JP7343138B2 - ターゲットの分析方法および分析キット - Google Patents
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Description
本発明は、ターゲットの分析方法および分析キットに関する。
近年、ターゲットの検出に、アプタマーの利用が試みられている。前記アプタマーは、核酸分子であるが、ターゲットに対して、相補性に基づく配列依存的な結合ではなく、立体的な構造により結合する。この結合を利用したターゲットの分析方法として、偏光度の変化を利用する方法が知られている（非特許文献１）。この方法は、前記アプタマーを蛍光物質で標識化した蛍光標識アプタマーを用い、前記ターゲットと非結合の状態における前記蛍光標識アプタマーに由来する偏光度と比較して、前記ターゲットと結合した状態における前記蛍光標識アプタマーに由来する偏光度が大きくなることを利用した方法であり、偏光度の変化によって、ターゲットの有無および量を分析することができる。
Percze K. et al, "Aptamers for respiratory syncytial virus detection", 2017
しかしながら、本発明者らは、ターゲット非存在下と比較して、ターゲット存在下においてターゲットへの結合による偏光度の増大は確認されるものの、ターゲット濃度に対する偏光度変化（偏光度の増大）のレンジが、非常に小さい場合があることを見出した。ターゲット濃度に対する偏光度変化のレンジが小さいと、ターゲットの有無および濃度について、分析精度が十分とは言えない可能性がある。
そこで、本発明の目的は、偏光度を利用したターゲットの分析方法について、分析精度を向上できる新たな方法を提供する。
本発明の偏光度によるターゲットの分析方法は、蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを使用し、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記蛍光非標識アプタマーと、前記蛍光標識相補鎖と、サンプルとを共存させ、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖との結合および非結合に依存する、前記蛍光標識相補鎖に由来する偏光度の変化を検出する検出工程と、
前記偏光度の変化に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する分析工程とを含むことを特徴とする。
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記蛍光非標識アプタマーと、前記蛍光標識相補鎖と、サンプルとを共存させ、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖との結合および非結合に依存する、前記蛍光標識相補鎖に由来する偏光度の変化を検出する検出工程と、
前記偏光度の変化に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する分析工程とを含むことを特徴とする。
本発明の分析キットは、蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを含み、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。
本発明の方法によれば、例えば、ターゲット濃度に対する偏光度変化のレンジを大きくできるため、偏光度を利用した分析において、分析精度を向上することができる。
＜ターゲット分析方法＞
本発明のターゲット分析方法は、前述のように、蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを使用し、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記蛍光非標識アプタマーと、前記蛍光標識相補鎖と、サンプルとを共存させ、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖との結合および非結合に依存する、前記蛍光標識相補鎖に由来する偏光度を検出する検出工程と、
前記偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する分析工程とを含むことを特徴とする。
本発明のターゲット分析方法は、前述のように、蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを使用し、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記蛍光非標識アプタマーと、前記蛍光標識相補鎖と、サンプルとを共存させ、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖との結合および非結合に依存する、前記蛍光標識相補鎖に由来する偏光度を検出する検出工程と、
前記偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する分析工程とを含むことを特徴とする。
本発明者らは、鋭意研究の結果、核酸配列であるアプタマーの構成単位が、塩基として修飾塩基を含む場合に、前述のような、偏光度変化のレンジが狭くなるという問題が生じることを見出した。アプタマーの構築においては、例えば、ターゲットに対する結合力を向上させる点から、構成単位の塩基として、天然塩基の他に、修飾塩基を使用することが試みられている。このため、アプタマーの結合力を維持したまま、前述のような偏光度を利用した分析を行うには、アプタマーの塩基の構成を変更することなく、前述の問題も解消する必要がある。そこで、本発明者らは、さらなる検討を重ねた結果、アプタマーに対する相補鎖を使用し、前記アプタマーではなく、前記相補鎖を偏光度に寄与する蛍光物質で修飾し、且つ、前記相補鎖の構成単位の塩基に、修飾塩基を使用せず、天然塩基とすることで、前述のような問題を抑制できることを見出した。このため、本発明の分析方法によれば、使用するアプタマーが、修飾塩基を含む場合であっても、例えば、前記アプタマーを蛍光標識化する場合よりも、優れた分析精度でターゲットを分析することができる。
本発明の分析方法は、前記修飾塩基を含むアプタマーを使用する際に、前記アプタマーは、前記蛍光物質による標識を行わず、前記蛍光物質による標識を行った前記標識相補鎖を併用することがポイントであって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
本発明によれば、前記修飾塩基を含むアプタマーではなく、前記修飾塩基を含まない前記標識相補鎖に由来する偏光度の変化を測定することにより、ターゲット濃度に対する偏光度変化のレンジを大きくできる。このため、前記修飾塩基を含むアプタマーを使用する場合でも、偏光度による分析方法において、分析精度を維持することができる。
本発明の分析方法は、例えば、前記ターゲットの有無を分析する定性分析であってもよいし、前記ターゲットの量を分析する定量分析であってもよい。
本発明の分析方法において、前記サンプルは、特に制限されず、分析目的のターゲットに応じて、適宜選択できる。前記サンプルは、例えば、飲食品由来の試料、環境由来の試料、生体由来の試料等、様々なものが利用できる。前記サンプルの形態は、特に制限されず、例えば、液体が好ましい。前記試料の形態は、例えば、液体でも、固体でもよく、前者の場合、例えば、そのまま使用してもよいし、溶媒を用いて、混合液、懸濁液、抽出液、溶液を調製し、これらを前記サンプルとして前記分析方法に供してもよい。また、後者の場合は、例えば、同様に溶媒を用いて、混合液、懸濁液、抽出液、溶液を調製し、これらを前記サンプルとして前記分析方法に供してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。前記サンプルは、例えば、前記ターゲットを含むサンプルでもよいし、前記ターゲットを含まないサンプルでもよく、前記ターゲットを含むか不明のサンプルでもよい。
前記ターゲットは、特に制限されず、任意のターゲットが選択できる。前記ターゲットは、例えば、低分子化合物、高分子化合物、微生物、ウイルス等があげられ、前記低分子化合物は、例えば、農薬、医薬等の薬剤、食品添加物等があげられ、前記高分子化合物は、例えば、アレルゲン等のペプチド、タンパク質等があげられる。
前記蛍光非標識アプタマーは、ターゲットに結合する核酸分子であり、例えば、ターゲットに応じて適宜選択できる。また、前記核酸分子は、例えば、例えば、ターゲットに応じて、いわゆるＳＥＬＥＸ法によって得ることもできる。
アプタマーは、構成単位が連続する核酸配列（核酸分子）である。前記アプタマーの構成単位は、例えば、塩基、糖、リン酸基を含むヌクレオチド残基である。本発明における前記蛍光非標識アプタマー（以下、非標識アプタマーという）の構成単位は、前述のように、前記修飾塩基および前記天然塩基を含む。具体的には、前記非標識アプタマーは、前記構成単位として、前記修飾塩基を含むヌクレオチド残基（以下、修飾残基という）および前記天然塩基を含むヌクレオチド残基（以下、天然残基）を含む。
前記核酸配列に含まれる修飾塩基は、その種類が、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよく、その個数が、１個でもよいし、１個以上でもよい。前記蛍光非標識アプタマーの核酸配列において、前記修飾塩基と前記天然塩基との割合は、何ら制限されない。蛍光非標識前記ヌクレオチド残基、前記修飾塩基、前記天然塩基については、後述する。
前記非標識アプタマーは、前述のように、蛍光物質で標識化されていないが、それ以外の物質による標識化を除くものではない。
本発明における前記蛍光標識相補鎖（以下、標識相補鎖という）は、前記非標識アプタマーに結合する相補鎖が、前記蛍光物質で標識化されている。前記相補鎖は、構成単位が連続する核酸配列（核酸分子）であり、その構成単位は、例えば、塩基、糖、リン酸基を含むヌクレオチド残基である。前記標識相補鎖の構成単位は、前述のように、塩基として前記修飾塩基を含まず前記天然塩基を含む。具体的には、前記標識相補鎖は、前記構成単位として、前記天然塩基を含むヌクレオチド残基（以下、天然残基）を含み、前記修飾塩基を含むヌクレオチド残基（修飾残基）を含まない。
前記標識相補鎖の配列は、特に制限されず、例えば、前記非標識アプタマーに対して配列依存的に結合する配列である。前記相補鎖は、例えば、前記非標識アプタマーの核酸配列の一部に相補的な相補配列を含んでもよいし、全部に相補的な相補配列を含んでもよい。前記相補鎖は、例えば、前記相補配列からなる配列でもよいし、前記相補配列を含む配列でもよい。前記相補配列は、例えば、前記非標識アプタマーの配列情報に基づいて設計できる。前記非標識アプタマーと前記相補配列とをアライメントした際の相補性は、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、好ましくは１００％である。
前記標識相補鎖において、前記蛍光物質が結合する部位は、特に制限されず、例えば、
３’末端またはその周辺領域（３’領域）、５’末端またはその周辺領域（５’領域）、前記３’領域と５’領域との間でもよく、好ましくは、３’末端または５’末端である。前記蛍光物質は、例えば、前記相補鎖に直接連結されてもよいし、後述する付加配列（リンカー）を介して間接的に連結されてもよい。
３’末端またはその周辺領域（３’領域）、５’末端またはその周辺領域（５’領域）、前記３’領域と５’領域との間でもよく、好ましくは、３’末端または５’末端である。前記蛍光物質は、例えば、前記相補鎖に直接連結されてもよいし、後述する付加配列（リンカー）を介して間接的に連結されてもよい。
