KR101216906B1

KR101216906B1 - 항생제 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 ｒｎａ 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101216906B1
Application number: KR1020100095518A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 한승렬; 유재훈
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2012-12-28
Also published as: KR20120033801A

Abstract

본 발명은 항생제 다노플록사신(danofloxacin)에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 상기 RNA 앱타머는 U(우라실)과 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 RNA 앱타머에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 RNA 앱타머를 포함하는 항생제 다노플록사신 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 검출용 키트, 항생제 다노플록사신을 검출하는 방법, 및 시료 내 항생제 다노플록사신을 제거하는 방법 및 상기 RNA 앱타머 제조 방법에 관한 것이다.

Description

항생제 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 ＲＮＡ 앱타머 및 이의 용도{RNA aptamer binding to danofloxacin with specificity and the use thereof}

플루오로퀴놀론계 항생제는 가축과 사람에 널리 사용되는 중요한 합성 항생제 중 하나로, 그램 양성 세균과 그램 음성 세균 모두에 항균 활성을 나타내는 항균 범위가 넓은 매우 유용한 항생제이다. 이와 같은 넓은 항균활성 범위로 인해 돼지, 닭 및 소 등 식육용 가축에 널리 사용되고 있으며 그로 인해 식육용 가축에 잔류할 위험성이 있다. 식육용 가축에 잔류하는 항생물질은 인간에 사용되는 의약품에 대한 병원체의 내성을 유도할 수 있고, 플루오로퀴놀론계 항생제에 노출된 유아에서 중추신경에 영향을 미치는 부작용이 보고된 바 있다. 이와 같이 식육용 가축에 플루오로퀴놀론계 항생제가 잔류하는 것은 잠재적으로 문제를 야기시킬 것으로 추측되며, 이를 모니터링하는 것은 식품안전성 검사에서 중요한 항목 중의 하나로 여겨지고 있다. 따라서, 식육용 가축에서의 플루오로퀴놀론계 항생제를 검출하기 위한 방법을 개발하기 위하여 많은 연구가 수행되어져 왔다. 한편 돼지에서의 플루오로퀴놀론계 항생제를 크로마토그래피 방법으로 검출하기 위한 여러 가지 방법들이 보고되었으나, 대부분 형광이나 자외선 검출기, 부분적으로 질량 분석기를 사용한 액체크로마토그래피를 이용하는 방법들이었다. 상기 방법들은 유기 용매와 수용성 용매를 사용하여 플루오로퀴놀론계 항생제를 추출한 다음 정제 과정(Cleanup procedure)을 거친 후 크로마토그래프에 주입하여 분석하는 것이다. 용매를 이용하여 생체 시료에서 플루오로퀴놀론계 항생제를 추출할 경우에는 에멀션(emulsion)이나 거품을 만들어 항생제의 분리와 정제를 어렵게 하기도 하고 물질의 용해도를 고려하여 용매의 선택에 있어 세심한 주의가 필요하다.

다노플록사신(danofloxacin)은 플루오로퀴놀론계열 항생제로서 수의학 분야에서 미생물의 감염에 대한 치료제로 사용되며, 그람 양성균 및 음성균에 현저한 작용을 하는 광범위한 항생물질이다. 이는 박테리아의 막에 존재하는 포린 단백질을 통해 박테리아 내로 유입되어 그람 양성균에서는 DNA 자이레이스(gyrase)를, 그람 음성균에서는 토포아이소머라제 Ⅳ (Topoisomerase Ⅳ)를 각각 억제하여 박테리아의 DNA 복제를 억제하여 항생작용을 나타낸다. 검출한계는 소근육 0.2㎍/㎎, 돼지근육 0.1㎍/㎎, 닭근육 0.2㎍/㎎ 이다. 다노플록사신이 인체에 축적되었을 경우 위장관계에서 복통, 오심, 구토, 설사를 유발하고, 중추신경계에서 두통, 어지럼증, 불면증을, 피부에서는 발진, 소양증, 광과민증, 간에서는 간 효소 수치 상승 등의 부작용을 유발하게 된다. 따라서, 상기 다노플록사신을 검출하고 이를 제거하는 방법의 개발을 통해 상기와 같은 부작용을 감소시키는 것이 필요하다.

앱타머는 특정 타깃에 대해 높은 특이성과 친화도를 갖는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체를 의미하는 것이다. 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체보다도 훨씬 표적에 대한 친화도가 높고, 열 안정성이 우수하며, in vitro에서 합성이 가능하기 때문에 동물에게 항원을 주입하여 항체를 생산하는 번거로운 공정을 생략할 수 있어 비용 면에서 훨씬 우위에 있고, 타깃 물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자나 환경호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타깃에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 따라서 앱타머는 극미량의 잔류 항생제의 검출방법에 도입하기에 매우 적절한 물질이며, 이를 활용한 나노바이오 기술을 이용하여 다른 특정 물질을 검출하는데도 응용할 수 있다. 이렇게 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템, 그리고 바이오센서로 이용하기 위하여 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 기존의 앱타머 개발의 목표는 대부분 의료 진단용 바이오센서 개발이나 신약 개발에 사용하기 위해 단백질 관련 질병의 표적물질로 하는 연구가 대부분이었다. 앱타머의 경우 항체나 효소와 같은 제한점이 없이 다양한 환경 유해화학물질에 대해 개발이 가능하고 바이오센서나 모니터링 시스템으로 개발하기에 유리한 점이 많아 환경 유해화학물질 분석 및 검출을 위한 기술을 개발하는데 좋은 재료이다.

