KR20120133408A - 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents
리스테리아 모노사이토제네스 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 세포 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 세포 표면에 특이적으로 결합하는 활성을 가짐으로써, 예를 들어 축산품, 가공식품, 유제품, 식수, 조리기구, 수자원 등의 시료에서 리스테리아 모노사이토제네스의 생균을 검출하고, 리스테리아증의 진단에 유용한 정보를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
자연계에서 흔하게 발견되고 인수공통 전염병을 유발하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 인체 감염시 초기 가벼운 두통 및 복통을 유발하는 식중독을 유발하나 인체 중추 신경계로 감염될 경우 구토, 발열, 불안 등을 포함한 전구증상과 전형적인 뇌수막염, 패혈증 또는 뇌염 등 리스테리아증을 유발하여 인간의 생명을 치명적으로 위협하는 고위험 병원성 미생물이다. 리스테리아증의 주증세인 뇌수막염은 주로 노년과 면역부전 환자에게서 나타나며, 1차 패혈증 또는 심내막염을 유발하기도 한다. 특히, 임산부는 정상인에 비해 약 20배 이상 높은 감염 위험성을 보이며, 리스테리아 모노사이토제네스 감염은 조기 분만, 자연 유산, 사산, 태아 감염 등을 유발하며, 감염 산모 및 태아는 뇌수막염 혹은 심내막염 등의 심각한 합병증을 일으켜 사망에 이르게 하는 것으로 알려져 있다. 리스테리아 모노사이토제네스는 저온과 고온(0 - 45℃)에서 성장이 가능하고, 잠복기가 70 - 90일에 달하며, 치사율이 20 - 30％에 달하여 매년 전 세계적으로 병원성 리스테리아 모노사이토제네스에 의한 리스테리아 감염 질환 환자의 및 사망자가 증가하고 있는 가운데 일상생활에서 흔히 접하게 되는 가공식품, 샐러드, 조리기구, 다양한 농축산물 등 일반 환경 내 어디든 존재하고 있어 수시로 국민 건강을 위협하고 있다.
상기한 바와 같이 치명적인 질환을 유발하는 리스테리아 모노사이토제네스는 수입 축산, 수입 가공식품 증가, 지구 온난화 및 기상이변으로 인한 국내 평균기온의 상승으로 각종 병원성 미생물에 의한 보건 환경성 질환 발생건수 및 인체 감염 및 공공환경으로의 전염속도가 급속하게 증가가 심각해지고 있다. 이에 가공식품, 수입축산품, 유제품 등 다양한 식품, 식수 등의 환경에 포함된 리스테리아 모노사이토제네스를 효과적으로 검출할 수 있는 기술 개발이 요구되고 있다.
종래 식품, 식수 등의 환경에 포함되어 있는 리스테리아 모노사이토제네스의 조기 검출 및 확인을 위한 방법으로는 3M petrifilm 법, PCR 법, 생화학적 검사 및 ELISA 기법을 이용한 진단 방법 등이 이용되고 있다. 이러한 방법들은 검출 효율을 높이기 위해서 샘플내 DNA 추출 및 목적 미생물 분리, 배양 단계를 거쳐야하는 단점을 가지고 있어 샘플 전처리 후 병원성 미생물의 검출 확인까지의 긴 시간이 소요되며, 결과 해석 시에도 모호한 경우가 많아 정확한 검출 및 확인을 위해서는 두 세가지의 실험을 병행해야하는 문제로 인해 대량 샘플 처리는 불가능한 단점을 가지고 있다. 따라서 대규모의 시료를 빠르고 간단하게 처리 할 수 있는 고효율의 리스테리아 모노사이토제네스 검출 시스템 개발이 절실히 요구된다.
앱타머는 짧은 길이의 올리고머로 안정된 삼차구조 형성을 통하여 표적 물질과 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 특징을 가지고 있다. 또한 화학적 합성 기법을 이용하여, 단시간, 저비용으로 대량 생산이 가능하며 한번 제작, 생산 후 동일한 능력을 가지는 앱타머를 지속적으로 생산 가능한 탁월한 장점을 갖고 있다. 뿐만 아니라, 주변의 pH와 온도에 매우 안정성이 높아 최근 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발 등 환경, 의료 등 다양한 분야에서의 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 리스테리아증을 유발하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)를 생균 상태로 검출하는 사용될 수 있는 DNA 앱타머(aptamer)를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 생균 상태의 리스테리아 모노사이토제네스의 세포 표면에 높은 특이도로 결합하는 DNA 앱타머를 합성 및 선별하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 검출 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 DNA 앱타머는 서열목록 제1서열 내지 제12서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 DNA 앱타머는 서열목록 제1서열 내지 제12서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트는 DNA 앱타머가 기판상에 고정화된 마이크로어레이 형태이다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 검출 방법을 제공한다: (a) 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균을 확인하는 단계.
