WO2015045535A1 - ラクトパミンに結合する核酸分子およびその用途 - Google Patents

ラクトパミンに結合する核酸分子およびその用途 Download PDF

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WO2015045535A1
WO2015045535A1 PCT/JP2014/067057 JP2014067057W WO2015045535A1 WO 2015045535 A1 WO2015045535 A1 WO 2015045535A1 JP 2014067057 W JP2014067057 W JP 2014067057W WO 2015045535 A1 WO2015045535 A1 WO 2015045535A1
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WO
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modified
nucleic acid
polynucleotide
acid molecule
ractopamine
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PCT/JP2014/067057
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French (fr)
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宏貴 皆川
穣 秋冨
克紀 堀井
行大 白鳥
嘉仁 吉田
真木雄 古市
巌 和賀
Original Assignee
Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid molecule that binds to ractopamine and its use.
  • Rhtopamine is an agonist for ⁇ -adrenergic receptor, but it has not been approved in Japan.
  • ractopamine can be used in livestock breeding overseas because it can increase the amount of meat when administered to livestock.
  • ractopamine is accumulated in meat, viscera and the like of the livestock due to excessive administration of ractopamine, there is a concern about the influence on humans who have ingested the meat and viscera of the livestock.
  • Non-patent Document 1 For detection of ractopamine, a method using a liquid chromatograph is known (Non-patent Document 1). However, for example, it is necessary to perform pretreatment on a sample collected from livestock, which is troublesome. . Moreover, although the method of detecting ractopamine using an antibody is also considered, since ractopamine is a low molecular compound, there exists a problem that acquisition of an antibody is difficult. Even if the antibody can be obtained, it is difficult to use the antibody for a simple test method at a low cost because the antibody is a protein and has a problem in stability (Patent Document 1).
  • nucleic acid molecules that specifically bind to antigens have recently attracted attention in place of antibodies.
  • nucleic acid molecule for ractopamine since no nucleic acid molecule for ractopamine has been reported so far, provision of a nucleic acid molecule that can be used for detection of ractopamine is desired.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule that can be used for the detection of ractopamine.
  • the nucleic acid molecule of the present invention comprises at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (c), and the polynucleotide comprises at least one modified base. It is characterized by including.
  • A a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • b a polynucleotide comprising a base sequence having 80% or more identity to the base sequence of (a) and binding to ractopamine
  • c A polynucleotide comprising a base sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide comprising the base sequence of (a) and binding to ractopamine
  • the ractopamine detection reagent of the present invention includes the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the ractopamine detection kit of the present invention comprises the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the ractopamine detection method of the present invention includes a step of bringing the nucleic acid molecule of the present invention into contact with a sample to form a complex of ractopamine and the nucleic acid molecule in the sample, and a step of detecting the complex. It is characterized by that.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can bind to ractopamine. For this reason, according to the nucleic acid molecule of the present invention, for example, ractopamine can be detected by the presence or absence of binding to ractopamine. Therefore, the nucleic acid molecule of the present invention can be said to be an extremely useful tool for detecting ractopamine in the fields of food management, public health, and the like.
  • FIG. 1 is a graph showing the binding ability between an aptamer and ractopamine in Example 1 of the present invention.
  • nucleic acid molecule of the present invention for example, in the polynucleotide, at least one thymine is the modified base, and the modified base is at least one of modified thymine and modified uracil.
  • the modified base in the total number of bases of thymine, 1/20 or more is the modified base, and the modified base is at least one of modified thymine and modified uracil. .
  • nucleic acid molecule of the present invention for example, in the polynucleotide, all thymines are the modified bases, and the modified base is at least one of modified thymine and modified uracil.
  • the modified base is a modified cytosine.
  • nucleic acid molecule of the present invention for example, in the polynucleotide, more than 1/20 of the total number of bases of cytosine is the modified base, and the modified base is a modified cytosine.
  • all cytosines are the modified bases, and the modified base is a modified cytosine.
  • the polynucleotide is DNA.
  • nucleic acid molecule of the present invention contains at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (c), and the polynucleotide contains at least one modified base.
  • A a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • b a polynucleotide comprising a base sequence having 80% or more identity to the base sequence of (a) and binding to ractopamine
  • c A polynucleotide comprising a base sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide comprising the base sequence of (a) and binding to ractopamine
  • binding to ractopamine means, for example, having a binding ability to the ractopamine or having a binding activity to the ractopamine.
  • the binding between the nucleic acid molecule of the present invention and the ractopamine can be determined by, for example, surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • ProteON trade name, BioRad
  • BioRad BioRad
  • the ractopamine is represented by the following formula (1).
  • the ractopamine may be, for example, a derivative such as an isomer, a salt, a hydrate, or a solvate.
  • the description regarding the ractopamine can be used for the derivative.
  • the structural units of the polynucleotides (a) to (c) are, for example, nucleotide residues, and examples include deoxyribonucleotide residues and ribonucleotide residues.
  • the polynucleotide is, for example, DNA composed of deoxyribonucleotide residues, DNA containing deoxyribonucleotide residues and ribonucleotide residues, and may further contain non-nucleotide residues.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is hereinafter also referred to as a DNA aptamer, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of any of the polynucleotides (a) to (c) or a molecule containing the polynucleotide.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, two or more of any of the polynucleotides (a) to (c) as described later.
  • the two or more polynucleotides may have the same sequence or different sequences.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have, for example, a linker and / or an additional sequence.
  • the polynucleotide (a) is a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 5'-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGAAGTATCGCCGCTACCGTTTGATATTTAATCACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3 '
  • identity may be, for example, within a range in which the polynucleotide of (b) binds to ractopamine.
  • the identity is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • the identity can be calculated with default parameters using analysis software such as BLAST and FASTA (hereinafter the same).