기존의 다노플록사신의 검출에는 HPLC, LC/MS, GC/MS 등의 기계적인 검출 방법이 주로 사용되었는데, 기기분석을 통한 항생제 검출은 시간이 오래 걸리고 비용이 비싸다는 단점이 있었다. 앱타머를 통한 방법을 사용할 경우 시간과 비용을 줄을 수 있을 것이라 예상된다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 기존의 항생제 다노플록사신 검출에 사용되어지는 기계적인 기법들을 대체할 수 있는 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 서열번호 1 내지 6의 앱타머가 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 U(우라실)와 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 항생제 다노플록사신(danofloxacin)에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 앱타머를 포함하는 항생제 다노플록사신 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 항생제 다노플록사신 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항생제 다노플록사신을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 상기 RNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 항생제 다노플록사신과 RNA 앱타머의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 항생제 다노플록사신을 검출 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항생제 다노플록사신을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 상기 RNA 앱타머를 접촉시켜 항생제 다노플록사신 및 RNA 앱타머 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 복합체를 제거하는 단계를 포함하는 시료 내 항생제 다노플록사신을 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 RNA 앱타머를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 U(우라실)와 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 항생제 다노플록사신(danofloxacin)에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머에 관한 것이다.

본 발명의 상기 RNA 앱타머는 RNA 분해효소 저항성을 갖는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명에서 용어 "RNA 분해효소 저항성"이란 생체 내에 존재하는 RNA 분해효소에 의해 RNA 앱타머가 절단되는 것을 방지하는 것을 의미하며 이는 U 및 의 C의 2'히드록실기가 플루오르기로 치환되어 이루어진다.

본 발명자들은 RNA 분해효소 저항성을 갖는 RNA 앱타머를 제조하기 위해서 2'-데옥시-2'플루오르 CTP와 UTP 그리고 정상적인 GTP와 ATP들과 T7 RNA 중합효소를 이용해 시험관에서 합성된 주형의 전사에 의해 플루오르기로 매 2번 위치가 피리미딘기로 변형되어진 RNA를 생산한 결과 RNA 분해효소에 저항성을 갖는 RNA 앱타머를 제작하였다.

본 발명의 상기 서열번호 1 내지 서열번호 6의 RNA 앱타머 염기서열은 아래와 같다. (밑줄 친 부위는 무작위 염기서열로부터 SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)기술을 통해 발굴된 염기서열 부위이며 U와 C는 2' 히드록실기 대신 플루오르기로 구성되어있다.)

#8 (서열번호 1)

5'-GGGAUACCAGCUUAUUCAAUUGGGUUGACUUUUCCCUCAGGCUCCUGUGAAGCAACCGAAUGGACUGAAAUGAAACCGCCCGAGAUAGUAAGUGCAAUCU-3'

#5 (서열번호 2)

5'-GGGAUACCAGCUUAUUCAAUUAAUCGGCCCAAUUUUACCUUCGGACUUCAGUAUCUAGUGUGGCUUUAAAUCAUA GCGAGAUAGUAAGUGCAAUCU-3'

#8 59mer (서열번호 3, 최적화된 앱타머)

5'-GGGUGACUUUUCCCUCAGGCUCCUGUGAAGCAACCGAAUGGACUGAAAUGAAACCGCCC-3'

#8 47mer (서열번호 4, 최적화된 앱타머)

5'-GGGUCCCUCAGGCUCCUGUGAAGCAACCGAAUGGACUGAAAUGACCC-3'

#8 36mer (서열번호 5, 최적화된 앱타머)

5'-GGGUCAGGCUCCUGUGAAGCAACCGAAUGGACUGAC-3'

#8 24mer (서열번호 6, 최적화된 앱타머)

5'-GGGCUGUGAAGCAACCGAAUGCCC-3'

본 발명에서 용어, "다노플록사신(danofloxacin)"은 수의학 분야에서 미생물의 감염에 대한 치료제로 사용되는 플루오로퀴놀론계 항생제를 의미한다. 이는 그람 양성균, 음성균에 현저한 작용을 하는 광범위한 항생물질로서 박테리아의 막에 존재하는 포린 단백질을 통해 박테리아 내로 유입되어 그람 양성균에서는 DNA 자이레이스를, 그람 음성균에서는 토포아이소머라제 Ⅳ를 각각 억제하여 박테리아의 DNA 복제를 억제하여 항생작용을 나타낸다. 검출한계는 소근육 0.2㎍/㎎, 돼지근육 0.1㎍/㎎, 닭근육 0.2㎍/㎎이다. 다노플록사신이 인체에 축적되었을 경우 위장관계에서 복통, 오심, 구토, 설사를 유발하고, 중추신경계에서 두통, 어지럼증, 불면증을, 피부에서는 발진, 소양증, 광과민증, 간에서는 간 효소 수치 상승 등의 부작용을 유발하게 되나, 이전까지 이에 대하여 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머에 대해 보고된 바는 없다. 본 발명자들은 이에 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 새롭게 개발하였다.

본 발명에서 용어, "RNA 앱타머"는 짧은 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로 높은 친화도와 특이성으로 표적 물질에 결합할 수 있는 3차원 구조를 형성할 수 있으며, 대부분의 경우에 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐 아니라 효율적으로 그 기능을 억제할 수 있어 표적 단백질의 기능을 알아내는데 이용될 수 있다. 반복된 생체 외 선별과정은 임의의 RNA 라이브러리로부터 특이적인 RNA 분자, 즉 앱타머의 선별이 가능하도록 하는데 (A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346: 818-822, 1990; C. Tuerk and L. Gold, Science 249: 505-510, 1990) RNA 라이브러리의 사이즈가 크고(1014-1015) 생체 외 효소 작용에 의해 RNA 분자를 생성하기 쉽기 때문에 RNA 라이브러리는 고 친화도 앱타머를 선별하기 위한 다른 생물학적 라이브러리 또는 합성 라이브러리보다 우수하다(E. N. Brody and L. Gold, Rev. Mol. Biotechnol. 74: 5-13, 2000).

