KR20230068834A - 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 앱타머 - Google Patents
황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 앱타머 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 앱타머에 관한 것으로, 상기 앱타머는 황색포도상구균에 특이적으로 결합하며 높은 결합 친화도를 가지므로 본 발명의 앱타머를 이용해 경제적이고 효과적으로 황색포도상구균을 분리 또는 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 식중독을 일으키는 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 앱타머에 관한 것으로, 상기 앱타머는 식품, 의료분야 등에서 황색포도상구균의 분리 또는 검출하는데 사용될 수 있다.
황색포도상구균(S.aureus, Staphylococcus aureus)은 그람양성균인 포도상구균의 한 종으로, 포도상구균은 자연계에 널리 분포되어 있는 세균 중 하나이며 건강한 사람의 30% 이상의 비강, 인후두, 피부, 털에 집락된 채로 보균되어 있는 균이다. 포도상구균은 여러 종류가 있지만, 식중독을 일으키는 균은 황색포도상구균이다. 황색포도상구균이 증식한 식품에서는 장 독소가 생산되고, 이 독소가 들어있는 식품을 섭취하면 위 또는 장에 흡수되면서 구토, 설사, 복통 등이 발생한다. 주로 식품 취급자가 오염의 주체이지만, 식품 취급 기구도 오염원이 될 수 있다. 따라서, 황색포도상구균을 경제적이면서도 간단하게 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
앱타머(aptamer)는 1012-14 정도의 다양성을 가지는 랜덤 핵산 라이브러리로부터 얻어지는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA 분자 구조체 이다. 앱타머는 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체와는 달리 핵산구조체 이므로 열 안정성이 우수하며, 시험관 내(in vitro)에서 합성되기 때문에, 동물이나 세포가 따로 필요하지 않아 생산 비용 면에서도 경제적이다. 또한, 타겟 물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자 물질부터 환경호르몬, 항생제, 잔류 의약품 등의 저분자 유기화학 물질, 박테리아, 바이러스 등의 다양한 타겟에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 앱타머는 식품 내 극미량의 식품 유해균 검출 방법에 도입하기에 매우 적절한 물질이며, 이를 활용한 나노 바이오 기술을 통해 특정 식품 유해균을 검출하는데도 응용할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 황색포도상구균 검출 방법의 개선을 위해 예의 연구 노력한 결과, 황색포도상구균에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 DNA 앱타머를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 황색포도상구균에 특이적으로 결합하며 높은 친화도를 갖는 DNA 앱타머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 앱타머.
2. 위 1의 앱타머를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 분리 또는 검출용 조성물.
3. 위 1의 앱타머를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 분리 또는 검출용 키트.
4. 위 1의 앱타머를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 분리 또는 검출 방법.
5. 위 4에 있어서, 상기 시료는 물, 토양, 식품, 폐기물 또는 인간을 포함한 동식물에서 채취한 세포 또는 조직인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 분리 또는 검출 방법.
본 발명에 따른 앱타머는 식품 등에 존재하는 극소량의 황색포도상구균 검출 및 분리를 가능하게 하므로, 식중독을 예방하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 앱타머를 이용한 황색포도상구균의 분리 또는 검출용 조성물, 키트, 검출용 센서, 분리 또는 검출 방법은 낮은 비용으로 생산이 가능한 앱타머를 이용하므로 경제적이다.
도 1은 SELEX기법을 활용해 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 앱타머를 개발하기 위한 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 앱타머의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 각 선별단계에서 수득한, 황색포도상구균에 결합하는 DNA의 형광 신호 측정결과를 비율로 나타낸 것이다.
도 4는 각 선별단계에서 수득한, 황색포도상구균에 결합하는 DNA의 형광 신호 측정 이미지를 나타낸 것이다.