본 발명은 리스테리아증을 유발하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)의 살아있는 균의 세포 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "DNA 앱타머(aptamer)"는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 "DNA 앱타머"는 "DNA 올리고뉴클레오타이드"와 혼용하여 사용한다.
본 명세서에서 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 본 명세서에서 "SELEX 방법"이란 임의적으로 합성된 DNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 의미한다(Louis et al. 1992. Nature 355, 564-566). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 DNA 앱타머는 다음의 단계를 통해 선별된다: (ⅰ) PCR과 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, ssDNA 앱타머를 제조하는 단계; (ⅱ) 리스테리아 모노사이토제네스를 배양하고 세척하는 단계; 및 (ⅲ) 리스테리아 모노사이토제네스 생균을 이용한 Live Cell SELEX 기법을 통해 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 세포 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계(도 2 참조).
(ⅰ) PCR과 비대칭(asymmetric)PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, ssDNA 앱타머를 제조하는 단계.
PCR을 이용하여 랜덤 dsDNA 라이브러리를 증폭한다. 증폭된 랜던 ds DNA 라이브러리에서 ssDNA 만을 증폭하기 위해 비대칭 PCR을 수행한다. 비대칭 PCR은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 10:1 비율, 예를 들면, 동일한 농도(25 μM)에서 정방향 프라이머를 10 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕를 사용하여 PCR을 수행함으로써 단일가닥 DNA를 수득하는 방법이다. ssDNA 앱타머를 선별하는 방법은 예를 들면, PCR 수행시 역방향 프라이머에 바이오틴(biotin)을 부착시켜 dsDNA를 증폭하고, 증폭 산물에 스트렙트아비딘을 처리하여 바이오틴-스트렙트아비딘 복합체를 형성하여 복합체를 선택적으로 제거함으로써 ssDNA 앱타머만을 선별할 수 있게 된다. 수득한 ssDNA 앱타머에 S1 nuclease를 처리하여 ssDNA인지를 확인할 수 있다(도 1 참고). 제조한 ssDNA 앱타머는 SELEX 방법에 사용하기 위해 ssDNA를 가열하여 변성시킨 후 상온에서 천천히 식혀 3차원 구조를 형성시킨다.
(ⅱ) 리스테리아 모노사이토제네스를 배양하고 세척하는 단계.
리스테리아 모노사이토제네스의 생균의 표면에 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위해, 리스테리아 모노사이토제네스를 배양하여 생균 상태로 유지하고 이를 세척한다.
(ⅲ) Live Cell SELEX 기법을 통해 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 세포 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계.
상기 준비한 리스테리아 모노사이토제네스 생균과 ssDNA 앱타머를 서로 접촉하여 반응시킨 후, 결합하지 않는 ssDNA 앱타머는 세척하여 제거하고 특이적으로 결합하는 ssDNA만을 용출시킨다. 이 단계에서 다른 세균 예를 들어 그람 음성의 대장균과 그람 양성의 바실러스 균에 결합하는 ssDNA를 제거하는 Negative SELEX 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서는 리스테리아 모노사이토제네스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 최대로 용출되는 최적의 SELEX 라운드를 선택하기 위해 용출된 ssDNA를 (a) 나노드랍 방법으로 정량하는 방법과, (b) 실시간 PCR 방법을 통해 정량하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서 최적 SELEX 라운드 중 리스테리아 모노사이토제네스와 최적 결합력을 보이는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 최적 SELEX 라운드 선별과 마찬가지로 최적 라운드에서 확보한 앱타머 서열 각각을 모두 확보하여 동일한 농도의 ssDNA로 제작 후 SELEX를 진행한 뒤 나노드랍(Nanodrop)을 이용하여 용리된 앱타머 농도를 나노드랍 방법을 통해 측정함으로서 최적 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머를 선별하였다.
본 발명의 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열목록 제 1 서열 내지 제 12 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.
한편, 본 발명의 서열목록 제 1 서열 내지 제 12 서열의 DNA 앱타머는 본 명세서 도 4에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.
본 발명의 DNA 앱타머는 리스테리아 모노사이토제네스 생균 표면에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 12 서열 중 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 검출용 조성물에 관한 것이다. 하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 DNA 앱타머는 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 세포 표면에 특이적으로 결합하므로, 시료 내에 살아있는 리스테리아 모노사이토제네스의 존재 여부를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 검출용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태일 수 있으며, 또는 DNA 앱타머가 기판상에 고정화된 마이크로어레이 형태일 수 있다. DNA 앱타머를 칩이나 기판상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 칩 또는 기판을 스트렙트아비딘(streptavidin)으로 개질하고, DNA 앱타머의 5' 말단은 비오티닐화(biotinylation)시킨 후, DNA 앱타머의 비오틴과 지지체의 스트렙트아비딘과의 결합을 이용하여 고정화한다.