본 발명의 RNA 앱타머는, 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 이와 같은 앱타머는 표적 단백질뿐만 아니라 표적 화합물에도 특이적으로 결합할 수 있으며, 본 발명의 목적상 항생제인 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 서열번호 1 내지 6의 RNA 앱타머가 항생제 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 무작위 60개 서열을 가진 pool로 구성된 RNA 라이브러리를 생성하여 다노플록사신에 결합하는 RNA 앱타머를 선별하였다. 6번의 과정 후 얻어진 RNA pool이 다노플록사신에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해서 real-time PCR을 수행하여 다노플록사신에 결합한 RNA의 양을 측정하여, 얻어진 RNA의 양을 사용한 RNA에 대한 백분율로 나타내었다(도 2). 선별된 RNA들은 크게 그룹 (클론 8번)과 그룹 (클론 5번)로 분류되었고(도 3), 이들이 다노플록사신에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해, RNA 앱타머 3' 말단에 A 뉴클레오티드 16개를 연결하고 dT-FAM 올리고와 결합시켜 항생제와 결합시킨 뒤 결합된 RNA 앱타머를 항-FAM-HRP 항체를 이용하여 형광광도계를 이용해 형광을 측정한 결과 SELEX를 통해 얻어진 RNA 앱타머 서열번호 1(클론 8번)과 서열번호 2(클론 5번)은 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 4). 그 후 선별된 클론 8번과 5번의 RNA 앱타머의 최적화를 위해 전체 길이의 RNA 앱타머를 단계적으로 잘라내어 절단한 결과, 서열번호 1(클론 8번)의 앱타머의 절단된 형태인 서열번호 3(59mer), 서열번호 4(47mer), 서열번호 5(36mer), 서열번호 6(24mer)가 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였으며(도 5 및 6), 서열번호 2(클론 5번)의 앱타머의 절단된 형태인 64mer, 43mer, 27mer는 다노플록사신에 특이적으로 결합하지 못함을 확인하였다(도 7). 최적화된 서열번호 5의 36mer RNA 앱타머의 특이성을 확인하기 위해 항생제에 대한 대조군으로 5' 말단에 비오틴이 표지된 올리고를 사용하여 다노플록사신과의 결합이 동일한 36mer RNA와의 경쟁을 통해 그 결합이 줄어드는지 확인한 결과, 서열번호 5의 앱타머가 선별된 염기서열에 의해 이루어지는 특이적인 구조에 의해 다노플록사신에 결합한다는 것을 확인할 수 있었다(도 9). 최종적으로, Biacore2000 장비를 이용해 SPR 실험을 통해 선별한 RNA 앱타머들의 다노플록사신에 대한 친화도를 살펴본 결과, 선별된 서열번호 1번의, 2번의 RNA 앱타머는 다노플록사신에 대해 각각 4.8nM, 4.9nM의 친화력을 가지는 것을 확인하였으며, 서열번호 5의 최적화된 36mer RNA 앱타머는 3.7nM의 높은 친화도를 가짐을 확인하였다(도 10). 이와 같은 결과로부터, 본 발명의 상기 RNA 앱타머들이 다노플록사신에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 U(우라실)와 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 항생제 다노플록사신(danofloxacin)에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 포함하는 항생제 다노플록사신 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 조성물은 HPLC, LC/MS, GC/MS 등의 기계적인 검출 방법을 대체하여 항생제 다노플록사신을 특이적으로 검출할 수 있는 것으로, 잔류 항생제는 매우 적은 양으로 식품이나 환경에 존재하더라도 생물농축현상 등과 같은 여러 환경적인 경로에 의해서 최종 소비자인 사람에게 영향을 미칠 수 있기 때문에, 축산물에서 광범위하게 사용되고 있는 잔류 항생물질을 검출 및 제거하는 기술이 필요하다. 따라서 항생제 다노플록사신의 검출을 위해 본 발명의 RNA 앱타머를 포함하는 조성물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 RNA 앱타머를 자성비드에 고정화시켜 다노플록사신을 결합시키게 되면 결합된 RNA 앱타머-다노플록사신 복합체를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 복합체로부터 다시 다노플록사신을 분리함으로써 다노플록사신만을 선택적으로 검출 및 제거할 수 있다. 또 다른 방법으로, 본 발명의 RNA 앱타머와 연결자로 연결된 센서를 이용하여 시료 중의 다노플록사신을 검출하는 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에서 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 가질 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 U(우라실)와 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 항생제 다노플록사신(danofloxacin)에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 포함하는 항생제 다노플록사신 검출용 조성물을 포함하는 항생제 다노플록사신 검출용 키트에 관한 것이다.

상기 검출용 키트는 항생제 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 가지는 다노플록사신 검출용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 키트를 이용할 경우, 기존의 기기적인 분석을 이용한 방법을 사용하는 데 비해 시간과 비용을 줄일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항생제 다노플록사신을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 상기 RNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 항생제 다노플록사신과 RNA 앱타머의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 항생제 다노플록사신을 검출하는 방법에 관한 것이다.

상기 항생제 다노플록사신을 함유하는 것으로 의심되는 시료는 이에 제한되는 것은 아니나, 항생제 다노플록사신이 축적될 수 있는 소근육, 돼지근육, 닭근육, 등의 가축의 근육 또는 이를 섭취한 사람의 근육 등에 존재하는 다노플록사신이 포함된 시료이다.

다노플록사신의 검출을 위해 본 발명의 RNA 앱타머를 이용하여 어떠한 형태로도 사용할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 본 발명의 RNA 앱타머를 자성비드에 고정화된 다노플록사신에 결합시키게 되면 결합된 RNA 앱타머-항생제-자성비드를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 복합체로부터 다시 다노플록사신을 분리함으로써 다노플록사신만을 선택적으로 검출할 수 있게 된다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 항생제 다노플록사신을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 상기 RNA 앱타머를 접촉시켜 항생제 다노플록사신 및 RNA 앱타머 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 복합체를 제거하는 단계를 포함하는 시료 내 항생제 다노플록사신을 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 항생제 다노플록사신을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 RNA 앱타머 접촉시켜 복합체를 형성하여, 상기 복합체를 제거하는 단계를 포함하는 시료 내 항생제 다노플록사신을 제거하는 방법은 여러 가지일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 본 발명의 RNA 앱타머를 자성비드에 고정화시켜 다노플록사신을 결합시키게 되면 결합된 RNA 앱타머-다노플록사신 복합체를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 복합체로부터 다시 다노플록사신을 분리함으로써 다노플록사신만을 선택적으로 검출 및 제거할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 U(우라실)와 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 항생제 다노플록사신(danofloxacin)에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 제조 방법에 대한 것이다.