  • the “hybridizable polynucleotide” is, for example, a polynucleotide that is completely or partially complementary to the polynucleotide of (a).
  • the hybridization can be detected by, for example, various hybridization assays.
  • the hybridization assay is not particularly limited, for example, Zanburuku (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) " [(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like can also be employed.
  • the “stringent conditions” may be, for example, any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • Medium stringent conditions are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
  • the degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, time, and the like.
  • “Stringent conditions” are, for example, Zanburuku previously described (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) " [(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like can also be employed.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a nucleic acid molecule that binds to ractopamine, including the following polynucleotide (d), wherein the polynucleotide includes at least one modified base.
  • a polynucleotide comprising a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the base sequence of (a), and binding to ractopamine
  • “one or several” may be in the range where the polynucleotide in (d) binds to ractopamine.
  • the “one or several” is, for example, 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, 1 to 3, 1, or 2 in any one of the base sequences of (a). .
  • the structural unit of the polynucleotide (d) is, for example, the same as the other polynucleotides described above.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may include, for example, one of the polynucleotide sequences (a) to (d) or a plurality of the polynucleotide sequences. In the latter case, it is preferable that a plurality of polynucleotide sequences are linked to form a single-stranded polynucleotide.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides may be directly linked to each other or indirectly linked via a linker.
  • the polynucleotide sequences are preferably linked directly or indirectly at the respective ends.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides may be the same or different, for example.
  • sequences of the plurality of polynucleotides are preferably the same, for example.
  • the number of the sequences is not particularly limited, and is, for example, 2 or more, specifically, for example, 2 to 20, 2 to 10, 2 or 3.
  • the linker is not particularly limited.
  • the length of the linker is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases long, 1 to 20 bases long, 3 to 12 bases long, and 5 to 9 bases long.
  • the structural unit of the linker is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the linker is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues.
  • linker examples include polydeoxythymine (poly dT), polydeoxyadenine (poly dA), poly dAdT which is a repeating sequence of A and T, and preferably poly dT and poly dAdT.
  • the polynucleotide is preferably a single-stranded polynucleotide.
  • the single-stranded polynucleotide is preferably capable of forming a stem structure and a loop structure by, for example, self-annealing.
  • the polynucleotide is preferably capable of forming a stem loop structure, an internal loop structure, and / or a bulge structure, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, double stranded.
  • one single-stranded polynucleotide includes any of the polynucleotides (a) to (d), and the other single-stranded polynucleotide is not limited.
  • the other single-stranded polynucleotide include a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any one of the polynucleotides (a) to (d).
  • the nucleic acid molecule of the present invention is double-stranded, it is preferably dissociated into a single-stranded polynucleotide by denaturation or the like prior to use.
  • the dissociated single-stranded polynucleotide of any one of (a) to (d) preferably has, for example, a stem structure and a loop structure as described above.
  • the stem structure and the loop structure can be formed means, for example, that the stem structure and the loop structure are actually formed, and even if the stem structure and the loop structure are not formed, the stem structure depending on the conditions. And the ability to form a loop structure.
  • a stem structure and a loop structure can be formed includes, for example, both experimental confirmation and prediction by a computer simulation.
  • the structural unit of the nucleic acid molecule of the present invention is, for example, a nucleotide residue.
  • the length of the nucleic acid molecule is not particularly limited, and the lower limit thereof is, for example, 15 base length and 78 base length, and the upper limit thereof is, for example, 91 base length and 78 base length.
  • nucleotide residue examples include deoxyribonucleotide residue and ribonucleotide residue.
  • nucleic acid molecule of the present invention examples include DNA composed only of deoxyribonucleotide residues, DNA containing one or several ribonucleotide residues, and the like. In the latter case, “one or several” is not particularly limited.
  • the polynucleotide for example, 1 to 91 or 1 to 78, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15 The number is more preferably 1 to 7, particularly preferably 1 to 3, and most preferably 1 to 2.
  • the numerical range of numbers such as the number of bases and the number of sequences, for example, discloses all positive integers belonging to the range. That is, for example, the description “1 to 5 bases” means all disclosures of “1, 2, 3, 4, 5 bases” (the same applies hereinafter).
  • the polynucleotide includes at least one modified base.
  • the modified base is not particularly limited, and examples thereof include a base modified with a natural base (non-artificial base), and preferably has the same function as the natural base.
  • the natural base is not particularly limited, and examples thereof include a purine base having a purine skeleton and a pyrimidine base having a pyrimidine skeleton.
  • the purine base is not particularly limited, and examples thereof include adenine (a) and guanine (g).
  • the pyrimidine base is not particularly limited, and examples thereof include cytosine (c), thymine (t), uracil (u) and the like.
  • the base modification site is not particularly limited.
  • examples of the purine base modification site include the 7th and 8th positions of the purine skeleton.
  • examples of the modification site of the pyrimidine base include the 5th and 6th positions of the pyrimidine skeleton.
  • modified uracil or modified thymine when “ ⁇ O” is bonded to carbon at position 4 and a group other than “—CH 3 ” or “—H” is bonded to carbon at position 5, it is called modified uracil or modified thymine. Can do.
  • the modifying group of the modifying base is not particularly limited, and examples thereof include a methyl group, a fluoro group, an amino group, a thio group, a benzylaminocarbonyl group represented by the following formula (2), and a tryptaminocarbonyl represented by the following formula (3).
  • the modified base is not particularly limited.
  • modified adenine modified with adenine, modified thymine modified with thymine, modified guanine modified with guanine, modified cytosine modified with cytosine and modified modified with uracil examples include uracil and the like, and the modified thymine, the modified uracil and the modified cytosine are preferable.
  • modified adenine examples include 7'-deazaadenine and the like.
