JP6012085B2 - サルモネラに結合する核酸分子およびその用途 - Google Patents

サルモネラに結合する核酸分子およびその用途 Download PDF

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Description

本発明は、サルモネラに結合する核酸分子およびその用途に関し、具体的には、Ｏ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群のサルモネラに結合する核酸分子、およびその用途に関する。
近年、サルモネラによる食中毒の増加が問題となっている。サルモネラは、血清型で分類した場合、中でも、Ｏ４群、Ｏ７群およびＯ９群に属するサルモネラが、食中毒の原因菌の大半を占めている。このため、これらの群に属するサルモネラを特異的に検出する方法の確立が、非常に重要視されている。
サルモネラの検出は、例えば、選択培地を用いる方法が知られている。この方法は、まず、増殖培地を用いて、試料に含まれる細菌の増殖を行い、つぎに、前記選択培地（例えば、ＲＶ培地）を用いて、増殖細菌中のサルモネラを選択的に生育させることで、サルモネラの検出を行う方法である。しかしながら、前記選択培地は、サルモネラの他に、例えば、日和見菌であるサイトロバクター等も生育するという問題がある。このため、前記選択培地における生育の有無のみでサルモネラを検出することは、現実的ではなく、抗体等を用いた血清型による同定等が必要とされる。
この他に、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法により、サルモネラに特異的な配列を増幅させ、増幅の有無によって、サルモネラを検出する方法も提案されている。しかしながら、遺伝子増幅法において、ターゲット配列を特異的に増幅させるには、類似する配列の増幅を回避するために、プライマーの配列の設計等、増幅条件の設定が複雑である。また、増幅反応に時間を要するという問題がある。
他方、抗体にかわる新たなツールとして、ターゲットに特異的に結合する核酸分子（アプタマー）の研究が行われている。アプタマーは、抗体と比較すると低分子であることから、合成が容易であり、改変等も可能であることから、アプタマーとターゲットとの結合を利用した様々な応用が考えられている。サルモネラ検出についても、サルモネラに結合するアプタマーが報告されている（非特許文献１）。
Raghavendra Joshiら、Molecular and Cellular Probes 2009、 23、20-28
しかしながら、報告されているアプタマーは、サルモネラ検出の実用化において、サルモネラに対する結合が十分ではないことから、さらに優れたアプタマーの提供が望まれている。
そこで、本発明の目的は、サルモネラの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供することにある。
本発明の核酸分子は、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とするサルモネラに特異的に結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１〜１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
本発明の検出方法は、サルモネラの検出方法であり、試料と前記本発明の核酸分子とを接触させ、前記試料中のサルモネラと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のサルモネラを検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明の検出試薬は、サルモネラの検出試薬であり、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
本発明の検出キットは、サルモネラの検出キットであり、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
本発明の検出デバイスは、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
本発明の核酸分子は、サルモネラに結合可能であり、中でも、食中毒の原因菌であるＯ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群に属するサルモネラに特異的に結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、例えば、サルモネラとの結合の有無によって、サルモネラを検出できる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、食品管理、公衆衛生等の分野におけるサルモネラの検出に、極めて有用なツールといえる。
図１は、本発明の実施例１において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例１において、アプタマーとサイトロバクターとの結合能を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例２において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例３において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図５は、本発明の実施例４において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図６は、本発明の実施例５において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図７は、本発明の実施例６において、アプタマーとサルモネラとの結合の特異性を示すグラフである。 図８は、本発明の実施例７において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図９は、本発明の実施例８において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図１０は、本発明の実施例９において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図１１は、本発明の実施例１０において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。
本発明の核酸分子は、前述のように、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とするサルモネラに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１〜１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
本発明において、「サルモネラに結合する」とは、例えば、前記サルモネラに対する結合能を有している、または、前記サルモネラに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子と前記サルモネラとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名 BioRad社）が使用できる。
サルモネラの種類は、例えば、Ｏ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群に属するものがあげられる。Ｏ４群のサルモネラは、例えば、Salmonella typhimurium、Salmonella paratyphi B、Salmonella fyrisがあげられ、Ｏ７群のサルモネラは、例えば、Salmonella infantis、Salmonella singapore、Salmonella brenderupがあげられ、Ｏ９群のサルモネラは、例えば、Salmonella enteritidis、Salmonella typhi、Salmonella dublinがあげられる。本発明の核酸分子は、例えば、サルモネラの生菌および／または死菌に結合する。
本発明の核酸分子は、例えば、サルモネラ以外の細菌と比較して、サルモネラに対して特異的に結合する。前記サルモネラ以外の細菌は、例えば、リステリア属、エッシェリシア属である。本発明の核酸分子は、例えば、サルモネラ以外の細菌と比較して、サルモネラに対して優れた結合力を示す。サルモネラに対する前記結合力を示す本発明の核酸分子の解離定数は、例えば、１μＭ以下であり、好ましくは、５００ｎＭ以下である。
本発明の核酸分子において、前記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明の核酸分子は、例えば、以下、ＤＮＡアプタマーともいう。
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前記配列番号１〜１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