前記標識相補鎖における前記蛍光物質の種類は、特に制限されず、例えば、蛍光偏光度の測定に使用できる蛍光を発する物質であればよい。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ（登録商標）３色素、Ｃｙ（登録商標）５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられる。
前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖は、例えば、それぞれ一本鎖である。前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖の長さは、特に制限されない。前記非標識アプタマーの長さは、その下限が、例えば、１５塩基長、７５塩基長、８０塩基長であり、その上限が、例えば、１０００塩基長、２００塩基長、１００塩基長、９０塩基長である。前記標識相補鎖の長さは、例えば、その下限が、例えば、５塩基長、８塩基長、１０塩基長であり、その上限が、例えば、２２塩基長、２０塩基長、１８塩基長、１５塩基長である。前記非標識アプタマー（Ａ）と前記標識相補鎖（Ｃ）との長さの比（Ａ：Ｃ）は、特に制限されず、例えば、１：１である。
本発明の分析方法においては、後述するように、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖との間における結合、および前記非標識アプタマーと前記ターゲットとの間における結合が利用される。具体的には、前記ターゲットが存在していれば、その量に応じて、前記非標識アプタマーは、前記標識相補鎖に対する結合よりも優先して、前記ターゲットに結合することが利用される。このため、前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖は、前記非標識アプタマーと前記ターゲットとの結合性が、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖との結合性よりも、有意であることが好ましい。このような関係に、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とを設定する方法は、特に制限されず、例えば、前記標識相補鎖における前記相補配列の長さによって調整できる。核酸配列と核酸配列とが配列依存的に結合する場合、その結合力は、一般的に、両者がアライメントした際に完全に相補的な関係となる領域が、相対的に長い程、強くなり、相対的に短い程、弱くなる。このため、例えば、前記非標識アプタマーに応じて、前記標識相補鎖における前記相補配列の長さを調整することで、前記ターゲットが存在する場合に、前記非標識アプタマーが、前記標識相補鎖よりも優先して前記ターゲットに結合するように設定することができる。
本発明のターゲット分析方法において、前記検出工程は、前記非標識アプタマーと、前記標識相補鎖と、前記サンプルとを共存させ、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖との結合および非結合に依存する、前記蛍光標識相補鎖に由来する偏光度の変化を検出する工程である。前記検出工程において、前記共存させる際の方法および条件は、特に制限されない。また、前記検出工程において、前記標識相補鎖に由来する偏光度の変化を検出する方法も、特に制限されず、例えば、前記標識相補鎖における蛍光物質の種類に応じて、その条件を設定できる。
本発明のターゲット分析方法において、前記分析工程は、前記偏光度の変化に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する工程である。具体的には、例えば、前記偏光度の変化と、前記ターゲットの有無または量との関係に基づいて、前記サンプル中のターゲットの有無または量を分析できる。
本発明の分析方法は、例えば、以下の第１の分析方法、および第２の分析方法が例示できる。なお、本発明は、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖を使用し、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖との結合および非結合を利用するものであればよく、これらの例示には、何ら制限されない。
（１）第１の分析方法
前記第１の分析方法は、前記検出工程が、反応系において、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖とのハイブリッドを形成し、前記反応系に前記サンプルを添加し、前記ハイブリッドに前記サンプル中のターゲットを接触させ、前記反応系の偏光度を測定する工程であり、前記分析工程が、前記サンプルと接触後の前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する工程である。
前記第１の分析方法は、前記検出工程が、反応系において、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖とのハイブリッドを形成し、前記反応系に前記サンプルを添加し、前記ハイブリッドに前記サンプル中のターゲットを接触させ、前記反応系の偏光度を測定する工程であり、前記分析工程が、前記サンプルと接触後の前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する工程である。
前記第１の分析方法は、予め、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とを結合させておき、さらに前記サンプルを添加することで、前記サンプル中にターゲットが存在する場合、前記非標識アプタマーが前記標識相補鎖から遊離して、前記ターゲットに結合する現象を利用する方法である。この点を、図１を用いて説明する。図１は、前記第１の分析方法における反応の一例を示す模式図である。
まず、図１（Ａ）に示すように、非標識アプタマー１０と、相補鎖２００に標識物質２０１が結合した標識相補鎖２０とを共存させると、図１（Ｂ）に示すように、配列依存的に、非標識アプタマー１０と標識相補鎖２０とが結合し、ハイブリッドが形成される。そこに、図１（Ｃ）に示すように、前記サンプル中のターゲット３０が添加されると、図１（Ｄ）に示すように、前記ハイブリッドの標識相補鎖２０から非標識アプタマー１０が遊離して、ターゲット３０と結合する。この際、図１の枠内に記載するように、標識相補鎖２０は、ハイブリッドの状態では回転速度が遅くなるため、相対的に偏光度は大きくなり、一方、ハイブリッドから遊離した状態では回転速度が速くなるため、相対的に偏光度は小さくなる。このため、例えば、前記反応系の偏光度が、ターゲット非存在下での偏光度と同じであれば、ターゲットはサンプル中に存在しないと分析でき、ターゲット非存在下での偏光度よりも低下すれば、ターゲットがサンプル中に存在すると分析でき、さらに、前記反応系の偏光度の低下の割合によって、サンプル中のターゲットの量も分析できる。
前記第１の分析方法において、一連の工程（前記検出工程および前記分析工程）は、反応系において行うことが好ましく、前記反応系は、例えば、液体反応系である。前記液体反応系には、例えば、溶媒が使用でき、前記溶媒は、例えば、水、緩衝液等である。
前記検出工程は、前述のように、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖とのハイブリッドを形成するハイブリッド形成工程、前記反応系に前記サンプルを添加し、前記ハイブリッドに前記サンプル中のターゲットを接触させる接触工程、前記反応系の偏光度を測定する測定工程とを含む。
前記ハイブリッド形成工程は、例えば、前記反応系に、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とを添加し、前記反応系中で両者を接触させることで、前記ハイブリッドを形成できる。前記ハイブリッド形成工程は、例えば、温度変化による、アンフォールディング処理、アニーリング処理、およびフォールディング処理を含むことが好ましい。
具体的には、例えば、まず、前記非標識アプタマーが前記標識相補鎖と配列依存的に結合できるように、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖が添加された前記反応系を加熱して、前記非標識アプタマーのフォールディングを解除するアンフォールディング処理を行う。この処理条件は、特に制限されず、温度は、例えば、９０～９８℃であり、時間は、例えば、３～５分である。つぎに、フォールディングを解除した前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とを配列依存的に結合させるため、アニーリング処理を行う。この処理条件は、特に制限されず、温度は、例えば、２０～６０℃であり、時間は、例えば、５～６０分である。そして、前記非標識アプタマーを再度フォールディングするフォールディング処理を行う。この処理条件は、特に制限されず、温度は、例えば、４～２０℃であり、時間は、例えば、２０分～一晩である。
前記反応系に添加する前記非標識アプタマー（Ａ）および前記標識相補鎖（Ｃ）の量は、特に制限されず、モル比（Ａ：Ｃ）は、例えば、１：１である。
前記接触工程は、前記反応系に前記サンプルを添加し、前記ハイブリッドに前記サンプルを接触させる。前記サンプルに前記ターゲットが存在すれば、前記非標識アプタマーは、前記ハイブリッドから遊離して前記ターゲットと結合し、前記非標識アプタマーと結合していた前記標識相補鎖も前記ハイブリッドから遊離する。この処理条件は、特に制限されず、温度は、例えば、４～３７℃であり、時間は、例えば、５～６０分である。
前記測定工程は、前記反応系の偏光度を測定する。前記偏光度の測定方法は、特に制限されず、蛍光偏光度の一般的な測定方法が採用でき、その条件も、特に制限されず、前記標識相補鎖の蛍光物質の種類等に応じて適宜決定できる。
前記分析工程は、前記サンプルと接触後の前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する。前述のように、前記第１の分析方法では、前記サンプル中にターゲットが存在すれば、例えば、前記ターゲットの量に応じて、前記非標識アプタマーがハイブリッドから遊離し、その結果、前記非標識アプタマーと結合していた前記標識相補鎖も遊離する。このため、前記標識相補鎖の遊離に伴って、前記反応系の偏光度は、ターゲット非存在下での偏光度よりも低下する。このため、例えば、前記ターゲット非存在下と比較した前記反応系における低下の有無によって、前記ターゲットの有無が分析でき、前記低下の程度によって、前記ターゲットの量が分析できる。
前記分析工程において、前記ターゲットの有無は、例えば、予め準備した評価基準に基づいて判断できる。前記評価基準は、例えば、前記ターゲット非存在下の反応系の偏光度（Ｐ０）があげられる。これを評価基準とすれば、前記検出工程で測定した偏光度（Ｐｘ）が、偏光度（Ｐ０）よりも有意に小さい場合は、ターゲットが存在すると分析でき、有意差がなければ、ターゲットが存在しないと分析できる。
前記分析工程において、前記ターゲットの量も、例えば、予め準備した評価基準に基づいて判断できる。前記評価基準は、例えば、前記ターゲット濃度と偏光度との相関関係であり、検量線等が使用できる。前記相関関係は、例えば、既知濃度のターゲットを含む基準サンプルを用いて、同条件で前記第１の分析方法を行い、各反応系についての偏光度を測定し、前記基準サンプルのターゲット濃度と前記偏光度の測定値とから得ることができる。これを評価基準とすれば、前記検出工程で測定した偏光度（Ｐｘ）と、前記相関関係とから、前記偏光度（Ｐｘ）と相関関係にあるターゲット濃度を算出できる。そして、前記ターゲット濃度に基づけば、前記ターゲット量も算出できる。