  • modified guanine examples include, for example, 7'-deazaguanine.
  • modified thymine examples include 5'-benzylaminocarbonylthymine, 5'-tryptaminocarbonylthymine, 5'-isobutylaminocarbonylthymine and the like.
  • modified uracil examples include 5'-benzylaminocarbonyluracil (BndU), 5'-tryptaminocarbonyluracil (TrpdU), 5'-isobutylaminocarbonyluracil and the like.
  • the polynucleotide is not particularly limited, and may include, for example, only one type of the modified base, or may include two or more types of the modified base.
  • the number of the modified base is not particularly limited.
  • the number of the modified bases may be one or more, and the upper limit is not particularly limited.
  • the modified base is, for example, 1 to 91 or 1 to 78, 1 to 70, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 20, or 20 in the polynucleotide.
  • the base may be the modified base.
  • the number of the modified bases may be, for example, the number of any one of the modified bases or the total number of the two or more modified bases.
  • the modified base in the entire length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited, and is, for example, 1 to 91 or 1 to 78, which is the same as the above range.
  • the ratio of the modified base is not particularly limited.
  • the ratio of the modified base is, for example, 1/100 or more, 1/40 or more, 1/20 or more, 1/10 or more, 1/4 or more, or 1/3 or more of the total number of bases of the polynucleotide.
  • the ratio of the modified base in the entire length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited, and is the same as the above range.
  • the total number of bases is, for example, the total number of natural bases and modified bases in the polynucleotide.
  • the ratio of the modified base is expressed as a fraction, and the total number of bases and the number of modified bases that satisfy this are positive integers.
  • the number of the modified thymine is not particularly limited.
  • natural thymine can be substituted for the modified thymine.
  • the lower limit of the number of the modified thymines is 1, and the upper limit is not particularly limited.
  • the modified thymine is, for example, 1 to 40, 5 to 35, 8 to 30, 10 to 25, 13 to 22, or 17 in the polynucleotide. It may be a modified thymine.
  • the ratio of the modified thymine is not particularly limited.
  • the ratio of the modified thymine is, for example, 1/100 or more, 1/40 or more, 1/20 or more, 1/10 or more, 1/4 or more of the total number of the natural thymine and the modified thymine. 1/3 or more.
  • the number of the modified uracil is not particularly limited.
  • natural thymine can be substituted for the modified uracil.
  • the lower limit of the number of the modified uracils is 1, and the upper limit is not particularly limited.
  • the modified uracil is, for example, 1 to 40, 5 to 35, 8 to 30, 10 to 25, 13 to 22, or 17 in the polynucleotide. Modified uracil may also be used.
  • the ratio of the modified uracil is not particularly limited.
  • the ratio of the modified uracil is, for example, 1/100 or more, 1/40 or more, 1/20 or more, 1/10 or more, 1/4 or more of the total number of the natural thymine and the modified uracil. 1/3 or more.
  • Examples of the number of the modified thymine and the modified uracil may be, for example, the total number of both.
  • the number of the modified cytosines is not particularly limited.
  • natural cytosine can be substituted for the modified cytosine.
  • the number of the modified cytosines for example, has a lower limit of 1, and the upper limit is not particularly limited.
  • the modified cytosine is, for example, 1 to 40, 5 to 30, 5 to 20, 8 to 19, 10 to 18, or 12 in the polynucleotide. It may be a modified cytosine.
  • the ratio of the modified cytosine is not particularly limited.
  • the ratio of the modified cytosine is, for example, 1/100 or more, 1/40 or more, 1/20 or more, 1/10 or more, 1/4 or more of the total number of the natural cytosine and the modified cytosine. 1/3 or more.
  • the modified base is the modified adenine or the modified guanine
  • cytosine and modified cytosine are referred to as “adenine” and “modified adenine” or “guanine” and It can be read as “modified guanine”.
  • natural adenine can be substituted with the modified adenine
  • natural guanine can be substituted with the modified guanine.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain a modified nucleotide.
  • the modified nucleotide may be a nucleotide having the modified base described above, a nucleotide having a modified sugar in which a sugar residue is modified, or the modified base. And a nucleotide having the modified sugar.
  • the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include deoxyribose residue or ribose residue.
  • the modification site in the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include the 2'-position and the 4'-position of the sugar residue, and both of them may be modified.
  • Examples of the modifying group of the modified sugar include a methyl group, a fluoro group, an amino group, and a thio group.
  • the base when the base is a pyrimidine base, for example, the 2'-position and / or the 4'-position of the sugar residue is preferably modified.
  • Specific examples of the modified nucleotide residue include, for example, a 2′-methylated-uracil nucleotide residue and a 2′-methylated-cytosine nucleotide residue in which the deoxyribose residue or the 2 ′ position of the ribose residue is modified.
  • the number of the modified nucleotides is not particularly limited, and for example, in the polynucleotide, for example, 1 to 91 or 1 to 78, 1 to 80, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40 1 to 30 pieces. Further, the modified nucleotides in the entire length of the nucleic acid molecule including the polynucleotide are not particularly limited, and are, for example, 1 to 91 or 1 to 78, and specifically, for example, the same as the above-mentioned range. is there.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, one or several artificial nucleic acid monomer residues.
  • the “one or several” is not particularly limited.
  • the polynucleotide for example, 1 to 91 or 1 to 78, 1 to 80, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1-30.
  • the artificial nucleic acid monomer residue include PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), ENA (2'-O, 4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids) and the like.
  • the nucleic acid in the monomer residue is the same as described above, for example.