도 5 내지 18은 각 순서대로 본 발명의 서열번호 1 내지 14 중 하나의 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명 앱타머 각각이 황색포도상구균에 결합하여 나타내는 형광 신호를 통해 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명 앱타머 6종의 황색포도상구균에 대한 반응특이성을 유세포 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 21은 유세포 분석을 통하여 본 발명 앱타머 6종의 농도의존성 및 결합 친화도값(Kd)을 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명 앱타머 4종의 황색포도상구균에 대한 반응특이성 확인을 위한 공초점 레이저 주사 현미경 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명 앱타머 4종의 앱타머 듀오로서의 결합력 분석을 위한 흡광도를 측정값을 나타낸 것이다.
도 24는 선정된 앱타머 듀오를 샌드위치 방식으로 사용한 경우의 원형편광이색성 분광기(CD, circular dichroism) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 앱타머의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 각 선별단계에서 수득한, 황색포도상구균에 결합하는 DNA의 형광 신호 측정결과를 비율로 나타낸 것이다.
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도 5 내지 18은 각 순서대로 본 발명의 서열번호 1 내지 14 중 하나의 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명 앱타머 각각이 황색포도상구균에 결합하여 나타내는 형광 신호를 통해 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명 앱타머 6종의 황색포도상구균에 대한 반응특이성을 유세포 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 21은 유세포 분석을 통하여 본 발명 앱타머 6종의 농도의존성 및 결합 친화도값(Kd)을 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명 앱타머 4종의 황색포도상구균에 대한 반응특이성 확인을 위한 공초점 레이저 주사 현미경 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명 앱타머 4종의 앱타머 듀오로서의 결합력 분석을 위한 흡광도를 측정값을 나타낸 것이다.
도 24는 선정된 앱타머 듀오를 샌드위치 방식으로 사용한 경우의 원형편광이색성 분광기(CD, circular dichroism) 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 앱타머에 관한 것이다.
본 발명의 앱타머는 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하는 한, 상기 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 염기 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
상기 앱타머는 이 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 화학 합성할 수 있다.
본 발명의 앱타머는, 황색포도상구균에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기 (예를 들어, 리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것일 수 있다. 당잔기에서 수식되는 부위는, 예를 들면 당잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 종류로서는, 예를 들면 플루오로화, O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예, -NH)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145 등에 기재된 공지의 방법을 사용한 것일 수 있다.
상기 앱타머는 또한 황색포도상구균에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산 염기(예를 들면, 푸린, 피리미딘)가 변형(예를 들면, 화학적 치환)된 것일 수 있으며, 예를 들면, 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환일 수 있다.
또는, 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성을 갖도록 상기 앱타머에 포함되는 인산기가 변형된 것일 수 있다. 예를 들면, P(O)O기가, P(O)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, R(O)OR’, CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환된 것일 수 있다. 상기 각각의 R 또는 R’는 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)일 수 있다. 연결기는 예를 들면 -O-, -N- 또는 -S-일 수 있고, 이들 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
상기 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함한다.
상기 변형은 또한, 폴리에틸렌클리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(Myristoyl), 리쏘콜릭-올레일(Lithocolic-oleyl), 도코사닐(Docosanyl), 라우로일(Lauroyl), 스테아로일(Stearoyl), 팔미토일(Palmitoyl), 올레오일(Oleoyl), 리놀레오일(Linoleoyl), 그 외 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가하는 것일 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호에 기재된 방법이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 앱타머를 포함하는 황색포도상구균 분리 또는 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 "앱타머"에 대해서는 전술한 바와 같으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 앱타머는 발색 효소, 형광물질, 방사성 동위 원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색 효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다.
본 발명의 황색포도상구균의 분리 또는 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
상기 “검출”은 특정 물질에 대한 선택적 반응을 통해 상기 특정 물질의 존재를 확인하는 모든 행위(예를 들면, 형광 변화, 흡광 변화 등)를 포함하는 것일 수 있다.