ＳＡＬ−２０４（配列番号１）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２３６（配列番号２）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTTGGGGGTAGGCGCTGGGGTGGGTGGGAGCGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２３０（配列番号３）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２０３（配列番号４）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGCGGAGTTGTGGGGGGTCGGGGGGTGGCGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２１９（配列番号５）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGATCGGTGCTGCGGGGGTGGGTGGAGCGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２５６（配列番号６）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTCGGGGGTAGTGCCGGGGGTTGGGTGGGCAGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２４２（配列番号７）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGTGCTATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２７８（配列番号８）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２６２（配列番号９）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGCCGCGTGAAGAGGTGGGGGGGGTGGGCGCGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−３９６（配列番号１０）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−４４５（配列番号１１）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTCCGGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−４３７（配列番号１２）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGGCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−４０９（配列番号１３）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGGGCCTGGTAGGTTGGTGGGGGTGGGGAGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−４５５（配列番号１４）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGCGTGCGGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−１０７（配列番号１５）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−４３１（配列番号１６）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGGACAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−１２３（配列番号１７）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGGGTGTGGTGGGTGGGGGAGGTGGTATGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、サルモネラに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜６０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１または２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、サルモネラに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上であり、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
前記（ｂ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドは、特に制限されない。前記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、大腸菌Eschericia coliに実質的に結合しない。「実質的に結合しない」とは、例えば、前記核酸分子と大腸菌との結合を検出した際に、検出限界以下であることも含む。
前記（ｂ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドは、特に制限されず、具体例としては、以下のような配列が例示される。下記配列は、前述した、ＳＡＬ‐２０４（配列番号１）、ＳＡＬ−２３０（配列番号３）、ＳＡＬ−２４２（配列番号７）、ＳＡＬ−２７８（配列番号８）、ＳＡＬ−２６２（配列番号９）、ＳＡＬ−３９６（配列番号１０）、ＳＡＬ−４４５（配列番号１１）、ＳＡＬ−４３７（配列番号１２）、ＳＡＬ−４５５（配列番号１４）、ＳＡＬ−１０７（配列番号１５）、ＳＡＬ−４３１（配列番号１６）を小型化したポリヌクレオチドである。
ＳＡＬ−２０４＿ｓ４６ （配列番号２１）
GGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ−２０４＿ｒａｎｄ（配列番号２２）
GCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGG
ＳＡＬ−２３０＿ｓ４８ （配列番号２３）
GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ−２３０＿ｒａｎｄ（配列番号２４）
GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGG
ＳＡＬ−２４２＿ｓ４６ （配列番号２５）
TATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACAT
ＳＡＬ−２４２＿ｒａｎｄ（配列番号２６）
GGGTGCTATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGG
ＳＡＬ−２７８＿ｓ４９ （配列番号２７）
TGAATTGTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGGCAAAGGTTTCG
ＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）
GTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGG
ＳＡＬ−２６２＿ｓ３６ （配列番号２９）
GGTGGGGGGGGTGGGCGCGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ−２６２＿ｒａｎｄ（配列番号３０）
GCCGCGTGAAGAGGTGGGGGGGGTGGGCGCGG
ＳＡＬ−３９６＿ｓ５５ （配列番号３１）
CCCTAAAGTTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ−３９６＿ｒａｎｄ（配列番号３２）
TTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGG
ＳＡＬ−４４５＿ｓ４４ （配列番号３３）
GGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ−４４５＿ｒａｎｄ（配列番号３４）
TCCGGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTG
ＳＡＬ−４３７＿ｓ４１ （配列番号３５）
GGCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGGCAAAGCCGTC
ＳＡＬ−４３７＿ｒａｎｄ（配列番号３６）
GCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGG
ＳＡＬ−４５５＿ｓ４２ （配列番号３７）
GGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ−４５５＿ｒａｎｄ（配列番号３８）
CGTGCGGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCG
ＳＡＬ−１０７＿ｓ４３ （配列番号３９）
GGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ−１０７＿ｒａｎｄ（配列番号４０）
TTGTGGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTG
ＳＡＬ−４３１＿ｓ５６ （配列番号４１）
CTTGTCCCTAAAGTGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGGACAAAGCCGTCGAG
ＳＡＬ−４３１＿ｒａｎｄ（配列番号２０）
TGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGG
本発明の核酸分子において、例えば、前記（ａ）は、例えば、（ａ’）配列番号２０〜４１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよく、この場合、前記（ｂ）〜（ｄ）において、前記（ａ）のいずれかの塩基配列は、前記（ａ’）のいずれかの塩基配列に読み替えることができる。
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、好ましくは２〜２０であり、より好ましくは２〜１０であり、より好ましくは、２または３である。
前記リンカーは、特に制限されない。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長であり、好ましくは１〜２０塩基長であり、より好ましくは３〜１２塩基長であり、さらに好ましくは５〜９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の修飾化ヌクレオチド残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、修飾化デオキシリボヌクレオチド残基および修飾化リボヌクレオチド残基があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基における糖残基が修飾されたものがあげられる。前記糖残基は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたもの、または、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチド残基をピリミジンヌクレオチド残基といい、修飾されたピリミジンヌクレオチド残基を修飾化ピリミジンヌクレオチド残基といい、プリン塩基を有するヌクレオチド残基をプリンヌクレオチド残基といい、修飾されたプリンヌクレオチド残基を修飾化プリンヌクレオチド残基という。前記ピリミジンヌクレオチド残基は、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド残基、シトシンを有するシトシンヌクレオチド残基、チミンを有するチミンヌクレオチド残基等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、リボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