  • the artificial nucleic acid monomer residue in the entire length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited, and is, for example, 1 to 91 or 1 to 78, specifically, for example, within the above-mentioned range. It is the same.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is preferably nuclease resistant, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention preferably has, for example, the modified nucleotide residue and / or the artificial nucleic acid monomer residue for nuclease resistance. Since the nucleic acid molecule of the present invention is nuclease resistant, for example, tens of kDa PEG (polyethylene glycol) or deoxythymidine may be bound to the 5 'end or 3' end.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have an additional sequence, for example.
  • the additional sequence is preferably bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid molecule, and more preferably the 3 'end.
  • the additional sequence is not particularly limited.
  • the length of the additional sequence is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases long, 1 to 50 bases long, 1 to 25 bases long, or 18 to 24 bases long.
  • the structural unit of the additional sequence is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the additional sequence is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues. Specific examples of the additional sequence include poly dT and poly dA.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used, for example, immobilized on a carrier.
  • a carrier for example, either the 5 'end or the 3' end is preferably immobilized, and more preferably the 3 'end.
  • the nucleic acid molecule may be immobilized directly or indirectly on the carrier. In the latter case, for example, it is preferable to immobilize via the additional sequence.
  • the method for producing the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited, and can be synthesized by, for example, a genetic engineering technique such as a nucleic acid synthesis method using chemical synthesis or a known method.
  • the nucleic acid molecule of the present invention exhibits binding to the ractopamine as described above. For this reason, the use of the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited as long as it uses the binding property to ractopamine.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used in various methods, for example, instead of the antibody against the ractopamine.
  • the ractopamine can be detected, whereby the ractopamine can be detected.
  • the method for detecting ractopamine is not particularly limited, and can be performed by detecting the binding between ractopamine and the nucleic acid molecule.
  • the ractopamine detection method of the present invention includes a step of bringing the nucleic acid molecule of the present invention into contact with a sample to form a complex of ractopamine and the nucleic acid molecule in the sample, and a step of detecting the complex. It is characterized by that.
  • the detection method of the present invention is characterized by using the nucleic acid molecule of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to ractopamine, for example, ractopamine in a sample can be specifically detected by detecting the binding between ractopamine and the nucleic acid molecule. It is. Specifically, for example, since the amount of ractopamine in a sample can be analyzed, it can be said that qualitative or quantitative determination is also possible.
  • the sample is not particularly limited.
  • the sample include samples derived from living organisms, food and drink, and environment.
  • the living body is not particularly limited, and examples thereof include non-human mammals such as humans, cows, pigs, sheep, mice, rats, rabbits, horses, and animals such as birds and fish.
  • the biological sample include excrement, body fluid, skin, meat, mucous membrane, body hair and the like.
  • Examples of the sample derived from food and drink include beverages, foods, and food ingredients.
  • Examples of the environment-derived sample include living organisms, water, soil, air, and the like.
  • Examples of the water sample include groundwater, river water, seawater, domestic wastewater, and the like.
  • the sample derived from the environment includes, for example, deposits in food processing shops, cooking places, and the like.
  • the sample may be, for example, a liquid sample or a solid sample.
  • the solid sample for example, it is preferable to use it as a liquid sample by mixing it with a liquid because it is easy to contact with the nucleic acid molecule and is easy to handle.
  • the liquid is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, buffer solution, medium, and the like.
  • the detection step for example, a contact step in which the sample and the nucleic acid molecule are brought into contact with each other to bind ractopamine in the sample and the nucleic acid molecule, and binding detection in which binding between the ractopamine and the nucleic acid molecule is detected.
  • the detection step further includes, for example, a step of analyzing the presence or amount of ractopamine in the sample based on the result of the binding detection step.
  • the method for contacting the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact between the sample and the nucleic acid molecule is preferably performed in a liquid, for example.
  • the liquid is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
  • the contact condition between the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact temperature is, for example, 4 to 37 ° C. or 18 to 25 ° C.
  • the contact time is, for example, 10 to 120 minutes or 30 to 60 minutes.
  • the nucleic acid molecule may be, for example, an immobilized nucleic acid molecule immobilized on a carrier or an unfixed free nucleic acid molecule.
  • the sample is contacted in a container.
  • the nucleic acid molecule is preferably, for example, the immobilized nucleic acid molecule because of its excellent handleability.
  • the carrier is not particularly limited, and examples thereof include a substrate, a bead, and a container. Examples of the container include a microplate and a tube.
  • the nucleic acid molecule is immobilized as described above, for example.
  • the binding detection step is a step of detecting the binding between ractopamine in the sample and the nucleic acid molecule as described above.
  • the binding detection step is a step of detecting the presence or absence of binding between the two, for example, the presence or absence of ractopamine in the sample can be analyzed (qualitative), and by detecting the degree of binding (binding amount) between the two, for example, the sample The amount of ractopamine can be analyzed (quantified).
  • the method for detecting the binding between the ractopamine and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • a conventionally known method for detecting binding between substances can be adopted, and specific examples thereof include the SPR described above.
  • the binding between the ractopamine and the nucleic acid molecule cannot be detected, it can be determined that ractopamine is not present in the sample, and if the binding is detected, it can be determined that ractopamine is present in the sample. .
  • a correlation between the concentration of ractopamine and the amount of binding can be obtained in advance, and the concentration of ractopamine in the sample can be analyzed from the amount of binding based on the correlation.
  • the detection reagent of the present invention is a ractopamine detection reagent and includes the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection reagent of this invention should just contain the nucleic acid molecule of the said this invention, and another structure is not restrict
  • the detection kit of the present invention is a ractopamine detection kit and includes the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention is not limited as long as it contains the nucleic acid molecule of the present invention. If the detection kit of the present invention is used, for example, the detection of the ractopamine can be easily performed as described above.
  • the detection kit of the present invention may contain other components in addition to the nucleic acid molecule of the present invention, for example.
  • the component include the carrier, buffer solution, and instruction manual.
