CN114045281A - 一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法 - Google Patents

一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114045281A
CN114045281A CN202111056985.6A CN202111056985A CN114045281A CN 114045281 A CN114045281 A CN 114045281A CN 202111056985 A CN202111056985 A CN 202111056985A CN 114045281 A CN114045281 A CN 114045281A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glioma
screening
aptamers
aptamer
magnetic nanoparticles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111056985.6A
Other languages
English (en)
Inventor
张波
李星
梁建
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Peoples Hospital
Original Assignee
Shenzhen Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Peoples Hospital filed Critical Shenzhen Peoples Hospital
Priority to CN202111056985.6A priority Critical patent/CN114045281A/zh
Publication of CN114045281A publication Critical patent/CN114045281A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法，其技术方案要点是：第一步，Cell‑SELEX文库的构建；第二步，用于分离捕获的功能化磁性纳米颗粒的制备；第三步，神经胶质瘤特异性标志物及其核酸适配体的筛选；第四步，神经胶质瘤标志物的分离与鉴定。本发明的一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法具有实验操作简便、筛选高效快速等优点，在神经胶质瘤的早期诊断、精准的个性化治疗、药物靶向递送，并获得良好的预后等方面发挥重要的作用。

Description

一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，它涉及一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法。
背景技术
神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半。在临床中神经胶质瘤的诊断主要依赖影像学和病理学诊断，由于缺乏神经胶质瘤的特征性分子标志物，对其早期诊断与治疗仍存在较多困难与挑战。利用传统的筛查技术去寻找分子标志物尤如大海捞针，待测样本数量庞大且生物大分子信息繁杂，而且目前也缺少高效的筛选策略及工具。
核酸适配体，是一种单链寡核苷酸，由人工合成的随机核苷酸文库中，利用配体指数富集系统进化技术获得的，具有高亲和力，能够特异性识别靶标分子并与之紧密地结合在一起，具有靶标范围广、高亲和力和高特异性、制备和修饰方便、分子量小且肿瘤穿透能力强、免疫原性小和无毒性、批次间差异小，稳定性好等优点。
基于细胞筛选的SELEX技术，以完整的细胞为靶标，无需对靶细胞的分子特征有先验认识，能筛选出与靶细胞相结合的高亲和力、高特异性核酸适配体，该核酸适配体能够区分细胞所处的某种状态，如分化与否、是正常细胞还是癌细胞等，在神经胶质瘤诊断、治疗和其标志物发现方面具有极大潜能。传统的Cell-SELEX筛选技术流程仍相当复杂，文库的构建、PCR检测及纯化、细胞的分离及靶标分子的捕获，均需要相当熟练的实验技巧及精密昂贵的仪器支持，利用Cell-SELEX技术进行肿瘤标志物的筛选依然费时费力，且实验过程极易受到污染而无效。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法，具有实验操作简便、筛选高效快速等优点，在神经胶质瘤的早期诊断、精准的个性化治疗、药物靶向递送，并获得良好的预后等方面发挥重要的作用。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：构造一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
第一步，Cell-SELEX文库的构建，通过mFlod软件设计DNA文库，包含18～20个碱基的前、后引物区以及含45～50个碱基的随机核苷酸区；