前記ヌクレオチド残基における塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の天然塩基（非人工塩基）でもよいし、非天然塩基（人工塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基（ａ、ｃ、ｇ、ｔまたはｕ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’−メチルウラシル、２’−メチルシトシン、２’−フルオロウラシル、２’−フルオロシトシン、２’−アミノウラシル、２’−アミノシトシン、２−チオウラシル、２−チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長であり、好ましくは１〜５０塩基長であり、より好ましくは１〜２５塩基長、さらに好ましくは１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
本発明の核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは５’末端である。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。
前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、前述の例示を援用できる。
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。
本発明の核酸分子は、前述のように、前記サルモネラに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記サルモネラへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記サルモネラに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
本発明の核酸分子によれば、例えば、前記サルモネラを検出でき、これによって、前記サルモネラを検出できる。前記サルモネラの検出方法は、特に制限されず、前記サルモネラと前記核酸分子との結合を検出することによって、行える。
＜検出方法＞
本発明の検出方法は、前述のように、サルモネラの検出方法であって、試料と前記本発明の核酸分子とを接触させ、前記試料中のサルモネラと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のサルモネラを検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、サルモネラに特異的に結合することから、例えば、サルモネラと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のサルモネラを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のサルモネラの有無またはサルモネラの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。本発明によれば、サルモネラの中でも、例えば、Ｏ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群に属するサルモネラを、特異的に検出できる。
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、生体由来、飲食品由来、環境由来等の試料があげられる。前記生体は、特に制限されず、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ等の非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等の動物の生体があげられる。前記生体由来の試料は、例えば、排泄物、体液、皮膚、肉、粘膜、体毛等があげられる。前記飲食品由来の試料は、例えば、飲料、食品、食品原料等があげられる。前記環境由来の試料は、例えば、生物、水、土壌、大気等があげられる。前記水試料は、例えば、地下水、河川水、海水、生活排水等があげられる。また、前記環境由来の試料は、例えば、食品加工場、調理場等における付着物があげられる。
前記試料は、例えば、採取したものを、そのまま本発明の検出方法に使用してもよいし、前記採取物を種として培地で培養を行い、得られた培養物を本発明の検出方法に試料として使用してもよい。前記試料は、例えば、検出結果の信頼性を向上できることから、前記採取物中に含まれる細菌量を増加させた前記培養物を使用することが好ましい。前記培養方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法が採用できる。培養に使用する培地は、特に制限されず、増殖培地として、例えば、カゼインペプトン １７ｇ／Ｌ、ソイペプトン ３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム ２．５ｇ／Ｌ、ブドウ糖 ２．５ｇ／Ｌ（ｐＨ７．３）等を含むＴＳＶ培地、サルモネラ用の選択培地として、例えば、大豆ペプトン ５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ８ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １．６ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物 ４０ｇ／Ｌ、マラカイトグリーン ０．０４ｇ／Ｌ（ｐＨ５．２）等を含むＲＶ培地等が使用でき、これらを、順次併用してもよい。本発明の検出方法によれば、例えば、増殖培地で培養した培養試料を、そのまま使用できる。前記本発明の核酸分子は、サルモネラに対して特異的に結合することから、例えば、様々な細菌が含まれる前記培養試料であっても、特異的にサルモネラに結合し、この結合を検出可能だからである。
前記試料は、例えば、細菌が生存する生菌試料でもよいし、細菌が死滅した死菌試料でもよい。前者は、例えば、前述のように採取したものをそのまま使用したり、前記培養物をそのまま使用する場合があげられる。後者は、例えば、前記本発明の核酸分子との接触前または接触時において、前記試料に含まれる細菌に対する死滅処理を施す場合があげられる。前記死菌処理は、例えば、加熱処理があげられる。具体例としては、例えば、前記試料を９５℃〜１００℃で１０分間加熱処理した後、前記本発明の核酸分子と接触させる形態があげられる。前記試料中にサルモネラが存在する場合、サルモネラが拡散する可能性がある。しかしながら、予め、前記試料に死滅処理を施すことによって、検出時におけるサルモネラの拡散を十分に防止し、安全性を維持することができる。
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記固体試料の場合、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体と混合して、液体試料として使用することが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液、培地等があげられる。
前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中サルモネラと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記サルモネラと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のサルモネラの有無または量を分析する工程を含む。
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分であり、好ましくは３０〜６０分である。
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、カリウムイオン（Ｋ＋）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在下で行うことが好ましい。カリウムイオンは、例えば、カリウム化合物により供給できる。前記カリウム化合物は、例えば、液体中で、イオン化してカリウムイオンを遊離する、イオン供与体があげられる。前記カリウム化合物は、例えば、カリウム塩が使用でき、具体例として、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム等があげられる。マグネシウムイオンは、例えば、マグネシウム化合物により供給できる。前記マグネシウム化合物は、例えば、液体中で、イオン化してマグネシウムイオンを遊離する、イオン供与体があげられる。前記マグネシウム化合物は、例えば、マグネシウム塩が使用でき、具体例として、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、水酸化マグネシウム等があげられる。
前記接触工程において、前記核酸分子に接触させる前記試料中の細菌量は、特に制限されない。前記核酸分子１００ｐｍｏｌあたり、例えば、細菌１０５〜１０７ｃｅｌｌｓを接触させることが好ましく、より好ましくは１０６〜１０７ｃｅｌｌｓである。また、カリウムイオンおよびマグネシウムイオン存在下で接触工程を行う場合、前記核酸分子２００ｆｍｏｌあたり、カリウムイオンは、例えば、１００〜１０００ｎｍｏｌであり、より好ましくは５００〜１０００ｎｍｏｌであり、さらに好ましくは５００ｎｍｏｌであり、マグネシウムイオンは、例えば、１００〜１０００ｎｍｏｌであり、より好ましくは１００〜５００ｎｍｏｌであり、さらに好ましくは１００ｎｍｏｌである。
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のサルモネラと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のサルモネラの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のサルモネラの量を分析（定量）できる。