  • the description of the nucleic acid molecule of the present invention can be used, and the nucleic acid molecule of the present invention and the detection method of the present invention can also be used for the method of use.
  • the detection device of the present invention is a ractopamine detection device, characterized in that it comprises the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection device of the present invention is not limited as long as it contains the nucleic acid molecule of the present invention. If the detection device of the present invention is used, for example, the detection of ractopamine can be performed as described above.
  • the detection device of the present invention further includes, for example, a carrier, and the nucleic acid molecule is arranged on the carrier.
  • the nucleic acid molecule is preferably immobilized on the carrier.
  • the type of the carrier and the immobilization of the nucleic acid molecule are as described above, for example.
  • the method for using the detection device of the present invention is not particularly limited, and the nucleic acid molecule of the present invention and the detection method of the present invention can be used.
  • Example 1 The aptamer was indirectly confirmed for its ability to bind to ractopamine.
  • aptamer 1 The following polynucleotides were synthesized and used as aptamers in the examples.
  • the underlined region of aptamer 1 uses a deoxyribonucleotide residue having 5′-methylcytosine methylated at the 5-position of cytosine in place of natural cytosine (C), Further, in place of natural thymine (T), a deoxyribonucleotide residue having 5′-tryptaminocarbonyluracil (TrpdU) substituted at the 5-position of thymine was used for synthesis.
  • Aptamer 1 RAC124R8Tm1_m2_c5bio (SEQ ID NO: 1) 5'-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATG AAGTATCGCCGCTACCGTTTGATATTTAAT CACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3 '
  • a DNA library containing a plurality of DNAs consisting of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 containing a 40-base long random sequence (N) 40 was used as a negative control.
  • N is a deoxyribonucleotide residue
  • the nucleic acid was adenine, guanine, cytosine and / or thymine.
  • Negative control (SEQ ID NO: 2) CCTGCACCCAGTGTCCC- (N) 40 -GACGGAGAGGAGGACGG
  • the aptamer was added with polydeoxyadenine (poly dA) having a length of 24 bases at the 3 'end and used as a poly dA added aptamer in SPR described later.
  • poly dA polydeoxyadenine
  • Biotinylated ractopamine was prepared by biotinylating the amino group of ractopamine.
  • a 40 mmol / L HEPES buffer solution 2 ⁇ mol / L of the biotinylated ractopamine and 500 nmol / L of streptavidin (SA, manufactured by Sigma) are mixed to bind biotinylated ractopamine biotin and SA.
  • SA streptavidin
  • a chip product name: ProteOn NLC Sensor Chip, BioRad
  • streptavidin was immobilized
  • 5 ⁇ mol / L of biotinylated poly dT was injected into the flow cell of the sensor chip using ultrapure water (DDW), and was bound until the signal intensity (RU: Resonance Unit) was about 900 RU.
  • the biotinylated poly dT was prepared by biotinylating the 5 'end of deoxythymidine having a length of 24 bases.
  • the composition of the SPR buffer was 40 mmol / L HEPES, 125 mmol / L NaCl, 5 mmol / L KCl, 1 mmol / L MgCl 2 and 0.05% Tween (registered trademark) 20, and the pH was 7.5.
  • the dissociation constant (KD) was obtained by response curve fitting.
  • Control 1 was the same except that 500 nmol / L of SA was injected instead of the sample
  • Control 2 was the same except that negative control was injected instead of aptamer 1
  • Control 3 was aptamer
  • the signal intensity was measured in the same manner except that a negative control was injected instead of 1, and 500 nmol / L of SA was injected instead of the sample.
  • FIG. 1 is a graph showing the ability of aptamers to bind to the complex of biotinylated ractopamine and SA.
  • the horizontal axis represents measurement time (seconds), and the vertical axis represents signal intensity (RU).
  • 0 to 120 seconds are the injection time of the sample, and 120 seconds and after are the time for washing with the SPR buffer.
  • Example 1 of FIG. 1 it was found that when aptamer 1 and the sample were injected, the signal intensity increased and aptamer 1 was bound to the complex. In addition, no significant decrease in signal intensity was observed after washing, indicating that the binding between aptamer 1 and the complex was maintained. In contrast, as shown in control 1 of FIG. 1, when aptamer 1 and SA were injected, no increase in signal intensity was observed, indicating that aptamer 1 did not bind to SA. In addition, as shown in Controls 2 and 3 in FIG. 1, when a negative control and the complex or the SA were injected, no increase in signal intensity was observed, and the negative control was treated with the complex and the SA. It turns out that it doesn't bind to. The dissociation constant between the aptamer of the example and the complex was about 35 nmol / L. From these results, it was found that the aptamer of the example specifically binds to ractopamine with excellent binding ability.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can bind to ractopamine. For this reason, according to the nucleic acid molecule of the present invention, for example, ractopamine can be detected by binding to ractopamine. Therefore, the nucleic acid molecule of the present invention is an extremely useful tool for detecting ractopamine in fields such as food management and public health.

