KR20170055473A - 길항 ctla-4 압타머 및 면역 활성의 증진에서의 그의 적용 - Google Patents

길항 ctla-4 압타머 및 면역 활성의 증진에서의 그의 적용 Download PDF

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Abstract

CTLA-4에 결합하여 이를 억제하는 압타머 및 면역 활성의 증진, 및 암 및 HIV 감염의 치료에 있어서의 그의 용도가 제공된다.
[대표도]
도 2A

Description

길항 CTLA-4 압타머 및 면역 활성의 증진에서의 그의 적용 {ANTAGONISTIC CTLA-4 APTAMERS AND APPLICATIONS THEREOF IN ENHANCING IMMUNE ACTIVITY}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2014년 7월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 62/031,406을 우선권 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
암은 인간 사망 및 막대한 재정 비용을 초래하는 가장 중요한 질환이다. 2004년도 WHO 보고에 따르면, 전세계적으로 740만명이 넘는 생명을 이 질병으로 인해 잃었으며, 희생자는 해마다 여전히 증가하고 있다 (Abou-Alfa, G. K., et al. (2006), J Clin Oncol 24, 4293-4300). 암을 위한 주요 치료법은 수술, 화학요법 및 방사선요법이다. 그러나, 이들 통상의 요법은 심각한 부작용을 유발하고, 또한 정상 세포도 사멸시킨다.
이러한 이유로, 표적화 요법이 개발되었고, 몇몇 유형의 암을 효과적으로 치료하는데 효과적인 것으로 증명되었다 (Van Cutsem, E., et al. (2009), N Engl J Med 360, 1408-1417, Klein, S. and Levitzki A. (2007), Adv Cancer Res 97, 295-319). 그러나, 종양 특이적 마커는 거의 존재하지 않으며, 단지 소수의 표적화 요법만이 임상에 성공적으로 적용되었다 (Jain, R. K., et al. (2009), Nat Rev Clin Oncol 6, 327-3384, Gazdar, A. F. (2009), Oncogene 28 Suppl 1, S24-31). 그러나, 다수의 연구가 게놈 불안정성이 표적화 요법에 대한 내성을 용이하게 한다는 것을 밝혀냈다 (Dassie, J. P., et al. (2009), Nat Biotechnol 27, 839-849, Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., and Allavena, P. (2006), Eur J Cancer 42, 717-727). 보다 최근에, 보고는 종양 주위 미세환경이 종양 진행, 특히 면역 회피와 강하게 연관된다는 것을 보여주었다 (Pollard, J. W. (2004), Nat Rev Cancer 4, 71-78, de Visser, K. E., and Coussens, L. M. (2006), Contrib Microbiol 13, 118-137, Stewart, T. J., and Abrams, S. I. (2008), Oncogene 27, 5894-5903, Joyce, J. A., and Pollard, J. W. (2009), Nat Rev Cancer 9, 239-252).
종양-연관 대식세포 (TAM), 조절 T 세포 (Treg), 자연 킬러 (NK) 세포 및 CD8+ T-세포를 포함한, 종양 미세환경에서 주요 역할을 수행하는 여러 세포 유형이 제안되었으며, 이들은 종양 진행에 관여된다 (Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., and Allavena, P. (2009), J Leukoc Biol 86, 1065-1073, Zou, W. (2006), Nat Rev Immunol 6, 295-307, Whiteside, T. L. (2006), Cancer Treat Res 130, 103-124, Coffelt, S. B., Hughes, R., and Lewis, C. E. (2009), Biochim Biophys Acta 1796, 11-18). NK 및 CD8+ T-세포는 세포-매개 세포독성에 의해 비정상적 종양 세포를 근절시키는 2가지 주요 유효 세포 유형이다. Treg 세포는 전체 CD4+ T 세포의 작은 부분 (5-6%)을 차지하고 (Wang, R. F., Peng, G., and Wang, H. Y. (2006), Semin Immunol 18, 136-142), 종양 미세환경에서의 또 다른 주요 조절 세포 유형이다. 정상적 상황 하에, Treg 세포는 숙주를 자기-반응성 T-세포로부터 보호하여, 자가면역 질환의 형성을 방지한다 (Corthay, A. (2009), Scand J Immunol 70, 326-336). 그러나, 종양 미세환경에서, Treg는 시토카인, 예컨대 IL-10 및 TGF-β를 분비하여 종양-표적화 선천적 (NK 세포) 및 후천적 (CD8+ T-세포) 면역 반응의 기능을 억제하고 (Bingle, L., Brown, N. J., and Lewis, C. E. (2002), J Pathol 196, 254-265) 종양 세포를 면역 제거로부터 보호할 수 있다 (Andrew, G. et al. (2006), J Immunol 177, 896-904).
종양 미세환경에서 면역계를 하향조절할 수 있는 하나의 단백질 수용체는 세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4)이며, 이는 또한 분화 클러스터 152 (CD152)로도 공지되어 있다. CTLA-4는 T 세포의 표면 상에서 발견되며, 항원 상의 세포 면역 공격을 유도한다. T 세포 공격은 T 세포 상의 CD28 수용체를 자극하여 개시될 수 있는 반면, CTLA4 수용체를 자극하여 중단될 수도 있다.
항체는 질환 단백질을 표적화하는데 통상적으로 사용되지만, 높은 생산 비용, 낮은 안정성을 비롯한 제한을 가지며, 다수의 경우에 이들이 표적화할 수 있는 에피토프로 제한된다. 압타머는 조직을 통한 보다 용이한 침투를 허용하는 보다 낮은 분자량, 화학적 합성시의 낮은 비용, 확립된 변형 방법 및 높은 안정성과 같은, 이를 치료적 적용에 적합하게 하는 여러 이점을 갖는다. 따라서 표적 단백질에 대해 높은 친화도를 갖는 적합한 압타머의 개발이 큰 관심을 받고 있다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로 CTLA-4를 표적화하는 뉴클레오티드 압타머 (CA21)가 동계 마우스 모델에서 폐 종양 세포의 성장을 70% 초과만큼 성공적으로 억제한다는 예상외의 발견에 기초한다.
따라서, 본 개시내용의 한 측면은 CTLA-4에 대한 핵산 압타머 결합을 특색으로 한다. 압타머는 (i) GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT (서열식별번호: 1), (ii) GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA (서열식별번호: 6), (iii) GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA (서열식별번호: 7), 또는 (iv) CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA (서열식별번호: 8)에 대해 적어도 85% (예를 들어, 90%, 또는 95%) 동일한 핵산 서열을 포함한다. 이러한 항-CTLA-4 압타머는 20nM 미만의 해리 상수 (Kd)로 CTLA-4에 결합할 수 있다. 한 예에서, 항-CTLA4 압타머는 GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT (서열식별번호: 1), GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA (서열식별번호: 6), GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA (서열식별번호: 7), 또는 CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA (서열식별번호: 8)의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 항-CTLA4 압타머는 TCCCTACGGCGCTAACGATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGTGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 2), TCCCTACGGCGCTAACGATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTAGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 3), TCCCTACGGCGCTAACGTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTAGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 4), 또는 TCCCTACGGCGCTAACCGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTAGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 5)의 핵산일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항-CTLA-4 압타머는 30 kDa 내지 50 kDa의 범위, 예를 들어 40 kDa의 분자량을 가질 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 접합될 수 있다. 일부 예에서, PEG는 압타머의 3' 말단에 접합된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항-CTLA-4 압타머 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 암 (예를 들어, 폐암, 흑색종, 결장직장암, 또는 신세포암)을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 또한 본원에 기재된 바와 같은 항-CTLA-4 압타머를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 제약 조성물의 유효량을 (예를 들어, 정맥내로) 투여하는 것을 포함한다.
일부 예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 인간 환자, 예를 들어 암을 앓고 있거나, 암을 앓고 있는 것으로 의심되거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 인간 환자이다.
