KR20140013107A

KR20140013107A - 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140013107A
Application number: KR1020140000646A
Authority: KR
Inventors: 김양훈; 이문종; 이상희; 박재민; 김윤철
Original assignee: 충북대학교 산학협력단; (주)유앤비테크
Priority date: 2014-01-03
Filing date: 2014-01-03
Publication date: 2014-02-04
Also published as: KR101362725B1

Abstract

본 발명은 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 활성을 가짐으로써, 예를 들어 축산품, 가공식품, 유제품, 식수, 조리기구, 수자원 등의 시료에서 비브리오 파라해모라이티쿠스의 생균을 검출하고, 식중독 증의 진단에 유용한 정보를 제공할 수 있다.

Description

비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 앱타머 및 이의 용도{DNA Aptamer Specifically Binding to Surface of Living Cell of Vibrio parahemolyticus and Uses Thereof}

본 발명은 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.

비브리오(Vibrio) 속 중에서 사람에 식중독을 일으키는 원인균으로 알려진 비브리오 파라해모라이티쿠스 (Vibrio parahemolyticus)는 통성 혐기성 그람 음성 간균이며 운동성이 있고 하나 이상의 편모가 있는 특징을 갖는 균이다. 주된 감염경로는 상처나 피부의 연약한 부위를 침투해 감염되거나, 어패류 또는 해산물 등의 섭취로 인한 감염이 될 수 있지만 상처에 의한 감염은 비교적 낮은 편이다. 식중독의 발생은 여름부터 가을까지의 해안 지역의 높은 물 온도에 의해 급속히 증식하여 식중독 비율이 증가하는 경향이 있으며 감염 시 잠복기는 24시간 이내인 것으로 알려져 있다. 증상으로는 인체 감염 시 설사와 함께 메스꺼움, 구토, 복통, 혹은 발열 등의 증상을 3일에서 10일까지 지속적으로 발생시키기도 하며 면역력이 약화된 어린이와 노약자의 경우에는 심각할 경우 복부가 뒤틀리는 듯 한 심한 경련 증상과 함께 탈수와 무기력증으로 사망에 이를 정도로 치명적인 증상을 동반한다. 이러한 장염비브리오의 식중독 원인의 대부분은 용혈독이라 불리우는 독소로 주요 병원인자이다. 이 독소는 적혈구의 세포막에 구멍을 내어 용혈현상을 일으키는 독소로 알려져 있지만 일반 세포의 세포막에도 작용하기 때문에 내장관이나 심장에 작용하게 되면 설사를 일으키거나 중증일 경우 심장독성으로 죽음에 이르게 할 수 있다.

상기한 바와 같이 치명적인 질환을 유발하는 비브리오 파라해모라이티쿠스는 수입 축산, 수입 가공식품 증가, 지구 온난화 및 기상이변으로 인한 국내 평균기온의 상승으로 각종 병원성 미생물에 의한 보건 환경성 질환 발생건수 및 인체 감염 및 공공환경으로의 전염속도가 급속하게 증가가 심각해지고 있다. 이에 수산식품, 수입수산물, 어패류 등 다양한 식품, 식수 등의 환경에 포함된 비브리오 파라해모라이티쿠스를 효과적으로 검출할 수 있는 기술 개발이 요구되고 있다.

종래 식품, 식수 등의 환경에 포함되어 있는 비브리오 파라해모라이티쿠스의 조기 검출 및 확인을 위한 방법으로는 특수배지를 이용한 전통적 배양법, 분자생물학적 PCR 검출법, ELISA 기법 및 항원 항체 등을 이용한 면역분석법 등을 이용한 진단 방법이 이용되고 있다. 이러한 방법들은 검출 효율을 높이기 위해서 샘플 내 DNA 추출 및 목적 미생물 분리, 배양 단계를 거쳐야하는 단점을 가지고 있어 샘플 전처리 후 병원성 미생물의 검출 확인까지 28시간 이상이 소요되며, 결과 해석 시에도 불분명한 경우가 많아 정확한 검출 및 확인을 위해서는 두세 가지의 실험을 병행해야하는 문제로 인해 대량 샘플 처리는 불가능한 단점을 가지고 있다. 따라서 대규모의 시료를 빠르고 간단하게 처리할 수 있는 고효율의 비브리오 파라해모라이티쿠스 검출 시스템 개발이 절실히 요구된다. 이러한 시스템 개발을 통해 바이오센서를 개발하기 위해서는 짧은 응답시간, 특정 물질에만 반응하는 높은 선택도, 소량의 물질도 감지하는 민감도, 화학적 안정도 및 저렴한 비용 등의 조건을 만족해야 하며 본 발명에서는 앱타머를 이용한 연구를 진행하였다.

앱타머는 짧은 길이의 올리고머로 구성되어 자체적인 다양한 삼차원 구조를 형성하게 되는데 이 올리고머 구조체 라이브러리들은 다양한 표적물질들과 구조적으로 결합할 수 있는 능력이 있으며 이 중 표적물질에만 특이적인 앱타머를 선별하는 과정을 거쳐 확보하게 된다. 선별된 앱타머는 서열분석을 통해 서열을 획득하고 화학적 합성 기법을 이용하여 단시간, 저비용으로 대량 생산이 가능하며 한번 제작, 생산 후 동일한 능력을 가지는 앱타머를 지속적으로 생산 가능한 탁월한 장점을 갖고 있다. 뿐만 아니라, DNA로 구성되어 있고 부가적인 화학적 치환 과정을 거쳐 보다 안정성을 부여할 수 있어 주변의 pH와 온도에 매우 안정하며 바이오틴과 같은 화합물을 부착시켜 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발 등 환경, 의료 등 다양한 분야에서 활용될 수 있어 그 가능성이 높이 평가되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 식중독을 유발하는 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)를 생균 상태로 검출하는 사용될 수 있는 DNA 앱타머(aptamer)를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 생균 상태의 비브리오 파라해모라이티쿠스의 생균 표면에 높은 특이도로 결합하는 DNA 앱타머를 합성 및 선별하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 선별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 검출용 조성물 또는 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 검출 방법을 제공하는 것에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 의하면, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 28의 염기서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 상동 올리고뉴클레오타이드이다.