（２）第２の分析方法
前記第２の分析方法は、前記検出工程が、反応系において、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖と前記サンプルとを接触させ、前記反応系の偏光度を測定する工程であり、前記分析工程が、前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する工程である。
前記第２の分析方法は、前記検出工程が、反応系において、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖と前記サンプルとを接触させ、前記反応系の偏光度を測定する工程であり、前記分析工程が、前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する工程である。
前記第２の分析方法は、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖と前記サンプルとを接触させ、前記サンプル中のターゲットの有無または濃度に応じて、前記非標識アプタマーが前記ターゲットと結合し、それに対応して、前記標識相補鎖が前記非標識アプタマーに結合できなくなる現象を利用する方法である。この点を、図２を用いて説明する。図２は、前記第２の分析方法における反応の一例を示す模式図である。
図２（Ａ）に示すように、前記サンプル中にターゲットが存在しない場合、非標識アプタマー１０と標識相補鎖２０と前記サンプル（図示せず）を共存させると、図２（Ａ）に示すように、配列依存的に、非標識アプタマー１０と標識相補鎖２０とが結合し、ハイブリッドが形成される。一方、前記サンプル中にターゲットが存在する場合、非標識アプタマー１０と標識相補鎖２０と前記サンプルを共存させると、図２（Ｂ）に示すように、非標識アプタマー１０は、優先的に前記サンプル中のターゲット３０と結合する。この際、図２の枠内に記載するように、標識相補鎖２０は、ハイブリッドの状態では回転速度が遅くなるため、相対的に偏光度は大きくなり、一方、ハイブリッド未形成の状態（遊離した状態）では回転速度が速くなるため、相対的に偏光度は小さくなる。このため、例えば、前記反応系の偏光度が、ターゲット非存在下での偏光度と同じであれば、ターゲットはサンプル中に存在しないと分析でき、前記ターゲット非存在下での偏光度よりも低下すれば、ターゲットがサンプル中に存在すると分析でき、さらに、前記反応系の偏光度の低下の割合によって、サンプル中のターゲットの量も分析できる。
前記第２の分析方法において、一連の工程（前記検出工程および前記分析工程）は、反応系において行うことが好ましく、前記反応系は、例えば、液体反応系である。前記液体反応系には、例えば、溶媒が使用でき、前記溶媒は、例えば、水、緩衝液等である。
前記検出工程は、前述のように、前記反応系において、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖と前記サンプルとを接触させる接触工程と、前記反応系の偏光度を測定する測定工程とを含む。
前記接触工程では、例えば、前記サンプル中にターゲットが存在しなければ、前記標識相補鎖は、前記非標識アプタマーと結合できるが、前記サンプル中にターゲットが存在すれば、前記非標識アプタマーは、前記ターゲットと結合するため、その分だけ、前記標識相補鎖は前記非標識アプタマーと結合できなくなる。
前記接触工程において、前記反応系における、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖と前記サンプルとの接触順序は、特に制限されない。前記接触順序は、例えば、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖と前記サンプルとを同時に接触させてもよいし、前記非標識アプタマーと前記サンプルとを接触させた後、さらに、前記標識相補鎖を添加して接触させてもよく、好ましくは後者である。前記接触工程の条件は、特に制限されず、温度は、例えば、４～３７℃であり、時間は、例えば、５～６０分である。
前記反応系に添加する前記非標識アプタマー（Ａ）および前記標識相補鎖（Ｃ）の量は、特に制限されず、モル比（Ａ：Ｃ）は、例えば、１：１である。
前記測定工程は、前記反応系の偏光度を測定する。前記偏光度の測定方法は、特に制限されず、蛍光偏光度の一般的な測定方法が採用でき、その条件も、特に制限されず、前記標識相補鎖の蛍光物質の種類等に応じて適宜決定できる。
前記分析工程は、前記サンプルと接触後の前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する。前述のように、前記第２の分析方法では、前記サンプル中にターゲットが存在すれば、例えば、前記非標識アプタマーは前記ターゲットに結合するため、前記ターゲットの量に応じて、前記標識相補鎖は、前記非標識アプタマーと結合できなくなる。このため、前記非標識アプタマーと前記ターゲットとの結合に伴って、前記反応系の偏光度は、前記ターゲット非存在下での偏光度よりも低下する。このため、例えば、前記ターゲット非存在下と比較した前記反応系における低下の有無によって、前記ターゲットの有無が分析でき、前記低下の程度によって、前記ターゲットの量が分析できる。
前記分析工程において、前記ターゲットの有無は、例えば、予め準備した評価基準に基づいて判断できる。前記評価基準は、例えば、前記ターゲット非存在下の反応系の偏光度（Ｐ０）があげられる。これを評価基準とすれば、前記検出工程で測定した偏光度（Ｐｘ）が、偏光度（Ｐ０）よりも有意に小さい場合は、ターゲットが存在すると分析でき、有意差がなければ、ターゲットが存在しないと分析できる。
前記分析工程において、前記ターゲットの量も、例えば、予め準備した評価基準に基づいて判断できる。前記評価基準は、例えば、前記ターゲット濃度と偏光度との相関関係であり、検量線等が使用できる。前記相関関係は、例えば、既知濃度のターゲットを含む基準サンプルを用いて、同条件で前記第１の分析方法を行い、各反応系についての偏光度を測定し、前記基準サンプルのターゲット濃度と前記偏光度の測定値とから得ることができる。これを評価基準とすれば、前記検出工程で測定した偏光度（Ｐｘ）と、前記相関関係とから、前記偏光度（Ｐｘ）と相関関係にあるターゲット濃度を算出できる。そして、前記ターゲット濃度に基づけば、前記ターゲット量も算出できる。
＜構成単位＞
本発明における前記非標識アプタマーは、前述のように、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、本発明における前記標識相補鎖は、前述のように、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含む。本発明の分析方法は、修飾塩基を含むアプタマーであっても、修飾塩基を含まない標識相補鎖と併用することで、前述のような問題を解消できることがポイントであって、例えば、修飾塩基の種類、天然塩基の種類、構成単位のその他の条件は、何ら制限されない。以下に、塩基および構成単位を例示するが、あくまでも例示であって、本発明は、何らこれらの記載には制限されない。
本発明における前記非標識アプタマーは、前述のように、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、本発明における前記標識相補鎖は、前述のように、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含む。本発明の分析方法は、修飾塩基を含むアプタマーであっても、修飾塩基を含まない標識相補鎖と併用することで、前述のような問題を解消できることがポイントであって、例えば、修飾塩基の種類、天然塩基の種類、構成単位のその他の条件は、何ら制限されない。以下に、塩基および構成単位を例示するが、あくまでも例示であって、本発明は、何らこれらの記載には制限されない。
前記構成単位は、前述のように、例えば、塩基と糖とリン酸とを含むヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、１～３個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１～３塩基」との記載は、「１、２、３塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられ、前記ピリミジン塩基は、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。
前記修飾塩基は、例えば、前記天然塩基が修飾された塩基である。前記修飾塩基における修飾部位は、特に制限されない。前記プリン塩基が修飾された修飾塩基の場合、前記プリン塩基における修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記ピリミジン塩基が修飾された修飾塩基の場合、前記プリン塩基における修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「－ＣＨ３」または「－Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、下記式（１）のベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、下記式（２）のトリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシンおよびウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられる。
具体例として、前記修飾アデニンは、例えば、７’－デアザアデニン等、前記修飾グアニンは、例えば、７’－デアザグアニン等、前記修飾シトシンは、例えば、５’－メチルシトシン等があげられる。前記修飾チミンは、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルチミン、５’－トリプタミノカルボニルチミン、５’－イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられ、前記修飾ウラシルは、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’－イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。
前記非標識アプタマーの塩基配列における前記修飾塩基の個数は、特に制限されず、全塩基数のうち、例えば、１／１００以上、１／４０以上、１／２０以上、１／１０以上、１／４以上、１／３以上である。
前記ヌクレオチド残基における前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基は、例えば、修飾された修飾糖残基でもよく、その修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方でもよい。前記修飾糖残基の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖は、例えば、さらに、前記構成単位として、人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）等があげられる。