본 발명의 RNA 앱타머를 제조하는 방법은 (a) 무작위 60개 서열을 가진 pool로 구성된 RNA 라이브러리를 생성하는 단계; (b) SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법을 통하여 다노플록사신에 특이적인 RNA 분해 효소에 저항성이 있는 RNA 앱타머를 분리하는 단계; 및 (c) 선별된 RNA 앱타머의 항생제 다노플록사신에 특이적 결합을 real-time PCR을 통해 확인하는 단계를 포함하는 것으로 이루어진 방법이다.

본 발명의 상기 (a) 무작위 60개 서열을 가진 pool로 구성된 RNA 라이브러리를 생성하는 단계는 60개 염기가 무작위로 들어간 단일 올리고뉴클레오티드를 주형으로 이용하여 5'프라이머와 3'프라이머로 PCR을 통해 DNA 라이브러리를 제조한 후, 상기 DNA 라이브러리를 주형으로 T7 중합효소를 이용해 시험관내 전사 과정을 거쳐 다양한 염기서열을 갖는 RNA 라이브러리를 제조하여 수행될 수 있다.

본 발명의 상기 (b) SELEX 방법을 활용하여 다노플록사신에 특이적인 RNA 분해 효소에 저항성이 있는 RNA 앱타머를 분리하는 단계에서 SELEX 방법은 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법 (Louis C. Bock, Linda C. Griffin, John A.Latham, Eric H. Vermaas, John J. Toole. 1992. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature 355, 564-566)을 말한다. 다양성이 매우 높은(>10¹⁵이상의 다양한 서열을 가진 RNA가 섞여있는) 라이브러리부터 가장 적합한 RNA 분자를 찾는 기술 적용하면 기능체 RNA를 얻을 수 있었다. 일반적으로 라이브러리는 60개 이상의 임의의 서열의 양 끝의 RNA 서열을 갖는 RNA 분자들이 혼합된 상태이다.

본 발명의 SELEX 방법의 활용에서 표적하는 항생제인 다노플록사신과 이에 제한되는 것은 아니나, 다노플록사신과 구조가 상이한 비표적 항생제를 이용할 수 있으며 그 예로, 비표적 항생제인 테트라사이클린을 비오틴으로 표지하여 스트랩타비딘-아다로스 비드를 이용해 RNA 라이브러리로부터 RNA 앱타머들을 선별할 수 있다. 이는 비표적 항생제와 결합한 RNA 앱타머를 스트랩타비딘-아가로스 비드에 결합시킨 후 제거 후, 다노플록사신과 결합하는 앱타머를 스트랩타비딘-아가로스 비드와 결합하여 특이적 RNA 앱타머를 선별하여 수행하는 것이다.

본 발명의 상기 (c) 선별된 RNA 앱타머의 항생제 다노플록사신에 특이적 결합을 real-time PCR을 통해 확인하는 단계에서 상기 (b)에서 얻어진 RNA를 역전사-유전자 증폭기술과 시험관 전사를 반복하여 이에 제한되는 것은 아니나, 6번의 선별과정을 거친 후 증폭된 DNA를 클로닝한 다음 염기 서열 분석 수행에 의해, 특이적 RNA 앱타머를 선별할 수 있다.

앱타머의 경우 항체나 효소와 같은 제한점이 없이 다양한 환경 유해화학물질에 대해 개발이 가능하고 바이오센서나 모니터링 시스템으로 개발하기에 유리한 점이 많아 환경 유해화학물질 분석 및 검출을 위한 기술을 개발하는데 좋은 재료가 될 수 있다. 본 발명의 RNA 앱타머를 사용하여, 항생제 다노플록사신을 특이적으로 검출할 수 있으며, 본 발명의 RNA 앱타머를 이용할 경우 항생제 다노플록사신 검출에 드는 시간과 비용을 줄일 수 있을 것이라 예상된다. 또한 항생제에 특이적으로 결합하는 본 발명의 RNA 앱타머를 이용한 경우 잔류한 항생제의 제거에도 이용할 수 있을 것이다.

