JP7343138B2 - ターゲットの分析方法および分析キット - Google Patents
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Description
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記蛍光非標識アプタマーと、前記蛍光標識相補鎖と、サンプルとを共存させ、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖との結合および非結合に依存する、前記蛍光標識相補鎖に由来する偏光度の変化を検出する検出工程と、
前記偏光度の変化に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する分析工程とを含むことを特徴とする。
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。
本発明のターゲット分析方法は、前述のように、蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを使用し、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記蛍光非標識アプタマーと、前記蛍光標識相補鎖と、サンプルとを共存させ、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖との結合および非結合に依存する、前記蛍光標識相補鎖に由来する偏光度を検出する検出工程と、
前記偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する分析工程とを含むことを特徴とする。
3’末端またはその周辺領域(3’領域)、5’末端またはその周辺領域(5’領域)、前記3’領域と5’領域との間でもよく、好ましくは、3’末端または5’末端である。前記蛍光物質は、例えば、前記相補鎖に直接連結されてもよいし、後述する付加配列(リンカー)を介して間接的に連結されてもよい。
前記第1の分析方法は、前記検出工程が、反応系において、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖とのハイブリッドを形成し、前記反応系に前記サンプルを添加し、前記ハイブリッドに前記サンプル中のターゲットを接触させ、前記反応系の偏光度を測定する工程であり、前記分析工程が、前記サンプルと接触後の前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する工程である。
前記第2の分析方法は、前記検出工程が、反応系において、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖と前記サンプルとを接触させ、前記反応系の偏光度を測定する工程であり、前記分析工程が、前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する工程である。
本発明における前記非標識アプタマーは、前述のように、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、本発明における前記標識相補鎖は、前述のように、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含む。本発明の分析方法は、修飾塩基を含むアプタマーであっても、修飾塩基を含まない標識相補鎖と併用することで、前述のような問題を解消できることがポイントであって、例えば、修飾塩基の種類、天然塩基の種類、構成単位のその他の条件は、何ら制限されない。以下に、塩基および構成単位を例示するが、あくまでも例示であって、本発明は、何らこれらの記載には制限されない。
本発明のターゲット分析キットは、蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを含み、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、前記本発明の偏光度によるターゲット分析方法に使用することを特徴とする。
前記分析キットは、小麦アレルゲンの分析に使用できることから、小麦アレルゲン用の分析キットとして使用できる。前記分析キットは、前記非標識アプタマーとして、小麦アレルゲンに結合する小麦アレルゲンアプタマー(非標識アプタマー)と、前記小麦アレルゲンアプタマーに結合する標識相補鎖とを含む。
(a1)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a2)前記(a1)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、小麦アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
(a3)前記(a1)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、小麦アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
(a1) 5'-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAtt-3’ (配列番号1)
(b1)配列番号2、3または12の塩基配列からなるポリヌクレオチド