前記非標識アプタマーは、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記標識相補鎖とアライメントした際に、相補性を有さない配列である。前記付加配列は、例えば、５’末端に結合しても、３’末端に結合してもよく、両末端にそれぞれ結合してもよい。前記付加配列の構成単位は、例えば、前記非標識アプタマーの構成単位と同様である。一方、前記標識相補鎖は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記非標識アプタマーとアライメントした際に、相補性を有さない配列である。前記付加配列は、例えば、５’末端に結合しても、３’末端に結合してもよく、両末端にそれぞれ結合してもよい。前記付加配列の構成単位は、例えば、前記標識相補鎖の構成単位と同様である。
＜ターゲット分析キット＞
本発明のターゲット分析キットは、蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを含み、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、前記本発明の偏光度によるターゲット分析方法に使用することを特徴とする。
本発明のターゲット分析キットは、蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを含み、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、前記本発明の偏光度によるターゲット分析方法に使用することを特徴とする。
本発明において、前記蛍光非標識アプタマー、前記蛍光標識相補鎖、および前記分析方法は、前記本発明の分析方法における記載を援用できる。
本発明の分析キットは、例えば、さらに、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、緩衝液等の試薬、使用説明書等があげられる。
以下に、ターゲットが小麦アレルゲンである場合の分析キット、および、ターゲットが乳アレルゲンである場合の分析キットについて、例示する。なお、これらは例示であって、本発明は、これらの例示には制限されない。
（１）小麦アレルゲン用の分析キット
前記分析キットは、小麦アレルゲンの分析に使用できることから、小麦アレルゲン用の分析キットとして使用できる。前記分析キットは、前記非標識アプタマーとして、小麦アレルゲンに結合する小麦アレルゲンアプタマー（非標識アプタマー）と、前記小麦アレルゲンアプタマーに結合する標識相補鎖とを含む。
前記分析キットは、小麦アレルゲンの分析に使用できることから、小麦アレルゲン用の分析キットとして使用できる。前記分析キットは、前記非標識アプタマーとして、小麦アレルゲンに結合する小麦アレルゲンアプタマー（非標識アプタマー）と、前記小麦アレルゲンアプタマーに結合する標識相補鎖とを含む。
前記非標識アプタマーは、小麦アレルゲンに結合するアプタマーであり、例えば、下記（ａ１）、（ａ２）または（ａ３）のポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含む。
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）前記（ａ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、小麦アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ａ３）前記（ａ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、小麦アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）前記（ａ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、小麦アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ａ３）前記（ａ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、小麦アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
前記非標識アプタマーは、前記ポリヌクレオチドを含むアプタマーでもよいし、前記ポリヌクレオチドからなるアプタマーでもよい。
前記（ａ１）のポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号１の塩基配列において、例えば、下線部の塩基が前記修飾塩基である。「ｔ」は、天然チミンの修飾塩基であり、ウラシルの５位が置換された５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）であり、「ｃ」は、天然シトシンの修飾塩基であり、シトシンの５位が置換された５’－メチルシトシンである。
（ａ１） 5'-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAtt-3’ （配列番号１）
（ａ１） 5'-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAtt-3’ （配列番号１）
前記（ａ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ａ２）のポリヌクレオチドが、小麦アレルゲンに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ１）の塩基配列において、例えば、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１または２個である。前記（ａ１）の塩基配列における、「欠失、置換、挿入および／または付加」の位置は、特に制限されないが、前記修飾塩基以外の塩基の位置が好ましい。
前記（ａ３）において、「同一性」は、例えば、前記（ａ３）のポリヌクレオチドが、小麦アレルゲンに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
前記分析キットに含まれる前記非標識アプタマーは、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよく、好ましくは前記（ａ１）の非標識アプタマーである。
前記標識相補鎖は、例えば、下記（ｂ１）のポリヌクレオチドを含み、且つ、前記標識物質で標識されている。
（ｂ１）配列番号２、３または１２の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号２、３または１２の塩基配列からなるポリヌクレオチド
下記表１に、配列番号２からなるポリヌクレオチド（ｂ１－１）、配列番号３からなるポリヌクレオチド（ｂ１－２）、または配列番号１２からなるポリヌクレオチド（ｂ１－３）を示し、あわせて、前記（ａ１）の非標識アプタマーを示す。前記非標識アプタマーにおいて、四角で囲んだ領域が、それぞれ、前記（ｂ１－１）、（ｂ１－２）または（ｂ１－３）に対する相補領域である。
前記標識相補鎖は、前記標識物質で標識化され、且つ、前記ポリヌクレオチドを含む相補鎖でもよいし、前記標識物質で標識化され、且つ、前記ポリヌクレオチドからなる相補鎖でもよい。前記標識相補鎖において、前記標識物質による標識位置は、特に制限されないが、例えば、３’末端または５’末端であり、好ましくは５’末端である。また、前記標識物質の種類は、何ら制限されず、前述のようなものが例示でき、具体例としては、Ｃｙ５が例示できる。
前記小麦アレルゲン用の分析キットを用いて、本発明の分析方法を行うことにより、前記小麦アレルゲンの分析を行うことができる。特に示さない限り、前記本発明の分析方法の記載が援用できる。前記小麦アレルゲンは、例えば、加熱等による変性が生じていない未変性小麦アレルゲンでもよいし、加熱等による変性が生じた変性小麦アレルゲンでもよい。前記小麦アレルゲンは、例えば、グルテンまたはグリアジンである。
前記サンプルは、例えば、前述のように食品由来の試料等があげられる。前記飲食品由来の試料は、例えば、食品、食品原料、食品添加物、食品加工場、または調理場等における付着物、洗浄後の洗浄液等があげられる。
（２）乳アレルゲン用の分析キット
前記分析キットは、乳アレルゲンの分析に使用できることから、乳アレルゲン用の分析キットとして使用できる。前記分析キットは、前記非標識アプタマーとして、乳アレルゲンに結合する乳アレルゲンアプタマー（非標識アプタマー）と、前記乳アレルゲンアプタマーに結合する標識相補鎖とを含む。
前記分析キットは、乳アレルゲンの分析に使用できることから、乳アレルゲン用の分析キットとして使用できる。前記分析キットは、前記非標識アプタマーとして、乳アレルゲンに結合する乳アレルゲンアプタマー（非標識アプタマー）と、前記乳アレルゲンアプタマーに結合する標識相補鎖とを含む。
前記非標識アプタマーは、乳アレルゲンに結合するアプタマーであり、例えば、下記（ｃ１）、（ｃ２）または（ｃ３）のポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含む。
（ｃ１）配列番号４または５の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ２）前記（ｃ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、乳アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ３）前記（ｃ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、乳アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ１）配列番号４または５の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ２）前記（ｃ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、乳アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ３）前記（ｃ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、乳アレルゲンに結合するポリヌクレオチド
前記非標識アプタマーは、前記ポリヌクレオチドを含むアプタマーでもよいし、前記ポリヌクレオチドからなるアプタマーでもよい。
前記（ｃ１）のポリヌクレオチドは、配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｃ１－１）または配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｃ１－２）である。下記表２に、それぞれの配列を示す。配列番号４および配列番号５の塩基配列において、例えば、下線部の塩基が、前記修飾塩基である。「ｔ」は、天然チミンの修飾塩基であり、チミンの５位が置換された５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）であり、「ｃ」は、天然シトシンの修飾塩基であり、シトシンの５位が置換された５’－メチルシトシンである。
前記（ｃ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｃ２）のポリヌクレオチドが、乳アレルゲンに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ｃ１）の塩基配列において、例えば、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１または２個である。前記（ｃ１）の塩基配列における、「欠失、置換、挿入および／または付加」の位置は、特に制限されないが、前記修飾塩基以外の塩基の位置が好ましい。