도 1은 SELEX 실험 수행을 위해 표적 항생제인 다노플록사신과 비표적 항생제인 테트라사이클린의 Biotinylation한 모식도이다.
도 2는 6 라운드 후 얻어진 RNA pool이 다노플록사신에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위하여 Real-time PCR을 수행하여 표적 항생제에 결합한 RNA의 양을 측정하였다. 각각의 시료에서 얻어진 RNA의 양을 사용한 RNA에 대한 백분율로 나타낸 도이다.
도 3은 선별된 2'-플루오르 RNA 앱타머들의 염기서열과 예상된 2차 구조이다. C와 U는 2'-플루오르 C와 2'-플루오르 U를 나타낸 것이다. 염기서열의 빨간색 부위와 2차 구조에서 색으로 표시된 부위는 무작위 서열에서 선별된 염기서열을 나타낸 도이다.
도 4는 선별된 RNA 앱타머 클론들이 다노플록사신에 특이적으로 결합하는지 확인한 도이다. RNA 앱타머의 3' 말단에 A 뉴클레오티드 16개를 연결하고 dT-FAM 올리고와 결합시켜 항생제와 결합시킨 뒤, 결합된 RNA 앱타머를 항-FAM-HRP 항체를 이용하여 형광광도계를 이용해 형광을 측정하였다.
도 5는 선별된 서열번호 1번과 서열번호 2번의 RNA 앱타머의 절단된 형태의 앱타머들의 예상되어지는 2차 구조를 나타낸 도이다.
도 6는 선별된 서열번호 1번의 RNA 앱타머와 서열번호 1번에 대한 절단된 형태의 RNA 앱타머들의 다노플록사신에 대한 결합을 확인한 도이다. (A) 전체 길이와 59mer, 47mer, 36mer (B) 36mer와 24mer, 21mer
도 7은 선별된 5번 클론 RNA 앱타머와 5번 클론에 대한 절단된 형태의 RNA 앱타머들의 다노플록사신에 대한 결합을 확인한 도이다.
도 8은 최적화된 절단된 형태의 8번 클론의 36mer RNA 앱타머의 특이성을 확인한 도이다. 항생제에 대한 대조군으로 5' 말단에 비오틴이 표지된 올리고를 사용하였다. 36mer 앱타머의 특이성을 확인하기 위하여 비표적 물질에 대한 RNA 앱타머를 사용하였다.
도 9는 최적화된 36mer RNA 앱타머의 특이성을 확인하기 위하여 경쟁자 RNA들을 처리한 결과를 나타낸 도이다. 36mer RNA 앱타머의 3' 말단에 A 뉴클레오티드 16개를 연결하고 dT-FAM을 결합시켜 항-FAM-HRP를 이용하여 형광광도계로 측정하였다. 경쟁자 RNA들은 dT-FAM이 결합할 수 있는 3'말단의 16개의 A 뉴클레오티드가 달려 있지 않은 RNA들을 사용하였다.
도 10은 Biacore2000 장비를 이용해 SPR 실험을 통한 선별된 RNA 앱타머들의 다노플록사신에 대한 친화도를 나타낸 도이다. YJ-1과 라이브러리 RNA는 RNA 대조군으로 사용하였다. (A) 100nM의 각각의 RNA 앱타머들과 다노플록사신간의 결합 정도를 그래프로 표시한 것. (B) SPR 실험을 통해 관찰된 각 RNA 앱타머들의 다노플록사신에 대한 KD 상수를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예1 : RNA 앱타머 발굴

SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 과정을 수행하는데 필요한 RNA 라이브러리를 제조하기 위하여 먼저 60개의 염기가 무작위로 들어간 단일 올리고뉴클레오티드를 주형으로 이용하여 5'-프라이머와 3'-프라이머로 PCR을 통해 DNA 라이브러리를 제조하였다. 5'-프라이머는 RNA를 합성하기 위한 T7 RNA 중합효소 프로모터 부분을 포함하고 있다. 0.25μM 5'-프라이머(5'-GGGTAATACGACTCACTATAGGGATACCAGCTTATTCAAT-3', 서열번호 7), 0.25μM 3'-프라이머(5'-AGATTGCACTTACTATCT-3', 서열번호 8), 10X PCR 버퍼, 200μM dNTP mixture, DNA taq 중합효소(Finzzyme) 3 unit을 혼합하여 PCR을 수행하였다. 그리고 PCR 사이클로는 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 10 사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72℃ 7분으로 다양한 DNA 라이브러리를 제조하였다.

PCR을 통해 만들어진 DNA 라이브러리를 주형으로 T7 RNA 중합효소(Epicentre Technologies)를 이용하여 시험관 내 전사 과정을 거쳐 다양한 염기서열을 갖는 RNA 라이브러리를 제조하였다. 이때 RNA 분해 효소에 저항성 있는 RNA를 제조하기 위하여 2'-데옥시-2'플루오르 CTP와 UTP (Epicentre Technologies) 그리고 정상적인 GTP와 ATP들과 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관에서 합성된 주형의 전사에 의해 플루오르기로 매 2번 위치가 피리미딘기로 변형되어진 RNA를 생산하였다. 즉 DNA 라이브러리, 5X 전사 버퍼(transcription buffer), 5 mM DTT, 5 mM ATP, GTP, 2'-F CTP, 2'-F UTP, T7 RNA 중합효소, DEPC-H₂O 로 20㎕ 로 맞추고 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다. DNaseI(Epicentre Technologies)를 처리하여 37℃에서 30분간 처리하여 주형으로 사용된 DNA를 제거한 후 7M urea-8% 폴리아크릴아미드 겔에서 RNA 라이브러리를 추출하였다. RNA 라이브러리 염기서열은 A, G, C 그리고 U 각각 위치의 같은 molar로 혼입된 60개의 뉴클레오티드를 나타내는 N60 (5'-ATACCAGCTTATTCAATN60AGATAGTAAGTGCAATCT-3', 서열번호 9)을 갖는다.

SELEX에 사용할 다노플록사신과 테트라사이클린은 시그마(sigma)에서 구입하였고, 각각의 항생제에 비오틴을 고정화하였다. 다노플록사신 5.2㎎을 DMSO 400㎕에 녹이고 pH 5.0의 10mM MES(2-(N-morpholino) ethanesulphonic acid) 버퍼 800㎕에 넣었다. 여기에 7.1㎎의 EZ-link iodoacetyl LC 비오틴을 넣어 37℃에서 밤새 교반하였다. 이후 HPLC로 정제하여 생성물을 수득하였다. 테트라사이클린 12㎎을 400㎕ DMSO에 녹이고 pH 12.5의 10mM CHES(N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid) 버퍼 800㎕에 넣었다. 여기에 11㎎의 EZ-link iodoacetyl LC 비오틴을 넣어 37℃에서 밤새 교반하였다. 이후 HPLC로 정제하여 생성물을 수득하였다. SELEX 기술을 활용하여 다노플록사신에 특이적인 RNA 분해 효소에 저항성 있는 RNA 앱타머를 분리하였다. 처음 300pmole의 RNA 라이브러리를 실온에서 5분 동안 600pmole의 테트라사이클린과 200㎕ 결합 완충액 (30mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM dithiothreitol, and 1 % BSA)에서 반응하여 테트라사이클린과 반응하는 비특이적 RNA를 반응시켰다. 그 후 상층액을 스트랩타비딘-아가로스 비드(streptavidin-agarose bead(Sigma)) 20㎕가 들어 있는 새로운 튜브에 옮겨 진탕 상태로 실온에서 20분간 반응시켜 테트라사이클린과 결합한 비특이적 RNA를 제거하였다. 그 후 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 다노플록사신 150pmole을 첨가하여 실온에서 5분간 반응하였다. 그 후 상층액을 streptavidin-agarose bead 20㎕가 들어 있는 새로운 튜브에 옮겨 진탕 상태로 실온에서 20분간 반응 후 침전하여 펠렛을 400㎕ 결합 완충액으로 5번 씻어주었다. 이렇게 얻어진 RNA를 역전사-유전자 증폭기술과 시험관 전사를 반복하여 6번의 선별 후 증폭된 DNA를 클로닝한 다음 14개의 클론의 염기서열을 분석하였다.