본 명세서에서 상기 용어 "마이크로 어레이" 는 기판의 특정의 영역에 DNA 핵산 물질이 고밀도로 부착된 어레이(배열)를 의미한다. 본 명세서에서 용어 마이크로어레이의 "기판"은 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 막(membrane), 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기판에 결합될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 예를 들어, 비오티닐화화될 수 있고, 이는 스트랩트아비딘이 코팅된 기판상에 성공적으로 결합될 수 있다.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 검출 방법에 관한 것이다: (a) 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균을 확인하는 단계.
본 발명의 DNA 앱타머는 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 표면에 결합하는 능력이 매우 뛰어나므로 DNA 앱타머와 리스테리아 모노사이토제네스를 함유할 것으로 예상되는 시료를 접촉시켜 상기 세균를 검출할 수 있다. 상기 DNA 앱타머에 결합된 리스테리아 모노사이토제네스의 검출은 DNA 앱타머와 리스테리아 모노사이토제네스 결합 복합체를 검출하는 방법에 기초할 수 있다. 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 DNA 앱타머가 형광물질, 예를 들어 플루오레세인(fulorescein), Cy3 또는 Cy5; 방사성물질, 또는 화학물질, 예를 들어 비오틴(biotin)으로 표지되거나 1차 아민(primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 리스테리아 모노사이토제네스가 포함될 것으로 예상되는 시료는 예를 들어 축산품, 가공식품, 유제품, 식수, 조리기구, 수자원을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 세포 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 세포 표면에 특이적으로 결합하는 활성을 가짐으로써, 예를 들어 축산품, 가공식품, 유제품, 식수, 조리기구, 수자원 등의 시료에서 리스테리아 모노사이토제네스의 생균을 검출하고, 리스테리아증의 진단에 유용한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 및 비대칭 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과와 회수된 ssDNA에 S1 nuclease 처리한 결과를 아가로스 전기영동을 통하여 확인한 결과를 나타낸다. 레인 1: 100 bp DNA 마커; 레인 2: DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과; 레인 3: 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 회수한 ssDNA에 S1 nuclease를 처리한 결과이다.
도 2는 리스테리아 모노사이토제네스와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위한 Live cell SELEX 실험 모식도를 나타내는 것이다. (a) 과정은 리스테리아 모노사이토제네스와의 결합을 유도할 ssDNA 앱타머 제작 및 구조 형성과정이고; (b) 과정은 ssDNA와 결합을 유도할 리스테리아 모노사이토제네스 확보 과정이다. 상기의 (a) 및 (b) 과정에서 확보한 ssDNA 앱타머와 리스테리아 모노사이토제네스의 결합을 유도하고 리스테리아 모노사이토제네스의 표면에 결합한 ssDNA 앱타머만을 회수하는 과정, 회수 후 SELEX를 재진행할 경우 다시 (a), (b) 과정으로 돌아가 반복실험을 하고 SELEX의 마지막엔 회수된 ssDNA 앱타머를 T-vector에 클로닝함으로서 서열을 확인하는 과정을 포함한다.
도 3은 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 제작을 위한 SELEX 과정에서 각 라운드에서 회수된 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용해 정량적으로 측정한 양을 나타낸 것이다.
도 4는 리스테리아 모노사이토제네스의 표면과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 총 12개의 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 스트렙트아비딘이 코팅된 SA 칩 표면에 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머를 고정시키고 여기에 리스테리아 모노사이토제네스 생균을 결합시키는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA의 간이 검출 키트(kit)의 모식도를 나타낸 것이다. (a)는 리스테리아 모노사이토제네스 간이 검출 키트(kit)를 도식화한 것이다. (b)는 리스테리아 모노사이토제네스 간이 검출 키트(kit)의 사용 방법을 나타낸 것이다. 상기의 (a), (b)를 통하여 시료내의 리스테리아 모노사이토제네스를 신속하게 검출 가능하며, 리스테리아증이 의심되는 동물이나 사람의 피를 시료로 사용하는 경우 리스테리아증의 진단에도 활용할 수 있다.
도 2는 리스테리아 모노사이토제네스와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위한 Live cell SELEX 실험 모식도를 나타내는 것이다. (a) 과정은 리스테리아 모노사이토제네스와의 결합을 유도할 ssDNA 앱타머 제작 및 구조 형성과정이고; (b) 과정은 ssDNA와 결합을 유도할 리스테리아 모노사이토제네스 확보 과정이다. 상기의 (a) 및 (b) 과정에서 확보한 ssDNA 앱타머와 리스테리아 모노사이토제네스의 결합을 유도하고 리스테리아 모노사이토제네스의 표면에 결합한 ssDNA 앱타머만을 회수하는 과정, 회수 후 SELEX를 재진행할 경우 다시 (a), (b) 과정으로 돌아가 반복실험을 하고 SELEX의 마지막엔 회수된 ssDNA 앱타머를 T-vector에 클로닝함으로서 서열을 확인하는 과정을 포함한다.