상기한 다른 목적을 위하여, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머를 선별하는 방법을 제공한다: (ⅰ) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, ssDNA 앱타머를 제조하는 단계; (ⅱ) 비브리오 파라해모라이티쿠스를 배양하고 세척하는 단계; (ⅲ) 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균을 이용한 Live Cell SELEX 기법을 통해 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균의 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 의하면, 상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태이다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면 본 발명은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 검출 방법을 제공한다:

(a) 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균을 함유하는 검사 시료와 상기 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균을 확인하는 단계.

본 발명은 식중독을 유발하는 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 살아있는 균의 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 “DNA 앱타머(aptamer)”라 함은 특정 표적물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다.

본 명세서에서 “DNA 앱타머”는 “DNA 올리고뉴클레오타이드”와 혼용하여 사용한다.

본 명세서에서 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 일반적으로 길이가 약 200개미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질이 해당된다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.

상기 "상동 올리고뉴클레오타이드"란 서열번호 1 내지 28의 염기서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 올리고뉴클레오타이드로서 본 발명의 DNA 앱타머 유전자와 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 서열 상동성은 당업계에 공지된 방법으로 분석될 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 표적 물질의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 표적 물질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 생균 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 표적 물질이 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 본 명세서에서 “SELEX 방법”이란 임의적으로 합성된 DNA의 집합에서 특정 물질에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 물질의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 의미한다(Louis et al. 1992. Nature 355, 564-566).

하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 DNA 앱타머는 하기 단계를 통해 선별된다:

(ⅰ) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, ssDNA 앱타머를 제조하는 단계;

(ⅱ) 비브리오 파라해모라이티쿠스를 배양하고 세척하는 단계; 및

(ⅲ) 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균을 이용한 Live Cell SELEX 기법을 통해 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계.

이하, 본 발명의 DNA 앱타머의 선별방법을 보다 상세하게 설명하고자 한다.

(ⅰ) 단계

PCR을 이용하여 랜덤 dsDNA 라이브러리를 증폭한다. 증폭된 무작위 dsDNA 라이브러리에서 ssDNA 만을 증폭하기 위해 비대칭 PCR을 수행한다. 비대칭 PCR은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 10:1 비율, 예를 들면, 동일한 농도(25 μM)에서 정방향 프라이머를 10 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕를 사용하여 PCR을 수행함으로써 단일가닥 DNA를 수득하는 방법이다. ssDNA 앱타머를 선별하는 방법은 예를 들면, PCR 수행시 역방향 프라이머에 바이오틴(biotin)을 부착시켜 dsDNA를 증폭하고, 증폭 산물에 스트렙트아비딘을 처리하여 바이오틴-스트렙트아비딘 복합체를 형성하여 복합체를 선택적으로 제거함으로써 ssDNA 앱타머만을 선별할 수 있게 된다. 제조한 ssDNA 앱타머는 SELEX 방법에 사용하기 위해 ssDNA를 가열하여 변성시킨 후 상온에서 천천히 식혀 3차원 구조를 형성시킨다.

(ⅱ) 단계

비브리오 파라해모라이티쿠스의 생균 표면에 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위해, 비브리오 파라해모라이티쿠스를 배양한다. 생균 상태를 유지하기 위해 비브리오 파라해모라이티쿠스의 배양 조건인 Nutrient broth with 3% NaCl 배지에서 실험을 수행한다.

(ⅲ) 단계.

상기 준비한 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균과 ssDNA 앱타머를 서로 접촉하여 반응시킨 후, 결합하지 않는 ssDNA 앱타머는 세척하여 제거하고 특이적으로 결합하는 ssDNA만을 용출시킨다. 이 단계에서 다른 세균, 예를 들어 그람 음성 균인 대장균과 그람 양성균인 바실러스 균에 결합하는 ssDNA를 제거하는 Negative SELEX 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 최대로 용출되는 최적의 SELEX 라운드를 선택하기 위해 용출된 ssDNA를 나노드랍 방법으로 정량하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에서 최적 SELEX 라운드 중 비브리오 파라해모라이티쿠스와 최적 결합력을 보이는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 최적 SELEX 라운드 선별과 마찬가지로 최적 라운드에서 확보한 앱타머 서열 각각을 모두 확보하여 동일한 농도의 ssDNA로 제작 후 SELEX를 진행한 뒤 나노드랍(Nano-drop)을 이용하여 용리된 앱타머 농도를 나노드랍 방법을 통해 측정함으로써 최적 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면 결합 DNA 앱타머를 선별하였다.

본 발명의 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열번호 1 내지 28에 나타낸 염기서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.

한편, 본 발명의 서열번호 1 내지 28의 앱타머 중 가장 특이성이 높았던 서열번호 1과 13의 2차 구조는 도 4에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.

본 발명의 DNA 앱타머는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열번호 1 내지 28 중 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.

본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 검출용 조성물에 관한 것이다. 하기 본 발명의 구체적인 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 DNA 앱타머는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하므로, 다양한 환경에 존재하는 비브리오 파라해모라이티쿠스의 존재 여부를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 검출용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태일 수 있으며, 또는 DNA 앱타머가 기판 상에 고정화된 마이크로어레이 형태일 수 있다. DNA 앱타머를 칩이나 기판 상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 칩 또는 기판을 스트렙트아비딘(streptavidin)으로 개질하고, DNA 앱타머의 5‘말단은 바이오오티닐화(biotinylation)시킨 후, DNA 앱타머의 바이오틴과 지지체의 스트렙트아비딘과의 결합을 이용하여 고정화하여 사용될 수 있다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균의 검출 방법에 관한 것이다: (a) 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균을 함유하는 검사 시료와 상기 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균을 확인하는 단계.