前記分析キットは、乳アレルゲンの分析に使用できることから、乳アレルゲン用の分析キットとして使用できる。前記分析キットは、前記非標識アプタマーとして、乳アレルゲンに結合する乳アレルゲンアプタマー(非標識アプタマー)と、前記乳アレルゲンアプタマーに結合する標識相補鎖とを含む。
(c1)配列番号4または5の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(c2)前記(c1)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、乳アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
(c3)前記(c1)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、乳アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
(d1)配列番号6~10、13~26、または27の塩基配列からなるポリヌクレオチド
前記第1の分析方法により、小麦アレルゲンであるグリアジンの分析を行った。
実施例1の非標識アプタマーとして、蛍光物質で標識化していない前記(a1)の配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを合成した。配列番号1の塩基配列において、下線小文字の修飾塩基「t」は、5’-トリプタミノカルボニルウラシル(TrpdU)、下線小文字の修飾塩基「c」は、5’-メチルシトシンとした。
実施例1の非標識アプタマー(a1) (配列番号1)
5'-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAtt-3’
比較例1Aの標識アプタマー(配列番号11)
5'-Cy5-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAttGAcAt-3’
比較例1Bの標識アプタマー(配列番号11)
5'-TYE665-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAttGAcAt-3’
前記実施例1の非標識アプタマーの一部に相補的な前記(b1-1)の配列番号2の塩基配列からなる相補鎖を合成し、その5’末端をCy(登録商標)5で標識化した。これを、実施例1の標識相補鎖(b1-1)とした。前記標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例1の標識相補鎖(b1-1) (配列番号2)
5'-Cy5-ACGCAAATGATC-3’
小麦由来のグリアジン(cat# G3375-100G、SIGMA社製)を、15mmol/L MES(pH6.0)に懸濁し、一晩溶解させた後、遠心(10,000rpm、30分、室温)し、フィルターろ過(0.22μm, Cat# SLGV033RS, Millex社製)により分離した。前記分離した上清を、未変性グリアジンを含む抽出液とし、グリアジン濃度を所定濃度(0、1、2、4、8、16または32ppm)に調整し、これをグリアジンサンプルとした。
前記実施例1の非標識アプタマー1.6pmol、前記実施例1の標識相補鎖1.6pmol、緩衝液32μL、およびDW 78.4μLを混合した。この反応液について、95℃で5分間の熱変性処理を行った後、25℃で30分間のアニーリング処理を行い、さらに、4℃まで冷却してフォールディング処理を行った。これにより、前記反応液中で、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とのハイブリッドを形成した。前記緩衝液の組成は、5x TB1T, pH8.0 (200mmol/L Tricine, 625mmol/L NaCl, 25mmol/L KCl, 5mmol/L MgCl2, 0.05%Tween(登録商標)20)とした。
実施例1の前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖に代えて、比較例1Aまたは1Bの前記標識アプタマー1.6pmolを前記緩衝液に添加した以外は、前記実施例1と同様にして、反応液の蛍光偏光度を測定した。これらの結果を、図3(B)および(C)に示す。
前記第1の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行った。
実施例2の非標識アプタマーとして、蛍光物質で標識していない配列番号4の塩基配列からなる前記(c1-1)のポリヌクレオチドを合成した。配列番号4の塩基配列において、下線小文字の修飾塩基「t」は、5’-ベンジルアミノカルボニルウラシル(BndU)、修飾塩基「c」は、5’-メチルシトシンとした。
実施例2の非標識アプタマー(c1-1) (配列番号4)
5'-GGATAGCAGCAGGGACCTCTTATACGtcGGtGctGGtGttGtAtAGAcccccttAtAttAtAA-3’
実施例2の非標識アプタマーの一部に相補的な、前記(d1-1)の配列番号6の塩基配列からなる相補鎖と、前記(d1-2)の配列番号7の塩基配列からなる相補鎖とを合成し、それらの5’末端をCy(登録商標)5で標識化した。これらをそれぞれ、実施例2の標識相補鎖(d1-1)、(d1-2)とした。前記各標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例2の標識相補鎖(d1-1) (配列番号6)
