KR20230126803A - 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 - Google Patents
병원성대장균에 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본원은, 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본원의 일 구현예에 따르면 본원은 병원성 식중독균인 대장균과 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 그 제조방법을 제공함으로써, 식품산업 현장에서 48시간의 초기배양 기간 및 고가의 장비가 필요없이 병원성대장균의 신속하고 정확한 검출을 가능하게 할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면 본원은 병원성 식중독균인 대장균과 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 그 제조방법을 제공함으로써, 식품산업 현장에서 48시간의 초기배양 기간 및 고가의 장비가 필요없이 병원성대장균의 신속하고 정확한 검출을 가능하게 할 수 있다.
Description
본원은, 병원성대장균(Escherichia coli O157:H7)에 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 그 제조방법에 관한 것이다.
식중독균들은 부패한 채소, 농수산물, 각종 저장식품, 식품제조공정을 통하여 인체에 감염되면 식중독을 일으킬 수 있으므로, 식품의 안전성을 제고하고 보건위생환경을 개선하는 측면에서 이들 식중독균을 보다 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술을 개발하는 것에 관심이 높다. 그러나 지금까지 식중독균에 대한 효율적인 신속 검출법은 이상적인 리간드가 없어 어려움을 겪고 있다.
식중독균에 대한 신속 검출법으로 생물발광과 미생물대사결과의 반응산물을 이용하는 방법은 상대적으로 선택성이 결여되어 있으므로 단지 식중독균에 대한 일반적인 지표로만 활용될 수 있을 뿐이고, 부가적으로 선택성이 높은 면역학적 방법과 핵산중합을 사용하여 명확한 동정을 해야 하는 추가적인 단계가 필요하고 특별한 장비 및 실험시설이 있어야 하는 문제점이 있으며, 아울러 효소면역측정과 면역형광측정의 경우는 사용하는 항체의 불안전성으로 인해 물질의 보관 및 유통에 문제가 있으며 또한 항체는 식중독균의 세포벽에 의한 선택성 및 감도에 대한 단점이 있다.
한편, 압타머(Aptamer)는 저분자의 올리고 뉴클레오티드로 표적분자에 특이적이고 선택적으로 결합한다. 널리 알려진 바와 같이 핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체로서, 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로서 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘(사이토신, 티미딘, 우라실)으로 이루어져 있다. 상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하는데, 이런 구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다.
일반적으로 DNA와 RNA와 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 형성함으로써 효소로서의 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다. 핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 형성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 형성하여 안정화된다.
이러한 특성으로 인해 핵산이 단백질을 포함하는 특정물질에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 압타머를 제작할 수 있다.
특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법을 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)라 하고, 이런 SELEX를 통하여 자연 상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질뿐만 아니라 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와도 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 분자들이 선별되고 있다.
최근 이러한 압타머를 이용하여 질병을 진단하고 치료하는 다양한 시도가 이루어지고 있다. 특히, 질병의 원인이 되는 각종 병원체들의 존재를 검출하는데 압타머를 이용함으로써 질병을 미연에 방지할 수 있다. 그러나 일반적으로 압타머는 하나의 표적 물질에만 결합하는 것이 아니라 유사한 구조를 가지는 다른 물질에도 결합할 수 있어 질병의 진단이나 병원체의 검출 정확도가 떨어지는 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은 식품산업 현장에서 식중독을 일으키는 병원균, 그 중에서도 병원성대장균에 결합하여 이를 검출할 수 있는 단일가닥 DNA 압타머를 발명하여, 본 발명을 완성하였다.
본원은, 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 그 제조방법에 관한 것이다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제1측면은, 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 DNA 압타머를 제공한다.
본원의 제2측면은, 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 DNA 압타머를 포함하는 병원성대장균 검출용 조성물을 제공한다.
본원의 제3측면은, 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 DNA 압타머를 포함하는 병원성대장균 검출용 키트를 제공한다.
본원의 제4측면은, 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 DNA 압타머의 제조방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면 본원은 병원성 식중독균인 대장균과 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 그 제조방법을 제공함으로써, 식품산업 현장에서 48시간의 초기배양 기간 및 고가의 장비가 필요없이 병원성대장균의 신속하고 정확한 검출을 가능하게 할 수 있다.
도 1은, 본원의 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 DNA 압타머의 발굴과정을 나타낸 도면이다.
도 2는, PCR(중합효소연쇄반응)을 거쳐 회수된 병원성대장균에 결합한 단일가닥 DNA pool의 전기영동 결과를 도시한 도면이다.