본 발명의 DNA 앱타머는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 결합하는 능력이 매우 뛰어나므로 DNA 앱타머와 비브리오 파라해모라이티쿠스를 함유할 것으로 예상되는 시료를 접촉시켜 세균을 검출할 수 있다. 상기 DNA 앱타머에 결합된 비브리오 파라해모라이티쿠스의 검출은 DNA 앱타머와 비브리오 파라해모라이티쿠스 결합 복합체를 검출하는 방법에 기초할 수 있다. 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 DNA 앱타머가 형광물질, 예를 들어 플루오레세인(fulorescein), Cy3 또는 Cy5; 방사성물질, 또는 화학물질, 예를 들어 바이오틴(biotin)으로 표지되거나 1차 아민(primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 비브리오 파라해모라이티쿠스가 포함될 것으로 예상되는 시료는 예를 들어 축산품, 가공식품, 유제품, 식수, 조리기구, 수자원을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 활성을 가짐으로써, 예를 들어 축산품, 가공식품, 유제품, 식수, 조리기구, 수자원 등의 시료에서 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균을 검출하고, 식중독의 진단에 유용한 정보를 제공할 수 있다.

도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과와 PCR로만 증폭한 결과를 나타낸다. 레인 1: 100bp DNA size 마커; 레인 2: DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과; 레인 3: PCR 기법으로 증폭한 후, 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 이용하여 ssDNA만을 회수한 결과이다.
도 2는 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면 결합 DNA 앱타머의 제작을 위한 SELEX 과정 중 각 라운드에서 회수된 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면 결합 DNA 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용하여 정량적으로 측정한 결과이다.
도 3은 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정 후 선별된 라운드에서 확보한 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면 결합 DNA 앱타머 후보군들의 1차 (a), 2차 (b) 용리 액을 나노드랍을 이용하여 정량적으로 측정한 결과이다.
도 4는 m-fold 프로그램을 이용하여 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면 결합 DNA 앱타머 VPCA-01과 VPCA-02의 예상 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면 결합 DNA 앱타머를 스트렙트아비딘이 코팅된 Sensor chip SA의 표면에 고정시키고 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균을 결합시키는 과정을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업 계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : DNA 앱타머 풀의 준비

1. primer 및 DNA 앱타머 풀의 합성

비브리오 파라해모라이티쿠스에 특이적으로 결합하는 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면결합 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 양 말단에 앱타머 풀을 쉽게 증폭하기 위한 부위로서 5`-ATACCAGCTTATTCAATT (서열번호 29)의 부위와 3`-AGATTGCACTTACTATCT (서열번호 30) 를 구성하고 중심에는 40개의 연속 랜덤 뉴클레오타이드를 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1의 비율로 가지는 서열의 합성과 이 DNA 라이브러리를 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 단일 가닥 DNA를 회수하기 위해 바이오티닐화된 역방향 프라이머를 바이오니아 (Bioneer, Korea)에 주문 제작하였다 (정방향 프라이머 : 5`-ATACCAGCTTATTCAATT-3`(서열번호 31), 바이오티닐화된 (biotinylated) 역방향 프라이머 : 5`-바이오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3`(서열번호 32)).

2. PCR 기법을 활용한 DNA 앱타머 풀의 증폭

합성한 프라이머 및 40개의 연속 랜덤 서열을 가지는 임의의 DNA 라이브러리를 PCR (Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭하였다. 76bp의 DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성으로는 10X PCR 완충용액 5㎕, 각 2.5 mM dNTP mixture 4㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2㎕, 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2㎕, 주형 DNA 라이브러리 1 - 2㎕, Ex Taq 중합효소 (TaKaRa, Japan) 0.3㎕ (1unit/㎕)와 증류수 34.7-35.7㎕로 구성하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 3㎕를 취하여, 2% 아가로스 젤을 이용하여 정확한 크기인 76bp에서 밴드가 나타나는지 확인하였다. 확인된 DNA는 PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 DNA 앱타머 풀을 회수하였다.

3. DNA 앱타머 풀의 ssDNA 제작 및 정제

상기한 바와 같이 5`에 바이오티닐화된 dsDNA 앱타머 풀을 ssDNA 앱타머 풀로 제작하기 위하여 5`에 바이오티닐화된 dsDNA 앱타머 풀 200㎕를 85℃에서 5분간 끓인 후에 얼음에 신속히 냉각시켰다. 이후에 스트렙트아비딘 아가로스 레진 (Streptavidin agarose resin)을 dsDNA 앱타머 풀의 1/2배인 100㎕를 넣고 상온에서 스트렙트아비딘과 1시간 이상 반응을 유도하였다. 이후에 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 침전시킴으로써 스트렙트아비딘과 바이오틴 결합을 통해 바이오티닐화된 dsDNA 앱타머 풀 중 한쪽 서열을 제거하여 ssDNA 앱타머 풀을 제작하였다. 이후 순수한 ssDNA 앱타머 풀을 확보하기 위하여 상층 200㎕를 새 튜브에 옮겼다. 통상적으로 본 업계에서 사용하는 PCI 처리 및 에탄올 침전 법을 활용하였다. 본 방법은 옮긴 ssDNA 앱타머 풀에 동량의 PCI 200㎕를 처리하고 교반하여 ssDNA에 잔류하는 지질과 단백질을 제거한 후에 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 15분간 수행한 후에 상층 200㎕를 새 튜브에 옮겨 페놀을 제거하였다. 이 후에 에탄올을 DNA양의 3배인 600㎕를 넣고 3M Sodium Acetate를 1/10배인 20㎕ 그리고 1-2㎕의 tRNA를 첨가한 후에 70℃의 초저온 냉동고 (Deep freezer)에 1시간 이상 반응하였다. 그 후에 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 20분간 수행하여 DNA를 침전시키고 상층을 제거한 후에 85℃ Heat block에서 건조시킨 후 증류수 100㎕를 첨가하여 ssDNA 앱타머 풀을 확보하였다.

