CN107075517A - 拮抗性ctla‑4适体及其于增进免疫活性的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供结合CTLA‑4并拮抗CTLA‑4的适体及其增进免疫活性与治疗癌症和HIV感染的用途。
Description
相关申请案
本申请案依据35U.S.C.§119(e)请求于2014年7月31日提申的美国临时申请案第62/031,406号的优先权,其全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明提供结合CTLA-4并拮抗CTLA-4的适体及其增进免疫活性与治疗癌症和HIV感染的用途。
背景技术
癌症是导致人类死亡与极大金融损失的最重要疾病。依据2004年的WHO报告,在全世界有超过740万人因为这个疾病而丧生且罹病者仍逐年增加(Abou-Alfa,G.K.,et al.(2006),J Clin Oncol24,4293-4300)。癌症的主要治疗是外科手术、化学疗法以及放射线疗法。但是,这些传统疗法会造成严重副作用而且也会杀死正常细胞。
因此,开发了标靶疗法且经证实能有效治疗数种类型的癌症(Van Cutsem,E.,etal.(2009),N Engl J Med360,1408-1417,Klein,S.and Levitzki A.(2007),AdvCancerRes97,295-319)。但是,几乎没有肿瘤特异性标记而且只有少数标靶疗法成功应用于临床上(Jain,R.K.,et al.(2009),Nat Rey Clin Oncol6,327-3384,Gazdar,A.F.(2009),Oncogene28Suppl 1,S24-31)。此外,许多研究已显示,基因体不稳定促使对标靶疗法的抗性(Dassie,J.P.,et al.(2009),Nat Biotechnol27,839-849,Sica,A.,Schioppa,T.,Mantovani,A.,and Allavena,P.(2006),Eur J Cancer42,717–727)。最近,报导已指出肿瘤周遭微环境与肿瘤进展(尤其是免疫侵袭)有强烈相关性(Pollard,J.W.(2004),Nat RevCancer4,71-78,de Visser,K.E.,and Coussens,L.M.(2006),Contrib Microbiol13,118-137,Stewart,T.J.,and 25Abrams,S.I.(2008),Oncogene27,5894-5903,Joyce,J.A.,andPollard,J.W.(2009),Nat Rev Cancer9,239-252)。
数种细胞类型已被提出在肿瘤微环境中扮演关键角色并且参与肿瘤进展,包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、调节性T细胞(Treg)、天然杀手(NK)细胞以及CD8+T细胞(Solinas,G.,Germano,G.,Mantovani,A.,and Allavena,P.(2009),JLeukoc Biol86,1065-1073,Zou,W.(2006),Nat Rev Immunol6,295-307,Whiteside,T.L.(2006),Cancer TreatRes130,103-124,Coffelt,S.B.Hughes,R.,and Lewis,C.E.(2009),Biochim BiophysActa1796,11-18)。NK以及CD8+T细胞是通过细胞媒介的细胞毒性来消灭异常肿瘤细胞的两种主要有效细胞类型。Treg细胞代表整个CD4+T细胞的一小部分(5-6%)(Wang,R.F.,Peng,G.,and Wang,H.Y.(2006),Semin Immunol18,136-142),而且在肿瘤微环境中是另一种主要调节性细胞类型。在正常环境下,Treg细胞保护宿主免于自身反应性T细胞,因而预防自体免疫疾病形成(Corthay,A.(2009),Scand JImmunol70,326-336)。但是,在肿瘤微环境中,Treg可分泌诸如IL-10与TGF-β的细胞激素来抑制肿瘤靶定内生性(NK细胞)与顺应性(CD8+T细胞)免疫反应的功能(Bingle,L.,Brown,N.J.,andLewis,C.E.(2002),J Pathol196,254-265)以及保护肿瘤细胞免于免疫清除(Andrew,G.et al.(2006),J Immunol177,896-904)。
可在肿瘤微环境中下调免疫系统的一种蛋白质受体是细胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA-4),也已知是分化群152(CD152)。CTLA-4是在T细胞表面上被发现到,而T细胞会针对抗原发动细胞免疫攻击。T细胞可以通过刺激T细胞上的CD28受体而被活化,其亦可通过刺激CTLA4受体而被抑制。
虽然抗体通常使用于靶定疾病蛋白质,但它们有自己的限制性,包括生产成本高、稳定性低,且在许多情况下对它们能够靶定的表位有所限制。适体拥有许多使其适用于治疗应用的优点,诸如分子量较低而容许更容易穿透过组织、化学合成成本低、修饰方法已建立以及高稳定性。因此,开发出对某个目标蛋白质具有高亲和力的适宜适体有极大利益。
发明内容
本发明内容至少一部分是基于意外发现,靶定CTLA-4(CA21)的核苷酸适体在同系小鼠模型中成功地压制肺肿瘤细胞生长达超过70%。
因此,本发明内容的一个态样是特征为一种结合至CTLA-4的核酸适体。该适体包含与(i)GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT(SEQ ID NO:1)、(ii)GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA(SEQ ID NO:6)、(iii)GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA(SEQ ID NO:7),或(iv)CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA(SEQ ID NO:8)至少85%(例如90%或95%)一致的核酸序列。此一抗CTLA-4适体可以低于20nM的解离常数(Kd)结合至CTLA-4。在一个实例中,该抗-CTLA4适体包含GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT(SEQ ID NO:1)、GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA(SEQ ID NO:6)、GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA(SEQ ID NO:7),或CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA(SEQ ID NO:8)的核酸序列。此一抗-CTLA4适体可为具有TCCCTACGGCGCTAACGATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGTGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO:2)、TCCCTACGGCGCTAACGATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTAGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO:3)、TCCCTACGGCGCTAACGTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTAGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO:4),或TCCCTACGGCGCTAACCGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTAGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO:5)的核酸。
本文所述任一种抗-CTLA-4适体可与聚乙二醇(PEG)接合,聚乙二醇可具有范围自30kDa至50kDa的分子量,例如40kDa。在一些实例中,PEG接合至该适体的3’端。
在另一个态样中,本发明内容提供一种医药组成物,其包含本文所述任一种抗-CTLA-4适体以及医药上可接受的载剂。
在又另一个态样中,本发明内容提供一种治疗癌症(例如肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌,或肾细胞癌)的方法,该方法包含向有需要的个体投与(例如静脉内)有效量的如本文所述任一种医药组成物,其包含亦如本文所述的抗-CTLA-4适体。