도 3은, 병원성대장균에 결합하는 형광이 표지된 단일가닥 DNA 압타머 후보군을 이용한 결합 감도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는, 선발된 단일가닥 DNA 압타머가 병원성대장균에 결합하기 위해 변형하는 3차원 구조의 예측 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는, PCR(중합효소연쇄반응)을 거쳐 회수된 병원성대장균에 결합한 단일가닥 DNA pool의 전기영동 결과를 도시한 도면이다.
도 3은, 병원성대장균에 결합하는 형광이 표지된 단일가닥 DNA 압타머 후보군을 이용한 결합 감도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는, 선발된 단일가닥 DNA 압타머가 병원성대장균에 결합하기 위해 변형하는 3차원 구조의 예측 결과를 나타낸 도면이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 병원성대장균에 결합하는 DNA 압타머를 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서 상기 DNA 압타머는, 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 DNA 압타머로서, 서열번호 1 내지 13에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 것이다.
본원의 제 2측면은, 병원성대장균에 결합하는 DNA 압타머를 포함하는 병원성대장균 검출용 조성물을 제공한다. 제 1측면과 중복되는 내용은 제 2측면의 조성물에도 공히 적용된다.
본원의 제 3측면은, 병원성대장균에 결합하는 DNA 압타머를 포함하는 병원성대장균 검출용 키트를 제공한다. 제 1측면 및 제 2측면과 중복되는 내용은 제 3측면의 키트에도 공히 적용된다.
본원의 키트는 병원성대장균과 결합하는 단일가닥 DNA 압타머를 포함하여, 병원성대장균의 신속하고 정확한 검출을 가능하게 할 수 있다.
본원의 제 4측면은, 병원성대장균에 결합하는 DNA 압타머의 제조방법을 제공한다. 제1측면 내지 제 3측면과 중복되는 내용은 제4측면의 제조방법에도 공히 적용된다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제4측면의 제조방법은
(a) 양 끝에 PCR용 프라이머 영역을 가지며 중앙에 무작위로 배열된 20 내지 40개의 염기를 가지는 DNA들을 포함하는 DNA라이브러리와 병원성대장균을 결합버퍼 용액에 혼합하여 병원성대장균-DNA 결합체를 유도하는 단계;
(b) 상기 DNA 라이브러리와 병원성대장균의 혼합용액을 원심분리하여 상기 병원성대장균-DNA 결합체를 추출하는 단계:
(c) 상기 병원성대장균-DNA 결합체로부터 DNA를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 DNA를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시키는 단계;
(e) 상기 증폭된 DNA를 원심분리 필터를 사용하여 농축하는 단계;
(f) 상기 농축된 DNA와 비-표적 미생물을 결합 버퍼 용액에 혼합하여 비-표적 미생물-DNA 결합체를 유도하는 단계; 및
(g) 상기 농축된 DNA와 비-표적 미생물의 혼합용액을 원심분리하여 상기 비-표적 미생물과 결합하지 않은 DNA를 추출하는 단계를 포함한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 결합버퍼 용액은 인산버퍼 용액(PBS, Phosphate buffered saline) 일 수 있으며, pH는 7.1 내지 7.8 일 수 있고, 바람직하게는 7.4일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현에에 있어서, 상기 비-표적 미생물은 병원성 대장균(Escherichia coli O157:H7) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 중 적어도 하나일 수 있다.
이하, 본원의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것 일뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. DNA 라이브러리 형성
본 발명의 일 실시예에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 제조방법을 보다 상세히 설명한다(도 1 참조).
병원성대장균에 결합하는 단일가닥 핵산의 선별을 위해 아래와 같이 양 끝에 프라이머 결합용 고정서열을 가지며 중앙에 20-40개의 염기서열(A, T, C, G)로 구성된 DNA library를 준비하였다.
5‘-[고정서열1]-N40-[고정서열2]-3’
여기서 고정서열1 및 고정서열2는 DNA library에 포함된 프라이머 결합 부위이며 N40은 40개의 A, T, C, G 무작위 배열 염기서열을 포함하고 있다.
PCR 시에 이용되는 Forward primer는 5‘ 말단의 고정서열1(TAGGGAAGAGAAGGACATATGAT)과 결합을 할 수 있고 Reverse primer는 고정서열2(TCAAGTGGTCATGTACTAGTCAA)와 결합을 할 수 있다.
DNA library와 표적 미생물인 병원성대장균의 결합을 유도하기 전에 95℃에서 10분간 열처리 후 -20℃에서 반응하여 열변성을 통해 유도된 3차원 구조를 가지는 단일가닥 DNA library를 제조하였다.