4. ssDNA 앱타머 풀 확인을 위한 PAGE

스트렙트아비딘과 바이오틴 결합을 통해 회수된 ssDNA 앱타머 풀을 0.5X TBE 아크릴아마이드 젤 (Acrylamide gel) 상에서 전기영동을 하여 확인하였다. 0.5X TBE (Tris-borate-EDTA) 아크릴아마이드 젤의 조성으로는 40% 아크릴아마이드 3.75ml, 10X TBE buffer 0.75ml을 넣고 증류수로 15ml을 채운 후에 10% APS (Ammonium per sulfate) 용액 135㎕, TEMED (Tetramethylethylenediamine) 10.5㎕로 구성하였다. 아크릴아마이드 젤에 ssDNA 앱타머 풀 10㎕와 DNA loading dye 2㎕를 섞어 넣었고 래더마커 (Ladder marker)로는 100bp DNA 마커를 사용하였다. 제작한 PAGE (Poly-acrylamide Gel Electrophoresis)용 ssDNA 앱타머 풀 확인용 아크릴아마이드 젤을 파워서플라이 (Major science, USA) 150V에 45분간 전기영동하였다. 전기영동한 아크릴아마이드 젤은 ETBR solution에 5분간 염색한 후에 Gel-doc (Bio-rad, USA)으로 자외선을 조사하여 관찰하였다. (도 1)

5. DNA 앱타머 풀의 구조 제작

PAGE로 확인한 ssDNA 앱타머 풀은 자체 3차원의 구조를 형성하기 위하여 기 제작 확보한 ssDNA 앱타머 풀 100㎕와 동량의 2X Nutrient broth with 3% NaCl 100㎕를 첨가한 후 85℃로 예열된 Heat block에서 5분간 가열하여 ssDNA 앱타머 풀의 변성을 유도하였다. 변성된 ssDNA는 상온에서 2시간 이상 서서히 식혀 자체 3차원 구조 형성을 유도하였다.

실시예 2 : 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 생균 (Live-cell) 의 준비

1. 비브리오 파라해모라이티쿠스의 배양 준비 및 배양

비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 결합 DNA 앱타머의 제작을 위하여, 비브리오 파라해모라이티쿠스는 배양을 통해 확보하였다. 배양 배지로는 Nutrient broth with 3% NaCl (Difco, USA)를 사용하였으며 37℃ 교반배양기에서 14시간 동안 배양하였다. 또한, 생균 자체에만 결합하도록 배양시 형성되는 타 물질의 제거를 위하여 Tris base 10 mmol/L, NaCl 0.85%, pH 8.0 조성의 세척용액을 사용하여 배양된 비브리오 파라해모라이티쿠스를 세척하였다. 세척방법은 배양된 비브리오 파라해모라이티쿠스를 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 비브리오 파라해모라이티쿠스를 침전시키고 상층을 제거하였다. 그 후에 세척 용액 200㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 비브리오 파라해모라이티쿠스의 표면을 세척하고 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 비브리오 파라해모라이티쿠스를 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복하여 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면을 세척하였다.

2. Negative selection 진행을 위한 타세균 배양 및 확보

비브리오 파라해모라이티쿠스에 특이적으로 결합하는 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군 중에 다른 균주에도 결합하는 비특이적인 앱타머 후보군을 제거하기 위하여 대장균과 바실러스를 이용한 negative selection을 수행하였다.

2-1. 대장균 ( E. coli )의 배양 및 확보

Negative selection 대상 균주인 대장균의 배양배지로는 LB broth를 사용하였다. LB broth 5ml에 균을 접종하여 37℃에서 12시간동안 배양하였다. 그 후에 배양된 대장균을 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 그 후에 세척 용액 200㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 대장균의 표면을 세척하고 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기 과정을 3회 반복하여 대장균 표면을 세척하였다.

2-2. 바실러스 서브틸리스 ( B. subtilis )의 배양 및 확보

Negative selection 대상 균주인 바실러스 서브틸리스의 배양배지로는 LB broth를 사용하였다. LB broth 5ml에 바실러스 서브틸리스를 접종하여 37℃에서 12시간동안 배양하였다. 그 후에 배양된 바실러스 서브틸리스를 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 그 후에 세척 용액 200㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 바실러스 서브틸리스의 표면을 세척하고 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복하여 바실러스 서브틸리스 표면을 세척하였다.

2-3. 리스테리아 모노사이토제네스 ( L. monocytogenes )의 배양 및 확보

SPR 측정시 비특이적으로 결합하는 앱타머를 제거하기 위한 균주인 리스테리아 모노사이토제네스의 배양배지로는 NA broth를 사용하였다. NA broth 5ml에 리스테리아 모노사이토제네스를 접종하여 37℃에서 12시간동안 배양하였다. 그 후에 배양된 리스테리아 모노사이토제네스를 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 그 후에 세척 용액 200㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 리스테리아 모노사이토제네스의 표면을 세척하고 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복하여 리스테리아 모노사이토제네스 표면을 세척하였다.

2-4. 비브리오 피셔리 ( V. fischeri )의 배양 및 확보

SPR 측정시 비특이적으로 결합하는 앱타머를 제거하기 위한 균주인 비브리오 피셔리의 배양배지로는 LBS broth를 사용하였다. LBS broth 5ml에 비브리오 피셔리를 접종하여 37℃에서 12시간동안 배양하였다. 그 후에 배양된 비브리오 피셔리를 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 그 후에 세척 용액 200㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 비브리오 피셔리의 표면을 세척하고 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복하여 비브리오 피셔리 표면을 세척하였다.