そして、前記サルモネラと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にサルモネラは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にサルモネラが存在すると判断できる。また、予め、サルモネラの細菌数と、結合量との相関関係を求めておき、前記相関関係に基づいて、前記結合量から、前記試料中のサルモネラの細菌数を分析することもできる。
前記サルモネラと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ、蛍光偏光法等があげられる。また、前記結合は、例えば、前記サルモネラと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。
前記蛍光偏光法は、一般に、偏光励起光を前記標識物質に照射した際、前記標識物質から発せられる蛍光が、前記標識物質で標識された分子の分子量に応じて異なった偏光度を示すという特性に基づく測定方法である。本発明においては、例えば、前記標識物質で標識化した前記核酸分子（標識化核酸分子）を使用することで、前記蛍光偏光法により前記サルモネラと前記核酸分子との結合を検出することができる。具体的には、前記標識化核酸分子は、サルモネラと未結合の状態とサルモネラと結合した状態を比較した場合、前者は、相対的に分子量が小さいため、相対的に偏光度が高く、一方、後者は、相対的に分子量が大きいため、相対的に偏光度が低い。このため、例えば、試料と接触させる前の前記標識化核酸分子の偏光度と、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の前記偏光度とを比較することで、サルモネラと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。また、サルモネラと未結合の前記標識化核酸分子およびサルモネラと結合した前記標識化核酸分子の少なくとも一方の偏光度を評価基準として、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の偏光度を評価することでも、サルモネラと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。
前記蛍光偏光法によれば、例えば、前記本発明の核酸分子を、前記標識物質で標識化するのみで、センサとして容易に使用できる。また、前記標識物質は、その種類によって検出波長が異なるため、例えば、試料の種類に応じて前記標識物質を選択することで、前記試料由来の蛍光の影響を低減することもできる。
前記標識化核酸分子は、例えば、前記本発明の核酸分子が前記標識物質で標識化されていればよく、その標識方法は、特に制限されない。
前記標識化核酸分子としては、例えば、前記本発明の核酸分子に前記標識物質が連結した形態があげられる。この形態は、例えば、前述の記載が援用でき、前記本発明の核酸分子に、前記標識物質が直接的に連結してもよいし、前述のようにリンカー等を介して前記標識物質が間接的に連結してもよい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、０〜１０塩基長であり、好ましくは０〜７塩基長であり、より好ましくは、０〜５塩基長である。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよく、好ましくは、５’末端である。
前記標識化核酸分子としては、この他に、例えば、前記本発明の核酸分子と、これに相補的であって且つ標識物質が連結した相補鎖（以下、「標識化相補鎖」ともいう）とを含み、前記核酸分子と前記標識化相補鎖とがハイブリダイズしたハイブリッド分子があげられる。
前記相補鎖は、例えば、前記本発明の核酸分子の一部に相補的な配列を有していればよく、前記相補的な配列のみから構成されてもよいし、前記相補的な配列を含んでもよい。前記相補鎖は、前記本発明の核酸分子のどの領域に対して相補的でもよく、好ましくは、５’末端領域または３’末端領域に相補的である。また、例えば、前記本発明の核酸分子が、その５’末端または３’末端にリンカーを有し、前記相補的な配列は、前記リンカーに相補的であることが好ましい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長であり、好ましくは１５〜２５塩基長であり、より好ましくは、１８〜２４塩基長である。前記相補鎖の長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長であり、好ましくは１５〜２５塩基長であり、より好ましくは、１８〜２４塩基長である。
前記標識化相補鎖において、前記標識物質は、例えば、前記相補鎖のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよい。前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の３’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の５’末端に連結することが好ましく、前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の５’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の３’末端に連結することが好ましい。
前記標識物質は、特に制限されず、前述した例示を援用でき、中でも前記蛍光物質および前記色素が好ましい。
前記蛍光偏光法を採用する場合、本発明の検出方法は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させ、前記試料中のサルモネラと前記標識化核酸分子とを結合させる接触工程と、前記標識化核酸分子に偏光励起光を照射して、前記標識化核酸分子の偏光度を測定する測定工程と、前記測定工程における測定結果と評価基準とを比較し、サルモネラと前記標識化核酸分子との結合を検出する工程を検出する検出工程を含むことが好ましい。
前記測定工程において、前記偏光励起光の波長および前記偏光度の検出波長は、特に制限されず、例えば、前記標識物質の種類に応じて適宜設定できる。具体例として、前記標識物質がＡｌｅｘａ６４７の場合、前記偏光励起光の波長は、例えば、６２０〜６８０ｎｍであり、偏光度の検出波長は、例えば、６６０〜８００ｎｍである。前記偏光励起光の照射時間は、特に制限されず、例えば、１ナノ〜５ナノ秒があげられる。
前記検出工程において、前記評価基準は、例えば、予め決定してもよいし、測定ごとに決定してもよい。前記評価基準としては、例えば、サルモネラ未結合の基準、サルモネラ結合の基準が設定できる。前者の基準は、例えば、サルモネラが結合していない前記標識化核酸分子のみの偏光度であり、後者の基準は、例えば、サルモネラが結合した前記標識化核酸分子の偏光度である。
前者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも高ければ、サルモネラが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのサルモネラが存在すると判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または低ければ、サルモネラが存在しないと判断できる。前者の基準は、例えば、前記接触工程前の前記標識化核酸分子の偏光度でもよい。
また、後者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも低ければ、サルモネラが存在しないと判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または高ければ、サルモネラが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのサルモネラが存在すると判断できる。
また、前記基準は、サルモネラの量と偏光度との相関関係であってもよい。例えば、複数の既知濃度のサルモネラと所定量の前記標識化核酸分子とを接触させ、各濃度のサルモネラに結合した前記標識化核酸分子の偏光度を測定することにより、前記相関関係を示す相関式が得られる。そして、この相関式と、前記測定工程における測定値とから、前記試料におけるサルモネラの量を判断することができる。
＜検出試薬およびキット＞
本発明の検出試薬は、前述のように、サルモネラの検出試薬であって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、前記サルモネラの検出等を行うことができる。
本発明の検出キットは、前述のように、サルモネラの検出キットであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記サルモネラの検出等を容易に行うことができる。
本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、前記試料を培養するための培地、緩衝液、マグネシウム化合物およびカリウム化合物、使用説明書等があげられる。
本発明の検出試薬および検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用でき、また、その使用方法についても、前記本発明の核酸分子および前記本発明の検出方法を援用できる。
＜検出デバイス＞
本発明の検出デバイスは、前述のように、サルモネラの検出デバイスであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出デバイスは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出デバイスを使用すれば、前述のように、例えば、前記サルモネラの検出等を行うことができる。
本発明の検出デバイスは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体の種類および前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。本発明の検出デバイスの使用方法は、特に制限されず、前記本発明の核酸分子および前記本発明の検出方法を援用できる。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
［実施例１］
各アプタマーについて、サルモネラに対する結合能を確認した。
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。