Abstract

　ラクトパミンの検出に利用可能な核酸分子を提供する。　下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾塩基を含む核酸分子を、ラクトパミンに結合する核酸分子とする。 （ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド （ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ラクトパミンに結合するポリヌクレオチド （ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ラクトパミンに結合するポリヌクレオチド

Description

ラクトパミンに結合する核酸分子およびその用途
　本発明は、ラクトパミンに結合する核酸分子およびその用途に関する。
　ラクトパミンは、βアドレナリン受容体に対する作動薬であるが、日本においては、承認されていない。他方、ラクトパミンは、家畜に投与することで肉量を増やせることから、海外においては、家畜の飼育において使用されることがある。この場合、ラクトパミンの過剰投与により、前記家畜の肉や内臓等にラクトパミンが蓄積されるため、前記家畜の肉や内臓等を摂取したヒトへの影響が心配されている。
　ラクトパミンの検出には、液体クロマトグラフを用いた方法が知られているが（非特許文献１）、例えば、家畜から採取したサンプルについて前処理を行う必要があるため、手間がかかるという問題がある。また、抗体を用いてラクトパミンを検出する方法も考えられるが、ラクトパミンは低分子化合物であるため、抗体の取得が困難という問題がある。また、抗体が取得できても、抗体はタンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい（特許文献１）。
　このような問題から、近年、抗体に代えて、抗原と特異的に結合する核酸分子が注目されている。しかしながら、これまでにラクトパミンに対する核酸分子は報告されていないことから、ラクトパミンの検出に利用可能な核酸分子の提供が求められている。
国際公開２０１３／０６５３１４号
WEILIN　L．　SHELVER　AND　DAVID　J．　SMITH、「Determination　of　Ractopamine　in　Cattle　and　Sheep　Urine　Samples　Using　an　Optical　Biosensor　Analysis：　Comparative　Study　with　HPLC　and　ELISA」、J．　Agric．　Food　Chem．、2003、51、3715-3721頁
　そこで、本発明の目的は、ラクトパミンの検出に利用可能な核酸分子を提供することにある。
　前記課題を解決するために、本発明の核酸分子は、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾塩基を含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ラクトパミンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ラクトパミンに結合するポリヌクレオチド
　本発明のラクトパミン検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
　本発明のラクトパミン検出キットは、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
　本発明のラクトパミン検出方法は、前記本発明の核酸分子とサンプルとを接触させ、前記サンプル中のラクトパミンと前記核酸分子との複合体を形成させる工程、および、前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
　本発明の核酸分子は、ラクトパミンに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、例えば、ラクトパミンとの結合の有無によって、ラクトパミンを検出できる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、食品管理、公衆衛生等の分野におけるラクトパミンの検出に、極めて有用なツールといえる。
図１は、本発明の実施例１において、アプタマーとラクトパミンとの結合能を示すグラフである。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のチミンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、チミンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、全チミンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のシトシンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾シトシンである。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、シトシンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾シトシンである。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、全シトシンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾シトシンである。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである。
＜核酸分子＞
　本発明の核酸分子は、前述のように、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾塩基を含むことを特徴とするラクトパミンに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ラクトパミンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ラクトパミンに結合するポリヌクレオチド
　本発明において、「ラクトパミンに結合する」とは、例えば、前記ラクトパミンに対する結合能を有している、または、前記ラクトパミンに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子と前記ラクトパミンとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface　Plasmon　resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名　BioRad社）が使用できる。
　ラクトパミンは、下記式（１）で表わされる。前記ラクトパミンは、例えば、異性体、塩、水和物、溶媒和物等の誘導体でもよい。以下、前記ラクトパミンに関する記載は、前記誘導体に援用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明の核酸分子において、前記（ａ）～（ｃ）のポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明の核酸分子は、例えば、以下、ＤＮＡアプタマーともいう。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。
　前記（ａ）のポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
配列番号１
　5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGAAGTATCGCCGCTACCGTTTGATATTTAATCACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
　前記（ｂ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、ラクトパミンに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
　前記（ｃ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
　前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
　本発明の核酸分子は、例えば、下記（ｄ）のポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾塩基を含む、ラクトパミンに結合する核酸分子でもよい。
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ラクトパミンに結合するポリヌクレオチド
　前記（ｄ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、ラクトパミンに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、例えば、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１個または２個である。前記（ｄ）のポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、前述した他のポリヌクレオチドを同じである。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、具体的には、例えば、２～２０、２～１０、２または３である。
　前記リンカーは、特に制限されない。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長、１～２０塩基長、３～１２塩基長、５～９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
　本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
　本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
　本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
　本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記核酸分子の長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、１５塩基長、７８塩基長、その上限は、例えば、９１塩基長、７８塩基長である。
　前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～９１個または１～７８個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～７個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１～２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１～５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
　前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾塩基を含む。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「－ＣＨ３」または「－Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
　前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、下記式（２）のベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、下記式（３）のトリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシンおよびウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられ、前記修飾チミン、前記修飾ウラシルおよび前記修飾シトシンが好ましい。
　前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’－デアザアデニン等があげられる。
　前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’－デアザグアニン等があげられる。
　前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルチミン、５’－トリプタミノカルボニルチミン、５’－イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられる。