실시예 3 : 비브리오 파라해모라이티쿠스와 특이적으로 결합하는 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면결합 앱타머의 제작

1. 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 선별 및 확보

상기의 실시예 2를 통해 세척한 생균과 자체 3차원 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 풀 200㎕를 넣고 Thermo mixer (Eppendorf, USA) 4℃, 500rpm으로 1시간동안 반응시켰다. 이 후 튜브를 꺼내 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행함으로서 ssDNA 앱타머 풀이 결합되어 있는 비브리오 파라해모라이티쿠스를 침전시키고 상층을 제거하였다. 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 결합 DNA 앱타머는 비브리오 파라해모라이티쿠스의 무게에 의해 침전되고, 결합되지 않은 ssDNA 앱타머들은 상층에 남아 제거하였다.

침전된 비브리오 파라해모라이티쿠스와 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 결합 DNA 앱타머 후보군 중 비브리오 파라해모라이티쿠스와 결합하지 않은 ssDNA 앱타머 풀을 제거하기 위하여 세척용액 200㎕를 첨가하여 파이펫팅한 후에 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 비브리오 파라해모라이티쿠스를 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복하여 비브리오 파라해모라이티쿠스에 비특이적으로 결합한 ssDNA 앱타머 풀을 제거하였다. 이 후에 침전물에 10 mM Tris (pH 7.5), 1mM EDTA로 구성된 DNA 앱타머 용출 용액 100㎕를 첨가하였다. 그 후에 85℃로 예열된 Heat block에 5분간 반응시킨 후 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 비브리오 파라해모라이티쿠스를 침전시키고 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 특이 결합 DNA 앱타머가 용리되었을 상층은 새 튜브에 옮겨 비브리오 파라해모라이티쿠스에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군을 회수하였다. 상기의 과정을 2회 반복하여 DNA 앱타머 풀 각 100㎕를 회수하였다.

2. 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 정제 및 용리 농도 측정

비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 특이 결합 DNA 앱타머 풀에 잔류하는 단백질과 지질을 제거하고 DNA만을 회수하기 위하여 업계에서 통상적으로 사용되는 PCI 및 에탄올 침전법을 사용하였다. 회수한 각 DNA 앱타머 풀 100㎕에 PCI 용액 100㎕를 각각 처리하여 섞어주었다. 이 후 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 15분간 수행한 뒤에 상층 100㎕를 새 튜브에 옮겼다. 이 후에 에탄올 (100% Ethanol) 300㎕를 넣고 3M Sodium acetate 10㎕ 그리고 1㎕의 tRNA를 첨가한 후에 70℃의 초저온 냉동고 (Deep freezer)에 1시간 이상 반응하였다. 그 후에 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 20분간 수행하여 DNA를 침전시키고 상층을 제거한 후에 85℃ Heat block에서 건조시킨 후 증류수 50㎕를 각각 첨가하여 용출된 DNA 앱타머 풀을 확보하였다. 확보한 DNA 앱타머 풀 1㎕를 Nano-drop에서 측정하여 DNA 농도를 확인하였다.

실시예 4 : 비브리오 파라해모라이티쿠스와 최적 결합력을 보이는 DNA 앱타머 후보군의 선별

1. 각 round DNA 앱타머 풀의 선별 및 확보

상기 기술한 방법을 이용하여 각 round의 용리 DNA 앱타머 풀을 이용하여 ssDNA를 제작한 후에 확보한 각 round의 ssDNA 앱타머 풀 50㎕를 상기 기술한 방법과 동일한 방식으로 제작한 비브리오 파라해모라이티쿠스의 침전물에 넣고 Thermo mixer (Eppendorf, USA) 4℃, 500rpm으로 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 튜브를 꺼내 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 구조 형성 ssDNA 앱타머 풀이 결합되어 있는 비브리오 파라해모라이티쿠스를 침전시키고 상층을 제거한 후에 세척용액 200㎕를 넣어 파이펫팅한 후에 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 상층을 제거하여 세척하는 과정을 3회 수행하고 용출용액 100㎕를 넣어 85℃에서 5분간 가열한 후에 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 각 round의 용출된 DNA 앱타머를 확보하였다.

2-1. Nano-drop을 이용한 각 round 용리 DNA 앱타머 풀의 분석

각 round의 DNA 앱타머 풀에 잔류하는 단백질과 지질을 제거하고 DNA만을 회수하기 위하여 당 업계에서 통상적으로 사용하는 PCI 및 에탄올 침전법을 사용하여 정제하였다. 확보한 각 round의 DNA 앱타머 풀 1㎕를 Nano-drop으로 측정하여 DNA 농도를 확인해 2번의 Negative selection이 끝난 후 가장 농도가 높은 round인 8 round의 앱타머 후보군을 선별하였다. (도 2 참고)

2-2. Real-time PCR을 이용한 각 round 용리 DNA 앱타머 풀의 분석

Nano-drop으로 측정된 용리 DNA 앱타머 후보군의 보다 심층적인 분석을 위하여 Real-time PCR을 이용한 분석법을 이용하였다. 초기의 DNA 앱타머 풀과 Negative selection 이후의 round인 7, 8, 9 round를 각각 1/1, 1/10, 1/100 농도로 희석하여 진행하였다. 분석 결과 8 round의 1/1의 농도에서 가장 효율이 좋은 것으로 판단되었다.

Sample	Efficiency (%)	C(t)
0 round 1/1	68.42	13.72
0 round 1/10	79.25	14.59
0 round 1/100	63.67	15.96
7 round 1/1	93.81	8.73
7 round 1/10	81.35	12.63
7 round 1/100	85.52	14.86
8 round 1/1	99.56	7.68
8 round 1/10	81.73	11.73
8 round 1/100	79.90	15.86
9 round 1/1	92.98	7.95
9 round 1/10	78.51	12.71
9 round 1/100	71.08	17.31

실시예 5 : 선별된 round에서 비브리오 파라해모라이티쿠스에 특이적으로 결합하는 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면결합 DNA 앱타머 후보군 분석