在一些实例中,受到本文所述方法治疗的个体为人类患者,例如患有癌症、怀疑患有癌症或处于癌症风险下的人类患者。
此外,本揭示内容是特征为一种在个体体内增进免疫活性的方法,该方法包含向有需要的个体投与(例如静脉内)有效量(例如足够增加T细胞活化之量)的本文所述任一种医药组成物,其包含亦如本文所述的抗-CTLA-4适体。在一些实例中,该个体可以是患有癌症(例如肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌,或肾细胞癌)、怀疑患有癌症或处于癌症风险下的人类患者。在其他实例中,该患者为患有或怀疑患有HIV感染的人类患者。
亦落在本发明内容范畴中的是(a)用于治疗癌症(例如肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌,或肾细胞癌)或HIV感染的医药组成物,其中该医药组成物包含如本文所述的抗-CTLA-4核酸适体(例如包含与(i)GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT(SEQ ID NO:1)、(ii)GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA(SEQ ID NO:6)、(iii)GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA(SEQ ID NO;7),或(iv)CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA(SEQ ID NO:8)至少85%(例如90%或95%)一致的核酸序列的核酸)以及医药上可接受的载剂,以及(b)CTLA-4适体用于制造供治疗癌症(例如肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌,或肾细胞癌)或HIV感染之药物的用途。
本发明的一或多个具体例的详细内容列于下面的说明中。本发明的其他特征或益处将因为下列图式与数个具体例的详细说明,还有因为随附权利要求而清楚。
附图说明
图1包括显示通过SELEX进化而结合亲和力增加的图。A区是显示在各种浓度下适体对CTLA-4的结合活性的图。针对CTLA-4的第4、8、12、16回合中的适体池经扩增并且自500nM起连续稀释2倍。通过与经CTLA-4转染的野生型293T细胞培养,针对每一选定池分析十个剂量点。结合的适体是通过RT-qPCR定量。结果显示于A区的XY图中。圆圈表示第4回合的结果、矩形表示第8回合的结果、指向上方的三角形表示第12回合的结果而反向三角形表示第16回合的结果。虚线表示各个池的拟合曲线。第4、8、12、16回合的解离常数分别为120.7nM、24nM、8.8nM与6.6nM。
B-I区显示对表现在野生型293T细胞上的CTLA-4的适体结合活性的FACS分析图。SELEX第4、8、12及16回合的适体池是通过PCR而被AlexaFluor 647标记。经标记适体与野生型293T细胞(B、C、D与E区)或经CTLA-4转染的野生型293T细胞(F、G、H、I区)一起培育。使用流式细胞仪来评估结合信号。B、C、D与E区显示野生型293T细胞的结果,而F、G、H与I区显示经转染293T细胞的结果。
图2显示通过SELEX进化筛选出的适体的CTLA-4结合活性的图。A区与B区为FACS分析图,显示选定适体对表现在野生型293T细胞上的CTLA-4的结合活性。A区显示经CTLA-4表现质体转染的293T细胞而B区显示为做为阴性对照的未转染293T细胞。如指明,A区与B区的细胞与10nM经AlexaFluor 647标记的CA7、CA21、CA32及CA82适体一起培育。在洗掉未结合的适体后,通过流式细胞仪测定萤光信号而野生型293T细胞的结果显示于A区中。表现CTLA-4的野生型293T细胞的结果显示于B区中。C、D、E与F区分别显示适体CA7、CA21、CA32与CA82的CTLA-4结合亲和力。选出四个适体并特征鉴定其对CTLA-4表现细胞的结合亲和力。首先合成这些适体并且自250nM起连续稀释2倍。在选定池与稳定表现CTLA-4的293细胞培育之后分析六个剂量点。CA7、CA21、CA32与CA82的解离常数分别为51.48m M、11.84nM、61.75nm与36.51nM。
图3包括显示在A区中抗-CTLA-4适体的序列,以及在B区中抗-CTLA-4适体CA21的预测二级结构的图。在A区的CA21的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)中,底线G残基指出形成G-四股螺旋结构的可能位置。5’端与3’端的16个灰色核苷酸指出5’引子区及3’引子区。依据Mfold决定的CA21二级结构显示于B区中,而这个结构的ΔG为-10.6。
图4包括显示抗-CTLA-4适体CA21的抗癌效用的图。A区是显示于同系小鼠模型中,单次注射CA21寡核苷酸压制TC-1细胞的肺肿瘤生长的图。小鼠TC-1肺癌细胞(3x105)皮下植入至C57BL/6小鼠体内。当肿瘤的短轴达到8mm时,将0.3nmole CA21(于PBS中)或对照PBS注入小鼠的腹膜空间内。注射日记录为第0天且每周测量肿瘤尺寸两次。相较于适体CA21治疗(参见A区中的下排肿瘤),在对照组中大略观察到数个组织反应(参见A区中的上排肿瘤)。B区是显示对照小鼠与经CA21治疗的小鼠的肿瘤体积平均值的图。C区是显示经CA21治疗的小鼠与经PBS治疗的小鼠的肿瘤生长率的图。通过公式(LxD2)/2计算肿瘤尺寸,其中L为长直径,而D为短直径。D区是显示经CA21或PBS治疗的小鼠的体重的图。E区是显示CA21对TC-1细胞生长的活体外抑制活性的图。
图5包括显示抗-CTLA-4适体CA21在同系小鼠模型中对CT26结肠癌细胞的抗癌效用的图。A区显示皮下注射CT26结肠癌细胞的BALB/c小鼠的肿瘤体积。在肿瘤达到8mm后,于第4、6、8与10天将0.3nmole CA21(于PBS中)(矩形)或对照PBS(圆圈)注入小鼠的腹膜空间内。CT26细胞注射日纪录为第0天,且每周测量肿瘤尺寸三次。图显示经抗-CTLA-4适体CA21治疗的小鼠的肿瘤体积减少大约70%。B区显示经对照PBS治疗的C57BL/6小鼠的肿瘤(参见B区的上排肿瘤)或经CA21适体治疗的C57BL/6小鼠的肿瘤(参见B区的下排肿瘤)。
图6包括显示抗-CTLA-4适体C21在同系小鼠模型中对路易士(Lewis)肺癌细胞的抗癌效用的图。A区显示皮下注射路易士肺癌细胞的C57B/6小鼠的肿瘤体积。在肿瘤达到8mm后,于第4、6、8、10与12天将0.3nmole CA21(于PBS中)(矩形)或对照PBS(圆圈)注入小鼠的腹膜空间内。路易士肺细胞注射日纪录为第0天,且每周测量肿瘤尺寸三次。图显示经抗-CTLA-4适体CA21治疗的小鼠的肿瘤体积减少大约50%。B区显示经对照PBS治疗的C57BL/6小鼠的肿瘤(参见B区的上排肿瘤)或经CA21适体治疗的C57BL/6小鼠的肿瘤(参见B区的下排肿瘤)。
图7是显示CA21适体与聚乙二醇化CA21适体(CA21-PEG)在同系小鼠模型中通过静脉内注射对路易士肺癌细胞的抗癌效用的比较图。图显示皮下注射路易士肺癌细胞的C57B/6小鼠的肿瘤体积。在肿瘤达到8mm后,将0.3nmole CA21(于PBS中)(矩形)、0.3nmoleCA21-PEG(于PBS中)(三角形)或对照PBS(圆圈)经由尾静脉注射静脉内注入小鼠。路易士肺细胞注射日纪录为第0天,且每周测量肿瘤尺寸两次。图显示,相较于CA21适体,经聚乙二醇化CA21适体(CA21-PEG)治疗的小鼠的肿瘤体积减少约50%。
具体实施方式
发明的详细说明
本发明内容是以下列为基础:开发特异地结合并抑制CTLA-4的核酸适体(例如CA21)且意外发现此核酸适体在同系小鼠模型中成功地压制癌细胞生长达超过70%。该抗-CTLA4适体治疗不会影响小鼠体重,暗示该适体大体上无毒。因此,诸如CA21的抗-CTLA-4适体将有效增进免疫活性并减低癌症生长。
因此,本文描述诸如CA21的抗-CTLA-4适体、包含抗-CTLA-4适体的医药组成物,以及使用本文揭示的抗-CTLA-4适体来增进免疫活性及/或治疗诸如癌症与HIV感染的疾病的方法。
抗-CTLA-4核酸适体
本文描述结合至CTLA-4并抑制其活性的核酸适体(抗-CTLA-4适体),从而增进免疫活性(诸如T细胞活性)。如本文所用核酸适体意指一种对特定目标分子(例如CTLA-4)具有结合活性并因而抑制其活性的核酸分子(DNA或RNA)。本揭示内容的抗-CTLA-4适体呈线性或环状形式,可以是RNA、DNA(例如单股DNA)、经修饰核酸,或其混合物。该抗-CTLA-4适体可以是非天然分子(例如含有不存在于天然基因中的核苷酸序列或含有自然界中不存在的经修饰核苷酸)。或者或另外,该抗-CTLA-4适体可不含有编码功能性肽的核苷酸序列。