예를 들면 상기 검출은 형광 신호 기반 결합 분석 (Fluorescence-based binding assay), 유세포 분석(FACS, Flow cytometry), 공초점 레이저 주사 현미경 이미징 분석(Confocal imaging analysis) 및 자성 비드 기반 색도 분석(Magnetic bead-based colorimetric assay)으로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 검출하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 형광 염료(fluorescence dye)가 표지된 앱타머와 타겟을 완충용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도한 뒤, 타겟에 결합하지 않은(unbound) 앱타머를 원심분리 통해 제거한 혼합액에 대해 마이크로 플레이트 리더(plate reader) 장비를 통해 황색포도상구균을 검출하는 것일 수 있다. 즉, 타겟 세포에 특이적으로 결합하는 형광이 표지된 앱타머가 있을 때 증가하는 형광 신호 세기를 측정하는 방식일 수 있다.
또는, 형광 염료(fluorescence dye)가 표지된 앱타머와 타겟을 완충용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도한 뒤, 타겟에 결합하지 않은(unbound) 앱타머를 원심분리 통해 제거한 혼합액을 유세포 분석기(flow cytometer)에 주입하여, 황색포도상구균을 검출할 수 있다. 유세포 분석기는 용액 상태의 입자나 세포가 일정 감지지역을 통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여 세포의 크기, 세포 내부 조성 정도, 세포 기능 인지 등 한 세포가 갖는 여러 특징을 동시에 측정한다. 용액 상태의 입자나 세포를 감지하기 위해서는 일정 파장을 띄는 형광 표지가 필수적이며, 레이저 광원을 통한 형광의 발광 작용으로 형광을 감지한다. 즉, 타겟 세포에 특이적으로 결합하는 형광이 표지된 앱타머 복합체를 유세포 분석기에 주입함으로써, Forward scatter, Side scatter, 및 형광 세기(APC-A)를 정량적으로 측정하는 방식을 이용하여 황색포도상구균을 검출할 수 있다.
또는, 형광 염료(fluorescence dye)가 표지된 앱타머와 타겟을 완충용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도한 뒤, 타겟에 결합하지 않은(unbound) 앱타머를 원심분리 통해 제거한 혼합액에 대해 공초점 레이저 주사 현미경(confocal microscopy)을 통해 황색포도상구균을 검출할 수 있다. 즉, 타겟 세포에 특이적으로 결합하는 형광이 표지된 앱타머가 있을 때 나타나는 형광 신호를 현미경을 통해 육안으로 확인하는 방식을 이용하여 황색포도상구균을 검출할 수 있다.
상기 검출은 또한, 자성 비드 기반 색도 분석을 통해 황색포도상구균을 검출하는 것일 수 있다. 즉, 자성 비드에 앱타머를 연결한 복합체와 HRP 효소에 앱타머를 연결한 복합체를 각각 스트렙트아비딘(streptavidin)-비오틴(biotin) 결합으로 만들고, 이를 순서대로 이용하여 효소 반응으로 나타나는 색 변화 통해 황색포도상구균을 검출할 수 있다.
상기 “분리”는 특정 물질을 함유하고 있거나 함유하는 것으로 의심되는 대상으로부터 상기 특정 물질만을 별도로 구분하는 것을 의미하며, 상기 특정 물질을 대상으로부터 “제거”하거나 특정 물질을 “회수”하여 재사용하는 것을 포함한다.
예를 들면, 상기 "제거"는 상기 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나로 이루어진 앱타머를 고상담체에 고정화하고 상기 고상담체와 황색포도상구균의 제거가 필요한 시료를 접촉시키는 것일 수 있다. 상기 고상담체는 기관, 수지, 플레이트, 필터, 카트리지, 비드, 컬럼 및 다공질재의 담체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 니켈-PTEE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판, 유리 기판, 아파타이트(apatite) 기판, 실리콘 기판, 금 기판, 은 기판 또는 알루미나 기판일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또는, 예를 들면 상기 앱타머가 고정된 필터 또는 비드에 황색포도상구균이 포함된 시료를 통과시킴으로써 수행될 수 있고, 예를 들면, 상기 앱타머가 고정된 비드를 컬럼에 충진하고 황색포도상구균이 포함된 시료를 통과시켜 황색포도상구균을 제거할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 앱타머를 포함하는 황색포도상구균 분리 또는 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 "앱타머", "분리" 및 "검출"에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 키트는 이에 포함되는 앱타머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합된 것일 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
상기 키트는 황색포도상구균을 검출하는 센서 형태로 제공되는 것을 포함한다.