실시예 2 : Real-time PCR

SELEX 과정이 수행되었던 RNA와 초기의 RNA 라이브러리 각각 3pmole과 스트렙타비딘이 코팅된 플레이트에 항생제를 고정화시킨 후 결합된 RNA를 얻어내었다. 페놀 추출/에탄올 침전 과정을 통해 RNA를 얻어낸 후 DEPC-H₂O를 넣어 RNA를 녹였다. 여기에 200nM 3'프라이머(서열번호 8)를 넣고 65℃에서 5분간 가열한 뒤 상온에서 10분간 RNA와 3'프라이머(서열번호 8)를 결합시켰다. 1mM dNTP, 5X RTase 버퍼, 200 unit M-MLV RTase (Finzzyme)를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응한 뒤 95℃에서 5분간 RTase를 불활성화시켰다. 역전사 시킨 단일 DNA 중 1/3만 PCR 주형으로 사용하였다. 실시간 양을 측정하기 위해 Real-time PCR (Rotor Gene RG-6000)을 다음과 같은 조건으로 사용하였다. cDNA, 100nM 5'프라이머(서열번호 7), 100nM 3'프라이머(서열번호 8), 10X PCR 버퍼 10㎕, 500μM dNTP, 5X RTase 버퍼 7㎕, 100X Syber green, 2 unit Taq 중합효소(Finnzyme)를 혼합하여 처음 95℃ 5분간 유지한 후 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초 조건으로 40 사이클을 반복하여 얻어진 RNA의 양을 측정하였다.

실시예 1의 6번의 선별을 거쳐 얻어진 RNA pool이 다노플록사신에 특이적으로 결합하는지를 real-time PCR을 통하여 확인하였으며(도 2), 이러한 라이브러리에서 선별된 RNA 앱타머들은 클론 #8 (5'-GGGAUACCAGCUUAUUCAAUUGGGUUGACUUUUCCCUCAGGCUCCUGUGAAGCAACCGAAUGGACUGAAAUGAAACCGCCCGAGAUAGUAAGUGCAAUCU-3', 서열번호 1)인 그룹 I과 클론 #5(5'-GGGAUACCAGCUUAUUCAAUUAAUCGGCCCAAUUUUACCUUCGGACUUCAGUAUCUAGUGUGGCUUUAAAUCAUAGCGAGAUAGUAAGUGCAAUCU-3', 서열번호 2)인 그룹 II의 두 그룹으로 분류되었다(도 3). 상기 클론 #8과 클론 #5의 밑줄 친 부위는 무작위 염기 서열로부터 SELEX 기술을 통해 발굴된 염기서열 부위이며 U와 C는 2'가 히드록실기기 대신 플루오르기로 구성되어 있다. M-flod를 이용하여 이들이 안정적인 2차 구조를 갖는 것으로 예측되었으며, 2개의 그룹은 서로 염기서열은 다르지만 특이하게도 유사한 stem-loop 구조를 갖으며, RNA 라이브러리의 무작위 부분으로부터 선별된 상기 두 앱타머의 stem-loop 부분이 다노플록사신을 특이적으로 인지하는 부위일 것이라는 가능성을 제시한다.

실시예 3 : RNA 앱타머의 항생제 결합 분석

우선 비오틴이 표지되어 있는 다노플록사신과 테트라사이클린 100pmole을 스트랩타비딘이 코팅된 96 웰 블랙 플레이트(Nunc.)에 실온에서 DEPC-H₂O 50㎕에서 30분 동안 고정화시켰다. 고정화 후 DEPC-H₂O 200㎕로 2번 씻어주어 스트랩타비딘과 결합되지 않은 항생제들을 제거하였다. 실험에 사용한 RNA는 3' 말단에 A 뉴클레오티드 16개가 추가된 RNA 앱타머(A16 RNA 앱타머)를 사용하였다. A16 RNA 앱타머 10pmole과 dT(16)-5'-FAM 올리고 100pmole을 10㎕ 용량으로 실온에서 30분간 결합시켰다. 결합시킨 RNA 앱타머를 100㎕의 결합 완충액에 넣어 준 후 항생제가 고정화되어 있는 플레이트의 웰에 넣어준 후 실온에서 20분간 반응시켰다. 결합 완충액 200㎕로 3회 씻어내어 비특이적 결합과 결합하지 않은 RNA 앱타머들을 제거하였다. Block 용액 (3% BSA, 0.05% Tween-20, 1.5mM MgCl2, 1XPBS) 200㎕를 각 웰에 넣어 준 후 실온에서 30분간 블로킹하였다. 그 후 항-FAM-HRP 항체(Invitrogen)를 항체 결합용액 (0.05% Tween-20, 1.5mM MgCl2, 1XPBS)에 1:166으로 희석하여 희석한 항체 100㎕를 각 웰에 넣어 주어 항생제와 결합하고 있는 RNA 앱타머에 달려 있는 FAM과 실온에서 15분간 결합시켰다. FAM과 항체를 결합시킨 후 세척용액(0.1% Tween-20, 1.5mM MgCl2, 1XPBS) 200㎕로 3번 씻어주어 결합하지 않은 항체를 제거하였다. 그 후 HRP 기질 용액 100㎕를 넣은 후 형광광도계 (Thermo Scientific)로 형광을 측정하였다.