CTLA-4,称为细胞毒性T淋巴球相关蛋白4(也已知为CD152),是一种表现在T细胞上的受体,其反向地调控T细胞活性。举例而言,人类CTLA-4的胺基酸序列是依据GenBank登录编号AAH69566所提供。
在一些具体例中,本文揭示的抗-CTLA-4核酸适体可包含与5’-GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT-3’(SEQ ID NO:1)至少70%(例如80%、85%、90%、95%或98%)一致的核苷酸序列。在一些实例中,本文揭示的抗-CTLA-4核酸适体可包含与SEQ ID NO:1的核酸序列至少85%一致的核苷酸序列。在一些实例中,该抗-CTLA-4适体包含5’-GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT-3’(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列。在一个具体实例中,该抗-CTLA-4适体由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成。
在一些具体例中,本文揭示的抗-CTLA4核酸适体可包含与下列序列的粗体区至少70%(例如80%、85%、90%、95%或98%)一致的核苷酸序列:
(а)TCCCTACGGCGCTAAC GCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO:3);
(b)TCCCTACGGCGCTAAC GCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO:4);或
(c)TCCCTACGGCGCTAAC GCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO:5)。
在一些实例中,本文揭示的抗-CTLA-4核酸适体可包含与SEQ ID NO:3、4或5的核酸序列至少85%一致的核苷酸序列。在一些实例中,该抗-CTLA-4适体包含SEQ ID NO:3、4或5的核苷酸序列,或其中的粗体区。在一个具体实例中,该抗-CTLA-4适体由SEQ ID NO:3、4或5的核苷酸序列,或其中呈粗体区组成。
两个核酸的”百分率同一性”是使用Karlin and AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的演算法,经如在Karlin and AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中所修改来决定。此一演算法并入Altschul,et al.J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST及XBLAST程序(第2.0版)中。BLAST核苷酸研究可以使用NBLAST程序进行,计分=100,字长=12,获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。若两个序列之间存在空位,则可如Altschul et al.,Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402,1997中所述使用Gapped BLAST。当采用BLAST及GappedBLAST程序时,可使用个别程序(例如XBLAST及NBLAST)的预设参数。
在其他具体例中,相比于5’-GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT-3’(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列,本文所述抗-CTLA-4适体可包含至多8个(例如至多7、6、5、4、3、2或1个)核苷酸变异。能引入此等变异的位置是可以依据例如CA21的二级结构(其包含参考核苷酸序列)来决定(参见图3B)。
在一些实例中,抗-CTLA-4适体在5’端、3’端或两端可包含引子位点。在一个实例中,该抗-CTLA-4适体具有TCCCTACGGCGCTAACGATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGTGCCACCGTG CTACAAC-3’(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列,其中底线/斜体旁侧序列意指5’及3’引子位点。亦参见SEQ ID NO:3、4或5的非粗体区。
本文揭示的任一种抗-CTLA-4适体可含有至多200个核苷酸(nt),例如150个nt、100个nt、80个nt、70个nt、60个nt、50个nt、40个nt或30个nt。在一些实例中,该抗-CTLA-4适体可含有范围自30-150nt、30-100nt、30-80nt、30-70nt、30-60nt、30-50nt或30-40nt的核苷酸。
在一些具体例中,本文所述抗-CTLA-4适体以低于20nM(例如15nM、10nM、5nm、1nm,或更低)的解离常数(Kd)结合至CTLA-4(例如人类CTLA-4)。该抗-CTLA-4适体可特异地结合人类CTLA-4。或者,该适体可结合至来自不同物种(例如人类及小鼠)的CTLA-4分子。当结合至表现在T细胞表面上的CTLA-4分子时,此一适体可抑制CTLA-4的活性达至少20%(例如40%、50%、80%、100%、2-倍、5-倍、10-倍、100-倍,或1,000-倍)(因而增加T细胞活性)。抗-CTLA-4适体对CTLA-4的抑制活性(以及因而活化增进T细胞活性)可以通过例如下面实例中所述彼等来测定。
在一些具体例中,本文所述抗-CTLA-4适体可含有非天然核碱基、糖,或共价核苷间键结(骨架)。此一经修饰寡核苷酸赋予期望特性,诸如细胞摄入提高、对目标核酸的亲和力增进,以及活体内稳定性增加。
在一个实例中,本文所述适体具有经修饰的骨架,包括彼等保有磷原子者(参见例如美国专利第3,687,808号;第4,469,863号;第5,321,131号;第5,399,676号;以及第5,625,050号),与彼等不具有磷原子者(参见例如美国专利第5,034,506号;第5,166,315号;以及第5,792,608号)。含磷经修饰骨架的实例包括,但不限于具有3’-5’键接或2’-5’键接的硫代磷酸酯、对掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、膦酸甲基酯与其他膦酸烷基酯(包括3’-膦酸伸烷基酯、5’-膦酸伸烷基酯与对掌性膦酸酯)、亚磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidates)(包括3’-胺基磷酰胺酯与胺基烷基磷酰胺酯)、硫羰代磷酰胺酯、硫羰代烷基膦酸酯、硫羰代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯,以及硼烷磷酸酯。此等骨架也包括彼等具有相反极性者,亦即3’至3’、5’至5’或2’至2’键接。不包括磷原子的经修饰骨架是由短链烷基或环烷基核苷间键结、混合型杂原子与烷基或环烷基核苷间键结或一或多个短链杂原子或杂环核苷间键结所形成。此等骨架包括彼等具有吗啉基键结者(部分由核苷的糖部分所形成);硅氧烷骨架;硫化物、亚砜和砜骨架;甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基骨架;亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架;核糖乙酰基骨架;含烯骨架;胺基磺酸酯骨架;亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架;磺酸酯和磺酰胺骨架;酰胺骨架;以及其他具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。
在另一个实例中,本文所述适体包括一或多个经置换糖部分。此等经置换糖部分可在其2’位置处包括下列基团之一:OH;F;O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基;O-炔基、S-炔基、N-炔基及O-烷基-O-烷基。在这些基团中,烷基、烯基及炔基可以是未经置换或经置换C1至C10烷基或C2至C10烯基与炔基。它们也可以在其2’位置处包括杂环烷基、杂环烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、经置换硅烷基、RNA切割基团、报导子基团、嵌入剂、增进寡核苷酸之药动学特性的基团,或增进寡核苷酸之药效学特性的基团。较佳的经置换糖部分包括彼等具有2’-甲氧基乙氧基、2’-二甲基胺基氧基乙氧基,及2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基者。参见Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504。