前記（ｃ３）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ３）のポリヌクレオチドが、乳アレルゲンに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記分析キットに含まれる前記非標識アプタマーは、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよく、好ましくは、前記（ｃ１）の非標識アプタマーである。
前記標識相補鎖は、例えば、下記（ｄ１）のポリヌクレオチドを含み、且つ、前記標識物質で標識されている。
（ｄ１）配列番号６～１０、１３～２６、または２７の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ１）配列番号６～１０、１３～２６、または２７の塩基配列からなるポリヌクレオチド
下記表３Ａ、３Ｂ（３Ｂ－１および３Ｂ－２）、または３Ｃに、配列番号６～１０、１３～２６、または２７の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｄ１－１）～（ｄ１－２０）を示し、あわせて、前記（ｃ１－１）または前記（ｃ１－２）の非標識アプタマーを示す。下記表３Ａにおいて、前記（ｃ１－１）の非標識アプタマーの四角で囲んだ領域が、それぞれ、前記（ｄ１－１）～（ｄ１－２）、（ｄ１－６）～（ｄ１－８）または（ｄ１－９）に対する相補領域である。下記表３Ｂおよび３Ｃにおいて、前記（ｃ１－２）の非標識アプタマーの四角で囲んだ領域が、それぞれ、前記（ｄ１－１）、（ｄ１－３）～（ｄ１－５）、（ｄ１－７）～（ｄ１－１９）または（ｄ１－２０）に対する相補領域である。なお、前記（ｃ１－２）の非標識アプタマーは、前記（ｃ１－１）の非標識アプタマーよりも３’側に６塩基長い配列である。
前記標識相補鎖は、前記標識物質で標識化され、且つ、前記ポリヌクレオチドを含む相補鎖でもよいし、前記標識物質で標識化され、且つ、前記ポリヌクレオチドからなる相補鎖でもよい。前記標識相補鎖において、前記標識物質による標識位置は、特に制限されないが、例えば、３’末端または５’末端であり、好ましくは５’末端である。また、前記標識物質の種類は、何ら制限されず、前述のようなものが例示でき、具体例としては、Ｃｙ５が例示できる。
前記乳アレルゲン用の分析キットを用いて、本発明の分析方法を行うことにより、前記乳アレルゲンの分析を行うことができる。特に示さない限り、前記本発明の分析方法の記載が援用できる。前記乳アレルゲンは、例えば、加熱等による変性が生じていない未変性乳アレルゲンでもよいし、加熱等による変性が生じた変性乳アレルゲンでもよい。前記乳アレルゲンは、例えば、αカゼイン等のカゼインである。
前記サンプルは、例えば、前述のように食品由来の試料等があげられる。前記飲食品由来の試料は、例えば、食品、食品原料、食品添加物、食品加工場、または調理場等における付着物、洗浄後の洗浄液等があげられる。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
［実施例１］
前記第１の分析方法により、小麦アレルゲンであるグリアジンの分析を行った。
前記第１の分析方法により、小麦アレルゲンであるグリアジンの分析を行った。
（１）小麦アレルゲンアプタマー
実施例１の非標識アプタマーとして、蛍光物質で標識化していない前記（ａ１）の配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを合成した。配列番号１の塩基配列において、下線小文字の修飾塩基「ｔ」は、５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）、下線小文字の修飾塩基「ｃ」は、５’－メチルシトシンとした。
実施例１の非標識アプタマー（ａ１） （配列番号１）
5'-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAtt-3’
実施例１の非標識アプタマーとして、蛍光物質で標識化していない前記（ａ１）の配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを合成した。配列番号１の塩基配列において、下線小文字の修飾塩基「ｔ」は、５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）、下線小文字の修飾塩基「ｃ」は、５’－メチルシトシンとした。
実施例１の非標識アプタマー（ａ１） （配列番号１）
5'-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAtt-3’
比較例１Ａおよび１Ｂのアプタマーとして、蛍光物質で標識化した標識アプタマーを合成した。具体的には、配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを合成し、その５’末端をＣｙ（登録商標）５またはＴＹＥ６６５で標識し、比較例１Ａまたは１Ｂの標識アプタマーとした。配列番号１１の塩基配列において、下線小文字の修飾塩基「ｔ」および「ｃ」は、前記実施例１の非標識アプタマーと同じ修飾塩基とした。
比較例１Ａの標識アプタマー（配列番号１１）
5'-Cy5-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAttGAcAt-3’
比較例１Ｂの標識アプタマー（配列番号１１）
5'-TYE665-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAttGAcAt-3’
比較例１Ａの標識アプタマー（配列番号１１）
5'-Cy5-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAttGAcAt-3’
比較例１Ｂの標識アプタマー（配列番号１１）
5'-TYE665-CGCCTAGATCATTTGcGtcctccctGGtGGGGAttGGcGAAAAttGAcAt-3’
（２）相補鎖
前記実施例１の非標識アプタマーの一部に相補的な前記（ｂ１－１）の配列番号２の塩基配列からなる相補鎖を合成し、その５’末端をＣｙ（登録商標）５で標識化した。これを、実施例１の標識相補鎖（ｂ１－１）とした。前記標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例１の標識相補鎖（ｂ１－１） （配列番号２）
5'-Cy5-ACGCAAATGATC-3’
前記実施例１の非標識アプタマーの一部に相補的な前記（ｂ１－１）の配列番号２の塩基配列からなる相補鎖を合成し、その５’末端をＣｙ（登録商標）５で標識化した。これを、実施例１の標識相補鎖（ｂ１－１）とした。前記標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例１の標識相補鎖（ｂ１－１） （配列番号２）
5'-Cy5-ACGCAAATGATC-3’
（３）サンプル
小麦由来のグリアジン（cat# G3375-100G、SIGMA社製）を、１５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）に懸濁し、一晩溶解させた後、遠心（１０，０００ｒｐｍ、３０分、室温）し、フィルターろ過（0.22μm, Cat# SLGV033RS, Millex社製）により分離した。前記分離した上清を、未変性グリアジンを含む抽出液とし、グリアジン濃度を所定濃度（０、１、２、４、８、１６または３２ｐｐｍ）に調整し、これをグリアジンサンプルとした。
小麦由来のグリアジン（cat# G3375-100G、SIGMA社製）を、１５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）に懸濁し、一晩溶解させた後、遠心（１０，０００ｒｐｍ、３０分、室温）し、フィルターろ過（0.22μm, Cat# SLGV033RS, Millex社製）により分離した。前記分離した上清を、未変性グリアジンを含む抽出液とし、グリアジン濃度を所定濃度（０、１、２、４、８、１６または３２ｐｐｍ）に調整し、これをグリアジンサンプルとした。
（４）実施例１
前記実施例１の非標識アプタマー１．６ｐｍｏｌ、前記実施例１の標識相補鎖１．６ｐｍｏｌ、緩衝液３２μＬ、およびＤＷ ７８．４μＬを混合した。この反応液について、９５℃で５分間の熱変性処理を行った後、２５℃で３０分間のアニーリング処理を行い、さらに、４℃まで冷却してフォールディング処理を行った。これにより、前記反応液中で、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とのハイブリッドを形成した。前記緩衝液の組成は、５ｘ ＴＢ１Ｔ， ｐＨ８．０ （２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｃｉｎｅ， ６２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， ２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， ５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）とした。
前記実施例１の非標識アプタマー１．６ｐｍｏｌ、前記実施例１の標識相補鎖１．６ｐｍｏｌ、緩衝液３２μＬ、およびＤＷ ７８．４μＬを混合した。この反応液について、９５℃で５分間の熱変性処理を行った後、２５℃で３０分間のアニーリング処理を行い、さらに、４℃まで冷却してフォールディング処理を行った。これにより、前記反応液中で、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とのハイブリッドを形成した。前記緩衝液の組成は、５ｘ ＴＢ１Ｔ， ｐＨ８．０ （２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｃｉｎｅ， ６２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， ２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， ５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）とした。
つぎに、前記反応液に、各濃度の前記サンプル１６μＬと、１０ｍｍｏｌ／Ｌ デキストラン（デキストラン硫酸ナトリウム5000, 和光純薬, Cat# 198-13405） １．６μＬとを添加し、室温で振とうした（１０００ｒｐｍ、３０分間）。前記サンプルのグリアジンの存在に依存して、前記非標識アプタマーは、前記ハイブリッドからから遊離し、前記グリアジンと結合し、前記非標識アプタマーの遊離に伴って、前記ハイブリッドから前記標識相補鎖も遊離する。そして、前記反応液を、プレート（商品名384 Flat black、Greiner社製）のウェルに分注し、測定器（商品名Infinite M1000 Pro、ＴＥＣＡＮ社製）により、前記反応液の蛍光偏光度を測定した。測定において、励起光の波長は、６３５ｎｍとし、偏光度の検出波長は、６６５ｎｍとした。これらの結果を、図３（Ａ）に示す。
（５）比較例１Ａおよび１Ｂ
実施例１の前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖に代えて、比較例１Ａまたは１Ｂの前記標識アプタマー１．６ｐｍｏｌを前記緩衝液に添加した以外は、前記実施例１と同様にして、反応液の蛍光偏光度を測定した。これらの結果を、図３（Ｂ）および（Ｃ）に示す。
実施例１の前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖に代えて、比較例１Ａまたは１Ｂの前記標識アプタマー１．６ｐｍｏｌを前記緩衝液に添加した以外は、前記実施例１と同様にして、反応液の蛍光偏光度を測定した。これらの結果を、図３（Ｂ）および（Ｃ）に示す。