5'-Cy5-ATAAGAGGTCCC-3’
実施例2の標識相補鎖(d1-2) (配列番号7)
5'-Cy5-TAATATAAGGGG-3’
乳由来のカゼイン(cat# C6780-5G、SIGMA社製)を、TB1T緩衝液(pH8.0)に懸濁し、一晩溶解させた後、遠心(10,000rpm、30分、室温)し、フィルターろ過(0.22μm, Cat# SLGV033RS, Millex社製)により、上清を回収した。前記上清を、未変性カゼインを含む抽出液とし、カゼイン濃度を所定濃度(0、1、2、4、8、16または32ppm)に調整し、これをカゼインサンプルとした。前記TB1T緩衝液の組成は、40mmol/L Tricine, 125mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl, 1mmol/L MgCl2, 0.01%Tween(登録商標)20とした。
前記非標識アプタマーとして、前記実施例2の非標識アプタマーを使用し、前記標識相補鎖として、前記実施例2の標識相補鎖(d1-1)または(d1-2)を使用し、前記サンプルとして、前記αカゼインサンプルを使用した以外は、前記実施例1と同様にして、反応を行い、蛍光偏光度の測定を行った。これらの結果を、図4(A)および(B)に示す。
実施例2の前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖に代えて、比較例2の前記標識アプタマー1.6pmolを前記緩衝液に添加した以外は、前記実施例2と同様にして、反応液の蛍光偏光度を測定した。これらの結果を、図4(C)に示す。
前記第2の分析方法により、小麦アレルゲンであるグリアジンの分析を行った。
実施例3の非標識アプタマーとして、前記実施例1の非標識アプタマー(a1)を使用した。
実施例3の標識相補鎖として、前記実施例1の標識相補鎖(b1-1)を使用した。また、前記実施例3の非標識アプタマー(a1)の一部に相補的な前記(b1-2)の配列番号3の塩基配列からなる相補鎖を合成し、その5’末端をCy(登録商標)5で標識化した。これを、実施例3の標識相補鎖(b1-2)とした。前記標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例3の標識相補鎖(b1-2) (配列番号3)
5'-Cy5-CGCAAATGATCT-3’
サンプルは、前記実施例1で調製したグリアジンサンプルを使用した。まず、前記非標識アプタマー1.6pmol、各濃度の前記サンプル16μL、0.5mmol/Lデキストラン(デキストラン硫酸ナトリウム5000, 和光純薬, Cat# 198-13405)を含む5x TB1T緩衝液32μL、およびDW 80μLを混合し、この反応液を室温で振とうした(1000rpm、15分間)。これにより、前記反応液中で、前記非標識アプタマーと前記サンプル中のグリアジンとを結合させた。
前記第2の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行った。
実施例2の非標識アプタマーとして、蛍光物質で標識していない配列番号5の塩基配列からなる前記(c1-2)のポリヌクレオチドを合成した。配列番号5のポリヌクレオチドにおいて、下線小文字の修飾塩基「t」は、5’-ベンジルアミノカルボニルウラシル(BndU)、下線小文字の修飾塩基「c」は、5’-メチルシトシンとした。
実施例4の非標識アプタマー(c1-2) (配列番号5)
5'-GGATAGCAGCAGGGACCTCTTATACGtcGGtGctGGtGttGtAtAGAcccccttAtAttAtAAccGAAt-3’
実施例4の非標識アプタマー(c1-2)の一部に相補的な、前記(d1-3)の配列番号8、前記(d1-4)の配列番号9、または前記(d1-5)の配列番号10からなる相補鎖を合成し、それらの5’末端をCy(登録商標)5で標識化した。これらをそれぞれ、実施例4の標識相補鎖(d1-3)~(d1-5)とした。前記各標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例4の標識相補鎖(d1-3) (配列番号8)
5'-Cy5-CACCAGCACCGA-3’
実施例4の標識相補鎖(d1-4) (配列番号9)
5'-Cy5-ACACCAGCACCG-3’
実施例4の標識相補鎖(d1-5) (配列番号10)
5'-Cy5-AACACCAGCACC-3’
サンプルは、前記実施例2で調製したαカゼインサンプルを使用した。そして、前記非標識アプタマーとして、前記実施例4の非標識アプタマー(c1-2)を使用し、前記標識相補鎖として、前記実施例4の標識相補鎖(d1-3)~(d1-5)をそれぞれ使用し、前記サンプルとして、前記αカゼインサンプルを使用した以外は、前記実施例3と同様にして、反応を行い、蛍光偏光度の測定を行った。これらの結果を、図6(A)、(B)または(C)に示す。
以下の標識相補鎖を使用した以外は、前記実施例1と同様にして、前記第1の分析方法により、小麦アレルゲンであるグリアジンの分析を行い、グリアジン濃度0ppmの偏光度とグリアジン濃度32ppmの偏光度との差(ΔmP)を算出した。これらの結果を下記表4に示す。
5'-Cy5-GCAAATGATCTA-3’
標識相補鎖(b1-2) (配列番号3)
5'-Cy5-CGCAAATGATCT-3’