或者或另外,本文所述适体包括一或多个经修饰天然核碱基(亦即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。经修饰核碱基包括彼等描述于美国专利第3,687,808号中者。The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990、Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613,以及Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,AntisenseResearch and Applications,pages 289-302,CRC Press,1993。这些核碱基中的某一些尤其适用于增加适体分子对其目标位点的结合亲和力。这些包括5-经置换的嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6与O-6经置换嘌呤(例如2-胺基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶与5-丙炔基胞嘧啶)。参见Sanghvi,et al.,eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)。
任一种本文所述适体可通过现有方法制备,例如化学合成或活体外转录。如本文所述,其所期望的生物活性可经例如彼等描述于下面实例中者来进行验证。用于表现任一种抗-CTLA-4适体的载体也落在本发明内容的范畴内。
本文所述任一种适体可经由共价键结、非共价键结或两者接合至一或多个聚醚部分,诸如聚乙二醇(PEG)部分。因此,在一些具体例中,本文所述适体经聚乙二醇化。本揭示内容不是要限制特定分子量的PEG部分。在一些具体例中,聚乙二醇部分具有范围自5kDa至100kDa、10kDa至80kDa、20kDa至70kDa、20kDa至60kDa、20kDa至50kDa,或30kDa至50kDa的分子量。在一些实例中,PEG部分具有40kDa的分子量。接合至本文所述抗-CTLA-4适体的PEG部分可以是线性或具分支。其可接合至核酸适体的5’端、适体的3’端或两端。若需要的话,PEG部分可以共价接合至核酸适体的3’端。
将PEG部分接合至核酸的方法为技艺中已知且先前已描述于例如PCT公开案第WO2009/073820号中,其相关教示以引用的方式并入本文中。应理解,本文所述接合PEG的核酸适体以及用于将PEG接合至核酸适体的方法为例示性且无意具限制性。
本揭示内容也提供本文所述任一种抗-CTLA-4核酸适体的二聚体。在一些具体例中,抗-CTLA-4适体二聚体包含两个通过适当聚合物部分连接的抗-CTLA-4适体,适当聚合物部分可为如本文所述彼等PEG部分。在二聚体中,两个适体的一者或两者可包含SEQ IDNO:1-2的核苷酸序列。或者,在二聚体中,两者适体的一者或两者可包含SEQ ID NO:3、4或5的核苷酸序列或其中粗体区。两个抗-CTLA-4适体可相同或不同。例如,抗-CTLA-4适体的一者或两者可包含(SEQ ID NO:1)。在另一个实例中,如本文所述抗-CTLA-4适体二聚体可具有一个包含(SEQ ID NO:1)的适体以及另一个包含(SEQ ID NO:2)的适体。
在一些具体例中,本文提供的任一种抗-CTLA-4适体二聚体的聚合物部分为PEG,其可具有如本文所述的分子量。
在一些具体例中,本文提供的抗-CTLA-4适体二聚体包含经由连接子连接至聚合物部分的适体。在一个实例中,第一适体经由连接子连接至聚合物部分。在另一个实例中,第二适体经由连接子连接至聚合物部分。在又另一个实例中,第一适体及第二适体是经由连接子连接至聚合物部分。“连接子”如本文所用,意指连接两个分子或部分的化学部分。在一些实例中,连接子包含一或多个核苷酸,其可为去氧核糖核苷酸。在一些实例中,核酸连接子长度为1至50个核苷酸。此等连接子长度可为1至5、1至10、1至15、1至20、1至30、1至40、10至15、10至20、10至30、10至40、10至50、20至30、20至40、20至50、30至40、30至50,或40至50个核苷酸。在一些实例中,连接子长度为11个核苷酸。连接子可包含腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及/或鸟嘌呤(U)。在一些实例中,连接子包含聚T(polyT)片段。「聚T片段」意指2个或更多个连续胸腺嘧啶(T)核苷酸残基的延伸物。例如,聚T连接子可包含2至50个T残基。在一些实例中,聚T连接子长度为2至40、2至35、2至30、2至25、2至20、5至15,或10至15个核苷酸。在一些具体例中,聚T连接子包含11个连续胸腺嘧啶(T)核苷酸。
医药组成物
如本文所述任一种抗-CTLA-4适体或PEG接合物可与医药上可接受的载剂混合而形成医药组成物用来治疗目标疾病。“可接受”表示载剂必须与组成物的活性成分相容(且较佳能够稳定活性成分)并且对于待治疗个体无害。医药上可接受的赋形剂(载剂)包括技艺中所熟知的缓冲剂。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。
使用于本发明方法中的医药组成物可包含医药上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂,呈冻干调配物或水溶液的形式。参见例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量与浓度下对接受者来说无毒,且可包含缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐与其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸与甲硫胺酸;防腐剂(诸如十八烷基二甲基芐基氯化铵;氯化六甲双铵;氯化芐二甲烃铵、氯化本索宁;苯酚、丁基或芐基醇;对羟苯甲酸烷基酯,诸如对羟苯甲酸甲基酯或对羟苯甲酸丙基酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;及m-甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;胺基酸,诸如甘胺酸、麸酰胺酸、天冬酰胺酸、组胺酸、精胺酸,或离胺酸;单糖、双糖,及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖;螯合剂,诸如EDTA;糖,诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成盐相对离子,诸如钠;金属复合物(例如Zn-蛋白复合物);及/或非离子性界面活性剂,诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实例中,本文所述医药组成物包含含有CTLA-4结合适体(或带有该适体的核苷酸序列的载剂)的脂质体,其可通过下列方法制备,诸如彼等描述于Epstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985);Hwang,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980);以及U.S.专利第4,485,045号与第4,544,545号中者。具有循环时间提高的脂质体揭示于美国专利第5,013,556号中。尤其适用的脂质体可以使用含有磷脂酰胆碱、胆固醇与PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组成物通过逆相蒸发法来生成。脂质体被挤压穿过具有限定孔隙之过滤器,以产生具有期望直径的脂质体。
抗-CTLA-4适体亦可陷入于制备的微胶囊中(例如分别通过凝聚技术或通过介面聚合作用(例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊)、于胶体药物投递系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、奈米颗粒及奈米胶囊)中或巨乳液中。此等技术为技艺中所熟知,参见例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy20th Ed.Mack Publishing(2000)。