　前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’－イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。
　前記ポリヌクレオチドは、特に制限されず、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
　前記修飾塩基の個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の個数は、１個以上であればよく、その上限は、特に制限されない。前記修飾塩基は、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～９１個または１～７８個、１～７０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、２０個であり、また、全ての塩基が、前記修飾塩基でもよい。前記修飾塩基の個数は、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基の個数であってもよいし、２種類以上の前記修飾塩基の個数の合計であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基も、特に制限されず、例えば、１～９１個または１～７８個、前述の範囲と同様である。
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の割合は、特に制限されない。前記修飾塩基の割合は、前記ポリヌクレオチドの全塩基数のうち、例えば、１／１００以上、１／４０以上、１／２０以上、１／１０以上、１／４以上、１／３以上である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基の割合も、特に制限されず、前述の範囲と同様である。ここで、前記全塩基数は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおける天然塩基の個数と前記修飾塩基の個数の合計である。前記修飾塩基の割合を分数で示すが、これを満たす全塩基数と修飾塩基数とは、それぞれ正の整数である。
　前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾チミンの場合、前記修飾チミンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾チミンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの個数は、例えば、その下限は、１個であり、その上限は、特に制限されない。前記修飾チミンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～４０個、５～３５個、８～３０個、１０～２５個、１３～２２個、１７個であり、また、全てのチミンが、前記修飾チミンでもよい。
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの割合は、特に制限されない。前記修飾チミンの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾チミンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、１／４０以上、１／２０以上、１／１０以上、１／４以上、１／３以上である。
　前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾ウラシルの場合、前記修飾ウラシルの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾ウラシルに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾ウラシルの個数は、例えば、その下限は、１個であり、その上限は、特に制限されない。前記修飾ウラシルは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～４０個、５～３５個、８～３０個、１０～２５個、１３～２２個、１７個であり、また、全てのチミンが、前記修飾ウラシルでもよい。
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾ウラシルの割合は、特に制限されない。前記修飾ウラシルの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾ウラシルの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、１／４０以上、１／２０以上、１／１０以上、１／４以上、１／３以上である。
　前記修飾チミンと前記修飾ウラシルの個数の例示は、例えば、両者をあわせた個数であってもよい。
　前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾シトシンの場合、前記修飾シトシンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然シトシンは、前記修飾シトシンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾シトシンの個数は、例えば、その下限は、１個であり、その上限は、特に制限されない。前記修飾シトシンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～４０個、５～３０個、５～２０個、８～１９個、１０～１８個、１２個であり、また、全てのシトシンが、前記修飾シトシンでもよい。
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾シトシンの割合は、特に制限されない。前記修飾シトシンの割合は、前記天然シトシンの個数と前記修飾シトシンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、１／４０以上、１／２０以上、１／１０以上、１／４以上、１／３以上である。
　前記修飾塩基が、前記修飾アデニンまたは前記修飾グアニンの場合、前記修飾シトシンの個数および割合の説明において、「シトシン」および「修飾シトシン」を、それぞれ「アデニン」および「修飾アデニン」または「グアニン」および「修飾グアニン」に読み替えて援用できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然アデニンは、前記修飾アデニンに置換でき、例えば、天然グアニンは、前記修飾グアニンに置換できる。
　本発明の核酸分子は、修飾ヌクレオチドを含んでもよい、前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
　前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
　前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－メチル化－シトシンヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－アミノ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－チオ化－シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
　前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～９１個または１～７８個、１～８０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１～９１個または１～７８個であり、具体的には、例えば、前述の範囲と同様である。
　本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～９１個または１～７８個、１～８０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記人工核酸モノマー残基も、特に制限されず、例えば、１～９１個または１～７８個であり、具体的には、例えば、前述の範囲と同様である。
　本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
　本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長、１～５０塩基長、１～２５塩基長、１８～２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
　本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
　本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。
　本発明の核酸分子は、前述のように、前記ラクトパミンに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記ラクトパミンへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記ラクトパミンに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
　本発明の核酸分子によれば、例えば、前記ラクトパミンを検出でき、これによって、前記ラクトパミンを検出できる。前記ラクトパミンの検出方法は、特に制限されず、前記ラクトパミンと前記核酸分子との結合を検出することによって、行える。
＜検出方法＞
　本発明のラクトパミン検出方法は、前記本発明の核酸分子とサンプルとを接触させ、前記サンプル中のラクトパミンと前記核酸分子との複合体を形成させる工程、および、前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
　本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、ラクトパミンに特異的に結合することから、例えば、ラクトパミンと前記核酸分子との結合を検出することによって、サンプル中のラクトパミンを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、サンプル中のラクトパミンの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。
　本発明において、前記サンプルは、特に制限されない。前記サンプルは、例えば、生体由来、飲食品由来、環境由来等のサンプルがあげられる。前記生体は、特に制限されず、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ等の非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等の動物の生体があげられる。前記生体由来のサンプルは、例えば、排泄物、体液、皮膚、肉、粘膜、体毛等があげられる。前記飲食品由来のサンプルは、例えば、飲料、食品、食品原料等があげられる。前記環境由来のサンプルは、例えば、生物、水、土壌、大気等があげられる。前記水サンプルは、例えば、地下水、河川水、海水、生活排水等があげられる。また、前記環境由来のサンプルは、例えば、食品加工場、調理場等における付着物があげられる。
　前記サンプルは、例えば、液体サンプルでもよいし、固体サンプルでもよい。前記固体サンプルの場合、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体と混合して、液体サンプルとして使用することが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液、培地等があげられる。
　前記検出工程は、例えば、前記サンプルと前記核酸分子とを接触させて、前記サンプル中のラクトパミンと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記ラクトパミンと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記サンプル中のラクトパミンの有無または量を分析する工程を含む。
　前記接触工程において、前記サンプルと前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記サンプルと前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
　前記接触工程において、前記サンプルと前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４～３７℃、１８～２５℃であり、接触時間は、例えば、１０～１２０分、３０～６０分である。