또한, 본 개시내용은 면역 활성의 증진을 필요로 하는 대상체에게 또한 본원에 기재된 바와 같은 항-CTLA-4 압타머를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 제약 조성물의 유효량 (예를 들어, T 세포 활성화를 증가시키는데 충분한 양)을 (예를 들어, 정맥내로) 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 활성을 증진시키는 방법을 특색으로 한다. 일부 예에서, 대상체는 암 (예를 들어, 폐암, 흑색종, 결장직장암, 또는 신세포암)을 앓고 있거나, 암을 앓고 있는 것으로 의심되거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 인간 환자일 수 있다. 다른 예에서, 대상체는 HIV 감염을 앓고 있거나 또는 앓고 있는 것으로 의심되는 인간 환자이다.
또한 본 개시내용의 범위 내에 (a) 본원에 기재된 바와 같은 항-CTLA-4 핵산 압타머, 예를 들어 (i) GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT (서열식별번호: 1), (ii) GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA (서열식별번호: 6), (iii) GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA (서열식별번호: 7), 또는 (iv) CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA (서열식별번호: 8)에 대해 적어도 85% (예를 들어, 90%, 또는 95%) 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 암 (예를 들어, 폐암, 흑색종, 결장직장암, 또는 신세포암) 또는 HIV 감염을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물; 및 (b) 암 (예를 들어, 폐암, 흑색종, 결장직장암, 또는 신세포암) 또는 HIV 감염을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 CTLA-4 압타머의 용도가 포함된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세내용이 하기 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특색 또는 이점은 하기 도면 및 여러 실시양태의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 SELEX 진화에 의한 결합 친화도 증가를 보여주는 다이어그램을 포함한다. 패널 A는 다양한 농도에서 CTLA-4에 대한 압타머의 결합 활성을 보여주는 차트이다. CTLA-4에 대한 라운드 4, 8, 12, 16에서의 압타머 풀을 증폭시킨 후에, 500 nM으로부터 출발하여 2배 연속 희석시켰다. 10개 투여량 포인트를 CTLA-4 형질감염된 야생형 293T 세포와의 인큐베이션에 의해 선택된 각각의 풀에 대해 분석하였다. 결합된 압타머를 RT-qPCR에 의해 정량하였다. 결과는 패널 A의 XY 플롯으로 제시된다. 원형은 라운드 4에 대한 결과를 나타내고, 사각형은 라운드 8에 대한 결과를 나타내고, 삼각형은 라운드 12에 대한 결과를 나타내고, 역삼각형은 라운드 16에 대한 결과를 나타낸다. 파선은 각각의 풀에 대한 핏 곡선을 나타낸다. 라운드 4, 8, 12, 16에 대한 해리 상수는 각각 120.7nM, 24nM, 8.8nM 및 6.6nM이었다. 패널 B-I는 야생형 293T 세포 상에서 발현된 CTLA-4에 대한 압타머 결합 활성의 FACS 분석 다이어그램을 보여준다. SELEX 라운드 4, 8, 12 및 16으로부터의 압타머 풀을 PCR에 의해 알렉사플루오르(AlexaFluor) 647로 표지하였다. 표지된 압타머를 야생형 293T 세포 (패널 B, C, D 및 E) 또는 CTLA-4 형질감염된 야생형 293T 세포 (패널 F, G, H, I)와 인큐베이션하였다. 유동 세포측정법을 사용하여 결합 신호를 평가하였다. 패널 B, C, D 및 E는 야생형 293T 세포의 결과를 보여주고, 패널 F, G, H 및 I는 형질감염된 293T 세포의 결과를 보여준다.
도 2는 SELEX 진화에 의해 선택된 압타머의 CTLA-4-결합 활성의 다이어그램을 보여준다. 패널 A 및 B는 야생형 293T 세포 상에서 발현된 CTLA-4에 대한 선택된 압타머의 결합 활성을 보여주는 FACS 분석 다이어그램이다. 패널 A는 CTLA-4 발현 플라스미드로 형질감염된 293T 세포를 보여주고, 패널 B는 음성 대조군 역할을 하는 비-형질감염된 293T 세포를 보여준다. 패널 A 및 패널 B의 세포를 지시된 바와 같이 10nM의 알렉사플루오르 647 표지된 CA7, CA21, CA32 및 CA82 압타머와 인큐베이션하였다. 미결합 압타머를 세척해낸 후에, 형광 신호를 유동 세포측정법에 의해 측정하였고, 야생형 293T 세포의 결과가 패널 A에 제시된다. CTLA-4 발현 야생형 293T 세포에 대한 결과는 패널 B에 제시된다. 패널 C, D, E 및 F는 각각 압타머 CA7, CA21, CA32 및 CA82의 CTLA-4 결합 친화도를 보여준다. 4개의 압타머를 선택하여 CTLA-4 발현 세포에 대한 그의 결합 친화도에 대해 특징화하였다. 이들 압타머를 먼저 합성한 후에, 250 nM으로부터 출발하여 2배 연속 희석하였다. 6개 투여량 포인트를 선택된 풀을 CTLA-4 안정하게 발현된 293 세포와 인큐베이션한 후에 분석하였다. CA7, CA21, CA32 및 CA82에 대한 해리 상수는 각각 51.48nM, 11.84nM, 61.75nM 및 36.51nM이었다.
도 3은 패널 A에 항-CTLA-4 압타머의 서열, 및 패널 B에 항-CTLA-4 압타머 CA21의 2차 구조를 보여주는 다이어그램을 포함한다. 패널 A에서의 CA21 (서열식별번호: 2)의 뉴클레오티드 서열에서, 밑줄표시된 G 잔기는 G-사중 구조의 형성이 가능한 유전자좌를 나타낸다. 5' 및 3' 말단에서의 16개 회색 뉴클레오티드는 5' 및 3' 프라이머 영역을 나타낸다. 엠폴드(Mfold))에 의해 결정된 바와 같은 CA21의 2차 구조가 패널 B에 제시되고, 이 구조의 ΔG는 -10.6이다.
도 4는 항-CTLA-4 압타머 CA21의 항암 효과를 보여주는 다이어그램을 포함한다. 패널 A는 CA21 올리고뉴클레오티드의 단일 주사가 동계 마우스 모델에서 TC-1 세포에서 폐 종양 성장을 억제하였다는 것을 보여주는 사진이다. 마우스 TC-1 폐암 세포 (3x105개)를 C57BL/6 마우스에 피하로 이식하였다. 종양의 짧은 축이 8 mm에 도달하였을 때, PBS 중 0.3 nmole CA21 또는 대조군 PBS를 마우스의 복막 공간에 주입하였다. 주입일을 제0일로 기록하고, 종양 크기를 1주 2회 측정하였다. 중증 조직 반응이 압타머 CA21 치료군 (패널 A에서 하단 열의 종양 참조)에 비하여 대조군 (패널 A에서 상단 열의 종양 참조)에서 크게 관찰되었다. 패널 B는 대조군 및 CA21-치료된 마우스에서의 종양 부피의 평균을 보여주는 차트이다. 패널 C는 CA21-치료된 및 PBS-치료된 마우스에서의 종양 성장률을 보여주는 차트이다. 종양 크기를 식 (LxD2)/2로 계산하였으며, 여기서 L은 긴 직경이고, D는 짧은 직경이다. 패널 D는 CA21 또는 PBS로 치료된 마우스의 체중을 보여주는 차트이다. 패널 E는 TC-1 세포 성장에 대한 CA21의 시험관내 억제 활성을 보여주는 차트이다.