1. DNA 앱타머 후보군 확보를 위한 T- vector cloning 수행 및 선별

선별된 8 round에 대한 DNA 앱타머 후보군 확보를 위하여 8 round DNA 앱타머 풀의 증폭을 위한 반응 조성으로는 10X PCR 완충용액 5㎕, 각 2.5 mM dNTP mixture 4㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2㎕, 역방향 프라이머 2㎕, 주형 DNA 라이브러리 1 - 2㎕, Ex Taq 중합효소 (TaKaRa, Japan) 0.3㎕ (1unit/㎕)와 증류수 34.7- 35.7㎕로 구성하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. 증폭시킨 DNA 앱타머를 T-vector cloning kit (Solgent, Korea)를 이용하여 T-blunt vector 1㎕, 6X cloning buffer 1㎕, PCR 산물 4㎕의 조성으로 25℃에서 10분간 ligation을 실시한 후에 Competent cell (E. coli DH5α) 100㎕에 6㎕를 넣고 20분간 얼음 안에서 반응시켰다. 그 후에 열충격법을 이용하여 42℃에서 30초간 반응시켜 형질전환하였고 앰피실린(ampicillin, 50㎍/㎖), 카나마이신(kanamycin, 50㎍/㎖), X-gal(50㎍/㎖), IPTG (5㎍/㎖)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 스프레딩하여 배양하였다. 배지에 배양되어 자란 콜로니 중 흰색 콜로니 31개를 선별하여 각각 앰피실린과 카나마이신이 첨가된 LB broth 5ml에 접종한 후 플라스미드 DNA prep kit (Intron, USA)을 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 확보한 각 콜로니에 대한 플라스미드 DNA는 Solgent (Korea)에 의뢰하여 서열분석을 의뢰하였다.

2. clustal-X를 통한 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군 서열 간의 그룹핑

각 콜로니들에 대한 서열 중에서 클로닝을 통해 삽입된 DNA 앱타머 서열을 확인하고 나열하여 Clustal-X 프로그램을 이용해 분석하였다. 각 서열에 대한 그룹을 형성하여 각 서열간의 서열 유사도를 분석하고 동일 서열 3개를 포함한 26개로 그룹핑된 28개의 서열을 확보하였다. (표 2 참고)

Group	Sequence	서열번호	Size (bp)	Clone
Group-1	CATACCAAGGCTACCGAGGTTCCAGATATTGGCCGCTATG	1	40	2
Group-2	CCACGTTTCCACGTATCCTCGGAGCTTGCTTAACCGTACG	2	40	2
Group-3	TGCGTAGTTCTTTTAACAACCATTCAGCGTATTTTCGTGG	3	40	2
Group-4	CCCTCGGCGTAACTAGTACCGTTGCACCACCAACGTGATT	4	40	1
Group-5	CGCAAGGGATTTCGGACCGGGCTTGGTCACACACAGAGCA	5	40	1
Group-6	CCAGCAGTGGGGCATGGGGGAACGATAAGATTATAAGGGGG	6	41	1
Group-7	CACGCAAGCAGAAGCCACTCCCCCTGGTCGTACTATTTAG	7	40	1
Group-8	CACAGGCGTACCACTGCCCCAACGATCCTTTTGGTTACCG	8	40	1
Group-9	GTCGGAGAGCCTGGCCGTCTGCTCGTAAGTACTATCATAGC	9	41	1
Group-10	TGGAGAAGCGGCAGTTGATGCCTGGTACCCGTCTGCTACG	10	40	1
Group-11	CGTAAAGGACGCTGCCATGAATGTGCTATCCAAGCCTGGG	11	40	1
	CGTAAAGAACGCTGCCATGAATGTGCTATCCAAGCCTGGG	12	40
	CGTAAGAACGCTGCCATGAATGTGCTATCCAGGCCTGGG	13	39
Group-12	CAACGGAGGGAAGTTTCCATGTCCGGTACCAAGCGGTTTTTG	14	42	1
Group-13	GCACGGGAGGCACCCTGACATTGCAAATCCCATCGGTGTG	15	40	1
Group-14	ACCTATAACAGCCATCATACGAGGTAATCCCCTCCCTCGA	16	40	1
Group-15	CCAACTGGATCTTACTGAGGAACGGTCCATTAGCACATCG	17	40	1
Group-16	CGCGACCACATCCTGCGTAAACACATCTCCGCCAGTCCAT	18	40	1
Group-17	CGCAAGAGCAGCATACAGCACGAACGAGCCATTTACGCCA	19	40	1
Group-18	CGAAGACCAGACATGGTAGCCACGCATAGTCCAACTTAAG	20	40	1
Group-19	ACACCACACTAATGCATGCATTCTGTGAGTCACAGTTCA	21	39	1
Group-20	CACTCAAACCCAAACCATGCAAACTGAACAACGCAACACA	22	40	1
Group-21	CACCAAACTGCCCAAATTTGAGGACGCCCTATACATGCG	23	39	1
Group-22	GCCCAATACGTATGTTGATACATGCCCCTTACCCTTTGCG	24	40	1
Group-23	CACCGTAGTAAGTAAGCAGACGCTAAGGATGTTGCCAGTG	25	40	1
Group-24	GTGACATGAACTGGTTTTCCACAGCTTAGGATCATGGATG	26	40	1
Group-25	GGGCATGTGGGCTTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG	27	40	1
Group-26	CCGTCGCTATAACCCTGTCTTTATATATCTTCGCCCACGGG	28	41	1

실시예 6 : 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화성 평가

1. 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 정제

기 확보한 비브리오 파라해모라이티쿠스 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 정제를 위하여 상기의 PCI처리 및 에탄올 침전법을 이용하여 정제된 순수 비브리오 파라해모라이티쿠스 특이 결합 DNA 앱타머 후보군을 확보하였다.