ＳＡＬ−１０７（配列番号１５）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ‐２０４（配列番号１）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２３０（配列番号３）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２４２（配列番号７）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGTGCTATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２６２（配列番号９）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGCCGCGTGAAGAGGTGGGGGGGGTGGGCGCGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２７８（配列番号８）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−３９６（配列番号１０）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−４３１（配列番号１６）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGGACAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−４３７（配列番号１２）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGGCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−４４５（配列番号１１）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTCCGGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−４５５（配列番号１４）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGCGTGCGGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
比較例として、サルモネラに結合する公知のアプタマー（ＳＡＬ−３３）を使用した（非特許文献１：Molecular and Cellular Probes 23、 2009、 20-28）。前記アプタマーの配列を以下に示す。
ＳＡＬ−３３（配列番号１８）
TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGCTATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGATTTCTCCTACTGGGATAGGTGGATTAT
また、４０塩基長のランダム配列（Ｎ）４０を含む配列番号１９で表わされるオリゴヌクレオチドからなるＤＮＡを複数含むＤＮＡライブラリーを、ネガティブコントロールＮ４０とした。下記配列において、「Ｎ」は、デオキシリボヌクレオチド残基であり、その核酸は、アデニン、グアニン、シトシンおよび／またはチミンとした。
Ｎ４０（配列番号１９）
CCTGCACCCAGTGTCCC-(N)40-GACGGAGAGGAGGACGG
前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。
（２）細菌試料
細菌は、Salmonella enteritidis、Salmonella typhimurium、Salmonella infantis、Citrobacter freundiiおよびEschericia coli（ＤＨ５ａ）を使用した。各細菌を、１００℃、１０分間の加熱処理によって、死滅させた。前記死滅した細菌を、光路長１ｃｍでの波長６００ｎｍの吸光度が０．１となるように、ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍｍｏｌ ＫＣｌ、１．４８ｍｍｏｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で希釈した。この希釈試料を、以下のＳＰＲに使用した。
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
結合能の解析には、ProteON XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。
まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名 ProteOn NLC Sensor Chip、BioRad社）を、前記ProteON XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５０００ｎｍｏｌ／Ｌのリガンドをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）が約１０００ＲＵになるまで結合させた。前記リガンドは、２４塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化した、ビオチン化ポリｄＴを使用した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＰＲバッファーを用いて、４００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約７００ＲＵになるまで結合させた。続いて、前記希釈試料（Ａｂｓ．６００＝０．１）を、ＳＰＲバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＰＲバッファーを流して洗浄を行った。前記希釈試料のインジェクションおよび前記ＳＰＲバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。
前記ＳＰＲバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．４とした。
そして、前記希釈試料のインジェクション開始を０秒として、１１５秒〜１２５秒におけるＲＵの最大値（ＲＵｍａｘ）と、３５５〜３６５秒におけるＲＵの平均値（ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ）とを求め、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘを算出した。ＲＵｍａｘは、試料のインジェクション時におけるアプタマーへのターゲットの結合量を示し、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔは、洗浄時におけるアプタマーへのターゲットの結合量を示す。ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘは、値が高い程、アプタマーとターゲットとの結合が、洗浄によって乖離し難いことを意味する。
ＲＵｍａｘの結果を下記表１に、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘの結果を図１および図２に示す。図１および図２は、各細菌に対する各アプタマーの結合能を示すグラフであり、図１（Ａ）がSalmonella enteritidis、（Ｂ）がSalmonella typhimurium、（Ｃ）がSalmonella infantis、図２がCitrobacter freundiiに対する各アプタマーの結合能を示すグラフである。図１および図２のグラフにおいて、縦軸は、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘである。
Figure 0006012085
表１に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、大腸菌には結合しなかった。また、図２に示すように、実施例のアプタマーは、Citrobacter freundiiに対し、インジェクション時に若干の結合（ＲＵｍａｘ）を示すものの、洗浄により解離した結果、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘがマイナス（実質的に結合無し）を示した。これに対して、比較例の公知アプタマーＳＡＬ−３３は、Citrobacter freundiiに結合し、洗浄後も結合が維持された。
さらに、図１に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、比較例の公知アプタマーより、Salmonella enteritidisに対して優れた結合能を示し、Salmonella typhimuriumおよびSalmonella infantisに対しても、優れた結合能を示した。中でも、ＳＡＬ−２３０、ＳＡＬ−２６２、ＳＡＬ−３９６、ＳＡＬ−４３１およびＳＡＬ−４３７は、前記希釈試料のインジェクション時において優れた結合能を示し、且つ、洗浄によっても、サルモネラとの結合が十分に維持できた。これらの結果から、実施例のアプタマーは、優れた結合能でかつ特異的に各サルモネラに結合できることがわかった。
［実施例２］
各アプタマーについて、サルモネラに対する結合能を確認した。
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。
ＳＡＬ−１２３（配列番号１７）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGGGTGTGGTGGGTGGGGGAGGTGGTATGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ−２１９（配列番号５）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGATCGGTGCTGCGGGGGTGGGTGGAGCGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−２３６（配列番号２）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTTGGGGGTAGGCGCTGGGGTGGGTGGGAGCGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ−４０９（配列番号１３）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGGGCCTGGTAGGTTGGTGGGGGTGGGGAGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