도 3은 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 제작을 위한 SELEX 과정에서 각 라운드에서 회수된 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용해 정량적으로 측정한 양을 나타낸 것이다.
도 4는 리스테리아 모노사이토제네스의 표면과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 총 12개의 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 스트렙트아비딘이 코팅된 SA 칩 표면에 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머를 고정시키고 여기에 리스테리아 모노사이토제네스 생균을 결합시키는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA의 간이 검출 키트(kit)의 모식도를 나타낸 것이다. (a)는 리스테리아 모노사이토제네스 간이 검출 키트(kit)를 도식화한 것이다. (b)는 리스테리아 모노사이토제네스 간이 검출 키트(kit)의 사용 방법을 나타낸 것이다. 상기의 (a), (b)를 통하여 시료내의 리스테리아 모노사이토제네스를 신속하게 검출 가능하며, 리스테리아증이 의심되는 동물이나 사람의 피를 시료로 사용하는 경우 리스테리아증의 진단에도 활용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예
1:
DNA
앱타머의
제작
1. PCR 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭
리스테리아 모노사이토제네스에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 40개의 연속 랜덤 뉴클레오타이드를 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 가지는 서열을 포함하는 100bp의 주형 DNA (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT- N40-AGATTGCACTTACTATCT-3'; 서열목록 제13서열)와 이를 증폭할 수 있는 프라이머 한 쌍을 바이오니아(Bioneer, Korea)에 주문 제작하였다(정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'(서열목록 제14서열), 바이오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머: 5'-바이오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3'(서열목록 제15서열)). 임의의 DNA 라이브러리는 PCR(Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭하였다. PCR에 의한 100bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 반응 조성은 주형 DNA 1-2㎕, 10X PCR 완충용액 5㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4㎕, 25 μM 정방향 프라이머 2㎕, 25μM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2㎕, Ex Taq 중합효소(TaKaRa, Japan) 0.3㎕ (1unit/㎕)와 35.7 - 34.7㎕의 물로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성 시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 10주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 2％ 아가로스 겔을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다. 나머지 DNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)을 이용하여 DNA만을 회수하였다.
2. 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 활용한 ssDNA 증폭
PCR 기법을 이용하여 증폭한 dsDNA 중 ssDNA만을 증폭하기 위하여 비대칭 PCR를 수행하였다. 비대칭 PCR 반응 조성은 1.1을 통하여 획득한 주형 DNA 50㎕, 10X PCR 완충용액 10㎕, 10mM dNTP 혼합물 8㎕, 25μM 정방향 프라이머 10㎕, 25μM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 1㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.5㎕ (1 unit/㎕)와 20.5㎕의 물로 이루어져 있다. 비대칭 PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 2％ 아가로스 겔을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였으며, 나머지 DNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)을 이용하여 DNA만을 회수하였다.
3. ssDNA의 선별 및 회수
비대칭 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물 중 바이오틴이 붙어 있는 dsDNA 및 ssDNA를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, 상술한 비대칭 PCR 방법에서 획득한 DNA 50㎕에 증류수 50㎕를 첨가 후, 스트렙트아비딘(Pierce, USA) 50㎕를 첨가 하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 10분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 1/10 부피의 3M NaOAc (pH 4.5)와 2~3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 동안 방치하였다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 DNA만을 회수하였다. 회수된 DNA는 공기 중에서 말린 후, 50㎕의 증류수에 녹인다. 회수된 DNA 중 4㎕를 취하여 2％ 아가로스 겔을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다(도 1, 레인 2 참고). 나머지 DNA 중 2㎕를 취하여 S1 nuclease를 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 2％ 아가로스 겔을 이용하여 회수한 ssDNA가 완벽하게 제거됨을 확인하였다(도 1, 레인 3 참고).
실시예 2: Live Cell SELEX 기법을 이용한 리스테리아 모노사이토제네스와 특이적으로 결합하는 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머 선별
1. SELEX에 이용되는 각 용액의 조성
리스테리아 모노사이토제네스(ATCC 19115) 배양 배지는 Brain Heart Infusion broth (Difco, USA)를 사용하였고, 세척 용액 (리스테리아 모노사이토제네스 세척용, 리스테리아 모노사이토제네스와 비결합 ssDNA 제거용)은 Tris base 10 mmol/L, NaCl 0.85％, pH 8.0를 사용하였으며, 2X DNA 앱타머 선별 용액은 2 X Brain Heart Infusion broth를 사용하였다. DNA 앱타머 용출 용액은 10 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA를 사용하였다.