상기 키트는 병, 통, 작은 봉지, 봉투, 튜브, 앰플 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등을 이용한 것일 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 앱타머를 대상 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 황색포도상구균 분리 또는 검출 방법에 관한 것이다.
상기 시료는 물, 토양, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 물은 강수, 해수, 호수 및 우수 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인간을 포함한다.
상기 "앱타머", "분리" 및 "검출"에 대해서는 전술한 바와 같다. 예를 들면, 상기 분리 또는 검출 방법은 전술한 황색포도상구균의 분리 또는 검출용 조성물이나 키트를 사용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 서열번호 1 내지 14로 표시되는 DNA 앱타머 중 가장 높은 친화도를 보인 서열번호 8로 표시되는 DNA 앱타머인 SA-10R-37 및 서열번호 14로 표시되는 DNA 앱타머인 SA-10R-81에 대하여, 자성 비드 기반 색도 분석(Magnetic bead-based colorimetric assay)을 이용하여 결합력 분석을 수행한 결과에 관한 것이며, 황색포도상구균에 해당 앱타머가 특이적으로 결합함을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시 예에서는 상기 서열번호 1 내지 14로 표시되는 핵산 앱타머 중 가장 높은 친화도를 보인 서열번호 8로 표시되는 핵산 앱타머인 SA-10R-37에 대하여 서열번호 14로 표시되는 핵산 앱타머인 SA-10R-81 기반의 샌드위치 분석을 수행한 결과, 상기 샌드위치 방식을 사용할 경우, 황색포도상구균에 대한 민감도가 증가함을 확인하였다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. 임의의 염기서열을 가지는 DNA pool 합성
76mer DNA pool로서 양 끝에 PCR을 위한 프라이머 영역(primer region)이 있고 중앙에 임의의 염기를 가진 DNA pool GCTTCCAGCTTATTGAAT-random region(N40)-GCGCTGAAGCGCGGAAGC(서열번호 15)을 아래와 같은 방법으로 합성하였다. 본 발명에 사용된 DNA pool은 Bioneer Inc. Korea에 화학적으로 합성을 의뢰하였다. 본 발명에서 사용된 정방향 프라이머의 염기서열은 5'-GCTTCCAGCTTATTGAAT-3'(서열번호 16), 역방향 프라이머의 염기서열은 5'-GCTTCCGCGCTTCAGCGC-3'(서열번호 17)이다.
2. Bacterial cell-SELEX 프로세스를 이용한 황색포도상구균에 특이적인 DNA 앱타머의 선별
타겟은 황색포도상구균을 배지에 넣고 37℃에서 16시간 동안 키운 후, 버퍼용액(DPBS)로 2번 워싱하여 준비하였다.
실시예 1에서 합성한 랜덤 DNA pool을 버퍼용액(50mM Tris-HCl, 5mM KCl, 100mM NaCl, 1mM MgCl2, pH 7.4)에 넣고 준비한 황색포도상구균 용액(1x106 cells)과 혼합하여 40분간 상온에서 반응시켰으며, 황색포도상구균과 결합하지 않은 DNA를 원심분리 후 상층액을 제거함으로써 제거하였다. 이후, 본 혼합액을 고온에서 열을 가한 뒤 원심분리 방법을 통해 상층액을 획득하여, 타겟으로부터 분리된 DNA를 확보하였다.
수득한 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 DNA의 형광 신호를 측정한 결과, 도 3 및 4에 개시된 바와 같이 각 선별단계(selection round)에서 수득한 황색포도상구균에 결합하는 DNA의 양이 증가하는 것을 확인하였다.