　前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記サンプルと接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
　前記結合検出工程は、前述のように、前記サンプル中のラクトパミンと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記サンプル中のラクトパミンの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記サンプル中のラクトパミンの量を分析（定量）できる。
　前記ラクトパミンと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。
　そして、前記ラクトパミンと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記サンプル中にラクトパミンは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記サンプル中にラクトパミンが存在すると判断できる。また、予め、ラクトパミンの濃度と、結合量との相関関係を求めておき、前記相関関係に基づいて、前記結合量から、前記サンプル中のラクトパミンの濃度を分析することもできる。
＜検出試薬およびキット＞
　本発明の検出試薬は、前述のように、ラクトパミン検出試薬であって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、前記ラクトパミンの検出等を行うことができる。
　本発明の検出キットは、前述のように、ラクトパミン検出キットであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ラクトパミンの検出等を容易に行うことができる。
　本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、緩衝液、使用説明書等があげられる。
　本発明の検出試薬および検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用でき、また、その使用方法についても、前記本発明の核酸分子および前記本発明の検出方法を援用できる。
＜検出デバイス＞
　本発明の検出デバイスは、ラクトパミンの検出デバイスであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出デバイスは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出デバイスを使用すれば、前述のように、例えば、前記ラクトパミンの検出等を行うことができる。
　本発明の検出デバイスは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体の種類および前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。本発明の検出デバイスの使用方法は、特に制限されず、前記本発明の核酸分子および前記本発明の検出方法を援用できる。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
［実施例１］
　アプタマーについて、ラクトパミンに対する結合能を間接的に確認した。
（１）アプタマー
　下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。下記ポリヌクレオチドの合成において、アプタマー１の下線を付した領域は、天然シトシン（Ｃ）に代えて、シトシンの５位がメチル化された５’－メチルシトシンを有するデオキシリボヌクレオチド残基を使用し、また、天然チミン（Ｔ）に代えて、チミンの５位が置換された５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）を有するデオキシリボヌクレオチド残基を使用し、合成した。
アプタマー１：RAC124R8Tm1_m2_c5bio　（配列番号１）
　5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGAAGTATCGCCGCTACCGTTTGATATTTAATCACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
　また、４０塩基長のランダム配列（Ｎ）４０を含む配列番号２で表わされるオリゴヌクレオチドからなるＤＮＡを複数含むＤＮＡライブラリーを、ネガティブコントロールとした。下記配列において、「Ｎ」は、デオキシリボヌクレオチド残基であり、その核酸は、アデニン、グアニン、シトシンおよび／またはチミンとした。
ネガティブコントロール（配列番号２）
　CCTGCACCCAGTGTCCC-(N)40-GACGGAGAGGAGGACGG
　前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。
（２）ラクトパミン試料
　ラクトパミンのアミノ基をビオチン化し、ビオチン化ラクトパミンを作製した。４０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液中で、２μｍｏｌ／Ｌの前記ビオチン化ラクトパミンと５００ｎｍｏｌ／Ｌのストレプトアビジン（ＳＡ、シグマ社製）とを混合し、ビオチン化ラクトパミンのビオチンとＳＡとを結合させたものを試料とした。この試料を以下のＳＰＲに使用した。
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
　結合能の解析には、ProteON　XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。
　まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名　ProteOn　NLC　Sensor　Chip、BioRad社）を、前記ProteON　XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｕｎｉｔ）が約９００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２４塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＰＲバッファーを用いて、１μｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約８００ＲＵになるまで結合させた。続いて、前記試料を、ＳＰＲバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＰＲバッファーを流して洗浄を行った。前記希釈試料のインジェクションおよび前記ＳＰＲバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。
　前記ＳＰＲバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２および０．０５％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。
　また、前記シグナル強度の測定から、レスポンスカーブフィッティングにより解離定数（ＫＤ）を求めた。コントロール１は、前記試料に代えて、５００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ＳＡをインジェクションした以外は同様にして、コントロール２は、アプタマー１に代えてネガティブコントロールをインジェクションした以外は同様にして、コントロール３は、アプタマー１に代えてネガティブコントロールをインジェクションし、前記試料に代えて、５００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ＳＡをインジェクションした以外は同様にして、前記シグナル強度の測定を行った。
　これらの結果を図１に示す。図１は、前記ビオチン化ラクトパミンとＳＡとの複合体に対するアプタマーの結合能を示すグラフであり、横軸は、測定時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、０～１２０秒が、前記試料のインジェクション時間であり、１２０秒以降が、前記ＳＰＲバッファーによる洗浄の時間である。
　図１の実施例１に示すように、アプタマー１と前記試料とをインジェクションした場合、シグナル強度が上昇し、アプタマー１が、前記複合体に結合することがわかった。また、洗浄後もシグナル強度の著しい低下は観察されず、アプタマー１と前記複合体との結合が維持されることがわかった。これに対し、図１のコントロール１に示すように、アプタマー１と前記ＳＡとをインジェクションした場合、シグナル強度の上昇が観察されず、アプタマー１は、前記ＳＡに結合しないことがわかった。また、図１のコントロール２および３に示すように、ネガティブコントロールと前記複合体または前記ＳＡとをインジェクションした場合、いずれもシグナル強度の上昇が観察されず、ネガティブコントロールは、前記複合体および前記ＳＡに結合しないことがわかった。そして、実施例のアプタマーと前記複合体との解離定数は、約３５ｎｍｏｌ／Ｌであった。これらの結果から、実施例のアプタマーは優れた結合能で且つ特異的にラクトパミンに結合することがわかった。
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
　この出願は、２０１３年９月２５日に出願された日本出願特願２０１３－１９７９０７を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
　本発明の核酸分子は、ラクトパミンに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、例えば、ラクトパミンとの結合によって、ラクトパミンを検出できる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、食品管理、公衆衛生等の分野におけるラクトパミンの検出に、極めて有用なツールとなる。

Claims (11)

  1. 下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾塩基を含むことを特徴とする、ラクトパミンに結合する核酸分子。
    （ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ラクトパミンに結合するポリヌクレオチド
    （ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ラクトパミンに結合するポリヌクレオチド
  2. 前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のチミンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１記載の核酸分子。
  3. 前記ポリヌクレオチドにおいて、チミンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１または２記載の核酸分子。
  4. 前記ポリヌクレオチドにおいて、全チミンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のシトシンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾シトシンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 前記ポリヌクレオチドにおいて、シトシンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾シトシンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 前記ポリヌクレオチドにおいて、全シトシンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾シトシンである、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  8. 前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ラクトパミン検出試薬。
  10. 請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ラクトパミン検出キット。
  11. 請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子とサンプルとを接触させ、前記サンプル中のラクトパミンと前記核酸分子との複合体を形成させる工程、および、
    前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とするラクトパミン検出方法。
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