2. SELEX에 이용될 ssDNA 앱타머 구조 제작
리스테리아 모노사이토제네스에 특이적으로 결합하는 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 기 제작 확보한 ssDNA 40㎕에 증류수 60㎕를 첨가하고, 2X DNA 앱타머 선별 용액 100㎕을 첨가한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성(Denaturation) 시켰다가 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성시켰다.
3. 생세포 SELEX 방법을 이용한 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 선별
리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 선별을 위하여 먼저 리스테리아 모노사이토제네스(ATCC 19115)를 리스테리아 모노사이토제네스 배양 배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 15시간 동안 교반배양기에서 배양하여 리스테리아 모노사이토제네스를 확보하고, 확보한 리스테리아 모노사이토제네스의 표면에 잔여물을 세척하기 위하여 원심분리기를 이용하여 리스테리아 모노사이토제네스를 침전 시킨 후 배양 배지를 완전히 제거하고 세척 용액 200 ㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 리스테리아 모노사이토제네스의 표면을 세척하였다. 상기의 과정을 3번 반복하여 리스테리아 모노사이토제네스 표면에 잔여물을 제거하였다. 그 후 상온에서 식혀 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 200 ㎕를 넣고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 리스테리아 모노사이토제네스 표면에 특이적으로 결합하지 않은 ssDNA 앱타머는 세척 용액을 이용하여 모두 제거하였다. 리스테리아 모노사이토제네스 표면에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머는 DNA 앱타머 용출 용액 50 ㎕를 첨가한 뒤, 85℃에서 5분간 반응시켰고, 회수된 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머만을 용출하였다.
4. Negative SELEX을 통한 비특이적 ssDNA 제거
리스테리아 모노사이토제네스의 표면이 아닌 배양 배지나 타 성분에 결합하는 ssDNA를 제거하고, 리스테리아 모노사이토제네스에만 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 SELEX 5 라운드 후 그람 음성균인 대장균을 이용한 Negative SELEX(NS)와, SELEX 7 라운드 후 그람 양성균인 바실러스를 이용한 Negative SELEX(NS)을 진행하였다. 동일하게 생세포(live cell)을 이용하여 SELEX를 진행하고 타 세균의 표면에 결합하는 ssDNA는 제거하고 이에 결합하지 않은 ssDNA만을 회수하였다. 이후 SELEX는 총 10 라운드까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 라운드가 증가할수록 반응 조건을 엄격하게 하여 리스테리아 모노사이토제네스 생균의 표면에 더욱 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 얻었다.
실시예
3:
리스테리아
모노사이토제네스와
특이적으로 결합하는 최적
SELEX
라운드 선별을 위한 친화성 확인
1. 나노드랍(Nano-drop)을 이용한 리스테리아 모노사이토제네스 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 라운드의 선별
SELEX를 10 라운드 까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 회수된 리스테리아 모노사이토제네스 표면에 결합한 ssDNA의 농도를 나노드랍(Nano-drop)을 이용하여 측정하였다. 나노드랍(NanoDrop ND-1000 spectrophotometer, BCM, USA)을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 9 라운드의 농도가 265.6 ng/㎕로 가장 높았으며, 10 라운드의 농도는 242.1 ng/㎕로 9 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 리스테리아 모노사이토제네스에 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 9 라운드 풀임을 확인할 수 있었다(도 3 참고).
2. 실시간 PCR을 통한 SELEX 라운드의 선별
SELEX를 10회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다. 먼저 초기 DNA 라이브러리와 최종 Negative SELEX 이후인 8 라운드, 9 라운드, 10 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머들을 PCR을 통하여 증폭하고, 비대칭 PCR을 진행하여 ssDNA를 확보하였다. 각 0, 8, 9, 10 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머는 동일한 농도로 준비하여 다시 한번 SELEX 라운드를 진행하였다. 이로서 리스테리아 모노사이토제네스에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수하였다. 이후, 획득된 각 ssDNA들은 각각 100, 10-1, 10-2로 희석하여 실시간 PCR의 주형 DNA로 사용하였다. 실시간 PCR은 Biorad사의 iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 먼저, 94℃에서 5분 변성 이후, 94℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응하는 과정을 40주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 결과는 10-2로 희석된 샘플을 주형 DNA로 이용한 실험에서 결과를 획득할 수 있었다. 실시간 PCR 효율은 각 라운드별로 각각 78.66％, 84.6％, 70.45％였으며, 8 라운드와 10 라운드에서 획득한 ssDNA를 주형 DNA로 이용한 실시간 PCR 결과 효율은 78.66％, 70.45％로 9 라운드의 결과 보다 효율이 떨어지는 것으로 보아 더 이상 SELEX를 진행이 필요 없음을 확인할 수 있었다(표 1 참고). 이는 나노드랍(Nano-drop)을 이용하여 확인한 각 라운드별 앱타머 회수양 측정 결과와도 일치하는 결과임을 확인할 수 있었다.