도 5는 동계 마우스 모델에서 CT26 결장암 세포에 대한 항-CTLA-4 압타머 CA21의 항암 효과를 보여주는 다이어그램을 포함한다. 패널 A는 CT26 결장암 세포가 피하로 주입된 BALB/c 마우스의 종양 부피를 보여준다. 종양이 8mm에 도달한 후에, PBS 중 0.3nmole의 CA21 (사각형) 또는 대조군 PBS (원형)를 제4일, 제6일, 제8일 및 제10일에 마우스의 복막 공간에 주입하였다. CT26 세포 주입일을 제0일로 기록하고, 종양 크기를 1주 3회 측정하였다. 그래프는 항-CTLA-4 압타머 CA21로 치료된 마우스에서 대략 70% 종양 부피 감소를 보여준다. 패널 B는 대조군 PBS (패널 B에서 상단 열의 종양 참조) 또는 CA21 압타머 (패널 B에서 하단 열의 종양 참조)로 치료된 C57BL/6 마우스로부터의 종양을 보여준다.
도 6은 동계 마우스 모델에서 루이스 폐암 세포에 대한 항-CTLA-4 압타머 CA21의 항암 효과를 보여주는 다이어그램을 포함한다. 패널 A는 루이스 폐암 세포가 피하로 주입된 C57B/6 마우스의 종양 부피를 보여준다. 종양이 8mm에 도달한 후에, PBS 중 0.3nmole의 CA21 (사각형) 또는 대조군 PBS (원형)를 제4일, 제6일, 제8일, 제10일 및 제12일에 마우스의 복막 공간에 주입하였다. 루이스 폐 세포 주입일을 제0일로 기록하고, 종양 크기를 1주 3회 측정하였다. 그래프는 항-CTLA-4 압타머 CA21로 치료된 마우스에서의 대략 50% 종양 부피 감소를 보여준다. 패널 B는 대조군 PBS (패널 B에서 상단 열의 종양 참조) 또는 CA21 압타머 (패널 B에서 하단 열의 종양 참조)로 치료된 C57B/6 마우스로부터의 종양을 보여준다.
도 7은 정맥내 주사에 의해 동계 마우스 모델에서 루이스 폐암 세포에 대한 CA21 압타머와 PEG화 CA21 압타머 (CA21-PEG) 사이의 항암 효과의 비교를 보여주는 그래프이다. 그래프는 루이스 폐암 세포가 피하로 주입된 C57B/6 마우스의 종양 부피를 보여준다. 종양이 8mm에 도달한 후에, PBS 중 0.3nmole의 CA21 (사각형), PBS 중 0.3nmole의 CA21-PEG (삼각형) 또는 대조군 PBS (원형)를 마우스에 꼬리-정맥 주사에 의해 정맥내로 주입하였다. 루이스 폐 세포 주입일을 제0일로 기록하고, 종양 크기를 1주 2회 측정하였다. 그래프는 CA21 압타머에 비해 PEG화 CA21 압타머 (CA21-PEG)로 치료된 마우스에서의 대략 50% 종양 부피 감소를 보여준다.
본 개시내용은 CTLA-4에 특이적으로 결합하여 이를 억제하는 핵산 압타머 (예를 들어, CA21)의 개발 및 이러한 핵산 압타머가 동계 마우스 모델에서 암 세포의 성장을 70% 초과만큼 성공적으로 억제한다는 예상외의 결과에 기초한다. 항-CTLA4 압타머 치료는 마우스 체중에 영향을 미치지 않으며, 이는 압타머가 독성이 없음을 시사한다. 따라서, 항-CTLA-4 압타머, 예컨대 CA21은 면역 활성의 증진 및/또는 암 성장의 감소에 효과적일 것이다.
따라서, 항-CTLA-4 압타머, 예컨대 CA21, 이를 포함하는 제약 조성물, 및 본원에 개시된 항-CTLA-4 압타머를 사용하여 면역 활성을 증진시키고/거나 질환, 예컨대 암 및 HIV 감염을 치료하는 방법이 본원에 기재된다.
항-CTLA-4 핵산 압타머
CTLA-4에 결합하여 그의 활성을 억제하고, 이에 의해 면역 활성, 예컨대 T 세포 활성을 증진시키는 핵산 압타머 (항-CTLA-4 압타머)가 본원에 기재된다. 따라서, 항-CTLA-4 압타머는 면역 반응, 예를 들어 T 세포 반응을 증진시키는데 사용될 수 있고, 이에 따라 암의 면역요법에 이익을 준다.
본원에 기재된 바와 같은 핵산 압타머는 특정한 표적 분자 (예를 들어, CTLA-4)에 대한 결합 활성을 가지며, 이에 따라 그의 활성을 억제하는 핵산 분자 (DNA 또는 RNA)를 지칭한다. 본 개시내용의 항-CTLA-4 압타머는, 선형 또는 원형 형태이며, RNA, DNA (예를 들어, 단일 가닥 DNA), 변형된 핵산, 또는 그의 혼합물일 수 있다. 항-CTLA-4 압타머는 비-천연 분자 (예를 들어, 천연 유전자에 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유하거나 또는 자연에 존재하지 않는 변형된 뉴클레오티드를 함유함)일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항-CTLA-4 압타머는 기능적 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않을 수 있다.
세포독성 T-림프구-연관 단백질 4로 지칭되는 CTLA-4 (또한 CD152로 공지됨)는 T 세포 활성을 음성적으로 조절하는 T 세포 상에서 발현되는 수용체이다. 예로서, 인간 CTLA-4의 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 AAH69566 하에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 핵산 압타머는 5'-GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT-3' (서열식별번호: 1)에 대해 적어도 70% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 핵산 압타머는 서열식별번호: 1의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항-CTLA-4 압타머는 5'-GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT-3' (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적 예에서, 항-CTLA-4 압타머는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항-CTLA4 핵산 압타머는 하기 서열의 볼드체 영역에 대해 적어도 70% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00001
.
일부 예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 핵산 압타머는 서열식별번호: 3, 4, 또는 5의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항-CTLA-4 압타머는 서열식별번호: 3, 4, 또는 5, 또는 그 안의 볼드체 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정한 예에서, 항-CTLA-4 압타머는 서열식별번호: 3, 4, 또는 5, 또는 그 안의 볼드체 영역의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
2개의 핵산의 "동일성 퍼센트"는 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)로 도입되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 워드길이-12를 사용하여 수행할 수 있다. 2개의 서열 사이에 갭이 존재하는 곳에서, 갭드(Gapped) BLAST를 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CTLA-4 압타머는 5'-GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT-3' (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 서열에 비하여 최대 8개 (예를 들어, 최대 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 뉴클레오티드 변이를 함유할 수 있다. 이러한 변이가 도입될 수 있는 위치는, 예를 들어 참조 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CA21의 2차 구조에 기초하여 결정될 수 있다 (도 3B 참조).
일부 예에서, 항-CTLA-4 압타머는 5' 말단, 3' 말단, 또는 둘 다에 프라이머 부위를 함유할 수 있다. 한 예에서, 항-CTLA-4 압타머는
Figure pct00002
의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 여기서 밑줄표시/이탤릭체 플랭킹 서열은 5' 및 3' 프라이머 부위를 지칭한다. 또한 서열식별번호: 3, 4, 또는 5 내의 비-볼드체 영역을 참조한다.
본원에 개시된 임의의 항-CTLA-4 압타머는 최대 200개 뉴클레오티드 (nt), 예를 들어, 150개 nt, 100개 nt, 80개 nt, 70개 nt, 60개 nt, 50개 nt, 40개 nt, 또는 30개 nt를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 항-CTLA-4 압타머는 30-150개 nt, 30-100개 nt, 30-80개 nt, 30-70개 nt, 30-60개 nt, 30-50개 nt, 또는 30-40개 nt 범위의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CTLA-4 압타머는 20nM 미만 (예를 들어, 15 nM, 10 nM, 5 nm, 1 nm, 또는 그 미만)의 해리 상수 (Kd)로 CTLA-4 (예를 들어, 인간 CTLA-4)에 결합할 수 있다. 항-CTLA-4 압타머는 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있다. 대안적으로, 압타머는 상이한 종 (예를 들어, 인간 및 마우스)으로부터의 CTLA-4 분자에 결합할 수 있다. T 세포 표면 상에서 발현된 CTLA-4 분자에 대한 결합 시에, 이러한 압타머는 CTLA-4의 활성을 적어도 20% (예를 들어, 40%, 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 100배, 또는 1,000배)만큼 억제할 수 있다 (이에 따라 T 세포 활성이 증가함). CTLA-4에 대한 항-CTLA-4 압타머의 억제 활성 (및 이에 따른 T 세포 활성 증진의 활성화)은, 예를 들어 하기 실시예에 기재된 바에 따라 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CTLA-4 압타머는 비-자연-발생 핵염기, 당, 또는 공유 뉴클레오시드간 연결 (백본)을 함유할 수 있다. 이러한 변형된 올리고뉴클레오티드는 바람직한 특성, 예컨대 증진된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 개선된 친화도, 및 증가된 생체내 안정성을 부여한다.