図３は、サンプルのグリアジン濃度と、反応液の蛍光偏光度との関係を示すグラフであり、（Ａ）は、実施例１の結果であり、（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ、比較例１Ａおよび１Ｂの結果である。前記標識アプタマーのみを使用した比較例１Ａおよび１Ｂの場合、図３（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、グリアジン濃度の増加に伴って、蛍光偏光度の増加が確認されたが、グリアジン濃度０ｐｐｍの偏光度とグリアジン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、いずれも１０ｍＰにとどまっていた。これに対して、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とを併用した実施例１の場合、図３（Ａ）に示すように、グリアジン濃度の増加に伴って、蛍光偏光度の低下が確認され、且つ、グリアジン濃度０ｐｐｍの偏光度とグリアジン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、４３ｍＰと十分に広いレンジに拡張できた。つまり、実施例１によれば、比較例１Ａおよび１Ｂよりも、蛍光偏光度の変化から、グリアジン濃度をより精度良く分析できるといえる。
［実施例２］
前記第１の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行った。
前記第１の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行った。
（１）乳アレルゲンアプタマー
実施例２の非標識アプタマーとして、蛍光物質で標識していない配列番号４の塩基配列からなる前記（ｃ１－１）のポリヌクレオチドを合成した。配列番号４の塩基配列において、下線小文字の修飾塩基「ｔ」は、５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、修飾塩基「ｃ」は、５’－メチルシトシンとした。
実施例２の非標識アプタマー（ｃ１－１） （配列番号４）
5'-GGATAGCAGCAGGGACCTCTTATACGtcGGtGctGGtGttGtAtAGAcccccttAtAttAtAA-3’
実施例２の非標識アプタマーとして、蛍光物質で標識していない配列番号４の塩基配列からなる前記（ｃ１－１）のポリヌクレオチドを合成した。配列番号４の塩基配列において、下線小文字の修飾塩基「ｔ」は、５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、修飾塩基「ｃ」は、５’－メチルシトシンとした。
実施例２の非標識アプタマー（ｃ１－１） （配列番号４）
5'-GGATAGCAGCAGGGACCTCTTATACGtcGGtGctGGtGttGtAtAGAcccccttAtAttAtAA-3’
比較例２のアプタマーとして、前記配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端をＴＹＥ６６５で標識し、標識アプタマーとして使用した。
（２）相補鎖
実施例２の非標識アプタマーの一部に相補的な、前記（ｄ１－１）の配列番号６の塩基配列からなる相補鎖と、前記（ｄ１－２）の配列番号７の塩基配列からなる相補鎖とを合成し、それらの５’末端をＣｙ（登録商標）５で標識化した。これらをそれぞれ、実施例２の標識相補鎖（ｄ１－１）、（ｄ１－２）とした。前記各標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例２の標識相補鎖（ｄ１－１） （配列番号６）
5'-Cy5-ATAAGAGGTCCC-3’
実施例２の標識相補鎖（ｄ１－２） （配列番号７）
5'-Cy5-TAATATAAGGGG-3’
実施例２の非標識アプタマーの一部に相補的な、前記（ｄ１－１）の配列番号６の塩基配列からなる相補鎖と、前記（ｄ１－２）の配列番号７の塩基配列からなる相補鎖とを合成し、それらの５’末端をＣｙ（登録商標）５で標識化した。これらをそれぞれ、実施例２の標識相補鎖（ｄ１－１）、（ｄ１－２）とした。前記各標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例２の標識相補鎖（ｄ１－１） （配列番号６）
5'-Cy5-ATAAGAGGTCCC-3’
実施例２の標識相補鎖（ｄ１－２） （配列番号７）
5'-Cy5-TAATATAAGGGG-3’
（３）サンプル
乳由来のカゼイン（cat# C6780-5G、SIGMA社製）を、ＴＢ１Ｔ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、一晩溶解させた後、遠心（１０，０００ｒｐｍ、３０分、室温）し、フィルターろ過（0.22μm, Cat# SLGV033RS, Millex社製）により、上清を回収した。前記上清を、未変性カゼインを含む抽出液とし、カゼイン濃度を所定濃度（０、１、２、４、８、１６または３２ｐｐｍ）に調整し、これをカゼインサンプルとした。前記ＴＢ１Ｔ緩衝液の組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｃｉｎｅ， １２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， ５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， １ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とした。
乳由来のカゼイン（cat# C6780-5G、SIGMA社製）を、ＴＢ１Ｔ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、一晩溶解させた後、遠心（１０，０００ｒｐｍ、３０分、室温）し、フィルターろ過（0.22μm, Cat# SLGV033RS, Millex社製）により、上清を回収した。前記上清を、未変性カゼインを含む抽出液とし、カゼイン濃度を所定濃度（０、１、２、４、８、１６または３２ｐｐｍ）に調整し、これをカゼインサンプルとした。前記ＴＢ１Ｔ緩衝液の組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｃｉｎｅ， １２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， ５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， １ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とした。
（４）実施例２
前記非標識アプタマーとして、前記実施例２の非標識アプタマーを使用し、前記標識相補鎖として、前記実施例２の標識相補鎖（ｄ１－１）または（ｄ１－２）を使用し、前記サンプルとして、前記αカゼインサンプルを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、反応を行い、蛍光偏光度の測定を行った。これらの結果を、図４（Ａ）および（Ｂ）に示す。
前記非標識アプタマーとして、前記実施例２の非標識アプタマーを使用し、前記標識相補鎖として、前記実施例２の標識相補鎖（ｄ１－１）または（ｄ１－２）を使用し、前記サンプルとして、前記αカゼインサンプルを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、反応を行い、蛍光偏光度の測定を行った。これらの結果を、図４（Ａ）および（Ｂ）に示す。
（５）比較例２
実施例２の前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖に代えて、比較例２の前記標識アプタマー１．６ｐｍｏｌを前記緩衝液に添加した以外は、前記実施例２と同様にして、反応液の蛍光偏光度を測定した。これらの結果を、図４（Ｃ）に示す。
実施例２の前記非標識アプタマーおよび前記標識相補鎖に代えて、比較例２の前記標識アプタマー１．６ｐｍｏｌを前記緩衝液に添加した以外は、前記実施例２と同様にして、反応液の蛍光偏光度を測定した。これらの結果を、図４（Ｃ）に示す。
図４は、サンプルのαカゼイン濃度と、反応液の蛍光偏光度との関係を示すグラフであり、（Ａ）は、前記標識相補鎖（ｄ１－１）を使用した実施例２の結果であり、（Ｂ）は、前記標識相補鎖（ｄ１－２）を使用した実施例２の結果であり、（Ｃ）は、比較例２の結果である。前記標識アプタマーのみを使用した比較例２の場合、図４（Ｃ）に示すように、αカゼイン濃度の増加に伴って、蛍光偏光度の増加が確認されたが、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、１５ｍＰにとどまっていた。これに対して、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖（ｄ１－１）とを併用した実施例２の場合、図４（Ａ）に示すように、αカゼイン濃度の増加に伴って、蛍光偏光度の低下が確認され、且つ、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、２７ｍＰと十分に広いレンジに拡張できた。また、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖（ｄ１－２）とを併用した実施例２の場合も、図４（Ｂ）に示すように、αカゼイン濃度の増加に伴って、蛍光偏光度の低下が確認され、且つ、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、２５ｍＰと十分に広いレンジに拡張できた。つまり、実施例２によれば、比較例２よりも、蛍光偏光度の変化から、αカゼイン濃度をより精度良く分析できるといえる。
［実施例３］
前記第２の分析方法により、小麦アレルゲンであるグリアジンの分析を行った。
前記第２の分析方法により、小麦アレルゲンであるグリアジンの分析を行った。
（１）小麦アレルゲンアプタマー
実施例３の非標識アプタマーとして、前記実施例１の非標識アプタマー（ａ１）を使用した。
実施例３の非標識アプタマーとして、前記実施例１の非標識アプタマー（ａ１）を使用した。
（２）相補鎖
実施例３の標識相補鎖として、前記実施例１の標識相補鎖（ｂ１－１）を使用した。また、前記実施例３の非標識アプタマー（ａ１）の一部に相補的な前記（ｂ１－２）の配列番号３の塩基配列からなる相補鎖を合成し、その５’末端をＣｙ（登録商標）５で標識化した。これを、実施例３の標識相補鎖（ｂ１－２）とした。前記標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例３の標識相補鎖（ｂ１－２） （配列番号３）
5'-Cy5-CGCAAATGATCT-3’
実施例３の標識相補鎖として、前記実施例１の標識相補鎖（ｂ１－１）を使用した。また、前記実施例３の非標識アプタマー（ａ１）の一部に相補的な前記（ｂ１－２）の配列番号３の塩基配列からなる相補鎖を合成し、その５’末端をＣｙ（登録商標）５で標識化した。これを、実施例３の標識相補鎖（ｂ１－２）とした。前記標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例３の標識相補鎖（ｂ１－２） （配列番号３）
5'-Cy5-CGCAAATGATCT-3’
（３）実施例３