측정한 결과 대조군으로 사용한 dT-FAM과 2번 위치가 플루오르기로 치환된 라이브러리 RNA들은 다노플록사신과 거의 결합하지 않지만, SELEX를 통해 얻어진 RNA 앱타머 클론 8번과 클론 5 번은 테트라사이클린에는 결합하지 않고 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 4).

실시예 4 : 절단된 형태의 RNA ( truncated RNA ) 앱타머 제작

선별된 클론 8번과 5번의 RNA 앱타머의 최적화를 위해 전체 길이의 RNA 앱타머를 단계적으로 잘라내어 truncation을 하였다(도 5). 클론 8번은 59mer, 47mer, 36mer, 24mer, 21mer로, 클론 5번은 64mer, 43mer, 27mer로 truncation을 하였다. RNA 앱타머 8번 (group I)의 경우 59mer 앱타머를 5'프라이머 (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTGACTTTTCCCTCAGGCTCCTG-3', 서열번호 10) 및 3'프라이머 (5'-GGGCGGTTTCATTTCAGTCCATTCGGTTGCTTCACAGGAGCCTG-3', 서열번호 11)로, 47mer 앱타머를 5'프라이머 (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTCCCTCAGGCTCCTGTG-3', 서열번호 12) 및 3'프라이머 (5'-GGGTCATTTCAGTCCATTCGGTTGCTTCACAGGAGCCTG-3', 서열번호 13)로, 36mer 앱타머를 5'프라이머 (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTCAGGCTCCTGT-3', 서열번호 14) 및 3'프라이머 (5'-GTCAGTCCATTCGGTTGCTTCACAGGAGCCTGA-3',서열번호 15)로, 24mer 앱타머를 5'프라이머 (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGCTGTG-3',서열번호 16) 및 3'프라이머 (5'-GGGCATTCGGTTGCTTCACAGCCCTAT-3', 서열번호 17)로, 21mer 앱타머를 5'프라이머 (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGCTGTG-3', 서열번호 18) 및 3'프라이머 (CATTCGGTTGCTTCACAGCCCTAT, 서열번호 19) 으로 각각 PCR로 증폭시켰다. 0.25μM 5'-프라이머, 0.25μM 3'-프라이머, 5X PCR 버퍼, 200μM dNTP mixture, Phusion DNA taq 중합효소(Finzzyme) 0. 2unit을 혼합하여 PCR을 수행하였다. 그리고 PCR 사이클로는 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 25 사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72℃ 7분으로 DNA 주형을 제조하였다. RNA 앱타머 5번(group II)의 경우 64mer 앱타머를 5'프라이머 (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTCGGCCCAATTTT-3', 서열번호 20), 3'프라이머-1 (5'-ACACTAGATACTGAAGTCCGAAGGTAAAATTGGGC-3', 서열번호 21) 및 3'프라이머-2 (5'-GGGTCTCGCTATGATTTAAAGCCACACTAGATA-3', 서열번호 22)로, 43mer 앱타머를 5'프라이머 (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTTACCTTCGGACT-3', 서열번호 23) 및 3'프라이머 (5'-GGGTTTAAAGCCACACTAGATACTGAAGTCCGAAGG-3', 서열번호 24)로, 27mer 앱타머를 5프라이머 (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTCGGACT-3', 서열번호 25) 및 3프라이머 (5'-GCCACACTAGATACTGAAGTCCGACCC-3', 서열번호 26)으로 각각 PCR로 증폭시켰다. 0.25μM 5'-프라이머, 0.25μM 3'-프라이머, 5X PCR 버퍼, 200μM dNTP mixture, Phusion DNA taq 중합효소(Finzzyme) 0.2 unit을 혼합하여 PCR을 수행하였다. 그리고 PCR 사이클로는 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 25 사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72℃ 7분으로 DNA 주형을 제조하였다. 증폭시킨 이중나선 DNA 주형을 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관 내 전사를 수행한다. 이때 피리미딘 뉴클레오티드들은 2'-플루오르기로 치환된 것들을 이용하였다. 제작된 각각의 RNA 앱타머들은 우레아 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동 한 후 정제하였다.

상기 실시예 3의 RNA 앱타머의 항생제 결합 분석과 유사하게 결합여부를 확인한 결과 클론 8번의 절단된 RNA 앱타머들은 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였으나(도 6, A,B), 21mer 절단된 RNA 앱타머는 다노플록사신에 결합하지 않는 것을 확인하였다 (도 6, B). 또한 RNA 대조군으로 사용한 2번이 플루오르기로 치환된 비특이적 RNA 앱타머들은 다노플록사신에 결합하지 않는 것으로 보아 선별된 RNA 앱타머가 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다. 그리고 클론 5번에 대한 64mer, 43mer, 27mer 절단된 형태인 RNA 앱타머들은 다노플록사신에 결합하지 못하였다(도 7). 이는 클론 5번은 클론 8번과는 다르게 전체 염기서열이 모두 있어야 다노플록사신에 결합할 수 있음을 알 수 있다. 또한 선별된 RNA 앱타머들이 다노플록사신과 비오틴사이의 링커에 결합하지 않는다는 것을 확인하기 위하여 비오틴이 표지된 올리고를 표적에 대한 대조군으로 스트랩타비딘 플레이트에 고정화시킨 후 최적화된 36mer RNA 앱타머를 결합시켜 보았을 때 다노플록사신에만 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다 (그림 8).

클론 8번과 클론 5번을 절단한 결과 최적화된 앱타머는 다음과 같다.