한 예에서, 본원에 기재된 압타머는 인 원자를 보유하는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 5,321,131; 5,399,676; 및 5,625,050 참조) 및 인 원자를 갖지 않는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 및 5,792,608 참조)을 포함한 변형된 백본을 갖는다. 인-함유 변형된 백본의 예는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함한 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함한 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 3'-5' 연결 또는 2'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 백본은 또한 역극성, 즉 3' → 3', 5' → 5' 또는 2' → 2' 연결을 갖는 것을 포함한다. 인 원자를 포함하지 않는 변형된 백본은, 짧은 쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 짧은 쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성된다. 이러한 백본은 모르폴리노 연결 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 것; 실록산 백본; 술피드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 일부를 갖는 다른 것을 포함한다.
또 다른 예에서, 본원에 기재된 압타머는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함한다. 이러한 치환된 당 모이어티는 그의 2' 위치에 하기 기 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-알킬, S-알킬, N-알킬, O-알케닐, S-알케닐, N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐, N-알키닐, 및 O-알킬-O-알킬. 이들 기에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬 또는 C2-C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 이들은 또한 그의 2' 위치에 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선시키기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약역학적 특성을 개선시키기 위한 기를 포함할 수 있다. 바람직한 치환된 당 모이어티는 2'-메톡시에톡시, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시를 갖는 것을 포함한다. 문헌 [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]을 참조한다.
대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 압타머는 하나 이상의 변형된 천연 핵염기 (즉, 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실)를 포함할 수 있다. 변형된 핵염기는 미국 특허 번호 3,687,808, 문헌 [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, CRC Press, 1993]에 기재된 것을 포함한다. 이들 핵염기 중 특정한 것은 압타머 분자의 그의 표적화 부위에 대한 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린 (예를 들어, 2-아미노프로필-아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신)을 포함한다. 문헌 [Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]을 참조한다.
본원에 기재된 임의의 압타머는 통상적인 방법, 예를 들어 화학적 합성 또는 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 그의 의도되는 생물활성은 예를 들어 하기 실시예에 기재된 것에 의해 검증될 수 있다. 임의의 항-CTLA-4 압타머의 발현을 위한 벡터가 또한 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
본원에 기재된 임의의 압타머는 하나 이상의 폴리에테르 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 공유 연결, 비-공유 연결 또는 둘 다를 통해 접합될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 압타머는 PEG화된다. 본 개시내용은 특정 분자량의 PEG 모이어티와 관련하여 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 5kDa 내지 100kDa, 10kDa 내지 80kDa, 20kDa 내지 70kDa, 20kDa 내지 60kDa, 20kDa 내지 50kDa, 또는 30kDa 내지 50kDa 범위의 분자량을 갖는다. 일부 예에서, PEG 모이어티는 40kDa의 분자량을 갖는다. 본원에 기재된 항-CTLA-4 압타머에 접합된 PEG 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있다. 이는 핵산 압타머의 5' 말단, 압타머의 3' 말단, 또는 둘 다에 접합될 수 있다. 필요한 경우에, PEG 모이어티는 핵산 압타머의 3' 말단에 공유 접합될 수 있다.
PEG 모이어티를 핵산에 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2009/073820 (그의 관련 교시내용이 본원에 참조로 포함됨)에 이전에 기재된 바 있다. PEG 접합된 핵산 압타머 및 PEG를 본원에 기재된 핵산 압타머에 접합시키는 방법은 예시적인 것이며 제한하고자 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 항-CTLA-4 핵산 압타머의 이량체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-CTLA-4 압타머 이량체는 본원에 기재된 것과 같은 PEG 모이어티일 수 있는 적합한 중합체 모이어티에 의해 연결된 2개의 항-CTLA-4 압타머를 포함한다. 이량체 내의 2개의 압타머 중 하나 또는 둘 다는 서열식별번호: 1-2의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이량체 내의 2개의 압타머 중 하나 또는 둘 다는 서열식별번호: 3, 4, 또는 5, 또는 그 안의 볼드체 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 2개의 항-CTLA-4 압타머는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA-4 압타머 중 하나 또는 둘 다는 (서열식별번호: 1)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CTLA-4 압타머 이량체는 (서열식별번호: 1)을 포함하는 하나의 압타머 및 (서열식별번호: 2)를 포함하는 또 다른 압타머를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-CTLA-4 압타머 이량체의 중합체 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 분자량을 가질 수 있는 PEG이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CTLA-4 압타머 이량체는 링커를 통해 중합체 모이어티에 연결된 압타머를 포함한다. 한 예에서, 제1 압타머는 링커를 통해 중합체 모이어티에 연결된다. 또 다른 예에서, 제2 압타머는 링커를 통해 중합체 모이어티에 연결된다. 또 다른 예에서, 제1 압타머 및 제2 압타머는 링커를 통해 중합체 모이어티에 연결된다. 본원에 사용된 "링커"는 2개의 분자 또는 모이어티를 연결하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 일부 예에서, 링커는 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있는 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서 핵산 링커는 1 내지 50개 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 링커는 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 30, 1 내지 40, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 20 내지 30, 20 내지 40, 20 내지 50, 30 내지 40, 30 내지 50, 또는 40 내지 50개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 예에서, 링커는 11개 뉴클레오티드 길이이다. 링커는 아데닌 (A), 시토신 (C), 티민 (T) 및/또는 구아닌 (G)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 링커는 폴리T 단편을 포함한다. "폴리T 단편"은 2개 이상의 연속 티민 (T) 뉴클레오티드 잔기의 스트레치를 지칭한다. 예를 들어, 폴리T 링커는 2 내지 50개 T 잔기를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 폴리T 링커는 2 내지 40, 2 내지 35, 2 내지 30, 2 내지 25, 2 내지 20, 5 내지 15, 또는 10 내지 15개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 폴리T 링커는 11개의 연속 티민 (T) 뉴클레오티드를 포함한다.
제약 조성물
본원에 기재된 바와 같은 임의의 항-CTLA-4 압타머 또는 PEG 접합체는 제약상 허용되는 담체와 혼합되어, 예를 들어 표적 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물을 형성할 수 있다. "허용되는"은 담체가 조성물의 활성 성분과 상용성이어야 하고 (그리고 바람직하게는, 활성 성분을 안정화시킬 수 있음) 치료된 대상체에게 해롭지 않다는 것을 의미한다. 완충제를 비롯한 제약상 허용되는 부형제 (담체)는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다.
본 발명의 방법에 사용될 제약 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 CTLA-4 결합 압타머 (또는 압타머의 뉴클레오티드 서열을 보유하는 벡터)를 함유하는 리포솜을 포함하고, 이는 문헌 [Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 것과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다. 증진된 순환 시간을 갖는 리포솜이 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법으로 생성될 수 있다. 리포솜은 정해진 세공 크기의 필터를 통해 압출되어, 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 생성한다
항-CTLA-4 압타머는 또한, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 내의, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]을 참조한다.