サンプルは、前記実施例１で調製したグリアジンサンプルを使用した。まず、前記非標識アプタマー１．６ｐｍｏｌ、各濃度の前記サンプル１６μＬ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌデキストラン（デキストラン硫酸ナトリウム5000, 和光純薬, Cat# 198-13405）を含む５ｘ ＴＢ１Ｔ緩衝液３２μＬ、およびＤＷ ８０μＬを混合し、この反応液を室温で振とうした（１０００ｒｐｍ、１５分間）。これにより、前記反応液中で、前記非標識アプタマーと前記サンプル中のグリアジンとを結合させた。
サンプルは、前記実施例１で調製したグリアジンサンプルを使用した。まず、前記非標識アプタマー１．６ｐｍｏｌ、各濃度の前記サンプル１６μＬ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌデキストラン（デキストラン硫酸ナトリウム5000, 和光純薬, Cat# 198-13405）を含む５ｘ ＴＢ１Ｔ緩衝液３２μＬ、およびＤＷ ８０μＬを混合し、この反応液を室温で振とうした（１０００ｒｐｍ、１５分間）。これにより、前記反応液中で、前記非標識アプタマーと前記サンプル中のグリアジンとを結合させた。
つぎに、前記反応液に、前記標識相補鎖（ｂ１－１）または（ｂ１－２）１．６ｐｍｏｌを添加し、さらに、室温で振とうした（１０００ｒｐｍ、３０分）。これにより、グリアジンと結合しなかった余剰の前記非標識アプタマーを、前記標識相補鎖と結合させた。この反応液を、前記実施例１と同様にして、前記プレートのウェルに分注し、同様にして、蛍光偏光度の測定を行った。これらの結果を、図５（Ａ）または（Ｂ）に示す。
図５は、実施例３について、サンプルのグリアジン濃度と、反応液の蛍光偏光度との関係を示すグラフであり、（Ａ）は、前記標識相補鎖（ｂ１－１）を使用した結果であり、（Ｂ）は、前記標識相補鎖（ｂ１－２）を使用した結果である。前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖（ｂ１－１）とを併用した場合、図５（Ａ）に示すように、グリアジン濃度の増加に伴って、蛍光偏光度の低下が確認され、且つ、グリアジン濃度０ｐｐｍの偏光度とグリアジン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、４３ｍＰと十分に広いレンジに拡張できた。また、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖（ｂ１－２）とを併用した場合、図５（Ｂ）に示すように、グリアジン濃度の増加に伴って、蛍光偏光度の低下が確認され、且つ、グリアジン濃度０ｐｐｍの偏光度とグリアジン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、３６．３ｍＰと十分に広いレンジに拡張できた。前記比較例１Ａおよび１Ｂにおいて述べたように、蛍光物質で標識化された修飾塩基を含む標識アプタマーを使用した場合、ΔｍＰは、非常に狭いレンジであった。このことからも、実施例３によれば、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とを使用した前記第２の分析方法によっても、蛍光偏光度の変化から、グリアジン濃度をより精度良く分析できるといえる。
［実施例４］
前記第２の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行った。
前記第２の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行った。
（１）乳アレルゲンアプタマー
実施例２の非標識アプタマーとして、蛍光物質で標識していない配列番号５の塩基配列からなる前記（ｃ１－２）のポリヌクレオチドを合成した。配列番号５のポリヌクレオチドにおいて、下線小文字の修飾塩基「ｔ」は、５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、下線小文字の修飾塩基「ｃ」は、５’－メチルシトシンとした。
実施例４の非標識アプタマー（ｃ１－２） （配列番号５）
5'-GGATAGCAGCAGGGACCTCTTATACGtcGGtGctGGtGttGtAtAGAcccccttAtAttAtAAccGAAt-3’
実施例２の非標識アプタマーとして、蛍光物質で標識していない配列番号５の塩基配列からなる前記（ｃ１－２）のポリヌクレオチドを合成した。配列番号５のポリヌクレオチドにおいて、下線小文字の修飾塩基「ｔ」は、５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、下線小文字の修飾塩基「ｃ」は、５’－メチルシトシンとした。
実施例４の非標識アプタマー（ｃ１－２） （配列番号５）
5'-GGATAGCAGCAGGGACCTCTTATACGtcGGtGctGGtGttGtAtAGAcccccttAtAttAtAAccGAAt-3’
（２）相補鎖
実施例４の非標識アプタマー（ｃ１－２）の一部に相補的な、前記（ｄ１－３）の配列番号８、前記（ｄ１－４）の配列番号９、または前記（ｄ１－５）の配列番号１０からなる相補鎖を合成し、それらの５’末端をＣｙ（登録商標）５で標識化した。これらをそれぞれ、実施例４の標識相補鎖（ｄ１－３）～（ｄ１－５）とした。前記各標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例４の標識相補鎖（ｄ１－３） （配列番号８）
5'-Cy5-CACCAGCACCGA-3’
実施例４の標識相補鎖（ｄ１－４） （配列番号９）
5'-Cy5-ACACCAGCACCG-3’
実施例４の標識相補鎖（ｄ１－５） （配列番号１０）
5'-Cy5-AACACCAGCACC-3’
実施例４の非標識アプタマー（ｃ１－２）の一部に相補的な、前記（ｄ１－３）の配列番号８、前記（ｄ１－４）の配列番号９、または前記（ｄ１－５）の配列番号１０からなる相補鎖を合成し、それらの５’末端をＣｙ（登録商標）５で標識化した。これらをそれぞれ、実施例４の標識相補鎖（ｄ１－３）～（ｄ１－５）とした。前記各標識相補鎖の構成単位における塩基は、天然塩基とした。
実施例４の標識相補鎖（ｄ１－３） （配列番号８）
5'-Cy5-CACCAGCACCGA-3’
実施例４の標識相補鎖（ｄ１－４） （配列番号９）
5'-Cy5-ACACCAGCACCG-3’
実施例４の標識相補鎖（ｄ１－５） （配列番号１０）
5'-Cy5-AACACCAGCACC-3’
（３）実施例４
サンプルは、前記実施例２で調製したαカゼインサンプルを使用した。そして、前記非標識アプタマーとして、前記実施例４の非標識アプタマー（ｃ１－２）を使用し、前記標識相補鎖として、前記実施例４の標識相補鎖（ｄ１－３）～（ｄ１－５）をそれぞれ使用し、前記サンプルとして、前記αカゼインサンプルを使用した以外は、前記実施例３と同様にして、反応を行い、蛍光偏光度の測定を行った。これらの結果を、図６（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示す。
サンプルは、前記実施例２で調製したαカゼインサンプルを使用した。そして、前記非標識アプタマーとして、前記実施例４の非標識アプタマー（ｃ１－２）を使用し、前記標識相補鎖として、前記実施例４の標識相補鎖（ｄ１－３）～（ｄ１－５）をそれぞれ使用し、前記サンプルとして、前記αカゼインサンプルを使用した以外は、前記実施例３と同様にして、反応を行い、蛍光偏光度の測定を行った。これらの結果を、図６（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示す。
図６は、実施例４について、サンプルのαカゼイン濃度と、反応液の蛍光偏光度との関係を示すグラフであり、（Ａ）は、前記標識相補鎖（ｄ１－３）を使用した結果、（Ｂ）は、前記標識相補鎖（ｄ１－４）を使用した結果、および（Ｃ）は、前記標識相補鎖（ｄ１－５）を使用した結果である。前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖（ｄ１－３）とを併用した場合、図６（Ａ）に示すように、αカゼイン濃度の増加に伴って、蛍光偏光度の低下が確認され、且つ、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、５２．３ｍＰと十分に広いレンジに拡張できた。また、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖（ｄ１－４）とを併用した場合、図６（Ｂ）に示すように、αカゼイン濃度の増加に伴って、蛍光偏光度の低下が確認され、且つ、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、６８．３ｍＰと十分に広いレンジに拡張できた。前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖（ｄ１－５）とを併用した場合も、図６（Ｃ）に示すように、αカゼイン濃度の増加に伴って、蛍光偏光度の低下が確認され、且つ、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、６２．７ｍＰと十分に広いレンジに拡張できた。前記比較例２において述べたように、蛍光物質で標識化された修飾塩基を含む標識アプタマーを使用した場合、ΔｍＰは、非常に狭いレンジであった。このことからも、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とを使用した前記第２の分析方法によっても、蛍光偏光度の変化から、αカゼイン濃度をより精度良く分析できるといえる。
［実施例５］
以下の標識相補鎖を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、前記第１の分析方法により、小麦アレルゲンであるグリアジンの分析を行い、グリアジン濃度０ｐｐｍの偏光度とグリアジン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）を算出した。これらの結果を下記表４に示す。
以下の標識相補鎖を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、前記第１の分析方法により、小麦アレルゲンであるグリアジンの分析を行い、グリアジン濃度０ｐｐｍの偏光度とグリアジン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）を算出した。これらの結果を下記表４に示す。
標識相補鎖（ｂ１－３） （配列番号１２）
5'-Cy5-GCAAATGATCTA-3’
標識相補鎖（ｂ１－２） （配列番号３）
5'-Cy5-CGCAAATGATCT-3’
5'-Cy5-GCAAATGATCTA-3’
標識相補鎖（ｂ１－２） （配列番号３）
5'-Cy5-CGCAAATGATCT-3’
前記表４に示すように、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖（ｂ１－３）または（ｂ１－２）を用いることにより、グリアジン濃度０ｐｐｍの偏光度とグリアジン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、それぞれ、１４．７ｍＰまたは２９．７ｍＰであり、前記比較例１Ａおよび１Ｂの１０ｍＰと比較して、十分に広いレンジに拡張できた。
［実施例６］
以下の標識相補鎖を使用した以外は、前記実施例２と同様にして、前記第１の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行い、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）を算出した。これらの結果を下記表５に示す。