| 8R (1 X 10 -2 ) | 9R (1 X 10 -2 ) | 10R (1 X 10 -2 ) | |
| Efficiency(％) | 78.66 | 84.6 | 70.45 |
| C(t) | 9.74 | 8.08 | 9.02 |
실시예
4:
리스테리아
모노사이토제네스
표면 결합
DNA
앱타머
후보군의
클
로닝
나노드랍(Nano-drop)과 실시간 PCR을 통하여 리스테리아 모노사이토제네스와 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단되는 9 라운드의 ssDNA 앱타머에 대해 정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'(서열번호 14)와 역방향 프라이머: 5'-바이오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3'(서열번호 15)를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA는 QIAGEN의 PCR 클로닝 키트를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (50ng/㎕) 1㎕와 PCR 산물 (20ng/㎕) 4㎕, 라이게이션 마스터 믹스 버퍼 5㎕를 섞어서 16℃에서 30분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. TA 클로닝한 라이게이트(ligate) 10㎕는 200㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 1분 30초 동안 열충격(heat shock)을 준 후 바로 얼음에 놓아두었다. 이후 여기에 800㎕의 LB broth를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 200㎕의 용액을 취하여 앰피실린(ampicillin, 50㎍/㎖), 카나마이신(kanamycin, 50㎍/㎖), X-gal(50㎍/㎖), IPTG (5㎍/㎖)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 스프레딩하고 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후 흰색 콜로니만을 선별하여 솔젠트(Solgent, Korea)에 의뢰하여 앱타머의 염기서열을 결정하였다. 서열 분석을 통하여 중복되지 않은 서열 12개의 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머를 확보할 수 있었다. 아래 표 2는 생세포(live cell) SELEX 방법을 활용하여 획득한 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머 후보군 12개에 대한 서열을 나타낸 것이다.
|
클론
명칭 |
서열
번호 |
선별된 서열 |
서열
크기 (bp) |
동일
서열 수 |
| LMCA-1 | 서열번호 1 | TAGACGAATGTGCCCCGCGGTTTAGTTACGCTTGACATTGG | 41 | 1 |
| LMCA-2 | 서열번호 2 | CGCTCCAGTATCAATGACTTACATCCCGTCAGCAATGTGG | 40 | 1 |
| LMCA-3 | 서열번호 3 | CAGAACGGACCGAGTTTTATTTATTTTACTCCTACTCGAAC | 41 | 2 |
| LMCA-4 | 서열번호 4 | CGAGTCGCAGTGAGACCACCTCTTGGCCCCGTTTACGAGG | 40 | 1 |
| LMCA-5 | 서열번호 5 | TGGTCACAGGTAGTTGGTGCGTCCCTCTCCTAATACTACCG | 40 | 3 |
| LMCA-6 | 서열번호 6 | ATGGAAGATGTGTCGTCTTCTCTTGCCGTGCCTGTACTCG | 40 | 1 |
| LMCA-7 | 서열번호 7 | GCGGGTTTATAGGGTGAGATTTTGCAAAGTAGTTTGGAAG | 40 | 1 |
| LMCA-8 | 서열번호 8 | AACAGGCCCATAATGTAGACGTTTTTGTGTAATGTGTCGG | 40 | 1 |
| LMCA-9 | 서열번호 9 | CGATAGTAACGTAGAGATGAAGGCAGCCAGCGGGTCGTG | 39 | 2 |
| LMCA-10 | 서열번호 10 | AAAGCCCTAGTGCGAGCGGAGTATCCTCACCAGGTGTAG | 39 | 1 |
| LMCA-11 | 서열번호 11 | AAGCAATATTCTGTGCGTACGCGACCGTGGATACCGATCA | 40 | 1 |
| LMCA-12 | 서열번호 12 | ATCGAACAAAGTGCCCATAGGTCAAGAAAGAAGTCTCTGC | 39 | 1 |
실시예 5: 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 구조 결정
리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute 에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다(도 4 참고).
실시예
6 : 선별한
리스테리아
모노사이토제네스
생균주
세포 표면 결합
DNA
앱타
머 후보군의 결합 친화도 테스트
1. 나노드랍(Nano-drop)을 이용한 최적 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합
DNA
앱타머
후보군 선별
리스테리아 모노사이토제네스 생균의 표면에 최적 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 상기 실시예 4를 통해 최적 라운드로 선별된 9 라운드 앱타머의 서열을 가지는 클론을 확보하였다. 각 클론을 이용하여 ssDNA 앱타머를 제작하고 각각의 서열을 가지는 앱타머를 동일한 농도로 제작하여 SELEX를 진행하였다. 이후 회수된 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용하여 측정하였다 (표 3 참고).