以下の標識相補鎖を使用した以外は、前記実施例2と同様にして、前記第1の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行い、αカゼイン濃度0ppmの偏光度とαカゼイン濃度32ppmの偏光度との差(ΔmP)を算出した。これらの結果を下記表5に示す。
5'-Cy5-AAGAGGTCCCTG-3’
標識相補鎖(d1-7) (配列番号14)
5'-Cy5-TAAGAGGTCCCT-3’
標識相補鎖(d1-8) (配列番号15)
5'-Cy5-CAACACCAGCAC-3’
標識相補鎖(d1-9) (配列番号16)
5'-Cy5-GGTCTATACAAC-3’
以下の標識相補鎖を使用した以外は、前記実施例4と同様にして、前記第2の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行い、αカゼイン濃度0ppmの偏光度とαカゼイン濃度32ppmの偏光度との差(ΔmP)を算出した。これらの結果を下記表6に示す。
5'-Cy5-CTGCTGCTATCC-3’
標識相補鎖(d1-11) (配列番号18)
5'-Cy5-CCTGCTGCTATC-3’
標識相補鎖(d1-12) (配列番号19)
5'-Cy5-TCCCTGCTGCTA-3’
標識相補鎖(d1-13) (配列番号20)
5'-Cy5-GGTCCCTGCTGC-3’
標識相補鎖(d1-14) (配列番号21)
5'-Cy5-GAGGTCCCTGCT-3’
標識相補鎖(d1-7) (配列番号14)
5'-Cy5-TAAGAGGTCCCT-3’
標識相補鎖(d1-1) (配列番号6)
5'-Cy5-ATAAGAGGTCCC-3’
標識相補鎖(d1-15) (配列番号22)
5'-Cy5-GTATAAGAGGTC-3’
標識相補鎖(d1-16) (配列番号23)
5'-Cy5-ACGTATAAGAGG-3’
標識相補鎖(d1-17) (配列番号24)
5'-Cy5-CGACGTATAAGA-3’
標識相補鎖(d1-18) (配列番号25)
5'-Cy5-ACCAGCACCGAC-3’
標識相補鎖(d1-8) (配列番号15)
5'-Cy5-CAACACCAGCAC-3’
標識相補鎖(d1-9) (配列番号16)
5'-Cy5-GGTCTATACAAC-3’
標識相補鎖(d1-19) (配列番号26)
5'-Cy5-GGGTCTATACAA-3’
標識相補鎖(d1-20) (配列番号27)
5'-Cy5-GGGGTCTATACA-3’
Claims (8)
- 蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを使用し、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記蛍光非標識アプタマーと、前記蛍光標識相補鎖と、サンプルとを共存させ、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖との結合および非結合に依存する、前記蛍光標識相補鎖に由来する偏光度を検出する検出工程と、
前記偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する分析工程とを含み、
前記蛍光非標識アプタマーにおいて、前記修飾塩基として、修飾シトシンを含むことを特徴とする、偏光度によるターゲット分析方法。 - 前記検出工程は、
反応系において、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖とのハイブリッドを形成し、
前記反応系に前記サンプルを添加し、前記ハイブリッドに前記サンプルを接触させ、
前記反応系の偏光度を測定し、
前記分析工程は、
前記サンプルと接触後の前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する、請求項1記載の分析方法。 - 前記検出工程は、
反応系において、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖と前記サンプルとを接触させ、
前記反応系の偏光度を測定し、
前記分析工程は、
前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する、請求項1記載の分析方法。 - 前記蛍光非標識アプタマーにおいて、前記修飾塩基として、修飾チミンまたはおよび修飾ウラシルの少なくとも一方を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記蛍光非標識アプタマーが、前記修飾塩基を含むDNAであり、前記蛍光標識相補鎖が、前記修飾塩基を含まないDNAである、請求項1から4のいずれか一項記載の分析方法。
- 前記サンプルが、食品由来試料である、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記ターゲットが、食物アレルゲンである、請求項1から6のいずれか一項に記載の分析方法。
- 蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを含み、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
請求項1から7のいずれか一項に記載の偏光度によるターゲット分析方法に使用することを特徴とするターゲット分析キット。
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