以下の標識相補鎖を使用した以外は、前記実施例２と同様にして、前記第１の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行い、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）を算出した。これらの結果を下記表５に示す。
標識相補鎖（ｄ１－６） （配列番号１３）
5'-Cy5-AAGAGGTCCCTG-3’
標識相補鎖（ｄ１－７） （配列番号１４）
5'-Cy5-TAAGAGGTCCCT-3’
標識相補鎖（ｄ１－８） （配列番号１５）
5'-Cy5-CAACACCAGCAC-3’
標識相補鎖（ｄ１－９） （配列番号１６）
5'-Cy5-GGTCTATACAAC-3’
5'-Cy5-AAGAGGTCCCTG-3’
標識相補鎖（ｄ１－７） （配列番号１４）
5'-Cy5-TAAGAGGTCCCT-3’
標識相補鎖（ｄ１－８） （配列番号１５）
5'-Cy5-CAACACCAGCAC-3’
標識相補鎖（ｄ１－９） （配列番号１６）
5'-Cy5-GGTCTATACAAC-3’
前記表５に示すように、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖（ｄ１－６）～（ｄ１－９）を用いることにより、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、それぞれ、２７．７ｍＰ、２５．７ｍＰ、２６．７ｍＰ、または２１．０ｍＰであり、前記比較例２の１５ｍＰと比較して、十分に広いレンジに拡張できた。
［実施例７］
以下の標識相補鎖を使用した以外は、前記実施例４と同様にして、前記第２の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行い、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）を算出した。これらの結果を下記表６に示す。
以下の標識相補鎖を使用した以外は、前記実施例４と同様にして、前記第２の分析方法により、乳アレルゲンであるαカゼインの分析を行い、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）を算出した。これらの結果を下記表６に示す。
標識相補鎖（ｄ１－１０） （配列番号１７）
5'-Cy5-CTGCTGCTATCC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１１） （配列番号１８）
5'-Cy5-CCTGCTGCTATC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１２） （配列番号１９）
5'-Cy5-TCCCTGCTGCTA-3’
標識相補鎖（ｄ１－１３） （配列番号２０）
5'-Cy5-GGTCCCTGCTGC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１４） （配列番号２１）
5'-Cy5-GAGGTCCCTGCT-3’
標識相補鎖（ｄ１－７） （配列番号１４）
5'-Cy5-TAAGAGGTCCCT-3’
標識相補鎖（ｄ１－１） （配列番号６）
5'-Cy5-ATAAGAGGTCCC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１５） （配列番号２２）
5'-Cy5-GTATAAGAGGTC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１６） （配列番号２３）
5'-Cy5-ACGTATAAGAGG-3’
標識相補鎖（ｄ１－１７） （配列番号２４）
5'-Cy5-CGACGTATAAGA-3’
標識相補鎖（ｄ１－１８） （配列番号２５）
5'-Cy5-ACCAGCACCGAC-3’
標識相補鎖（ｄ１－８） （配列番号１５）
5'-Cy5-CAACACCAGCAC-3’
標識相補鎖（ｄ１－９） （配列番号１６）
5'-Cy5-GGTCTATACAAC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１９） （配列番号２６）
5'-Cy5-GGGTCTATACAA-3’
標識相補鎖（ｄ１－２０） （配列番号２７）
5'-Cy5-GGGGTCTATACA-3’
5'-Cy5-CTGCTGCTATCC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１１） （配列番号１８）
5'-Cy5-CCTGCTGCTATC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１２） （配列番号１９）
5'-Cy5-TCCCTGCTGCTA-3’
標識相補鎖（ｄ１－１３） （配列番号２０）
5'-Cy5-GGTCCCTGCTGC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１４） （配列番号２１）
5'-Cy5-GAGGTCCCTGCT-3’
標識相補鎖（ｄ１－７） （配列番号１４）
5'-Cy5-TAAGAGGTCCCT-3’
標識相補鎖（ｄ１－１） （配列番号６）
5'-Cy5-ATAAGAGGTCCC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１５） （配列番号２２）
5'-Cy5-GTATAAGAGGTC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１６） （配列番号２３）
5'-Cy5-ACGTATAAGAGG-3’
標識相補鎖（ｄ１－１７） （配列番号２４）
5'-Cy5-CGACGTATAAGA-3’
標識相補鎖（ｄ１－１８） （配列番号２５）
5'-Cy5-ACCAGCACCGAC-3’
標識相補鎖（ｄ１－８） （配列番号１５）
5'-Cy5-CAACACCAGCAC-3’
標識相補鎖（ｄ１－９） （配列番号１６）
5'-Cy5-GGTCTATACAAC-3’
標識相補鎖（ｄ１－１９） （配列番号２６）
5'-Cy5-GGGTCTATACAA-3’
標識相補鎖（ｄ１－２０） （配列番号２７）
5'-Cy5-GGGGTCTATACA-3’
前記表６に示すように、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖（ｄ１－１）、（ｄ１－７）～（ｄ１－２０）を用いることにより、αカゼイン濃度０ｐｐｍの偏光度とαカゼイン濃度３２ｐｐｍの偏光度との差（ΔｍＰ）は、２６．３ｍＰ～４６．３ｍＰであり、前記比較例２の１５ｍＰと比較して、十分に広いレンジに拡張できた。
以上のことから、本発明の分析方法によれば、前記非標識アプタマーと前記標識相補鎖とを使用することにより、前記標識相補鎖の配列に関わらず、蛍光偏光度の変化から、サンプル中のターゲットをより精度良く分析できるといえる。
これらのことから、本発明の分析方法によれば、ターゲット濃度に対する偏光度変化のレンジを大きくできるため、偏光度を利用した分析において、分析精度を向上することができることがわかった。
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
本発明の分析方法によれば、例えば、ターゲット濃度に対する偏光度変化のレンジを大きくできるため、偏光度を利用した分析において、分析精度を向上することができる。このため、本発明の分析方法は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野において、極めて有用なツールといえる。
Claims (8)
- 蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを使用し、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
前記蛍光非標識アプタマーと、前記蛍光標識相補鎖と、サンプルとを共存させ、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖との結合および非結合に依存する、前記蛍光標識相補鎖に由来する偏光度を検出する検出工程と、
前記偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する分析工程とを含み、
前記蛍光非標識アプタマーにおいて、前記修飾塩基として、修飾シトシンを含むことを特徴とする、偏光度によるターゲット分析方法。 - 前記検出工程は、
反応系において、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖とのハイブリッドを形成し、
前記反応系に前記サンプルを添加し、前記ハイブリッドに前記サンプルを接触させ、
前記反応系の偏光度を測定し、
前記分析工程は、
前記サンプルと接触後の前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する、請求項１記載の分析方法。 - 前記検出工程は、
反応系において、前記蛍光非標識アプタマーと前記蛍光標識相補鎖と前記サンプルとを接触させ、
前記反応系の偏光度を測定し、
前記分析工程は、
前記反応系の偏光度に基づいて、前記サンプル中のターゲットの存在を分析する、請求項１記載の分析方法。 - 前記蛍光非標識アプタマーにおいて、前記修飾塩基として、修飾チミンまたはおよび修飾ウラシルの少なくとも一方を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記蛍光非標識アプタマーが、前記修飾塩基を含むＤＮＡであり、前記蛍光標識相補鎖が、前記修飾塩基を含まないＤＮＡである、請求項１から４のいずれか一項記載の分析方法。
- 前記サンプルが、食品由来試料である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記ターゲットが、食物アレルゲンである、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
- 蛍光非標識アプタマーと、蛍光標識相補鎖とを含み、
前記蛍光非標識アプタマーは、蛍光物質で標識化されておらず、構成単位が修飾塩基および天然塩基を含み、ターゲットに結合するアプタマーであり、
前記蛍光標識相補鎖は、蛍光物質で標識化され、構成単位が修飾塩基を含まず天然塩基を含み、前記アプタマーに結合する相補鎖であり、
請求項１から７のいずれか一項に記載の偏光度によるターゲット分析方法に使用することを特徴とするターゲット分析キット。
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|---|---|---|---|---|
| US20020061531A1 (en) | 2000-09-01 | 2002-05-23 | Le Xiao-Chun (Chris) | Detection of binding factors with fluorescence polarization |
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| WO2014077167A1 (ja) | 2012-11-13 | 2014-05-22 | Ｎｅｃソフト株式会社 | サルモネラに結合する核酸分子およびその用途 |
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-
2019
- 2019-03-29 JP JP2019066834A patent/JP7343138B2/ja active Active
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