| 클론 명칭 | ng/㎕ | 클론 명칭 | ng/㎕ |
| LMCA-1 | 250.5 | LMCA-7 | 243.8 |
| LMCA-2 | 212.6 | LMCA-8 | 186.3 |
| LMCA-3 | 263.9 | LMCA1-9 | 260.2 |
| LMCA-4 | 253.1 | LMCA-10 | 280.7 |
| LMCA-5 | 282.2 | LMCA-11 | 256.8 |
| LMCA-6 | 273.0 | LMCA-12 | 190.4 |
2. SPR을 이용한 앱타머 후보군 LMCA-5의 친화도 정량적 측정을 위한 센서 칩 제작
리스테리아 모노사이토제네스와 상기 실시예 5에서 획득한 LMCA-5 앱타머와의 친화도를 정량적으로 평가하기 위하여, 본 발명자들은 상술한 리스테리아 모노사이토제네스 표면과 최적 결합력을 보인 앱타머 LMCA-5와 리스테리아 모노사이토제네스를 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000(BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. 표면이 스트렙트아비딘으로 코팅된 센서 칩 SA 센서칩(GE Healthcare)을 이용하였다. 먼저 스트렙트아비딘이 고정된 센서칩에 앱타머를 고정시키기 위하여 LMCA-5 앱타머의 5'에 바이오틴을 표지하여 ssDNA를 제작하였다. 이후, 센서칩 SA의 표면을 활성화시키기 위하여 HBS2P 버퍼(GE Healthcare)를 20 ㎕/min으로 흘려주었고 여기에 기 제작해둔 바이오틴이 표지된 LMCA-5를 10 ㎕/min로 흘리며 반응시켰다. 스트렙트아비딘-바이오틴 결합을 통해 SA 칩에 앱타머를 고정시켰으며, 고정되지 않은 앱타머를 제거하기 위하여 HBS2P 버퍼(GE Healthcare)를 20 ㎕/min으로 흘려주었다(도 5 참고). 각 실험 후 센서 칩은 10mM EDTA로 재생시켰으며 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)으로 수득, 정량하였다.
3. 최적 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 친화력 평가
리스테리아 모노사이토제네스와 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 LMCA-5와의 정략적 친화도 평가를 위하여 리스테리아 모노사이토제네스는 HBS2P 버퍼(GE Healthcare)에 100 ㎍/㎖의 농도로 녹여 준비하였다. 제작한 리스테리아 모노사이토제네스는 아무것도 결합시키지 않은 센서칩(채널 1), 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머가 고정된 센서칩(채널 2)에 리스테리아 모노사이토제네스 용액을 5 ㎕/min의 속도로 30분 동안 처리하여 리스테리아 모노사이토제네스와 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화할 수 있었다. 각 리스테리아 모노사이토제네스에 결합하는 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (Kd, dissociation) 수득 결과 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머 후보군 중에서 LMCA-5 앱타머의 해리상수가 8.75 X 10-12M 로써, 리스테리아 모노사이토제네스에 대해 가장 높은 친화도 값을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다. 다른 앱타머 후보군도 이와 같은 방법으로 리스테리아 모노사이토제네스와의 결합력을 측정할 수 있었다 (표 4 참고).
| 클론 명칭 | Kd (nM) | 클론 명칭 | Kd (nM) |
| LMCA-1 | 2.442 ± 0.027 | LMCA-7 | 5.971 ± 2.359 |
| LMCA-2 | 11.131 ± 0.162 | LMCA-8 | 47.375 ± 1.357 |
| LMCA-3 | 0.386 ± 1.841 | LMCA1-9 | 0.530 ± 0.004 |
| LMCA-4 | 1.231 ± 0.051 | LMCA-10 | 0.147 ± 0.217 |
| LMCA-5 | 0.0087 ± 6.517 | LMCA-11 | 1.054 ± 1.280 |
| LMCA-6 | 0.266 ± 1.381 | LMCA-12 | 14.289 ± 0.651 |
실시예
7 :
리스테리아
모노사이토제네스
표면 결합
DNA
앱타머을
사용한 다양한 시료에서
리스테리아
모노사이토제네스의
검출 및
리스테리아증
진단 방법
상기의 실시예를 통해 제작, 확보한 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머의 산업적 활용을 위하여 리스테리아 모노사이토제네스가 감염된 환경에서의 리스테리아 모노사이토제네스 표면 결합 DNA 앱타머를 이용한 검출 방법 및 리스테리아 모노사이토제네스가 감염된 동물이나 사람에서의 리스테리아증을 진단하기 위한 응용 가능성을 확인하기 위하여 다양한 시료에서의 리스테리아 모노사이토제네스의 검출 능력을 확인하기 위한 간이 키트를 개발하였다. 간이 검출 키트는 스트렙트아비딘-바이오틴 결합을 이용하여 리스테리아 모노사이토제네스의 검출에 활용하는 것으로 실시예 6에서 선별한 LMCA-5을 바이오틴으로 표지하여 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 나노 금속판에 고정시켰다. 고정시킨 금속판을 종이 크로마토크래피에 고정시킨 후 리스테리아 모노사이토제네스가 존재하는 시료를 떨어뜨렸다. 시료내에 리스테리아 모노사이토제네스가 존재하는 경우 그림 6의 b와 같이 두 개의 선으로 나타나게 되며, 리스테리아 모노사이토제네스가 존재하지 않을 경우 하나의 선만 나타나는 원리를 이용하였다. 또한 제작한 리스테리아 모노사이토제네스 검출/진단용 간이 키트의 검출 능력을 알아보기 위하여 시료를 넣지 않은 경우, 리스테리아 모노사이토제네스가 존재하지 않는 시료, 리스테리아 모노사이토제네스가 존재하는 시료를 준비하여 컨트롤(C)과 테스트 시료(T)의 발색 여부를 확인하는 실험하였다 (표 5).