#8 59mer (최적화된 앱타머, 서열번호 3)

5'-GGGUGACUUUUCCCUCAGGCUCCUGUGAAGCAACCGAAUGGACUGAAAUGAAACCGCCC-3'

#8 47mer (최적화된 앱타머, 서열번호 4)

5'-GGGUCCCUCAGGCUCCUGUGAAGCAACCGAAUGGACUGAAAUGACCC-3'

#8 36mer (최적화된 앱타머, 서열번호 5)

5'-GGGUCAGGCUCCUGUGAAGCAACCGAAUGGACUGAC-3'

#8 24mer (최적화된 앱타머, 서열번호 6)

5'-GGGCUGUGAAGCAACCGAAUGCCC-3'

(밑줄 친 부위는 무작위 염기서열로부터 SELEX 기술을 통해 발굴된 염기서열 부위이며 U와 C는 2' 히드록실기 대신 플루오르기로 구성되어있다.)

실시예 5 : RNA 앱타머의 특이성 분석

#8-36mer RNA 앱타머의 3 말단에 A16을 달아 dT-FAM oligo와 결합시킨 뒤 다노플록사신이 고정화되어 있는 웰에 A16 36mer 앱타머를 결합시킬 때, A16 올리고가 달려 있지 않은 36mer 앱타머와 다른 대조군 앱타머들을 함께 처리하여 A16 36mer 앱타머가 다노플록사신에 결합하는 정도를 항-FAM-HRP 항체와 형광광도계를 이용하여 측정하였다.

클론 8번의 36mer 절단된 형태인 RNA 앱타머의 특이성을 확인하기 위해 다노플록사신과의 결합이 동일한 36mer RNA와의 경쟁을 통해 그 결합이 줄어드는지 확인하였다. 36mer RNA 앱타머의 3'말단에 A16을 연결한 뒤 dT-FAM 올리고를 결합시킨 RNA 앱타머와 A16이 연결되지 않은 36mer RNA 앱타머를 경쟁자로 넣어주어 형광으로 다노플록사신과의 결합을 확인하였다. 자기 자신인 36mer RNA 앱타머를 비율별로 높여가며 넣어 주었을 때 A16 36mer RNA 앱타머가 나타내는 형광이 줄어드는 것으로 보아 A16 36mer RNA 앱타머가 36mer RNA 앱타머들과의 경쟁으로 다노플록사신과의 결합이 없어지는 것을 확인하였다(도 9). 이는 36mer RNA 앱타머가 비특이적인 RNA 상호작용이 아닌 선별된 염기서열에 의해 이루어지는 특이적인 구조에 의해 다노플록사신에 결합한다는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 또한 비특이적 RNA 앱타머들은 A16 36mer RNA 앱타머와 다노플록사신과의 결합을 방해하지 못하는 것으로 보아 36mer RNA 앱타머의 다노플록사신에 대한 특이적인 결합을 확인할 수 있었다.

실시예 6 : RNA 앱타머 결합 친화도 분석

Biacore2000 (GE healthcare) 장비를 이용하여 SPR 실험을 수행하였다. SA chip (streptavidin coated sensor chip, GE healthcare)을 이용해 항생제를 고정화시켰다. 항생제를 고정하기 전 50mM NaOH를 5㎕/min의 유속으로 1분씩 3번 흘려주어 칩을 활성화시켰다. 그 후 비오틴-다노플록사신과 비오틴-테트라사이클린을 결합 완충 용액 (30mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂) 100㎕에 섞은 뒤 5㎕/min의 유속으로 고정화하였다. 그 후 50mM NaOH를 5㎕/min의 유속으로 1분 흘려주어 고정화 정도를 확인하였다. 각각의 RNA 앱타머들을 농도별로 5㎕/min의 유속으로 kinetic flow (association 2분, dissociation 2분)으로 흘려주어 얻어진 그래프를 Biaevaluation 3.1 program을 이용하여 친화도를 측정하였다.

SPR 분석결과, 선별되어진 클론 8번, 5번의 RNA 앱타머는 다노플록사신에 대해 각각 4.8nM, 4.9nM의 친화력을 보이는 것을 확인하였다. 클론 8번의 절단된 RNA 앱타머들 역시 비슷한 수준의 친화력을 보이는 것을 확인했으며, 최적화된 36mer RNA 앱타머는 3.7nM의 높은 친화도를 확인할 수 있었다. 반면 대조군 RNA들인 라이브러리와 YJ-1 RNA들은 수십nM의 친화도를 보여 선별된 RNA 앱타머들이 다노플록사신에 특이적으로 높은 친화도를 보이는 것을 확인하였다(도 10).

이러한 결과로부터 선별된 RNA 앱타머들이 다노플록사신을 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

U(우라실)와 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 항생제 다노플록사신(danofloxacin)에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머.
제1항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 RNA 분해효소에 저항성을 갖는 것인 RNA 앱타머.
제1항의 앱타머를 포함하는 항생제 다노플록사신 검출용 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는 항생제 다노플록사신 검출용 키트.
(a) 항생제 다노플록사신을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 U(우라실)와 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 항생제 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
(b) 항생제 다노플록사신과 RNA 앱타머의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 항생제 다노플록사신을 검출하는 방법.
(a) 항생제 다노플록사신을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 U(우라실)와 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 항생제 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 접촉시켜 항생제 다노플록사신 및 RNA 앱타머 복합체를 형성하는 단계; 및
(b) 상기 복합체를 제거하는 단계를 포함하는 시료 내 항생제 다노플록사신을 제거하는 방법.
(a) 무작위 60개 서열을 가진 pool로 구성된 RNA 라이브러리를 생성하는 단계;
(b) SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법을 통해 다노플록사신에 특이적인 RNA 분해 효소에 저항성이 있는 RNA 앱타머를 분리하는 단계; 및
(c) 선별된 RNA 앱타머의 항생제 다노플록사신에 특이적 결합을 real-time PCR을 통해 확인하는 단계를 포함하는, 다노플록사신에 특이적으로 결합하는 제1항의 RNA 앱타머 제조 방법.