실시예 2. 병원성대장균과 결합 특이성을 가지는 단일가닥 DNA의 선별(SELEX 기법)
PBS(Phosphate buffered saline), pH 7.4 인산 완충용액을 이용하여 실온에서 35분간 단일가닥 DNA library를 표적 미생물 병원성대장균의 결합을 유도한 후 8,000g에서 10분간 원심분리하여 하층액의 표적 미생물에 결합한 단일가닥 DNA 및 상층액의 미결합 단일가닥 DNA를 분리하였다. 직후 상층액에서 분리된 비결합 단일가닥 DNA는 제거하였다. 하층액에 분리된 표적 미생물에 결합한 단일가닥 DNA 결합체는 본 발명에 따른 압타머 후보군으로 선별 되었다.
표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체에 멸균 증류수를 첨가하여 95℃에서 10분간 가열하여 열처리함으로서 단일가닥 DNA를 표적 미생물로부터 용리하고, 이 용액을 8,000g에서 10분간 원심분리하여 상층액에 존재하는 병원성대장균에 결합하는 단일 가닥 DNA 후보군을 이용한 PCR(중합효소연쇄반응)을 통해 농도를 증폭시켜 이를 정제 및 농축하여 사용하였다.
무작위로 배열된 20-40개의 염기서열을 갖는 DNA library 제작 및 SELEX 5 round 수행 후 병원성대장균에 결합하는 압타머 후보군의 전기영동 분석결과를 도 2에 나타냈다.
상기의 반복된 과정을 통해 최종적으로 얻어진 단일가닥 DNA에 FAM, Cyanine-3 및 Texas Red 등의 형광물질을 결합시켜 Spectrophotometer 장비를 이용한 병원성대장균에 결합된 형광물질의 파장대에서 측정한 후 이를 수치화하여 결합력을 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타냈다.
또한, 최종 선발된 단일가닥 DNA 압타머가 병원성대장균에 결합하기 위해 변형하는 3차원 구조의 예측 결과를 도 4에 나타냈다.
형광검출 측정 분석을 통해 결합이 확인된 단일가닥 DNA 염기서열은 아래의 [표 1]과 같다.
[표 1]
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Biosesang
<120> SINGLE STRANDED DNA APTAMERS SPECIFICALLY BINDING TO ESCHERICHIA
COLI O157:H7 AND PRODUCTION METHOD THEREOF
<130> DP20220091KR
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-7
<400> 1
ttcctttttc cttgctactc tattcgccca tatggtggcc 40
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-9
<400> 2
ggcttatttt tcttcggatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-10
<400> 3
tatttggtct gtctacgttg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-15
<400> 4
tagaatcggt gccgtgggta 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-16
<400> 5
aatcgtgact acatgtgatt 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-67
<400> 6
tgcatacatg catacggtt 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-68
<400> 7
tgcatacgtg cataacggtt 20
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-71
<400> 8
gcgtcatagc gcttcgtaga ggtccctcgt 30
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-73
<400> 9
tctagacaca cctgctaaat acaggcaagc ggaagcttac 40
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-79
<400> 10
ccccgatgaa ggagcacggg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-80
<400> 11
catatattat gagtgattga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-81
<400> 12
ccagggttta gttgaaagtg 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EC-85
<400> 13
cccggtttag ttgaaagtg 19
Claims (5)
- 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 DNA 압타머로서,
상기 압타머는 서열번호 1 내지 13에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 것인, DNA 압타머.
- 제 1항의 DNA 압타머를 포함하는, 병원성대장균 검출용 조성물.
- 제 1항의 DNA 압타머를 포함하는, 병원성대장균 검출용 키트.
- (a) 양 끝에 PCR용 프라이머 영역을 가지며 중앙에 무작위로 배열된 20 내지 40개의 염기를 가지는 DNA들을 포함하는 DNA라이브러리와 병원성대장균을 결합버퍼 용액에 혼합하여 병원성대장균-DNA 결합체를 유도하는 단계;
(b) 상기 DNA 라이브러리와 병원성대장균의 혼합용액을 원심분리하여 상기 병원성대장균-DNA 결합체를 추출하는 단계:
(c) 상기 병원성대장균-DNA 결합체로부터 DNA를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 DNA를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시키는 단계;
(e) 상기 증폭된 DNA를 원심분리 필터를 사용하여 농축하는 단계;
(f) 상기 농축된 DNA와 비-표적 미생물을 결합 버퍼 용액에 혼합하여 비-표적 미생물-DNA 결합체를 유도하는 단계; 및
(g) 상기 농축된 DNA와 비-표적 미생물의 혼합용액을 원심분리하여 상기 비-표적 미생물과 결합하지 않은 DNA를 추출하는 단계를 포함하는 것인,
병원성대장균에 결합하는 DNA 압타머의 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 결합버퍼 용액은 인산버퍼 용액인 것인, 병원성대장균에 결합하는 DNA 압타머의 제조방법.
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-
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