| 시료 | C 검출 여부 | T 검출 여부 |
| 시료를 넣지 않은 경우 | - | - |
| 리스테리아 모노사이토제네스 비존재 시료 | + | - |
| 리스테리아 모노사이토제네스 존재 시료 | + | + |
상기의 실험을 통하여 제작한 리스테리아 모노사이토제네스 검출 키트가 정상적으로 만들어진 것을 확인할 수 있었다.
또한 리스테리아 모노사이토제네스 검출의 키트의 검출 한계를 알아보기 위하여 리스테리아 모노사이토제네스를 5X10 cfu/㎖, 5X102 cfu/㎖, 5X103 cfu/㎖, 5X104 cfu/㎖, 5X105 cfu/㎖, 5X106 cfu/㎖, 5X107 cfu/㎖, 5X108 cfu/㎖ 의 8개의 시료로 나누어 준비하였다(표 6 참고). 실험 결과 리스테리아 모노사이토제네스 검출 키트의 검출 한계는 5X105 cfu/㎖ 으로 나타났으며, 5X105 cfu/㎖ 존재시에는 T 부분에 선이 형성되기는 하나 진하지 않고 5X106 cfu/㎖ 이상에서는 진하게 선이 생기는 것을 확인하였다. 본 실험을 통해 리스테리아 모노사이토제네스 검출 키트를 미량이 존재하는 환경에서도 리스테리아 모노사이토제네스를 검출 할 수 있을 것으로 기대된다.
|
리스테리아
모노사이토제네스
시료 ( CFU /㎖) |
검출 여부
(T) |
리스테리아
모노사이토제네스
시료 ( CFU /㎖) |
검출 여부
(T) |
| 5 X 10 | - | 5 X 105 | + |
| 5 X 102 | - | 5 X 106 | +++ |
| 5 X 103 | - | 5 X 107 | +++ |
| 5 X 104 | - | 5 X 108 | +++ |
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation
U&B Tech., Co.
<120> DNA Aptamer Specifically Binding to Surface of Living Cell of
Listeria monocytogenes and Uses Thereof
<160> 15
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 1
tagacgaatg tgccccgcgg tttagttacg cttgacattg g 41
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 2
cgctccagta tcaatgactt acatcccgtc agcaatgtgg 40
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 3
cagaacggac cgagttttat ttattttact cctactcgaa c 41
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 4
cgagtcgcag tgagaccacc tcttggcccc gtttacgagg 40
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 5
tggtcacagg tagttggtgc gtccctctcc taatactacc g 41
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 6
atggaagatg tgtcgtcttc tcttgccgtg cctgtactcg 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 7
gcgggtttat agggtgagat tttgcaaagt agtttggaag 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 8
aacaggccca taatgtagac gtttttgtgt aatgtgtcgg 40
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 9
cgatagtaac gtagagatga aggcagccag cgggtcgtg 39
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 10
aaagccctag tgcgagcgga gtatcctcac caggtgtag 39
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 11
aagcaatatt ctgtgcgtac gcgaccgtgg ataccgatca 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Aptamer
<400> 12
atcgaacaaa gtgcccatag gtcaagaaag aagtctctgc 40
<210> 13
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR DNA Template
<400> 13
ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagattgca cttactatct 100
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 14
ataccagctt attcaatt 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 15
agattgcact tactatct 18
Claims (8)
- 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer).
- 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 서열목록 제1서열 내지 제12서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
- 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 서열목록 제1서열 내지 제12서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 검출용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 검출용 키트.
- 제 5 항에 있어서, 상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 5 항에 있어서, 상기 키트는 DNA 앱타머가 기판상에 고정화된 마이크로어레이 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
- 다음의 단계를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균의 검출 방법:
(a) 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 생균을 확인하는 단계.
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