（２）ＳＰＲによる結合能の解析
サルモネラとして、Salmonella enteritidisを使用し、アプタマーとして、前記（１）のアプタマーを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、結合能を解析した。ＲＵｍａｘの結果を下記表２に、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘの結果を図３に示す。
Figure 0006012085
前記表２および図３に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、大腸菌には結合せず、Salmonella enteritidisに対して、優れた結合能を示した。
［実施例３］
アプタマーを用いたＥＬＡＡ（Enzyme‐linked Aptamer Assay）により、サルモネラの検出を行った。
（１）アプタマー
前記実施例１で使用したＳＡＬ−２３０（配列番号３）、ＳＡＬ−２６２（配列番号９）、ＳＡＬ−３９６（配列番号１０）、ＳＡＬ−４３１（配列番号１６）、ＳＡＬ−４３７（配列番号１２）、ＳＡＬ−２４２（配列番号７）、ＳＡＬ−１０７（配列番号１５）、ＳＡＬ‐２０４（配列番号１）、ＳＡＬ−２７８（配列番号８）、ＳＡＬ−４５５（配列番号１４）を使用した。
前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＥＬＡＡに使用した。
（２）細菌試料
前記実施例と同様に、Salmonella enteritidis、Salmonella typhimurium、Salmonella infantisおよびEschericia coli（ＤＨ５ａ）の死滅細菌を使用した。前記細菌を、光長１ｃｍでの波長６００ｎｍの吸光度が０．１となるように、ＰＢＳ緩衝液で希釈した。この希釈試料を、以下のＥＬＡＡで使用した。
（３）ＥＬＡＡ
使用した試薬等の組成を以下に示す。
固相化液：
ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍｍｏｌ ＫＣｌ、１．４８ｍｍｏｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）
ブロッキング液：
Protein Free（TBS）ブロッキングバッファー（PIERCE社）
希釈液：
５０ｍｍｏｌ/Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ/Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ/Ｌ ＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ/Ｌ ＫＣｌ
洗浄液：
ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍｍｏｌ ＫＣｌ、１．４８ｍｍｏｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
基質：
TMBE Peroxidase Substrate ELISA（MOSS社）
停止液：
０．５Ｎ（０．２５ｍｏｌ／Ｌ） Ｈ２ＳＯ４
９６穴プレート（商品名 Nunc-Immuno（登録商標） plate， Maxisorp（登録商標）、Nunc社）に、前記希釈試料を、ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩吸着させた。前記ウェルを２００μＬの洗浄液で洗浄後、ブロッキング液を２００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、前記ウェルを２００μＬの前記洗浄液で３回洗浄し、前記希釈試料中の死菌を固定化したプレートを作製した。
そして、希釈液で、前記ポリｄＡ付加アプタマーを１μｍｏｌ／Ｌに希釈した後、前記ウェルに１００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。つぎに、希釈液で１μｍｏｌ/Ｌに希釈したビオチン化ポリｄＴを、前記ウェルに１００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。前記ビオチン化ポリｄＴは、前記実施例１と同じものを使用した。これにより、プレートに固定化された死菌にアプタマーが結合し、さらに、前記アプタマーにおけるポリｄＡに、ビオチン化ポリｄＴが結合する。
続いて、前記ウェルを洗浄液で洗浄した後、１０００倍希釈したストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ、ＧＥ社、＃ＲＰＮ１２３１Ｖ）を１００μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。さらに、前記ウェルを洗浄液で洗浄した後、基質１００μＬを添加し、室温で１５分間、発色反応させた。その後、前記ウェルに１００μＬの停止液を加え、反応を停止した後、プレートリーダー（商品名 Microplate Reader Sunrise Remote、TECAN社）で、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した（ｎ＝３）。
また、ブランクとして、前記ポリｄＡアプタマーを未添加とし、前記死菌が固定化されたプレートに、前記ビオチン化ポリｄＴを添加して、同様にＥＬＡＡを行った。
そして、ブランクの吸光度を１として、各反応について相対値を求めた。これらの結果を図４に示す。図４は、アプタマーとサルモネラとの結合を示すグラフである。図４において、縦軸は、前記結合能を示す波長４５０ｎｍの吸光度の相対値である。各アプタマーについて、各アプタマーについて、（Ａ）がSalmonella enteritidis、（Ｂ）がSalmonella typhimurium、（Ｃ）がSalmonella infantisに対する結合能を示す。
図４に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、ネガティブコントロール（ｐｏｌｙｄＴ）と比較して、サルモネラに対して優れた結合能を示した。
［実施例４］
各アプタマーについて、サルモネラに対する結合を確認した。
（１）アプタマー
前記ＳＡＬ−２３０（配列番号３）およびＳＡＬ−２７８（配列番号８）を小型化した下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。前記アプタマーは、さらに、その３’末端に、２０塩基長のポリｄＡを付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。
ＳＡＬ−２３０＿ｓ４８ （配列番号２３）
GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ−２３０＿ｒａｎｄ（配列番号２４）
GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGG
ＳＡＬ−２７８＿ｓ４９ （配列番号２７）
TGAATTGTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGGCAAAGGTTTCG
ＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）
GTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGG
（２）ＳＰＲによる結合能の解析
サルモネラとしてSalmonella enteritidis、Salmonella typhimuriumおよびSalmonella infantisを使用し、アプタマーとして、前記（１）のアプタマーを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、結合能を解析した。
ＲＵｍａｘの結果を下記表３に、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘの結果を図５に示す。図５は、各サルモネラに対する各アプタマーの結合能を示すグラフである。図５のグラフにおいて、縦軸は、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘである。各アプタマーについて、（Ａ）がSalmonella enteritidis、（Ｂ）がSalmonella typhimurium、（Ｃ）がSalmonella infantisに対する結合能を示す。
Figure 0006012085
図５に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、（Ａ）Salmonella enteritidis、（Ｂ）Salmonella typhimuriumおよび（Ｃ）Salmonella infantisに対して優れた結合能を示した。この結果から、実施例のアプタマーは、優れた結合能で各サルモネラに結合できることがわかった。
［実施例５］
アプタマーを用いたＥＬＡＡにより、サルモネラの検出を行った。
（１）アプタマー
前記実施例４の小型化アプタマーである、ＳＡＬ−２３０＿ｓ４８（配列番号２３）、ＳＡＬ−２３０＿ｒａｎｄ（配列番号２４）、ＳＡＬ−２７８＿ｓ４９（配列番号２７）およびＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）を使用した。また、前記ＳＡＬ−２０４、ＳＡＬ−２４２（配列番号７）、ＳＡＬ−２６２（配列番号９）、ＳＡＬ−３９６（配列番号１０）、ＳＡＬ−４４５（配列番号１１）、ＳＡＬ−４３７（配列番号１２）、ＳＡＬ−４５５（配列番号１４）、ＳＡＬ−１０７（配列番号１５）およびＳＡＬ−４３１（配列番号１６）を小型化した下記ヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。前記アプタマーは、その３’末端に、２０塩基長のポリｄＡを付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＥＬＡＡに使用した。また、ネガティブコントロールとして、前記実施例１と同様のＮ４０を使用し、その３’末端に、同様にしてポリｄＡを付加し、前記ＥＬＡＡに使用した。