다른 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 지속-방출 포맷으로 제제화될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항-CTLA-4 압타머를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용되는 제약 조성물은 멸균되어야 한다. 이는 예를 들어, 멸균 여과 막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 달성된다. 치료 항-CTLA-4 압타머 조성물은 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘이 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣을 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한, 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액 또는 좌제일 수 있다.
정제와 같은 고체 조성물의 제조를 위해, 주요 활성 성분을 제약 담체, 예를 들어 통상의 정제화 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 제약 희석제, 예를 들어, 물과 혼합하여, 본 발명의 화합물 또는 그의 비독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성할 수 있다. 이들 예비제제 조성물이 균질한 것으로서 지칭되는 경우, 이는 활성 성분이 조성물 전반에 걸쳐 고르게 분산되어 조성물이 동등하게 유효한 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제 및 캡슐로 용이하게 세분될 수 있다는 것을 의미한다. 이어서, 이러한 고체 예비제제 조성물을, 본 발명의 활성 성분을 0.1 내지 약 500 mg 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분한다. 신규 조성물의 정제 또는 환제를 코팅하거나 또는 달리 배합하여, 지속 작용의 장점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 외부 투여 성분은 내부 투여 성분 상의 외피의 형태일 수 있다. 2개의 성분은 위에서의 붕괴에 저항하는 작용을 하고 내부 성분이 무손상 상태로 십이지장을 통과되게 하거나 또는 방출 지연될 수 있도록 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 이러한 장용 층 또는 코팅에 다양한 물질을 사용할 수 있고, 이러한 물질은 수많은 중합체 산, 및 중합체 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면-활성 작용제는 특히 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어, 스판(Span)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성 작용제를 갖는 조성물은 편리하게 0.05 내지 5% 표면-활성 작용제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 다른 성분, 예를 들어 필요에 따라 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid)™, 리포신(Liposyn)™, 인포누트롤(Infonutrol)™, 리포푼딘(Lipofundin)™ 및 리피피산(Lipiphysan)™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 미리 혼합된 에멀젼 조성물 중에 용해시킬 수도 있고, 또는 대안적으로는 활성 성분을 오일 (예를 들어, 대두 오일, 홍화 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 중에 용해시키고 인지질 (예를 들어, 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과의 혼합시에 에멀젼이 형성될 수도 있다. 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스를 첨가하여, 에멀젼의 장성을 조정할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20% 오일, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 .im, 특히 0.1 내지 0.5 .im의 지방 액적을 포함하고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.
에멀젼 조성물은 항-CTLA-4 압타머를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두 오일, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합하여 제조될 수 있다.
흡입 또는 취입을 위한 제약 조성물은 제약상 허용되는 수성 또는 유기 용매, 또는 그의 혼합물 중의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시된 바와 같은 적합한 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국부 또는 전신 효과를 위해 구강 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다.
바람직하게는 멸균 제약상 허용되는 용매 중의 조성물은 기체의 사용에 의해 분무될 수 있다. 분무되는 용액은 분무 장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나, 또는 이러한 분무 장치를 페이스 마스크, 텐트 또는 간헐적 양압 호흡 기계에 부착시킬 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 제제를 적절한 방식으로 전달하는 장치로부터, 바람직하게 경구로 또는 비강으로 투여될 수 있다.
치료 방법
본원에 기재된 임의의 항-CTLA-4 압타머 (PEG 접합체 포함)는 면역 활성, 특히 T 세포 활성을 증진시켜, 암 또는 감염성 질환, 예컨대 바이러스 (예를 들어, HIV) 감염 또는 박테리아 감염을 치료하는데 유효하도록 하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 적어도 하나의 항-CTLA-4 압타머를 함유하는 본원에 기재된 제약 조성물의 유효량이 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 적합한 경로, 예컨대 정맥내 투여를 통해, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 포함한 액체 제제를 위한 상업적으로 입수가능한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 분무될 수 있고, 동결건조 분말은 재구성 후에 분무될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 항-CTLA-4 압타머-함유 조성물은 플루오로카본 제제 및 계량 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸화되거나, 또는 동결건조 및 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.
본원에 사용된 "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합되어 대상체에 대해 치료 효과를 부여하는데 요구되는 각각의 활성제의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료 효과는 감소된 종양 부담, 암 세포의 감소, 또는 증가된 면역 활성이다. CTLA-4 결합 압타머의 양이 치료 효과를 달성하는지 여부의 결정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 분명할 것이다. 유효량은, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인지하고 있는 바와 같이, 건강 관리자의 지식 및 전문기술 내에서 치료될 구체적 병태, 병태의 중증도, 연령, 신체 조건, 신장, 성별 및 체중을 포함한 개별 환자 파라미터, 치료 기간, 병용 요법 (존재할 경우)의 특성, 특정 투여 경로 등의 인자에 따라 달라진다. 이들 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 단지 상용 실험만으로 다룰 수 있다. 개별 성분 또는 그의 조합의 최대 용량, 즉 타당한 의학적 판단에 따른 가장 높은 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다.
경험적 고려사항, 예컨대 반감기가 일반적으로 투여량을 결정하는데 기여할 것이다. 투여 빈도는 요법의 진행에 따라 결정 및 조정될 수 있고, 반드시는 아니지만 일반적으로 표적 질환/장애의 치료 및/또는 억제 및/또는 완화 및/또는 지연을 기초로 한다. 대안적으로, CTLA-4 결합 압타머의 지속 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 CTLA-4 결합 압타머에 대한 투여량은 CTLA-4 결합 압타머의 1회 이상의 투여(들)를 받은 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체는 증분 투여량의 길항제를 제공받는다. 길항제의 효능을 평가하기 위해, 질환/장애의 지표를 따를 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 임의의 항-CTLA-4 압타머의 투여를 위해, 초기 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 0.1 μg/kg 내지 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 것이다. 수일 또는 그 초과에 걸친 반복 투여를 위해, 병태에 따라, 치료는 원하는 증상 억제가 발생할 때까지 또는 충분한 치료 수준이 달성되어 표적 질환 또는 장애, 또는 그의 증상이 완화될 때까지 지속된다. 예시적인 투여 요법은 CTLA-4 결합 압타머를 초기 용량 약 2 mg/kg으로 투여한 후에 매주 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하거나 또는 격주로 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 진료의가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 1주 1-4회 투여가 고려된다. 일부 실시양태에서, 약 3 μg/mg 내지 약 2 mg/kg (예컨대 약 3 μg/mg, 약 10 μg/mg, 약 30 μg/mg, 약 100 μg/mg, 약 300 μg/mg, 약 1 mg/kg, 및 약 2 mg/kg) 범위의 투여량이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 1주마다, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 또는 10주마다 1회; 또는 1개월마다, 2개월마다, 또는 3개월마다, 또는 그 초과마다 1회이다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 요법 (사용되는 CTLA-4 결합 압타머 포함)은 시간 경과에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시양태에서, 정상 체중의 성인 환자에 대해, 약 0.3 내지 5.00 mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 특정한 투여 요법, 즉 용량, 타이밍 및 반복은 특정한 개체 및 그 개체의 병력 뿐만 아니라 개별 작용제의 특성 (예컨대 작용제의 반감기, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 기타 고려사항)에 좌우될 것이다.
본 개시내용의 목적을 위해, 본원에 기재된 바와 같은 CTLA-4 결합 압타머의 적절한 투여량은 특정 CTLA-4 결합 압타머, CTLA-4 결합 압타머, 질환/장애의 유형 및 중증도, CTLA-4 결합 압타머가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 길항제에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 임상의는 CTLA-4 결합 압타머를 목적하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 목적하는 결과는 종양 부담의 감소, 암 세포의 감소, 또는 증가된 면역 활성이다. 투여량이 목적하는 결과를 발생시키는지 여부를 결정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 하나 이상의 CTLA-4 결합 압타머의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료인지 또는 예방인지, 및 숙련된 진료의에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적이거나 또는 간헐적일 수 있다. CTLA-4 결합 압타머의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 또는 일련의 분할된 투여, 예를 들어 표적 질환 또는 장애의 발생 전, 그 동안 또는 그 후의 투여일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 장애, 질환의 증상, 또는 질환 또는 장애에 대한 소질을 관리하거나, 치유하거나, 완화시키거나, 호전시키거나, 변경시키거나, 구제하거나, 경감시키거나, 개선시키거나 또는 효과를 주기 위한 목적으로 표적 질환 또는 장애, 질환/장애의 증상, 또는 질환/장애에 대한 소질을 갖는 대상체에게 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다.