第二步，用于分离捕获的功能化磁性纳米颗粒的制备，首先通过软模板法和Stober法合成粒径分别为100～200nm和500～600nm磁性纳米颗粒，然后在磁性纳米颗粒表面修饰羧基，与链霉亲和素进行结合，最后与生物素标记的抗体或者核酸适配体孵育，制备得到不同的功能化磁性纳米颗粒；
第三步，神经胶质瘤特异性标志物及其核酸适配体的筛选，首先以抗体修饰的免疫磁性纳米颗粒捕获悬浮的神经胶质瘤细胞作为靶标，以捕获的正常神经细胞作为阴性筛选靶标，加入生物素和荧光基团标记的DNA文库进行捕获、富集和筛选，通过检测荧光信号实时评估核酸适配体的富集效率，然后对筛选出来的核酸适配体文库进行测序、二级结构模拟分析，最后用流式细胞仪筛选出亲和力和特异性最强的核酸适配体；
第四步，肿瘤标志物的分离与鉴定，将筛选得到的核酸适配体修饰磁性纳米颗粒后与细胞裂解液孵育捕获肿瘤标志物即神经胶质瘤细胞膜蛋白，通过磁场分离得到纯化的神经胶质瘤细胞膜蛋白，最后通过质谱技术鉴定。
通过采用上述技术方案，简化了传统的Cell-SELEX筛选技术流程，实验操作简便，能够高效针对神经胶质瘤细胞筛选出特异性识别的核酸适配体，从而分离出神经胶质瘤标志物，在神经胶质瘤的早期诊断、精准的个性化治疗、药物靶向递送，并获得良好的预后等方面发挥重要的作用。
作为优选，本发明所述的功能化磁性纳米颗粒，粒径为100～200nm的磁性纳米颗粒用于修饰抗体或者核酸适配体后捕获神经胶质瘤细胞及其膜蛋白，粒径为500～600nm的磁性纳米颗粒用于修饰链霉亲和素后与生物素标记的DNA文库结合，富集筛选核酸适配体。
通过采用上述技术方案，利用不用粒径的功能化磁性纳米颗粒，快速分离DNA、蛋白质和细胞，优化Cell-SELEX筛选技术流程，实现神经胶质瘤标志物的高效快速筛选。
作为优选，本发明所述的第一步Cell-SELEX文库的构建步骤，以神经胶质瘤细胞作为靶细胞，以正常神经胶质瘤细胞作为对照细胞，经过施加不同的筛选条件，使DNA文库不断富集；对筛选文库扩增的退火温度进行优化，选择最佳退火温度。将DNA初始库及引物序列通过利用梯度PCR，共设置了12～15个温度梯度，然后将PCR扩增产物在3％～5％琼脂糖凝胶中进行电泳，通过凝胶成像系统分析产物条带，从而选择本实验所使用的最佳退火温度。
通过采用上述技术方案，优化PCR扩增步骤得到最佳褪火温度，提高PCR的扩增效率，进一步优化DNA文库，获得可稳定使用的文库试剂盒，提高核酸适配体筛选的成功率。
作为优选，本发明所述的第三步，具体步骤包括：利用体外配体指数富集系统进化(SELEX)技术对特异性结合胶质瘤细胞蛋白的核酸适配体进行多轮阳性筛选，采用正常神经细胞进行阴性筛选，利用磁分离对结合胶质瘤细胞蛋白的核酸适配体和未结合的游离核酸进行分离，采用不对称PCR扩增的方法得到单一的ssDNA，对筛选得到的产物进行克隆测序，并将测序所得的适体除去上下游引物后进行和首轮ssDNA文库对比的亲和性检测，最后进行二级结构分析。
作为优选，本发明所述的阴性筛选，具体步骤包括：首先将1.5mL离心管用1％～5％的BSA于4～10℃封闭过夜，设为空白反筛管；首轮取0.5～2OD的ssDNA文库于95℃热变性5～10min，4℃下迅速冷却10～15min，与空白反筛管于37℃孵育1～2h。
作为优选，本发明所述的阳性筛选，具体步骤包括：取结合胶质瘤细胞蛋白的磁珠150～200μL，磁分离后去除上清液，与DNA文库和结合缓冲液混合，37℃温和振动反应1～2h；磁分离，用缓冲液洗涂5～10次，洗去未结合的ssDNA；加入去离子水150～200μL，100℃水浴加热10～20min，洗脱与靶蛋白结合的ssDNA，磁分离后吸取上清液，测定DNA含量，-20℃保存。
采用上述技术方案，结合功能化磁性纳米颗粒快速分离特异性结合神经胶质瘤细胞的核酸适配体和游离核酸，同时加入阴性筛选进一步提高了筛选效率。
作为优选，本发明第三步筛选得到核酸适配体文库后，以平衡解离常数Kd值来衡量核酸适配体对细胞的亲和力，将所合成的序列与正筛细胞神经胶质瘤细胞结合，采用流式细胞技术分析其与神经胶质瘤细胞结合的差异，从中选出最优化的DNA序列；将一系列浓度梯度的带荧光基团标记的适配体分别与3×105～4×105个神经胶质瘤细胞在4～10℃下孵育30～50min，然后用洗涤缓冲液充分洗涤3～6次后，用细胞刮将细胞-DNA复合物刮下并重悬在250～300μL结合缓冲液中进行流式细胞分析，使用未经筛选的初始库作为背景对照。调节细胞大小参数以及激光电压，使背景细胞平均荧光值为双位数。分别记录10000～20000个细胞，记录平均荧光值，然后计算每条序列的Kd值。最后进行核酸适配体的特异性分析，将浓度为250～300nM标记有荧光基团的适配体分别与正筛及反筛细胞，以及其他多种人类正常细胞、肿瘤细胞在4～10℃下孵育30～50min，然后用洗涤缓冲液充分洗涤3～6次后，用细胞刮将细胞-DNA复合物刮下并重悬在250～300μL结合缓冲液中进行流式细胞术分析，使用未经筛选的初始库作为背景对照。
通过采用上述技术方案，通过检测荧光信号实时评估核酸适配体的富集效率以及特异性结合神经胶质瘤细胞的能力，确保每一步筛选流程的正常进行，最终得到单一的、特异性强的神经胶质瘤细胞核酸适配体。
作为优选，本发明筛选得到的核酸适配体通过在胶质瘤细胞适体上修饰荧光基团，在其互补序列上修饰荧光淬灭基团，构建的荧光适配体传感器可用于检测神经胶质瘤细胞。