2. Nano-drop을 활용한 비브리오 파라해모라이티쿠스 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화성 평가

기 확보한 정제된 비브리오 파라해모라이티쿠스 특이 결합 DNA 앱타머 후보군들에 대한 친화성을 평가하기 위하여 확보한 각 비브리오 파라해모라이티쿠스 특이 결합 DNA 앱타머 후보군 각 1㎕를 Nano-drop으로 측정하여 DNA 농도를 확인해 1차 용리시와 2차 용리시 가장 농도가 높게 측정된 DNA 앱타머 후보군인 1번과 13번 후보군을 선별하여 각각 VPCA-01, VPCA-02로 명명하였다. (도 3)

실시예 7 : 선별된 DNA 앱타머의 예상 구조 모식도 확보

1. 각 DNA 앱타머 후보군의 예상 구조 제작

선별한 VPCA-01, VPCA-02의 예상 구조를 확인하기 위하여 http://mfold.rna.albany.edu/의 m-fold 프로그램을 이용하여 예상 구조를 제작하였다. 구조 제작 조건으로는 DNA 앱타머의 서열을 선형가닥으로 지정하였으며 구조 제작 온도는 상온인 25℃로 지정하였다. 구조에 영향을 줄 수 있는 나트륨의 농도는 배양 배지인 Nutrient broth with 3% NaCl의 농도인 0.5M로 지정하여 예상 구조를 제작하였다. (도 4 참고)

실시예 8 : SPR 측정을 위한 DNA 앱타머와 비브리오 파라해모라이티쿠스의 준비

1. SPR (Surface Plasmon Resornance) 측정을 위한 DNA 앱타머의 준비

실시예 1에 제시된 방법을 이용하되 PCR 시료 중 10 pM 바이오티닐화된 역방향 프라이머와 10 pM 정방향 프라이머 대신 10 pM 바이오티닐화된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 첨가한 시료를 이용하여 PCR을 진행하였다. 이후 과정은 실시예 1에 따라 진행하여 PCR 정제를 수행하였다. 기 확보한 PCR 시료는 ssDNA를 제작하기 위하여 비대칭 PCR을 사용하였다. 비대칭 PCR의 반응 조성으로는 10X PCR 완충용액 10㎕, 각 2.5 mM dNTP mixture 8㎕, 10 pM 바이오티닐화된 정방향 프라이머 10㎕, 역방향 프라이머 1㎕, 주형 DNA 라이브러리 10㎕, Ex Taq 중합효소 (TaKaRa, Japan) 0.5㎕ (1unit/㎕)와 증류수 60.5㎕로 구성하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 15주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. 이 후에 통상적으로 당업계에서 사용하는 PCI 및 에탄올 침전법을 이용하여 순수 DNA 앱타머를 확보하였다.

2. ssDNA 앱타머의 구조 제작

확보한 ssDNA는 Nano-drop에 1㎕를 넣고 ssDNA 농도를 측정한 후에 나머지 99㎕의 ssDNA 앱타머에 99㎕의 2X Nutrient broth with 3% NaCl을 첨가하여 85℃에서 5분간 가열하고 상온에서 1시간 이상 천천히 냉각하였다. 그 후에 DNA의 농도가 25uM이 되도록 1X Nutrient broth with 3% NaCl에 희석하여 준비하였다.

3. SPR (Surface Plasmon Resornance) 측정을 위한 비브리오 파라해모라이티쿠스의 준비

SPR 측정을 하기 위하여 실시예 2에 제시된 방법을 근거로 하여 비브리오 파라해모라이티쿠스를 배양하였다. 이후 실시예 2에 따라 세척용액을 이용하여 생균 표면을 세척하였다.

실시예 9 : SPR 측정을 통한 최적 DNA 앱타머의 선별

1. Sensor chip SA에 DNA 앱타머 고정

GE healthcare에서 제공한 protocol에 제시된 방법에 의하여 Gold 판막 위에 덱스트란 (Dextran)으로 고정된 스트렙트아비딘을 활성화하였다. 활성화시킨 Sensor chip SA의 표면에 DNA 앱타머를 고정시키기 위해 먼저 Start sensogram을 수행하였다. 그 후에 유속을 10㎕/min으로 지정하였다. Sensor chip SA의 4개 채널 중에서 1번은 검사용으로 앱타머를 붙이지 않았고 2,3,4번의 채널에만 각각의 선별된 앱타머를 결합시켰다. DNA 앱타머의 결합조건으로는 유속 10㎕/min으로 1분간 접종하는 일련의 과정을 각각 3회 반복 수행하였다. 그 후에 10분간 유속을 10㎕/min으로 HBS-EP buffer를 흘려주어 결합된 ssDNA 앱타머가 안정화되도록 하였다.

2. 비브리오 파라해모라이티쿠스의 결합

준비된 비브리오 파라해모라이티쿠스를 배양한 배양액 1ml을 튜브에 옮긴 후 Sensor chip SA 위에 유속 5㎕/min으로 20분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 과정동안 1번 채널과 2, 3, 4채널의 Sensogram 비교, 분석을 통하여 결합력을 확인하였다. 이 후에 50mM NaOH를 유속 10㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 비브리오 파라해모라이티쿠스와 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다. (도 5) 이 과정에서 최종 VPCA-02를 최적의 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 결합 DNA 앱타머로 선별하였다. (표 3)

Aptamer	Target microbe	kD value
VPCA-01	V.parahaemolyticus	4.61e^-9±1.02
VPCA-02	V. parahaemolyticus	3.00e^-10±0.87

실시예 10 : 최적 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 결합 DNA 앱타머의 특이성 평가

1. 비브리오 피셔리의 친화성 측정

비브리오 파라해모라이티쿠스와의 결합력 비교를 위하여 비브리오 피셔리를 배양하였다. 비브리오 피셔리의 배양방법은 실시예 2에 제시된 대로 배양하였다. 그 후에 배양액 1ml을 튜브에 옮긴 후 Sensor chip SA 위에 유속 5㎕/min으로 20분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 후에 50mM NaOH를 유속 10㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 비브리오 피셔리와 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다.

2. 리스테리아 모노사이토제네스의 친화성 측정

비브리오 파라해모라이티쿠스와의 결합력 비교를 위하여 리스테리아 모노사이토제네스를 배양하였다. 리스테리아 모노사이토제네스의 배양방법은 실시예 2에 제시된 대로 배양하였다. 그 후에 배양액 1ml을 튜브에 옮긴 후 Sensor chip SA 위에 유속 5㎕/min으로 20분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 후에 50mM NaOH를 유속 10㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 리스테리아 모노사이토제네스와 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다.