在其他实例中,本文所述医药组成物可调配成持续释放形式。持续释放制品的适当实例包括含有抗-CTLA-4适体的固体疏水性聚合物的半通透性基质,该基质是呈有形物品的形式(例如薄膜或微胶囊)。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯),或聚(乙烯基醇)、聚乳酸(美国专利第3,773,919号)、L-麸胺酸与7-麸胺酸乙基酯的共聚物、非可分解性乙烯-乙酸乙烯酯、可分解性乳酸-乙醇酸共聚物(诸如LUPRONDEPOTTM(乳酸-乙醇酸共聚物和柳菩林组成的可注射微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯,及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
使用于活体内投与的医药组成物必须是无菌的。这是通过例如滤过无菌过滤膜而轻易达到。治疗性抗-CTLA-4适体组成物可以放置在具有无菌出入口的容器(例如静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头穿刺的挡塞的小瓶)中。
本文所述医药组成物可以呈诸如锭剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒、溶液或悬浮液,或栓剂的单位剂型,供用于经口、非经口或直肠投与,或是通过吸入或吹入投与。
关于制备固体组成物(诸如锭剂),主要活性成分可与医药载剂混合以形成含有本发明化合物的均质混合物的固体预调配组成物,或其医药上可接受的无毒盐,医药载剂为例如习知制锭成分,诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶,以及其他医药稀释剂,例如水。当提到这些预调配组成物为均质时,表示活性成分平均分散在组成物中,使得组成物可容易分成等效单位剂型,诸如锭剂、丸剂与胶囊。此固体预调配组成物接而被分成上述类型的单位剂型,含有0.1至约500mg本发明活性成分。新颖组成物的锭剂或丸剂可经包覆或以其他方式经化合而提供给予延长作用益处的剂型。例如,锭剂或丸剂可包含内剂量组分以及外剂量组分,后者呈包覆前者的包衣形式。两种组分可被在胃中耐受崩解并允许内组分完整通过进入十二指肠或延迟释放的肠衣层所分隔。此肠衣层或包衣可使用各种材料,诸如包括一些聚合酸及聚合酸与如虫胶、十六醇及乙酸纤维素的材料的混合物。
适当表面活性剂尤其包括非离子性试剂,诸如聚氧乙烯山梨糖醇(例如TweenTM20、40、60、80或85)以及其他山梨糖醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组成物将习知地包含0.05%与5%间的表面活性剂,且可介于0.1%与2.5%。应理解,若需要的话可添加其他成分,例如甘露糖醇或其他医药上可接受媒剂。
可使用商业可购得脂质乳液来制备适当乳液,脂质乳液为诸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM。活性成分可溶解于预先混合的乳液组成物中或者其可溶解于油(例如大豆油、葵花油、棉仔油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中,在与磷脂(例如蛋磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合之后形成乳液。应理解,可添加其他成分来调整乳液的张力,其他成分为例如甘油或葡萄糖。适当乳液通常含有至多20%的油,例如5%与20%之间。脂质乳液可包含脂质小滴,介于0.1与1.0μm之间,尤其是0.1与0.5μm之间,并具有范围在5.5至8.0的pH。
乳液组成物可以是彼等通过将抗-CTLA-4适体与IntralipidTM或其组分(大豆油、蛋磷脂、甘油与水)混合来制备。
用于吸入或吹入的医药组成物包括于医药上可接受水性或有机溶剂或其混合物中的溶液及悬浮液,及粉剂。液体或固体组成物可含有上列适当医药上可接受的赋形剂。在一些具体例中,用于局部或全身性效用的组成物是通过经口或鼻呼吸路径投与。
较佳于无菌医药上可接受溶剂中的组成物可以通过使用气体而被雾化。可直接从喷雾装置吸入雾化溶液或可将喷雾装置附接到面罩、遮棚或间歇式正压呼吸器。溶液、悬浮液或粉剂组成物较佳经口或经鼻自以适当方式递送调配物的装置被投与。
治疗方法
本文所述任一种抗-CTLA-4适体(包括PEG接合物)可用来增进免疫活性,尤其是T细胞活性,从而有效治疗癌症或诸如病毒性(例如HIV)感染或细菌性感染的传染病。
为实施本文揭示的方法,有效量之含有至少一种抗-CTLA-4适体的本文所述医药组成物可经由适当途径被投与给有治疗需要的个体(例如人类),适当途径为诸如静脉内投与(例如团注(bolus))或经由连续输注一段时间、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、吸入或局部路径。用于液体调配物的商用喷雾器包括可用于投与的喷射喷雾器以及超音波喷雾器。液体调配物可直接被雾化而冻干粉末可以在还原之后被雾化。或者,如本文所述含有抗-CTLA-4适体的组成物可使用氟碳调配物及计量剂量吸入器被气溶胶化,或者如冻干且研磨粉剂被吸入。
如本文所用,“有效量”意指各个活性剂对个体赋予治疗效用所需的量,不论是单独或与一或多种其他活性剂组合。在一些具体例中,治疗效用为降低肿瘤负荷、减少癌细胞,或增加免疫活性。决定何量CTLA-4结合适体达到治疗效用对于习于技艺者来说将会是明显的。如技艺中具有通常技术者所认知,有效量会改变,取决于待治疗的特定病况、病况的严重性、个别患者参数(包括年龄、身体状况、身高、性别与体重)、治疗持续时间、同时治疗(若有的话)的特性、特定投与路径及健康从业人员知识与专业内的类似因素。这些因素为技艺中彼等具有通常技术者所熟知且可在不超出惯常实验的情况下获得处理。通常较佳为使用个别组分或其组合的最大剂量,其依据周全医学判断为最高安全剂量。
经验上的考量(诸如半衰期)通常影响剂量的决定。可决定投与频率并随着治疗过程而调整,且大体上(但非必须)是基于治疗及/或压制及/或改善及/或延迟目标疾病/病症。或者,CTLA-4结合适体的持续连续释放调配物可能是适合的。用于达到持续释放的各种调配物及装置在技艺中是熟知的。
在一个实例中,如本文所述抗-CTLA-4结合适体在个体中的剂量可以按经验来决定,该等个体经给予一或多次CTLA-4结合适体投与。给予个体渐增剂量的拮抗剂。为评估拮抗剂的效力,可追踪疾病/病症的指标。
大体上,就投与任一种本文所述抗-CTLA-4适体来说,初始候选剂量可为约2mg/kg。就本发明内容的目的而言,典型日剂量范围可为约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg,至30mg/kg至100mg/kg或更多中任一者,取决于上述因子。就重复投与超过数日或更久,持续治疗直到期望发生症状压抑或直到达到充分治疗程度以减轻目标疾病或病症或其症状为止,端视病况而定。例示性给药方案包含投与约2mg/kg的初始剂量,接着每周约1mg/kgCTLA-4结合适体的维持剂量,接着每隔一周约1mg/kg的维持剂量。但是,其他剂量方案亦可行,取决于从业人员希望达到的药动学衰退型态而定。例如,预计一周给药一至四次。在一些具体例中,可采用范围自约3μg/mg至约2mg/kg(诸如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg,及约2mg/kg)的给药。在一些具体例中,给药频率为为每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周,或每10周一次;或每个月、每2个月,或每3个月或更久一次。此疗法的进程可简单地通过现有技术及分析进行监控。给药方案(包括所用CTLA-4结合适体)可随着时间而有所改变。
在一些具体例中,就具有正常体重的成人患者来说,可投与范围自约0.3至5.00mg/kg的剂量。具体剂量方案(亦即剂量、时间安排及重复)将取决于特定个体以及个体病史,还有个别药剂的特性(诸如药剂半衰期,以及其他在技艺中所熟知的考量因素)。
就本发明内容的目的,如本文所述CTLA-4结合适体的适当剂量将取决于特定CTLA-4结合适体、特定CTLA-4结合适体、疾病/病症类型与严重性、CTLA-4结合适体是出于预防或治疗目的而投与、先前疗法、患者的临床病史以及对拮抗剂的反应,和参与临床医师的斟酌而定。临床人员可投与CTLA-4结合适体直到达到期望结果的剂量。在一些具体例中,期望结果为肿瘤负荷降低、癌细胞减少或免疫活性增加。决定剂量是否造成期望结果的方法对于习于技艺者来说是明显的。可连续或间歇投与一或多个CTLA-4结合适体,取决于例如接受者的生理状况、投与目的为治疗或预防,以及其他习于技艺的操作人员所熟知的因素。投与CTLA-4结合适体基本上可为在预选时间段里连续或者是呈连续间隔剂量,例如在目标疾病或病症长成之前、期间或之后。
如本文所用,术语“治疗”意指对个体施用或投与包括一或多种活性剂的组成物,该个体患有目标疾病或病症、该疾病/病症的症状,或有罹患该疾病/病症的倾向,目的是要治愈、治疗、减轻、缓解、改变、治疗、改善、增进或影响病症、疾病症状,或罹患该疾病或病症的倾向。