표적 질환/장애를 완화시키는 것은 질환의 발병 또는 진행의 지연, 또는 질환 중증도의 감소를 포함한다. 질환을 경감시키는 것이 반드시 치유적 결과를 요구하지는 않는다. 본원에 사용된 표적 질환 또는 장애의 발병을 "지연"시키는 것은 질환의 진행을 미루고/거나, 지체시키고/거나, 느리게 하고/거나, 저지하고/거나, 안정화시키고/거나, 지연시키는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질환의 병력 및/또는 치료될 개체에 따라 다양한 기간의 지연일 수 있다. 질환의 발병을 "지연" 또는 완화시키거나, 또는 질환의 개시를 지연시키는 방법은 방법을 사용하지 않은 경우와 비교하였을 때 주어진 시간 프레임에서 질환의 하나 이상의 증상이 발생할 가능성을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 수의 대상체를 사용하는 임상 연구에 기초한다.
질환의 "발병" 또는 "진행"은 질환의 초기 발현 및/또는 이어지는 진행을 의미한다. 질환의 발병은 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 임상 기술을 사용하여 검출되고 평가될 수 있다. 그러한, 발병은 또한 검출될 수 없는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 발병 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발병"은 발생, 재발, 및 개시를 포함한다. 본원에 사용된 표적 질환 또는 장애의 "개시" 또는 "발생"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CTLA-4 결합 압타머는 치료를 필요로 하는 대상체에게 생체내에서 종양 부담 또는 암 세포 성장, 또는 HIV 증식을 적어도 5% (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)만큼 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 다른 실시양태에서, CTLA-4 결합 압타머는 CTLA-4의 활성 수준을 적어도 5% (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)만큼 감소시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 다른 실시양태에서, CTLA-4 결합 압타머는 면역 활성을 적어도 5% (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)만큼 증가시키기에 효과적인 양으로 투여된다.
치료될 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 의약 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제약 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 다른 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있고, 예를 들어 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 국소로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질내로, 또는 이식된 저장소를 통해 투여된다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 이는 1-, 3-, 또는 6-개월 데포 주사가능한 또는 생체분해성 물질 및 방법을 이용하는 것과 같은 주사가능한 데포 투여 경로를 통해 대상체에 투여될 수 있다. 일부 예에서, 제약 조성물은 안구내로 또는 유리체내로 투여된다.
주사가능한 조성물은 다양한 담체, 예컨대 식물성 오일, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카르보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사를 위해, 수용성 CTLA-4 결합 압타머는 점적 방법에 의해 투여될 수 있고, 이에 의해 CTLA-4 결합 압타머 및 생리학상 허용되는 부형제를 함유하는 제약 제제가 주입된다. 생리학상 허용되는 부형제는 예를 들어 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예를 들어 CTLA-4 결합 압타머의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제제는 제약상 부형제, 예컨대 주사용수, 0.9% 염수 또는 5% 글루코스 용액에 용해되어 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA-4 결합 압타머는 부위-특이적 또는 표적화 국부 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-특이적 또는 표적화 국부 전달 기술의 예는 CTLA-4 결합 압타머의 다양한 이식가능한 데포 공급원 또는 국부 전달 카테터, 예컨대 주입 카테터, 유치 카테터, 또는 바늘 카테터, 합성 이식편, 외피 랩, 션트 및 스텐트 또는 기타 이식가능한 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사, 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/53211 및 미국 특허 번호 5,981,568을 참조한다.
안티센스 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술은 예를 들어 문헌 [Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338]에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 본원에 기재된 CTLA-4 결합 압타머 또는 이를 생성하기 위한 벡터)를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서의 국부 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 DNA 범위로 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg의 DNA 또는 그 초과의 농도 범위가 또한 유전자 요법 프로토콜 동안 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 예컨대 가축, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트일 수 있다. 한 예에서, 대상체는 인간이다. 항-CTLA-4 압타머-함유 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에서 면역 활성, 예를 들어 T 세포 활성을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 예에서, 대상체는 암, 예컨대 폐암, 흑색종, 결장직장암, 또는 신세포암을 앓고 있거나, 이를 앓고 있는 것으로 의심되거나, 또는 이에 걸릴 위험이 있는 인간 환자일 수 있다. 다른 예에서, 대상체는 HIV 감염을 앓고 있거나 또는 앓고 있는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. 이러한 환자는 또한 통상의 의료 행위에 의해 확인될 수 있다.
표적 질환 또는 장애 (예를 들면, 암 또는 바이러스 감염, 예컨대 HIV 감염 또는 박테리아 감염)를 앓고 있는 대상체는 통상의 의학적 검사, 예를 들어 실험실 검사, 기관 기능 검사, CT 스캔 또는 초음파에 의해 확인될 수 있다. 임의의 이러한 표적 질환/장애를 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체는 질환/장애의 하나 이상의 증상을 나타낼 것이다. 질환/장애에 걸릴 위험이 있는 대상체는 그 질환/장애와 연관된 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 대상체일 수 있다. 이러한 대상체는 또한 통상의 의료 행위에 의해 확인될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용되는 특정한 투여 요법, 즉 용량, 타이밍 및 반복은 특정한 대상체 (예를 들면, 인간 환자) 및 대상체의 병력에 좌우될 것이다.
일부 실시양태에서, 항-CTLA-4 압타머는 또 다른 적합한 치료제 (예를 들어, 항암제 또는 항-HIV 작용제)와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항-CTLA-4 압타머는 또한 작용제의 효과를 증진 및/또는 보완하는 역할을 하는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다.
표적 질환/장애에 대한 치료 효능은 예를 들어 하기 실시예에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다.
표적 질환을 완화시키기 위한 키트
본 개시내용은 또한 면역 활성 (예를 들어, T 세포 활성)의 증진, 암 (예를 들어, 폐암, 흑색종, 결장직장암, 또는 신세포암)의 완화, 및/또는 HIV 감염의 치료 또는 이에 대한 위험의 감소에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 CTLA-4에 결합하는 압타머, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 것을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 포함된 지침서는 본원에 기재된 것과 같은 표적 질환의 치료, 개시 지연, 또는 완화를 위해 압타머를 투여하는 설명을 포함할 수 있다. 키트는 개체가 표적 질환을 보유하고 있는지를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 지침서는 압타머를 표적 질환에 걸릴 위험이 있는 개체에게 투여하는 설명을 포함한다.
CTLA-4 결합 압타머의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 서브유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 지침서는 전형적으로, 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 작성된 지침서이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 수반된 지침서)가 또한 허용된다.
라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 암과 연관된 질환 또는 장애, 예컨대 본원에 기재된 것의 치료, 개시 지연 및/또는 완화를 위해 사용된다는 것을 나타낸다. 지침서는 본원에 기재된 임의의 방법을 실시하기 위해 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 적합하게 포장된다. 적합한 포장은 바이알, 병, 용기, 유연한 포장 (예를 들면, 실링된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들면, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와의 조합에 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본원에 기재된 것과 같은 CTLA-4 결합 압타머이다.
키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 그와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반적 기술
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)].
추가의 상술 없이도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 그의 최대 범위까지 이용할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적이며 어떠한 방식으로도 나머지의 본 개시내용을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물은 본원에 언급된 목적 또는 대상에 대해 참조로 포함된다.
실시예 1: 면역침전물-SELEX에 의한 항-CTLA-4 압타머에 대한 스크리닝
본 연구는 결합 분자가 핵산 (DNA 또는 RNA)의 크고 다양한 라이브러리로부터 선택되는 지수적 풍부화에 의한 리간드의 계통적 진화 (SELEX)를 위한 방법을 이용하였다. 예를 들어, 문헌 [Mol. Cell Biol (Oliphant A.R., et al., 1989); Science (Tuerk C. et al., 1990); Nature (Ellington A.D., et al., 1990)]을 참조한다.
압타머 선택의 성공률을 증가시키기 위해, 면역침전물-SELEX (IP-SELEX) 및 세포-기반 SELEX와 조합된 선택 전략을 채택하였다. IP-SELEX는 풀로부터 비-특이적 압타머를 크게 감소시킬 수 있고, 다른 한편으로, 세포-기반 SELEX는 세포막 상에서 표적 단백질을 인식하는데 실패하는 압타머를 감소시킬 수 있다. 16 라운드의 SELEX 절차를 각각 FOLR-2 및 CTLA-4에 대해 수행하였다. IP-SELEX를 2번째, 3번째 및 4번째 라운드에서 사용하는 한편, 세포-기반 SELEX를 나머지 라운드에 사용하였다. 압타머 풀의 성공적 진화를 보여주기 위해, CTLA-4 선택의 라운드 4, 8, 12, 및 16으로부터의 압타머 풀을 선택하여 분석하였다. 결합 친화도 및 특이성을 RT-qPCR (도 1, 패널 A에 나타난 바와 같음) 및 유동 세포측정법 (도 1, 패널 B-I에 나타난 바와 같음)과 커플링된 총 결합 검정에 의해 측정하였다. 이들 데이터는 친화도 및 특이성 둘 다가 SELEX 라운드의 증가에 따라 상승되었다는 것을 나타내었다. 예를 들어, 친화도는 120.7 nM (라운드 4)에서 6.6 nM (라운드 16)으로 증가하였다 (도 1, 패널 A에 나타난 바와 같음). 압타머 풀의 비-특이적 결합이 나중 SELEX 라운드에서 성공적으로 감소하였다 (도 1, 패널 B-I에 나타난 바와 같음). 이들 데이터는 본 발명자들의 SELEX 절차가 고친화도 및 특이적 압타머를 선택하는데 효율적으로 작업하였다는 것을 시사하였다. 선택의 16개의 라운드 후에, 압타머 풀을 서열분석하였다.
실시예 2: 단리된 압타머는 CTLA-4-발현된 세포를 고친화도로 특이적으로 인식하였다
실시예 1에 기재된 방법에 의해 단리된 4개의 압타머 (CA7, CA21, CA32 및 CA82)를 그의 보다 높은 구조적 안정성에 의거하여 선택하였다. 이들 4개의 압타머의 결합 특이성을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 이들 4개의 모든 압타머는 CTLA-4-발현 세포를 특이적으로 인식하였는데, 예외적으로 CA7에서는 야생형 293 세포에 대해 상대적으로 낮은 비-특이적 결합 신호가 있었다 (도 2, 패널 A 및 B). 이 데이터는 CTLA-4-발현 세포에 대한 특이적 압타머가 확인되었다는 것을 시사하였다. CTLA-4-발현 세포의 비-파선형 형광 신호 (도 2, 패널 B)는 CTLA-4 발현 수준의 큰 변동을 유발하는 일시적 형질감염으로 인한 것이었다. 이들 4개의 압타머의 결합 친화도는 또한 도 2, 패널 C-F에 나타난 바와 같이 확인되었다.
압타머 CA7, CA32, 및 CA82의 핵산 서열은 하기 제시된다.
Figure pct00003
이탤릭체 영역은 프라이머 부위를 나타내고, 볼드체 영역은 이들 항-CTLA4 압타머의 코어 영역을 나타낸다.
실시예 3: CTLA-4 길항 압타머는 생체내 종양 성장을 억제하였다.
50개의 단리된 CTLA-4 압타머를 분석한 후에, CTLA-4 상의 B7-1 및 B7-2 단백질의 결합 부위를 인식하는 5개의 압타머를 확인하였다. 마우스 CTLA-4와 교차-반응하는, 압타머 중 하나인 CA21을 동계 마우스 모델에서의 종양 억제 검정을 위해 선택하였다. 도 3은 CA21 압타머의 서열 (도 3, 패널 A) 및 예측된 2차 구조 (도 3, 패널 B)를 보여준다.
마우스 TC-1 폐암 세포 (3x105개)를 C57BL/6 마우스에 피하로 이식하였다. 종양의 짧은 축이 8 mm에 도달하였을 때, PBS 중 0.3 nmole CA21 또는 대조군 PBS를 마우스의 복막 공간에 주입하였다. 주입일을 제0일로 기록하고, 종양 크기를 1주 2회 측정하였다. 결과는 CA21이 대조군 PBS 치료 대조군에 비해 종양 성장을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 나타내었다 (도 4, 패널 A). 종양 부피를 24일 동안 모니터링하였으며, 종양 성장은 CA21 치료 후 70% 초과만큼 감소하였다 (도 4, 패널 B 및 C). 대조적으로, CA21 치료는 마우스 체중 또는 시험관내 종양 세포 증식에 영향을 미치지 않는다 (도 4, 패널 D 및 E). 이들 데이터는 CA21이 간접 메카니즘에 의해 종양 세포 성장을 억제한다는 것을 시사한다.
실시예 4: CTLA-4 길항 압타머는 결장암의 생체내 동계 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하였다
동계 마우스 모델을 사용하여 생체내 결장암 성장에 대한 CTLA-4 길항 압타머 CA21의 억제 활성을 입증하였다. 간략하게, 마우스 CT26 결장직장암 세포 (ATCC CRL-2638)를 제0일에 BALB/c 마우스에 피하로 이식하였다 (마우스당 2X105개 CT26 세포). 종양의 짧은 축이 8mm에 도달한 후에, PBS 중 0.3nmole의 CA21 또는 대조군 PBS를 마우스의 복막 공간에 주입하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 패널 A, CT26 세포 동계 마우스에게 CA21 압타머를 제4일, 제6일, 제8일 및 제10일에 주입하였다 (도 5, 패널 A; 화살표는 주입 시점을 나타낸다). 종양 크기를 1주 3회 측정하였다. 종양 크기의 계산에 사용된 식은 (LxD2)/2였으며, 여기서 L은 종양의 긴 직경이고, D는 종양의 짧은 직경이다. CA21 치료된 마우스에서의 종양 크기는 종양 세포 주입 후 제16일에 대조군 PBS로 치료된 마우스의 종양 크기에 비해 대략 70%만큼 감소하였다 (도 5, 패널 B). 이들 데이터는 CA21 압타머가 결장암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5: CTLA-4 길항 압타머는 폐암의 생체내 동계 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하였다
동계 폐암 마우스 모델을 사용하여 생체내 폐암 성장에 대한 CTLA-4 길항 압타머 CA21의 억제 활성을 입증하였다. 간략하게, 마우스 루이스 폐암 세포 (ATCC, CRL1642)를 제0일에 C57BL/6 마우스에 피하로 이식하였다 (마우스당 1X105개 루이스 폐 세포). 종양의 짧은 축이 8mm에 도달한 후에, PBS 중 0.3nmole의 CA21 또는 대조군 PBS를 마우스의 복막 공간에 주입하였다. 도 6, 패널 A에 나타난 바와 같이, 루이스 폐 세포 동계 마우스에게 CA21 압타머를 제4일, 제6일, 제8일, 제10일 및 제12일에 주입하였다 (도 6, 패널 A; 화살표는 주입 시점을 나타낸다). 종양 크기를 1주 3회 측정하였다. 종양 크기의 계산에 사용된 식은 (LxD2)/2였으며, 여기서 L은 종양의 긴 직경이고, D는 종양의 짧은 직경이다. CA21 치료된 마우스에서의 종양 크기는 종양 세포 주입 후 제18일에 대조군 PBS로 치료된 마우스의 종양 크기에 비해 대략 50%만큼 감소하였다 (도 5, 패널 B). 이들 데이터는 CA21 압타머가 폐암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 6: PEG화 CTLA-4 길항 압타머의 정맥내 투여는 종양 성장을 억제한다
생체내 암 세포 성장에 대한 CA21의 PEG화 형태 (CA21-PEG)의 억제 활성을 본 연구에서 평가하였다.