通过采用上述技术方案，实现了对神经胶质瘤细胞快速检测的目的。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
其一，通过制备功能化磁性纳米颗粒，简化了传统的Cell-SELEX筛选技术流程，实验操作简便；
其二，不同粒径大小的功能化磁性纳米颗粒有针对性地快速分离DNA、蛋白质和细胞，优化了Cell-SELEX筛选技术流程，实现神经胶质瘤标志物的高效快速筛选；
其三，本筛选方法得到核酸适配体对神经胶质瘤有强的特异性识别作用，能够实现对胶质瘤细胞蛋白快速检测，在神经胶质瘤的早期诊断、精准的个性化治疗、药物靶向递送，并获得良好的预后等方面发挥重要的作用。
附图说明
图1是根据本发明的优选实施例的一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法的流程图；
图2是根据本发明的优选实施例的一种神经胶质瘤标志物筛选实验流程图；
图3是根据本发明的优选实施例的一种神经胶质瘤标志物筛选实验的每轮阳性筛选与阴性筛选的保留率变化图；
图4是是根据本发明的优选实施例的一种神经胶质瘤标志物筛选得到的核酸适配体与不同浓度神经胶质瘤细胞结合的荧光光谱图；
图5是是根据本发明的优选实施例的一种神经胶质瘤标志物筛选得到的核酸适配体与不同浓度神经胶质瘤细胞结合的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行详细描述。
本发明的一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法,如图1所示，具体包括以下步骤：
第一步，Cell-SELEX文库的构建，通过mFlod软件设计DNA文库，包含18个碱基的前、后引物区以及含45个碱基的随机核苷酸区；
第二步，用于分离捕获的功能化磁性纳米颗粒的制备，首先通过软模板法和Stober法合成粒径分别为100nm和500nm磁性纳米颗粒，然后在磁性纳米颗粒表面修饰羧基，与链霉亲和素进行结合，最后与生物素标记的抗体或者核酸适配体孵育，制备得到不同的功能化磁性纳米颗粒；
第三步，神经胶质瘤特异性标志物及其核酸适配体的筛选，首先以抗体修饰的免疫磁性纳米颗粒捕获悬浮的神经胶质瘤细胞作为靶标，以捕获的正常神经细胞作为反筛靶标，加入生物素和荧光基团标记的DNA文库进行捕获、富集和筛选，通过检测荧光信号实时评估核酸适配体的富集效率，然后对筛选出来的核酸适配体文库进行测序、二级结构模拟分析，最后用流式细胞仪筛选出亲和力和特异性最强的核酸适配体；
第四步，肿瘤标志物的分离与鉴定，将筛选得到的核酸适配体修饰磁性纳米颗粒后与细胞裂解液孵育捕获肿瘤标志物即神经胶质瘤细胞膜蛋白，通过磁场分离得到纯化的神经胶质瘤细胞膜蛋白，最后通过质谱技术鉴定。
本发明的第三步神经胶质瘤特异性标志物及其核酸适配体的筛选流程如图2所示，具体包括以下步骤：
利用体外配体指数富集系统进化(SELEX)技术对特异性结合胶质瘤细胞蛋白的核酸适配体进行多轮阳性筛选，采用正常神经细胞蛋白进行阴性筛选，利用磁分离对结合神经胶质瘤细胞蛋白的核酸适配体和未结合的游离核酸进行分离，采用不对称PCR扩增的方法得到单一的ssDNA，对筛选得到的产物进行克隆测序，并将测序所得的适体除去上下游引物后进行和首轮ssDNA文库对比的亲和性检测，最后进行二级结构分析。
阴性筛选的具体步骤包括：首先将1.5mL离心管用1％的BSA于4℃封闭过夜，设为空白反筛管；首轮取2OD的ssDNA文库于95℃热变性10min，4℃下迅速冷却15min，与空白反筛管于37℃孵育2h。
阳性筛选的具体步骤包括：取结合神经胶质瘤细胞蛋白的磁珠200μL，磁分离后去除上清液，与DNA文库和结合缓冲液混合，37℃温和振动反应1h；磁分离，用洗涂缓冲液洗涂5次，洗去未结合的ssDNA；加入去离子水200μL，100℃水浴加热10min，洗脱与靶蛋白结合的ssDNA，磁分离后吸取上清液，测定DNA含量，-20℃保存。
本发明共进行8轮筛选，阳性筛选步骤的神经胶质瘤细胞浓度从初始的100μM降低至10μM，每两轮降低一次浓度。从第三轮开始引入阴性筛选步骤，正常神经细胞的浓度从10μM升高至50μM。每轮阳性筛选与阴性筛选的保留率变化如图3所示，对神经胶质瘤细胞具有亲和力的DNA序列逐渐富集，而对正常神经细胞具有亲和力的序列逐渐减少，以提高DNA文库中核酸适配体的特异性。
本发明筛选得到的核酸适配体修饰荧光基团，在其互补序列上修饰荧光淬灭基团，构建的荧光适配体传感器可用于检测神经胶质瘤细胞。
图4和图5为不同浓度神经胶质瘤细胞与核酸适配体结合的荧光光谱图和线性关系图。将制备的荧光适配体传感器分别与不同浓度的神经胶质瘤细胞(0.1～50μM)进行洗脱，记录所发生的荧光强度变化，并根据公式进行非线性拟合，公式为：F＝Nmax*X/(Kd+X)。依据拟合结果，得出该核酸适配体Kd值为2.02±0.48μM。观察各荧光点分布，线性关系在0.1～2.0μM间线性相关度最高，R2＝0.989。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，Cell-SELEX文库的构建，通过mFlod软件设计DNA文库，包含18～20个碱基的前、后引物区以及含45～50个碱基的随机核苷酸区；