减轻目标疾病/病症包括延迟疾病生成或进展,或降低疾病严重性。减轻疾病不一定需要治疗结果。如本文所用,“延迟”目标疾病或病症生成表示推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定/或延缓疾病的进展。这个延迟可以是时间长度的改变,取决于待治疗疾病及/或个体的病史而定。“延迟”或减轻疾病长成,或延迟疾病发生的方法是当与未使用该方法相比时,在一个给定时间框内降低生成该疾病的一或多个症状的可能性及/或在给定时间框内降低症状程度的方法。此等比对通常是基于临床研究,使用一些足以提供统计上显著结果的个体。
疾病的“生成”或“进展”表示疾病的初始病征及/或后续进展。可使用如技艺中所熟知的标准临床技术来侦测并评估疾病的生成。但是,生成也意指不能被侦测到的进展。就本发明内容的目的,生成或进展意指症状的生物过程。“生成”包括发生、复发与出现。如本文所用,目标疾病或病症的“出现”或“发生”包括起初出现及/或复发。
在一些具体例中,本文所述CTLA-4结合适体呈在活体内足以降低肿瘤负荷或癌细胞生长、或HIV增生达至少5%(例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)的量被投与给有治疗需要的个体。在其他具体例中,CTLA-4结合适体呈有效降低CTLA-4活性位准达至少5%(例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)的量被投与。在其他具体例中,CTLA-4结合适体呈有效增加免疫活性达至少5%(例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)的量被投与。
医学领域中彼等具有通常技术者所熟知的习知方法可用来将医药组成物投与给个体,取决于待治疗疾病类型或疾病部位而定。这个组成物也可以经由其他现有路径被投与(例如经口、非经口、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、颊内、阴道或经由植入贮器投与)。术语“非经口”如本文所用包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输注技术。此外,可经由可注射贮器投与路径投与给个体,诸如使用1-、3-或6-个月贮器可注射或生物可分解材料及方法。在一些实例中,医药组成物经眼内或经玻璃体内投与。
可注射组成物可含有各种载剂,诸如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇,及多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇,与类似物)。关于静脉内注射,可通过滴注方法投与水溶性CTLA-4结合适体,从而输注含有CTLA-4结合适体及生理学上可接受赋形剂的医药调配物。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5%右旋糖、0.9%食盐水、林格氏溶液或其他适当赋形剂。肌肉内制品(例如适当可溶盐形式之CTLA-4结合适体的无菌调配物)可溶解于诸如注射用水、0.9%食盐水或5%葡萄糖溶液的医药赋形剂中并在其中被投与。
在一个具体例中,经由部位特异性或靶定局部投递技术来投与CTLA-4结合适体。部位特异性或靶定局部投递技术的实例包括具有CTLA-4结合适体的各种可植入贮器来源或局部投递导管,诸如输注导管、留置导管或针头导管、合成移植物、外包套、分流器及支架或其他可植入装置、部位特异性载剂、直接注射或直接施用。参见例如PCT公开案第WO 00/53211号及U.S.专利第5,981,568号。
亦可以使用含有反义聚核苷酸、表现载体或次基因体聚核苷酸的治疗性组成物的靶定递送。接受体媒介的DNA递送技术描述于例如Findeis et al.,Trends Biotechnol.(1993)11:202;Chiou et al.,Gene Therapeutics:Methods And Applications OfDirect Gene Transfer(J.A.Wolff,ed.)(1994);Wu et al.,J.Biol.Chem.(1988)263:621;Wu et al.,J.Biol.Chem.(1994)269:542;Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655;Wu et al.,J.Biol.Chem.(1991)266:338中。
含有聚核苷酸(例如本文所述CTLA-4结合适体或用于生产该结合适体的载体)的治疗性组成物可在约100ng至约200mg DNA的范围内在基因疗法程序中被投与供局部投与。在一些具体例中,也可在基因疗法程序期间使用浓度范围约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg,及约20μg至约100μg或更多的DNA。
要依据本文所述方法治疗的个体可以是哺乳动物,诸如农场动物、运动动物、宠物、灵长类、马、狗、猫、小鼠及大鼠。在一个实例中,该个体为人类。含有抗-CTLA-4适体的组成物可用于在需要治疗的个体中增进免疫活性,例如T细胞活性。在一些实例中,个体可为患有癌症、怀疑患有癌症或处于癌症风险下的人类患者,癌症为诸如肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌,或肾细胞癌。在其他实例中,个体可以是患有或怀疑患有HIV感染的人类患者。此一患者也可以通过惯常医学实务予以鉴定。
患有目标疾病或病症(例如癌症或诸如HIV感染的病毒性感染或细菌性感染)的个体可以通过惯常医学检验予以鉴定,医学检验为例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超音波。怀疑患有此等目标疾病/病症任一者的个体可能表现出该疾病/病症的一或多种症状。处于该疾病/病症风险下的个体可能是带有与那个疾病/病症有关之一或多个风险因子的个体。此一个体也可以通过惯常医学实务予以鉴定。
在本文所述方法中使用的具体剂量方案(亦即剂量、时间安排及重复)将取决于特定个体(例如人类患者)以及个体病史。
在一些具体例中,抗-CTLA-4适体可与另一种适当治疗剂(例如抗癌剂或抗HIV剂)共同使用。或者或另外,抗-CTLA-4适体也可以与其他用来增进及/或补充药剂有效性的药剂组合使用。
目标疾病/病症的治疗效力可以通过例如下面实例中所述方法进行评估。
用于减轻目标疾病的套组
本揭示内容亦提供用于增进免疫活性(例如T细胞活性)、减轻癌症(例如肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌,或肾细胞癌),及/或治疗或降低HIV感染风险的套组。此等套组可包括一或多个含有例如本文所述彼等任一种结合CTLA-4的适体的容器。
在一些具体例中,套组可包含与本文所述方法任一者一致的使用说明。所纳入的使用说明可包含投与如本文所述那些要治疗目标疾病、延迟目标疾病发生,或减轻目标疾病之适体的说明。套组可进一步包含筛选适合治疗之个体的说明,其是基于鉴别个体是否患有目标疾病。在又其他具体例中,使用说明包含向处于目标疾病风险下的个体投与适体的说明。
与使用CTLA-4结合适体有关的使用说明通常包括期望治疗的剂量、给药计画表,以及投与路径的资讯。容器可以是单位剂量、散装(例如多剂量包装)或次单位剂量。在本发明套组中所提供的使用说明通常是标签或包装插页上的书面说明(例如套组中所包括的纸张),但机器可读说明(例如磁性或光学储存碟片上所传达的说明)也是可接受的。
标签或包装插页指明该等组成物是用于治疗癌症相关疾病或病症(诸如本文所述彼等癌症)、延迟癌症相关疾病或病症发生及/或减轻癌症相关疾病或病症。可提供使用说明供实施本文所述任一方法。
本发明套组可以呈适当包装。适当包装包括,但不限于小瓶、瓶、罐、可挠性包装(例如密封麦拉膜(Mylar)或塑胶袋),以及类似物。也预期包装可用于与特定装置组合,特定装置为诸如吸入器,鼻投与装置(例如雾化器)或诸如迷你泵的输注装置。套组可具有无菌出入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头穿刺过的挡塞的小瓶)。容器也可以具有无菌出入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头穿刺过的挡塞的小瓶)。组成物中的至少一种活性剂是如本文所述彼等CTLA-4结合适体。
套组可视情况提供额外组分,诸如缓冲剂或说明资讯。通常,套组包含容器及标签或包装插页在容器上或附接于容器。在一些具体例中,本发明提供制造包含上述套组内含物的物品。
一般性技术