3. 쉬겔라 소네이의 친화성 측정

비브리오 파라해모라이티쿠스와의 결합력 비교를 위하여 쉬겔라 소네이를 배양하였다. 쉬겔라 소네이의 배양방법은 실시예 2에 제시된 대로 배양하였다. 그 후에 배양액 1ml을 튜브에 옮긴 후 Sensor chip SA 위에 유속 5㎕/min으로 20분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 후에 50mM NaOH를 유속 10㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 쉬겔라 소네이와 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다.

4. 에스케리치아 콜라이의 친화성 측정

비브리오 파라해모라이티쿠스와의 결합력 비교를 위하여 에스케리치아 콜라이를 배양하였다. 에스케리치아 콜라이의 배양방법은 실시예 2에 제시된 대로 배양하였다. 그 후에 배양액 1ml을 튜브에 옮긴 후 Sensor chip SA 위에 유속 5㎕/min으로 20분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 후에 50mM NaOH를 유속 10㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 에스케리치아 콜라이와 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다. (표 4)

Target microbe	Kd value
V. parahaemolyticus	3.00e^-10±0.87
E. coli	1.24e^-7±0.75
L. monocytogenes	2.30e^-7±0.98
S. soneii	5.28e^-7±0.79
V. fischeri	1.25e^-6±1.12

실시예 11 : 최종 선별된 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면결합 DNA 앱타머의 산업적 활용을 위한 각종 시료에서의 검출 방법 연구

상기의 실시예를 통해 제작, 확보한 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면 결합 DNA 앱타머의 산업적 활용을 위하여 비브리오 파라해모라이티쿠스가 감염된 환경에서의 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면 결합 DNA 앱타머를 이용한 검출 방법 및 비브리오 파라해모라이티쿠스가 감염된 동물이나 사람에서의 질병 증상을 진단하기 위한 응용 가능성을 확인하기 위하여 다양한 시료에서의 비브리오 파라해모라이티쿠스의 검출 능력을 확인하였다. 이를 통해 다양한 시료에서의 활용력을 이용하여 다양한 환경에서의 비브리오 파라해모라이티쿠스의 검출이 가능할 것으로 기대된다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation U & B Tech., Co. <120> DNA Aptamer Specifically Binding to Surface of Living Cell of Vibrio parahemolyticus and Uses Thereof <130> 01 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 1 cataccaagg ctaccgaggt tccagatatt ggccgctatg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 2 ccacgtttcc acgtatcctc ggagcttgct taaccgtacg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 3 tgcgtagttc ttttaacaac cattcagcgt attttcgtgg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 4 ccctcggcgt aactagtacc gttgcaccac caacgtgatt 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 5 cgcaagggat ttcggaccgg gcttggtcac acacagagca 40 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 6 ccagcagtgg ggcatggggg aacgataaga ttataagggg g 41 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 7 cacgcaagca gaagccactc cccctggtcg tactatttag 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 8 cacaggcgta ccactgcccc aacgatcctt ttggttaccg 40 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 9 gtcggagagc ctggccgtct gctcgtaagt actatcatag c 41 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 10 tggagaagcg gcagttgatg cctggtaccc gtctgctacg 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 11 cgtaaaggac gctgccatga atgtgctatc caagcctggg 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 12 cgtaaaggac gctgccatga atgtgctatc caagcctggg 40 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 13 cgtaagaacg ctgccatgaa tgtgctatcc aggcctggg 39 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 14 caacggaggg aagtttccat gtccggtacc aagcggtttt tg 42 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 15 gcacgggagg caccctgaca ttgcaaatcc catcggtgtg 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 16 acctataaca gccatcatac gaggtaatcc cctccctcga 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 17 ccaactggat cttactgagg aacggtccat tagcacatcg 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 18 cgcgaccaca tcctgcgtaa acacatctcc gccagtccat 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 19 cgcaagagca gcatacagca cgaacgagcc atttacgcca 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 20 cgaagaccag acatggtagc cacgcatagt ccaacttaag 40 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 21 acaccacact aatgcatgca ttctgtgagt cacagttca 39 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 22 cactcaaacc caaaccatgc aaactgaaca acgcaacaca 40 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 23 caccaaactg cccaaatttg aggacgccct atacatgcg 39 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 24 gcccaatacg tatgttgata catgcccctt accctttgcg 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 25 caccgtagta agtaagcaga cgctaaggat gttgccagtg 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 26 caccgtagta agtaagcaga cgctaaggat gttgccagtg 40 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 27 gggcatgtgg gcttgcgatt tcggtttggt gtggttgggg 40 <210> 28 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer <400> 28 ccgtcgctat aaccctgtct ttatatatct tcgcccacgg g 41 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> site for amplification <400> 29 ataccagctt attcaatt 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> site for amplification <400> 30 agattgcact tactatct 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 31 ataccagctt attcaatt 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 32 agattgcact tactatct 18

Claims

비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 서열번호 11 내지 13 중 하나의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머(aptamer).
하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 따른 DNA 앱타머를 선별하는 방법:
(ⅰ) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, ssDNA 앱타머를 제조하는 단계;
(ⅱ) 비브리오 파라해모라이티쿠스를 배양하고 세척하는 단계; 및
(ⅲ) 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균을 이용한 Live Cell SELEX 기법을 통해 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계.
제 1 항에 따른 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균의 검출용 조성물.
제 1 항에 따른 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균의 검출용 키트.
제 4 항에 있어서,
상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
제 4 항에 있어서,
상기 키트는 DNA 앱타머가 기판 상에 고정화된 마이크로어레이 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 생균의 검출 방법:
(a) 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균을 함유하는 검사 시료와 제 1 항에 따른 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균을 확인하는 단계.