第二步，用于分离捕获的功能化磁性纳米颗粒的制备，首先通过软模板法和Stober法合成粒径分别为100～200nm和500～600nm磁性纳米颗粒，然后在磁性纳米颗粒表面修饰羧基，与链霉亲和素进行结合，最后与生物素标记的抗体或者核酸适配体孵育，制备得到不同的功能化磁性纳米颗粒；
第三步，神经胶质瘤特异性标志物及其核酸适配体的筛选，首先以抗体修饰的免疫磁性纳米颗粒捕获悬浮的神经胶质瘤细胞作为靶标，以捕获的正常神经细胞作为反筛靶标，加入生物素和荧光基团标记的DNA文库进行捕获、富集和筛选，通过检测荧光信号实时评估核酸适配体的富集效率，然后对筛选出来的核酸适配体文库进行测序、二级结构模拟分析，最后用流式细胞仪筛选出亲和力和特异性最强的核酸适配体；
第四步，肿瘤标志物的分离与鉴定，将筛选得到的核酸适配体修饰磁性纳米颗粒后与细胞裂解液孵育捕获肿瘤标志物即神经胶质瘤细胞膜蛋白，通过磁场分离得到纯化的神经胶质瘤细胞膜蛋白，最后通过质谱技术鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法，其特征在于：所述功能化磁性纳米颗粒，粒径为100～200nm的磁性纳米颗粒用于修饰抗体或者核酸适配体后捕获神经胶质瘤细胞及其膜蛋白，粒径为500～600nm的磁性纳米颗粒用于修饰链霉亲和素后与生物素标记的DNA文库结合，富集筛选核酸适配体。
3.根据权利要求1所述的一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法一共进行8轮筛选，神经胶质瘤细胞浓度从初始的100μM降低至10μM，每两轮降低一次靶标浓度，从第三轮开始引入阴性筛选步骤，正常神经细胞的浓度从10μM升高至50μM。
4.根据权利要求1所述的一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法，其特征在于：所述核酸适配体修饰荧光基团，在其互补序列上修饰荧光淬灭基团，构建的荧光适配体传感器线性关系在0.1～2.0μM间呈线性相关，可用于检测神经胶质瘤细胞。
CN202111056985.6A 2021-09-09 2021-09-09 一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法 Pending CN114045281A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111056985.6A CN114045281A (zh) 2021-09-09 2021-09-09 一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111056985.6A CN114045281A (zh) 2021-09-09 2021-09-09 一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114045281A true CN114045281A (zh) 2022-02-15

Family

ID=80204353

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111056985.6A Pending CN114045281A (zh) 2021-09-09 2021-09-09 一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114045281A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113960308A (zh) * 2021-09-09 2022-01-21 深圳市人民医院 一种基于MNPs的神经胶质肉瘤标志物筛选方法
CN116515844A (zh) * 2023-06-30 2023-08-01 四川大学华西医院 一种迁移体适配体及其筛选方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105802971A (zh) * 2016-01-25 2016-07-27 福建医科大学附属第医院 胶质瘤干细胞(gsc)的核酸适体及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105802971A (zh) * 2016-01-25 2016-07-27 福建医科大学附属第医院 胶质瘤干细胞(gsc)的核酸适体及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M. CARMEN ESTÉVEZ等: "Nanoparticle-aptamer conjugates for cancer cell targeting and detection", CANCER NANOTECHNOLOGY, vol. 624, pages 235 - 248 *