ＳＡＬ−２０４＿ｓ４６ （配列番号２１）
GGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ−２０４＿ｒａｎｄ（配列番号２２）
GCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGG
ＳＡＬ−２４２＿ｓ４６ （配列番号２５）
TATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACAT
ＳＡＬ−２４２＿ｒａｎｄ（配列番号２６）
GGGTGCTATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGG
ＳＡＬ−２６２＿ｓ３６ （配列番号２９）
GGTGGGGGGGGTGGGCGCGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ−２６２＿ｒａｎｄ（配列番号３０）
GCCGCGTGAAGAGGTGGGGGGGGTGGGCGCGG
ＳＡＬ−３９６＿ｓ５５ （配列番号３１）
CCCTAAAGTTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ−３９６＿ｒａｎｄ（配列番号３２）
TTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGG
ＳＡＬ−４４５＿ｓ４４ （配列番号３３）
GGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ−４４５＿ｒａｎｄ（配列番号３４）
TCCGGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTG
ＳＡＬ−４３７＿ｓ４１ （配列番号３５）
GGCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGGCAAAGCCGTC
ＳＡＬ−４３７＿ｒａｎｄ（配列番号３６）
GCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGG
ＳＡＬ−４５５＿ｓ４２ （配列番号３７）
GGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ−４５５＿ｒａｎｄ（配列番号３８）
CGTGCGGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCG
ＳＡＬ−１０７＿ｓ４３ （配列番号３９）
GGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ−１０７＿ｒａｎｄ（配列番号４０）
TTGTGGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTG
ＳＡＬ−４３１＿ｓ５６ （配列番号４１）
CTTGTCCCTAAAGTGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGGACAAAGCCGTCGAG
ＳＡＬ−４３１＿ｒａｎｄ（配列番号２０）
TGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGG
（２）ＥＬＡＡ
サルモネラとして、Salmonella enteritidisを使用し、アプタマーとして、前記（１）のアプタマーを使用した以外は、前記実施例３と同様にしてサルモネラの検出を行った。ブランクの吸光度を１として、各反応について相対値を求めた結果を図６に示す。
図６は、アプタマーとサルモネラの結合を示すグラフである。図６において、縦軸は、前記結合能を示す波長４５０ｎｍの吸光度の相対値である。図６に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、サルモネラに対して、前記ネガティブコントロールＮ４０（Ｏ ｐｏｏｌ）よりも優れた結合能を示した。
［実施例６］
各アプタマーについて、サルモネラに対する結合の特異性を確認した。
（１）アプタマー
前記実施例４の小型化アプタマーＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）を使用した。前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。また、ネガティブコントロールとして、３０塩基のランダム配列（Ｎ）３０を含む配列番号４２で表されるオリゴヌクレオチドを複数含むＤＮＡライブラリーを、ネガティブコントロールＮ３０とし、その３’末端に、同様にしてポリｄＡを付加し、後述するＳＰＲに使用した。下記配列において、「Ｎ」は、Ｎ４０と同様とした。
Ｎ３０（配列番号４２）
CCTGCACCCAGTGTCCC-(N)30-GACGGAGAGGAGGACGG
（２）細菌試料
細菌は、Salmonella enteritidis（ＳＥ）、Salmonella typhimurium（ＳＴ）、Eschericia coli O157:H7（０１５７）、Listeria monocytogenes 4a（ＬＭ４ａ）およびListeria monocytogenes 1／2a（ＬＭ１／２ａ）を使用した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、希釈試料を調製し、以下のＳＰＲに使用した。
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
前記ＳＰＲバッファーの組成を、４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨを、７．４とした以外は、前記実施例１（３）と同様にして、結合能を解析した。ＲＵｍａｘおよびＲＵｃｏｎｓｔａｎｔの結果を図７に示す。
図７は、アプタマーの結合能を示すグラフである。図７において、（Ａ）は、ＲＵｍａｘの結果を示し、（Ｂ）は、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔの結果を示す。図７において、横軸は、アプタマーの種類を示し、（Ａ）において、縦軸は、ＲＵｍａｘを示し、（Ｂ）において、縦軸は、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔを示す。図７に示すように、ＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄは、ネガティブコントロールに対して、サルモネラに優れた結合能を示した。また、ＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄは、Eschericia coli O157:H7、Listeria monocytogenes 4aおよびListeria monocytogenes 1/2aには結合せず、Salmonella enteritidisおよびSalmonella typhimuriumのみに対して、優れた結合能を示した。
［実施例７］
標識化相補鎖とアプタマーとをハイブリダイズした標識化アプタマーを用いた蛍光偏光法により、サルモネラの検出を行った。
（１）標識化アプタマー
まず、前記実施例４の小型化アプタマーＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）の３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーを調製した。このポリｄＡ付加アプタマー（１ｎｍｏｌ／Ｌ）を、９５℃で３分処理した後、１分間氷冷してフォールディングさせた。
他方、標識化相補鎖として、２４塩基長のデオキシチミジンの５’末端をＡｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で標識した標識化ポリｄＴを調製した。そして、ＳＢ１Ｔ緩衝液（４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４）中で、前記フォールディングさせた前記ポリｄＡ付加アプタマーと前記標識化ポリｄＴとを、室温で１０分間インキュベートし、前記ポリｄＡ付加アプタマーのポリｄＡ部分に前記標識化ポリｄＴをハイブリダイズさせ、標識化ハイブリッドアプタマーを調製した。
また、ネガティブコントロールとして、前記小型化アプタマーに代えて前記実施例１と同様のＮ４０を使用し、その３’末端に、同様にしてポリｄＡを付加し、前記標識化ポリｄＴをハイブリダイズさせ、標識化ハイブリッドアプタマーを調製した。
（２）細菌試料
細菌は、Salmonella enteritidis（ＳＥ）、Salmonella typhimurium（ＳＴ）、Eschericia coli O157:H7（Ｏ１５７）、Listeria monocytogenes 4a（ＬＭ４ａ）およびListeria monocytogenes 1／2a（ＬＭ１／２ａ）を使用し、ＰＢＳ緩衝液に代えて、前記ＳＢ１Ｔ緩衝液を使用した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、希釈試料を調製した。また、前記希釈試料に代えて、ＳＢ１Ｔ緩衝液を使用し、これをコントロールとした。
（３）蛍光偏光法による解析
前記（１）で調製した１ｎｍｏｌ／Ｌの前記標識化ハイブリッドアプタマー１μＬに、前記希釈試料中の死菌の濃度が１０８細胞／ｍＬとなるよう前記希釈試料を添加し、室温１５分間反応させた。これにより、前記標識化アプタマーとサルモネラとの複合体を形成させた。前記反応後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、前記反応液の蛍光偏光度を測定した。偏光励起光の波長は、６３５ｎｍとし、偏光度の検出波長は、６６５ｎｍとした（以下、同様）。偏光度の測定結果を図８に示す。
図８は、蛍光偏光度の結果を示すグラフである。図８において、横軸は、アプタマーの種類を示し、縦軸は、蛍光偏光度を示す。前記ポリｄＡ付加アプタマーには、前記標識化ポリｄＴがハイブリダイズしているため、前記ポリｄＡ付加アプタマーのアプタマー部分にサルモネラが結合すると、分子量の増大により、蛍光偏光度が増加する。図８に示すように、ＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄは、ネガティブコントロールよりも、サルモネラに対して高い蛍光偏光度を示した。このことから、蛍光偏光度により、ＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄがサルモネラに結合することがわかった。また、ＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄは、Eschericia coli O157:H7、Listeria monocytogenes 4aおよびListeria monocytogenes 1/2aに対して、ネガティブコントロールと同等の蛍光偏光度を示した。このことから、蛍光偏光度により、ＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄがサルモネラ以外に結合しないことがわかった。