除非另有指明,否则本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的现有技术,其落在技术技能中。Molecular Cloning:ALaboratory Manual,second edition(Sambrook,et al.,1989)Cold Spring HarborPress;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984);Methods in MolecularBiology,Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987);Introduction toCell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell andTissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons;Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.);GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.,eds.,1987);PCR:ThePolymerase Chain Reaction,(Mullis,et al.,eds.,1994);Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRLPress,1988-1989);Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd andC.Dean,eds.,Oxford University Press,2000);Using antibodies:a laboratorymanual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);TheAntibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。
在没有进一步详细阐述的情况下,本领域技术人员可基于以上说明,将本发明利用至其最大程度。因此,下列特定具体例被认为仅是例示说明,在任何方面都对发明内容的其余部分不具限制性。本文引用的全部公开数据以引用的方式并入或作为本文引用的技术现况。
实例1:通过免疫沉淀-SELEX筛选抗-CTLA-4适体
本研究采用指数增富的配体系统性进化(SELEX)方法,其中结合分子是选自于一个大型且多样化的核酸库(DNA或RNA)。参见例如Mol.Cell Biol(Oliphant A.R.,et al.,1989);Science(Tuerk C.et al.,1990);Nature(Ellington A.D.,et al.,1990)。
为增加适体筛选的成功率,采用合并免疫沉淀-SELEX(IP-SELEX)与以细胞为主的SELEX的筛选策略。IP-SELEX可以大幅地降低池(pool)中的非特异性适体,而另一方面,以细胞为主的SELEX可减少无法辨识细胞膜上的目标蛋白质的适体。FOLR-2与CTLA-4分别进行十六个回合的SELEX程序。在第2、3与4回合中使用IP-SELEX,而在其余回合中使用以细胞为主的SELEX。为显示适体池的成功进化,筛选并分析CTLA-4筛选的第4、8、12与16回合适体池。通过与RT-qPCR(如图1,A区中所示)及流式细胞仪(如图1A,B-I区中所示)偶合的总结合分析来测定结合亲和力与特异性。这些数据指出,亲和力与特异性会随着SELEX回合增加而升高。例如,亲和力从120.7nM(第4回合)增加至6.6nM(第16回合)(如图1,A区中所示)。在之后的SELEX回合中成功地降低适体池的非特异性结合(如图1,B-I区中所示)。这些数据暗示,吾人的SELEX程序在筛选高亲和力及特异性适体时充分作用。在16个回合的筛选之后,将适体池定序。
实例2:经分离适体以高亲和力特异地辨识表现CTLA-4的细胞
因为结构稳定性较高,选出经由在实例1中所述方法分离的四个适体(CA7、CA21、CA32与CA82)。通过流式细胞仪分析这四个适体的结合特异性。所有这四个适体特异地辨识表现CTLA-4的细胞,除了CA7对野生型293细胞的非特异性结合信号相对较低以外(图2,A与B区)。这个数据暗示,针对CTLA-4表现细胞的特异性适体被鉴别出。CTLA-4表现细胞的非波形萤光信号(图2,B区)是因为瞬时转染,造成CTLA-4表现位准的大幅变化。这四个适体的结合亲和力亦如图2,C-F区中所示来进行鉴别。
适体CA7、CA32与CA82的核酸序列显示于下。
CA7: (SEQ ID NO:3)
CA32: (SEQ ID NO:4)
CA82: (SEQ ID NO:5)
斜体区意指引子位点而粗体区意指这些抗-CTLA-4适体的核心区。
实例3:CTLA-4拮抗性适体在活体内抑制肿瘤生长
在分析50个经分离CTLA-4适体之后,鉴别出5个辨识CTLA-4上的B7-1与B7-2蛋白结合位点的适体。适体的一CA21与小鼠CTLA-4交叉反应,其被选出在同系小鼠模型中用于肿瘤抑制分析。图3显示CA21适体的序列(图3,A区)及预测二级结构(图3,B区)。
将小鼠TC-1肺癌细胞(3x105)皮下植入至C57BL/6小鼠体内。当肿瘤的短轴达到8mm时,将0.3nmole CA21(于PBS中)或对照PBS注入小鼠的腹膜空间内。注射日记录为第0天且每周测量肿瘤尺寸两次。结果指出,相较于对照PBS治疗对照组,CA21可有效率地抑制肿瘤生长(图4,A区)。监控肿瘤体积历时24天,且肿瘤生长在CA21治疗之后减少达超过70%(图4,B与C区)。相反地,CA21治疗不会影响小鼠体重或活体外的肿瘤细胞增生(图4,D与E区)。这些数据暗示,CA21是通过间接机制来抑制肿瘤细胞生长。
实例4:CTLA-4拮抗性适体在结肠癌的活体内同系小鼠模型中抑制肿瘤生长
使用同系小鼠模型来证实CTLA-4拮抗性适体CA21在活体内对于结肠癌生长的抑制活性。简言之,在第0天将小鼠CT26结肠直肠癌细胞(ATCC CRL-2638)皮下植入至BALB/c小鼠体内(每只小鼠2X105个CT26细胞)。当肿瘤的短轴达到8mm时,将0.3nmole CA21(于PBS中)或对照PBS注入小鼠的腹膜空间内。如图5,A区中所示,CT26细胞同系小鼠在第4、6、8及10天时注射CA21适体(图5,A区;箭头表示注射时间)。每周测量肿瘤尺寸三次。用来计算肿瘤尺寸的公式为(LxD2)/2,其中L为肿瘤的长直径,而D为肿瘤的短直径。相较于以对照PBS治疗之小鼠的肿瘤尺寸,经CA21治疗之小鼠的肿瘤尺寸在肿瘤细胞注射之后第16天减少达约70%(图5,B区)。这些数据指明,CA21适体可用来治疗结肠癌。
实例5:CTLA-4拮抗性适体在肺癌的活体内同系小鼠模型中抑制肿瘤生长
使用同系肺癌小鼠模型来证实CTLA-4拮抗性适体CA21在活体内对于肺癌生长的抑制活性。简言之,在第0天将小鼠路易士肺癌细胞(ATCC,CRL1642)皮下植入至C57BL/6小鼠体内(每只小鼠1X105个路易士肺细胞)。当肿瘤的短轴达到8mm时,将0.3nmole CA21(于PBS中)或对照PBS注入小鼠的腹膜空间内。如图6,A区中所示,路易士肺细胞同系小鼠在第4、6、8、10及12天时注射CA21适体(图6,A区;箭头表示注射时间)。每周测量肿瘤尺寸三次。用来计算肿瘤尺寸的公式为(LxD2)/2,其中L为肿瘤的长直径,而D为肿瘤的短直径。相较于以对照PBS治疗的小鼠的肿瘤尺寸,经CA21治疗的小鼠的肿瘤尺寸在肿瘤细胞注射之后第18天减少达约50%(图5,B区)。这些数据指明,CA21适体可用来治疗肺癌。
实例6:静脉内投与聚乙二醇化CTLA-4拮抗性适体抑制肿瘤生长
于本研究中评估CA21的聚乙二醇化形式(CA21-PEG)在活体内对于癌细胞的抑制活性。
使用马来酰亚胺将CA21适体接合至聚乙二醇(PEG)。为产生CA21-PEG,将20μL的18mM甲酸铵pH 4中的3’-硫醇CA21适体(3nmol)添加至具有分子量为40KDa的30nmol PEG(还原适体对PEG莫耳比为1:5)。混合物在硫醇及马来酰亚胺反应中于37℃下进行混合。1小时后,混合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以分离CA21-PEG,而CA21-PEG是使用标准技术由聚丙烯酰胺凝胶中被萃取出来。所使用的PEG分子量为40KDa,其附接至CA21适体的3’端。
在同系肺癌小鼠模型中通过静脉内投与来测定CA21-PEG的抗癌活性。在第0天将路易士肺癌细胞(ATCC,CRL1642)皮下植入至C57BL/6小鼠体内(每只小鼠1X105个路易士肺细胞)。当肿瘤的短轴达到8mm时,将0.3nmole CA21(于PBS中)、0.3nmole CA21-PEG(于PBS中)或对照PBS的一个剂量注入小鼠的尾静脉内。每周测量肿瘤尺寸两次。用来计算肿瘤尺寸的公式为(LxD2)/2,其中L为肿瘤的长直径,而D为肿瘤的短直径。相较于以CA21治疗的小鼠的肿瘤尺寸,经CA21-PEG治疗的小鼠的肿瘤尺寸在肿瘤细胞注射之后第16天减少达约50%(图7)。这些数据指明,聚乙二醇化CA21适体(CA21-PEG)可通过静脉内投与用来治疗癌症。