NINGQIN LIN等: "Aptamer Generated by Cell-SELEX for Specific Targeting of Human Glioma Cells", ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES, vol. 13, no. 8, pages 9306 - 9315 *
吴亮: "人胶质瘤细胞SHG44的核酸适配体筛选及初步应用", 中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑, vol. 2018, no. 07, pages 072 - 501 *
赵纳杰等: "基于SELEX技术的疾病标志物发现新策略研究进展", 药物生物技术, vol. 28, no. 01, pages 78 - 83 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113960308A (zh) * 2021-09-09 2022-01-21 深圳市人民医院 一种基于MNPs的神经胶质肉瘤标志物筛选方法
CN116515844A (zh) * 2023-06-30 2023-08-01 四川大学华西医院 一种迁移体适配体及其筛选方法和应用
CN116515844B (zh) * 2023-06-30 2023-09-08 四川大学华西医院 一种迁移体适配体及其筛选方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114045281A (zh) 一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法
WO2003002758A1 (en) Nucleic acid ligands to complex targets
CN105886512B (zh) 一组高特异识别盐酸克伦特罗，沙丁胺醇和莱克多巴胺的寡核苷酸适配子
CN104745589B (zh) 一种特异识别链霉素的核酸适配子的筛选方法和应用
CN111073891B (zh) 一种检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
CN104630230B (zh) 一组特异识别大田软海绵酸的核酸适配体
CN110643611B (zh) 一种核酸适配体及其构建方法和其在检测石斑鱼虹彩病毒中的应用
CN111073892A (zh) 一种识别石斑鱼虹彩病毒感染细胞的核酸适配体及其构建方法和应用
CN104745588B (zh) 一种特异识别链霉素的核酸适配子及其在链霉素检测中的应用
CN111500572B (zh) 一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法
CN113215167A (zh) 核酸适配体及其在检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞中的应用
CN107354207B (zh) 基于双链探针的液相杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒及其应用
CN117487813B (zh) 特异性识别阿奇霉素的单链dna适配体序列及其应用
Fang et al. Rapid screening of aptamers for fluorescent targets by integrated digital PCR and flow cytometry
Liu et al. In vitro selection and characterization of a DNA aptamer targeted to Prorocentrum minimum-A common harmful algae
CN109797154B (zh) 一种与百草枯特异性结合的核酸适配体pq-15及其应用
CN114621958B (zh) 特异性识别atp的单链dna适配体序列及其应用
CN116790648A (zh) 用于转座酶定向进化的辅助P-质粒、转座酶定向进化的系统及Tn5转座酶突变体
JP2002533097A (ja) ポリメラーゼヌクレオチド組み込みによる特定核酸配列の検出法
CN113462693B (zh) ssDNA核酸适配体在识别大口黑鲈虹彩病毒感染细胞中的应用
CN112813071B (zh) 一种特异性识别利巴韦林的适配体序列及其应用
CN111118014B (zh) 一种抗虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
CN111454956B (zh) 一种针对中华鳖虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
CN108486119B (zh) 一种与罗丹明B特异性结合的核酸适配体RhB-F02及其应用
CN110191950B (zh) 用于识别候选核酸试剂的组合物、方法和系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20220215

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication