后(VAE-2-M7)，DNAzyme的活性极大的降低，这说明该loop环对整个催化中心有着极为重要的作用，但其荧光检测结果显示仍具有少量的活性(图18A)，为了判断其是否是背景切割所引起的荧光释放，我们采用Ploy-T碱基序列作为对照，采用两种方法对VAE-2-M7进行活性检测。结果显示，VAE-2-M7并没有切割活性(图19)。在突变后，催化核心区域的序列碱基从原来的40个减少到15个。尽管突变后游戏突变体活性略低于原始VAE-2的活性，但其仍然具有活性并通过这些突变掌握了关键碱基的作用位点，这不仅在DNA序列的合成上更加经济，而且有利于该DNAzyme在生物学上的结构和机械学研究。
切割速率对比：
基于以上研究，我们在100mM HEPES，300mM NaCl，300mM MgCl2和pH8.0的条件下分别测定了VAE-2和VAE-2-M1 DNAzyme切割反应动力学(图20)，并通过一级反应速率方程Yt＝Y0+a(1-e-kx)来完成动力学线性曲线拟合，其中Yt和Y0分别代表在给定的反应时间t和时间为0时DNAzyme切割片段强度，k代表反应速率常数。拟合结果表明，VAE-2与VAE-2-M1均具有良性的切割性能，其反应速率常数分别为0.15min-1和0.26min-1，经过碱基剔除后其DNAzyme切割活性提高了约170％倍，该速率表明在特定条件下该DNAzyme可有效的完成对鳗弧菌菌体细胞的检测。
序列表
<110> 淮海工学院
江苏省海洋资源开发研究院（连云港）
<120> 用于鳗弧菌识别和切割的DNAzyme及筛选方法与用途
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttcgccatc ttagcgaagc gggtggtatc gcagatggga gctgagtaaa cgtagtgacg 60
gtaagctt 68
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttcgccatc ttcgatgggt accgcagctg gacccgatgg ttcgacccgt tatagtgacg 60
gtaagctt 68
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcgccatc ttcgatgggt accgcagctg gacccgatcg ttatagtgac ggtaagctt 59
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttcgccatc ttcgatgggt accgcagctg gacccatcgt tatagtgacg gtaagctt 58
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttcgccatc ttcgataccg cagctggatc gttatagtga cggtaagctt 50
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttcgccatc ttcgatccgc agctggatcg ttatagtgac ggtaagctt 49
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttcgccatc ttcgatcgca gctgatcgtt atagtgacgg taagctt 47
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttcgccatc ttctcgcagc tgagttatag tgacggtaag ctt 43

Claims (2)

1.一种用于鳗弧菌特异性识别和RNA 切割的DNAzyme，其特征在于，所述 DNAzyme的核苷酸序列为下述中所示的DNA片段的核苷酸序列中的一种：
VAE-1:
TTTCGCCATCTTAGCGAAGCGGGTGGTATCGCAGATGGGAGCTGAGTAAACGTAGTGACGGTAAGCTT，
VAE-2:
TTTCGCCATCTTCGATGGGTACCGCAGCTGGACCCGATGGTTCGACCCGTTATAGTGACGGTAAGCTT 。
2. 根据权利要求1所述的一种用于鳗弧菌特异性识别和RNA切割的DNAzyme, 其特征在于，对 VAE-2 进行碱基突变改造得到以下用于鳗弧菌特异性识别和RNA切割的突变体：
VAE-2-M1:
TTTCGCCATCTTCGATGGGTACCGCAGCTGGACCCGATCGTTATAGTGACGGTAAGCTT，
VAE-2-M2:
TTTCGCCATCTTCGATGGGTACCGCAGCTGGACCCATCGTTATAGTGACGGTAAGCTT，
VAE-2-M3: TTTCGCCATCTTCGATACCGCAGCTGGATCGTTATAGTGACGGTAAGCTT，
VAE-2-M4: TTTCGCCATCTTCGATCCGCAGCTGGATCGTTATAGTGACGGTAAGCTT，
VAE-2-M5: TTTCGCCATCTTCGATCGCAGCTGATCGTTATAGTGACGGTAAGCTT，
VAE-2-M6: TTTCGCCATCTTCTCGCAGCTGAGTTATAGTGACGGTAAGCTT 。
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Applicant after: Jiangsu Ocean University

Applicant after: MARINE RESOURCES DEVELOPMENT INSTITUTE OF JIANGSU (LIANYUNGANG)

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