CA21 압타머를 말레이미드를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 접합시켰다. CA21-PEG를 생성하기 위해, 20 μL의 18 mM 암모늄 포르메이트 (pH 4) 중 3'-티올 CA21 압타머 (3 nmol)를 40KDa의 분자량을 갖는 30 nmol의 PEG에 첨가하였다 (1:5의 환원된 압타머 대 PEG 몰비). 혼합물을 티올 및 말레이미드 반응으로 37℃에서 혼합하였다. 1시간 후에, 혼합물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 적용하여 CA21-PEG를 단리하고, 이를 표준 기술을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔로부터 추출하였다. 사용된 PEG의 분자량은 40 KDa였고, 이를 CA21 압타머의 3' 말단에 부착시켰다.
CA21-PEG의 항암 활성을 정맥내 투여에 의해 동계 폐암 마우스 모델에서 결정하였다. 루이스 폐암 세포 (ATCC, CRL1642)를 제0일에 C57BL/6 마우스에 피하로 이식하였다 (마우스당 1X105개 루이스 폐 세포). 종양의 짧은 축이 8mm에 도달한 후에, PBS 중 0.3nmole의 CA21, PBS 중 0.3nmole의 CA21-PEG, 또는 대조군 PBS의 1회 용량을 마우스의 꼬리-정맥에 주입하였다. 종양 크기를 1주 2회 측정하였다. 종양 크기의 계산에 사용된 식은 (LxD2)/2였으며, 여기서 L은 종양의 긴 직경이고, D는 종양의 짧은 직경이다. CA21-PEG 치료된 마우스에서의 종양 크기는 종양 세포 주입 후 제16일에 CA21로 치료된 마우스의 종양 크기에 비해 대략 50%만큼 감소하였다 (도 7). 이들 데이터는 PEG화 CA21 압타머, CA21-PEG가 정맥내 투여에 의해 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
다른 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특색은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특색은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특색으로 대체될 수 있다. 따라서, 분명하게 달리 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특색은 단지 일련의 포괄적인 동등하거나 유사한 특색의 예이다.
상기 기재로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 본질적인 특색을 용이하게 파악할 수 있을 것이며, 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 용법 및 조건에 적합하도록 본 발명에 다양한 변화 및 변형을 가할 수 있다. 따라서, 다른 실시양태도 청구범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Academia Sinica <120> ANTAGONISTIC CTLA-4 APTAMERS AND APPLICATIONS THEREOF IN ENHANCING IMMUNE ACTIVITY <130> A0988.70056WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/031,406 <151> 2014-07-31 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 gatggtgaaa atgggcctag ggtggacggt 30 <210> 2 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 tccctacggc gctaacgatg gtgaaaatgg gcctagggtg gacggtgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 3 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 tccctacggc gctaacgatg actggatgca aaaatgctgt ggggtagcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 4 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 tccctacggc gctaacgtcc acactcagaa aacagaatag ggggtagcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 5 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 5 tccctacggc gctaaccgat cgaaaatgtc cagggagttg tctgtagcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 6 gatgactgga tgcaaaaatg ctgtggggta 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 7 gtccacactc agaaaacaga atagggggta 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 8 cgatcgaaaa tgtccaggga gttgtctgta 30

Claims (21)

  1. (i) GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT (서열식별번호: 1);
    (ii) GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA (서열식별번호: 6);
    (iii) GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA (서열식별번호: 7); 및
    (iv) CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA (서열식별번호: 8)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 포함하는, CTLA-4에 결합하는 핵산 압타머.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT (서열식별번호: 1);
    (ii) GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA (서열식별번호: 6);
    (iii) GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA (서열식별번호: 7); 및
    (iv) CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA (서열식별번호: 8)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산 압타머.
  3. 제2항에 있어서,
    (i) GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT (서열식별번호: 1);
    (ii) GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA (서열식별번호: 6);
    (iii) GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA (서열식별번호: 7); 및
    (iv) CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA (서열식별번호: 8)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산 압타머.
  4. 제3항에 있어서,
    (i) GATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGT (서열식별번호: 1);
    (ii) GATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTA (서열식별번호: 6);
    (iii) GTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTA (서열식별번호: 7); 및
    (iv) CGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTA (서열식별번호: 8)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 압타머.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) TCCCTACGGCGCTAACGATGGTGAAAATGGGCCTAGGGTGGACGGTGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 2);
    (b) TCCCTACGGCGCTAACGATGACTGGATGCAAAAATGCTGTGGGGTAGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 3);
    (c) TCCCTACGGCGCTAACGTCCACACTCAGAAAACAGAATAGGGGGTAGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 4); 및
    (d) TCCCTACGGCGCTAACCGATCGAAAATGTCCAGGGAGTTGTCTGTAGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 5)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열로 이루어진 핵산 압타머.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 20nM 미만의 해리 상수 (Kd)로 CTLA-4에 결합하는 핵산 압타머.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 접합된 핵산 압타머.
  8. 제7항에 있어서, PEG가 핵산 압타머의 3' 말단에 접합되는 것인 핵산 압타머.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, PEG가 30 kDa 내지 50 kDa 범위의 분자량을 갖는 것인 핵산 압타머.
  10. 제9항에 있어서, PEG가 40 kDa의 분자량을 갖는 것인 핵산 압타머.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 핵산 압타머 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  12. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제11항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 대상체가 암을 앓고 있거나, 암을 앓고 있는 것으로 의심되거나 또는 암에 걸릴 위험이 있는 인간 환자인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 암이 폐암, 흑색종, 결장직장암 또는 신세포암인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물이 대상체에게 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  16. 면역 활성의 증진을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제11항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 활성을 증진시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 대상체가 암을 앓고 있거나, 암을 앓고 있는 것으로 의심되거나 또는 암에 걸릴 위험이 있는 인간 환자인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 암이 폐암, 흑색종, 결장직장암 또는 신세포암인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 대상체가 HIV 감염을 앓고 있거나 또는 앓고 있는 것으로 의심되는 인간 환자인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물의 양이 T 세포 활성화를 증가시키는데 효과적인 것인 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물이 대상체에게 정맥내로 투여되는 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110913910A (zh) * 2017-05-08 2020-03-24 奥曼尼提纳米有限公司 快速进化的生物实体的治疗
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WO2004081021A2 (en) * 2003-03-12 2004-09-23 Duke University Oligonucleotide mimetics
EP1620547B1 (en) 2003-04-21 2014-06-18 Archemix LLC Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
US20130209514A1 (en) * 2009-06-09 2013-08-15 Eli Gilboa Aptamer-targeted costimulatory ligand aptamer
EP2655621B1 (en) * 2010-12-20 2018-05-23 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
CA2742342A1 (en) * 2011-02-12 2012-08-12 Baylor Research Institute Msh3 expression status determines the responsiveness of cancer cells to the chemotherapeutic treatment with parp inhibitors and platinum drugs
EP2734232B1 (en) 2011-07-19 2017-11-01 Philogen S.p.A. Sequential anti-ctla4 and targeted il-2 therapy
DK2762569T3 (en) * 2011-09-28 2018-08-27 Ribomic Inc NGF aptamer and its use.
WO2014036048A1 (en) * 2012-08-30 2014-03-06 E. I. Du Pont De Nemours And Company Long intergenic non-coding rnas in maize

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