［実施例８］
アプタマーを用いた蛍光偏光法により、サルモネラの検出を行った。
（１）標識化アプタマー
前記実施例４の小型化アプタマーＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）を用いて、以下に示すように、３種類の標識化アプタマーを調製した。１つ目の標識化アプタマーは、標識化相補鎖とハイブリダイズさせた標識化ハイブリッドアプタマーであり、前記実施例７と同じものを使用した。２つ目の標識化アプタマーは、前記小型化アプタマーの５’末端に５塩基のポリｄＴを付加し、前記ポリｄＴの５’末端をＡｌｅｘａ６４７で標識したものを使用した（５’末端標識アプタマー）。３つ目の標識化アプタマーは、前記小型化アプタマーの３’末端に５塩基のポリｄＴを付加し、前記ポリｄＴの３’末端をＡｌｅｘａ６４７で標識したものを使用した（３’末端標識アプタマー）。
また、ネガティブコントロールとして、前記実施例６のＮ３０を使用し、３’末端に２０塩基のポリＡを付加し、前記標識化ポリｄＴをハイブリダイズさせた標識化ハイブリッドアプタマーを使用した。
（２）細菌試料
細菌は、Salmonella typhimuriumを用い、ＰＢＳ緩衝液に代えてＳＢ１Ｔ緩衝液を使用した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、希釈試料を調製した。また、前記希釈試料に代えて、ＳＢ１Ｔ緩衝液を使用し、これをコントロールとした。
（３）蛍光偏光法による解析
前記（１）の各標識化アプタマーを使用した以外は、前記実施例７（３）と同様にして、蛍光偏光度を測定した。蛍光偏光度の測定結果を図９に示す。
図９は、蛍光偏光度の結果を示すグラフである。図９において、横軸は、アプタマーの種類を示し、縦軸は、蛍光偏光度を示す。前記各標識化アプタマーは、それぞれ標識物質で標識化されているため、前記各標識アプタマーのアプタマー部分にサルモネラが結合すると、分子量の増大により、蛍光偏光度が増加する。図９に示すように、標識化ハイブリッドアプタマー（ハイブリッド）、前記５’末端標識アプタマー（５’標識）および前記３’末端標識アプタマー（３’標識）は、それぞれ、ネガティブコントロールよりも、サルモネラに対して高い蛍光偏光度を示した。中でも、前記５’末端標識アプタマーおよび前記３’末端標識アプタマーは、高い蛍光偏光度を示し、特に、前記５’末端標識アプタマーが、極めて高い蛍光偏光度を示した。これらの結果から、蛍光偏光法により、ＳＡＬ−２７８＿ｒａｎｄが、サルモネラに結合することがわかった。
［実施例９］
アプタマーを用いた蛍光偏光法により、サルモネラの検出を行った。
（１）アプタマー
前記実施例８の５’末端標識アプタマーを使用した。また、ネガティブコントロールとして、前記実施例１のＮ４０の３’末端に２０塩基のポリｄＡを付加し、前記標識化ポリｄＴをハイブリダイズさせた標識化ハイブリッドアプタマーを使用した。
（２）細菌試料
細菌は、Salmonella typhimuriumを用い、ＰＢＳ緩衝液に代えてＳＢ１Ｔ緩衝液を使用した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、ＳＢ１Ｔ希釈試料を調製した。また、ＰＢＳ緩衝液に代えて、トリプトソーヤブイヨン（ＴＳＢ）培養液を使用した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、ＴＢＳ希釈試料を調製した。
（３）蛍光偏光法による解析
前記（１）の標識化アプタマーを使用し、前記希釈試料における死菌の濃度が、所定濃度（１０６細胞／ｍＬ、１０７細胞／ｍＬまたは１０８細胞／ｍＬ）となるように前記各希釈試料を添加した以外は、前記実施例７（３）と同様にして、前記反応液の蛍光偏光度を測定した。蛍光偏光度の測定結果を図１０に示す。
図１０は、蛍光偏光度の結果を示すグラフである。図１０において、（Ａ）は、前記ＳＢ１Ｔ希釈試料を用いた結果であり、（Ｂ）は、前記ＴＢＳ希釈試料を用いた結果である。図１０（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、サルモネラの濃度を示し、縦軸は、蛍光偏光度を示す。図１０（Ａ）および（Ｂ）に示すように、前記ＳＢＴ１希釈試料および前記ＴＢＳ希釈試料のいずれを使用した場合も、ネガティブコントロールに対して、高い蛍光偏光度を示し、１０６細胞／ｍＬのサルモネラ濃度であっても、蛍光偏光法により、サルモネラを検出できることがわかった。
［実施例１０］
アプタマーを用いたＥＬＡＡにより、アプタマーのサルモネラに対する解離定数を測定した。
（１）アプタマー
前記実施例１で使用したＳＡＬ−２７８（配列番号８）の３’末端をビオチン化したビオチン化アプタマーを使用した。
（２）細菌試料
前記実施例３と同様に、Salmonella enteritidisおよびSalmonella typhimuriumの死滅細菌を使用した。前記細菌を、１×１０８細胞／ｍＬとなるように、ＰＢＳ緩衝液で希釈した。この希釈試料を、以下のＥＬＡＡで使用した。
（３）ＥＬＡＡ
プレートとして、９６穴プレート（商品名 ＰＳ−ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ、ｇｒｅｉｎａｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ社）を用いた以外は、前記実施例３と同様にして、前記希釈試料中の死菌を固定化したプレートを作製した。そして、前記希釈液で、前記ポリｄＡ付加アプタマーを所定濃度（０．０６、０．１２５、０．２５、０．５、１または２μｍｏｌ／Ｌ）に希釈した後、前記ウェルに１００μＬ添加した以外は、前記実施例３と同様にして、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した（ｎ＝３）。
また、ブランクとして、前記ビオチン化アプタマーを未添加とし、同様にＥＬＡＡを行った。そして、前記吸光度のフィッティングカーブから、前記ビオチン化アプタマーのサルモネラに対する解離定数を算出した。
これらの結果を図１１に示す。図１１は、アプタマーとサルモネラとの結合を示すグラフである。図１１において、横軸は、アプタマーの濃度を示し、縦軸は、前記結合能を示す波長４５０ｎｍの吸光度を示し、図中の黒抜きの丸（●）は、Salmonella enteritidisを用いた場合の結果を示し、白抜きの丸（○）は、Salmonella typhimuriumを用いた場合の結果を示す。
図１１に示すように、前記ビオチン化アプタマーの濃度依存的に、吸光度が上昇した。また、ＳＡＬ−２７８のSalmonella enteritidisのに対する解離定数は、５４０ｎＭであり、Salmonella typhimuriumに対する解離定数は３１０ｎＭであった。これらの結果から、ＳＡＬ−２７８が、サルモネラに対し極めて優れた結合力を示すことがわかった。
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
この出願は、２０１２年１１月１３日に出願された日本出願特願２０１２−２４９６６５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
本発明の核酸分子は、サルモネラに結合可能であり、中でも、食中毒の原因菌であるＯ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群に属するサルモネラに特異的に結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、例えば、サルモネラとの結合によって、サルモネラを検出できる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、食品管理、公衆衛生等の分野におけるサルモネラの検出に、極めて有用なツールとなる。

Claims (11)

  1. 下記（ａ）および（ｃ）の少なくとも一方のポリヌクレオチドを含み、
    前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡであることを特徴とするサルモネラに特異的に結合する核酸分子。
    （ａ）配列番号１、３、７〜１２および１４〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
  2. 前記ポリヌクレオチドが、Ｏ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群のサルモネラに結合するポリヌクレオチドである、請求項１記載の核酸分子。
  3. 試料と請求項１または２記載の核酸分子とを接触させ、前記試料中のサルモネラと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のサルモネラを検出する工程を含むことを特徴とする、サルモネラの検出方法。
  4. 検出対象のサルモネラが、Ｏ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群のサルモネラである、請求項３記載の検出方法。
  5. 前記試料が、死菌試料である、請求項３または４記載の検出方法。
  6. 前記試料が、培養試料である、請求項３から５のいずれか一項に記載の検出方法。
  7. 前記検出工程において、カリウムイオンおよびマグネシウムイオンの存在下、前記試料と前記核酸分子とを接触させる、請求項３から６のいずれか一項に記載の検出方法。
  8. 請求項１または２記載の核酸分子を含むことを特徴とする、サルモネラの検出試薬。
  9. 請求項１または２記載の核酸分子を含むことを特徴とする、サルモネラの検出キット。
  10. さらに、カリウム化合物およびマグネシウム化合物を含む、請求項９記載の検出キット。
  11. 請求項１または２記載の核酸分子を含むことを特徴とする、サルモネラの検出デバイス。
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