其他具体例
此说明书中揭示的所有特征能以任何组合形式加以组合。此说明书中揭示的个别特征可被具有相同、相等或类似特性的替代性特征所取代。因此,除非他处有清楚说明,否则所揭示的个别特征仅为具有相等或类似特征的上位系列实例。
由以上说明,习于技艺者可容易确定本发明的主要特征,且在不偏离其精神与范畴的情况下做出本发明的各种变化与修饰,以使其适用于不同用途及情况。因此,其他具体例也落在权利要求内。
序列表
<110> 中央研究院
<120> 拮抗性CTLA-4适体及其于增进免疫活性的应用
<130> A0988.70056WO00
<140> 尚未分派
<141> 同时随附
<150> US 62/031,406
<151> 2014-07-31
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 1
gatggtgaaa atgggcctag ggtggacggt 30
<210> 2
<211> 62
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<220>
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<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 4
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<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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tccctacggc gctaaccgat cgaaaatgtc cagggagttg tctgtagcca ccgtgctaca 60
ac 62
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gatgactgga tgcaaaaatg ctgtggggta 30
<210> 7
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<210> 8
<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 8
cgatcgaaaa tgtccaggga gttgtctgta 30
Claims (21)
1.一种核酸适体,包含与选自下列组成的群组的核苷酸序列至少85%一致的核酸序列:
(i)GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT(SEQ ID NO:1);
(ii)GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA(SEQ ID NO:6);
(iii)GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA(SEQ ID NO:7);以及
(iv)CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA(SEQ ID NO:8);
其中适体结合CTLA-4。
2.如权利要求1所述的核酸适体,其中适体包含与选自下列组成之群组的核苷酸序列至少90%一致的核酸序列:
(i)GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT(SEQ ID NO:1);
(ii)GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA(SEQ ID NO:6);
(iii)GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA(SEQ ID NO:7);以及
(iv)CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA(SEQ ID NO:8)。
3.如权利要求2所述的核酸适体,其中适体包含与选自下列组成之群组的核苷酸序列至少95%一致的核酸序列:
(i)GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT(SEQ ID NO:1);
(ii)GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA(SEQ ID NO:6);
(iii)GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA(SEQ ID NO:7);以及
(iv)CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA(SEQ ID NO:8)。
4.如权利要求3所述的核酸适体,其中适体包含选自下列组成之群组的核酸序列:
(i)GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT(SEQ ID NO:1);
(ii)GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA(SEQ ID NO:6);
(iii)GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA(SEQ ID NO:7);以及
(iv)CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA(SEQ ID NO:8)。
5.如权利要求4所述的核酸适体,其中适体由选自下列组成之群组的核酸序列所组成:
(a)TCCCTACGGCGCTAACGATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGTGCCACCGTGCTACAAC(SEQ IDNO:2);
(b)TCCCTACGGCGCTAACGATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTAGCCACCGTGCTACAAC(SEQ IDNO:3);
(c)TCCCTACGGCGCTAACGTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTAGCCACCGTGCTACAAC(SEQ IDNO:4);以及
(d)TCCCTACGGCGCTAACCGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTAGCCACCGTGCTACAAC(SEQ IDNO:5)。
6.如权利要求1至5中任一项所述的核酸适体,其中适体以低于20nM的解离常数(Kd)结合至CTLA-4。
7.如权利要求1至6中任一项所述的核酸适体,其中核酸适体与聚乙二醇(PEG)接合。
8.如权利要求7所述的核酸适体,其中PEG接合至核酸适体的3’端。
9.如权利要求7或8所述的核酸适体,其中PEG具有范围自30kDa至50kDa的分子量。
10.如权利要求9所述的核酸适体,其中PEG具有40kDa的分子量。
11.一种医药组成物,其包含如权利要求1至10中任一项所述的核酸适体以及医药上可接受载剂。
12.一种治疗癌症的方法,其包含向有需要的个体投与有效量的权利要求11的医药组成物。
13.如权利要求12所述的方法,其中个体为患有癌症、怀疑患有癌症或处于癌症风险下的人类患者。
14.如权利要求12或13所述的方法,其中癌症为肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌,或肾细胞癌。
15.如权利要求12至14中任一项所述的方法,其中医药组成物被静脉内投与至个体。
16.一种在个体内增进免疫活性的方法,该方法包含向有需要的个体投与有效量的如权利要求11的医药组成物。
17.如权利要求16所述的方法,其中个体为患有癌症、怀疑患有癌症或处于癌症风险下的人类患者。
18.如权利要求16或17所述的方法,其中癌症为肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌,或肾细胞癌。
19.如权利要求17所述的方法,其中个体为患有HIV感染或怀疑患有HIV感染的人类患者。
20.如权利要求16至19中任一项所述的方法,其中医药组成物的量有效增加T细胞活化。
21.如权利要求16至20中任一项所述的方法,其中医药组成物被静脉内投与至个体。
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