Counter SELEX에서는 앞서 동일하게 진행한 후, 분리되어 얻어진 상층액에 카운터 타겟을 혼합하여 40분간 상온에서 반응시킨다. 본 혼합액을 원심분리하여 상층액을 획득함으로써, 타겟에 특이적 DNA를 확보하였다.
3. 황색포도상구균에 결합 가능한 DNA 앱타머 pool의 제조
황색포도상구균과 결합 특이적인 DNA의 양을 늘리기 위해 이미 알고 있는 프라이머 영역을 이용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 생산물은 두 가닥의 DNA이므로 이를 단일 가닥으로 분리하기 위한 과정을 위하여, 아래와 같이 하나의 프라이머에는 플루오레세인(fluorescein)을 고정하였다.
- (APTFf) 5'-fluorescein-GCTTCCAGCTTATTGAAT-3’
- (APTR) 5'-GCTTCCGCGCTTCAGCGC-3’
PCR 반응물을 정제키트 (purification kit)를 이용하여 정제한 후, 이중가닥의 DNA를 단일 가닥으로 만들기 위해 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 실시하였다.
8%의 폴리아크릴아마이드 젤에는 6M의 요소(urea), 20% 포름아마이드(formamide)가 포함되어 있어 전기영동 후에는 두 개의 밴드가 생기는데, 이는 전기영동 과정에서 두 가닥의 DNA가 변성되어 플루오레세인이 붙어있는 DNA 가닥은 위에, 붙어있지 않은 DNA 가닥은 아래에 각각 위치하게 된다. 플루오레세인이 붙어있는 DNA 밴드를 잘라내어 젤 추출(gel extraction)을 실시한 후, 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보하였다.
이 때 확보된 DNA pool은 다시 처음의 타겟이 들어있는 버퍼 용액과 혼합하여 새로운 선별과정을 시작한다. 이러한 과정의 모식도를 도 1에 나타내었고, 일련의 과정(SELEX process)을 한 번의 선별(selection)이라 하면, Bacterial-cell SELEX는 총 7번의 선별과정과 3번의 카운터 선별과정을 거쳐 황색포도상구균에 결합하는 DNA pool을 얻었다.
4. DNA 앱타머의 염기서열 및 구조 분석
황색포도상구균에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA의 염기서열을 분석한 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 이 황색포도상구균 앱타머의 2차 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 예측한 결과를 도 5 내지 도 18에 나타내었다.
5. DNA 앱타머의 황색포도상구균에 대한 결합력 분석
상기의 DNA 앱타머가 황색포도상구균에 대한 결합력이 있는지를 확인하였다.
구체적으로, 5' 말단에 Cyanine 5(Cy5)을 연결한 앱타머와 타겟을 완충용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도한 뒤, 타겟에 결합하지 않은(unbound) 앱타머를 원심분리 통해 제거한 혼합액에 대해 마이크로 플레이트 리더(plate reader) 장비를 통해 황색포도상구균을 검출하였다. 그 결과, 형광이 표지된 앱타머가 타겟에 결합함으로써 발생하는 형광 신호가 증가함에 따라, 도 19에 개시된 바와 같이, 상기 모든 앱타머가 타겟에 결합함을 확인하였다.
6. DNA 앱타머의 황색포도상구균에 대한 농도의존성 및 반응 특이성 분석
상기 서로 다른 14종의 황색포도상구균과 결합하는 앱타머 중에서 6종(SA-9R-25, SA-10R-28, SA-10R-35, SA-10R-37, SA-10R-40, SA-10R-81)의 타겟에 대한 농도의존성(Dose-dependency) 및 반응특이성(Specificity)을 유세포 분석을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 5’ 말단에 Cyanine 5(Cy5)을 연결한 DNA 500nM과 황색포도상구균 1x106 cells (OD600=0.1)을 각 100ul 씩 혼합하여, 상온에서 40분간 쉐이커(shaker) 상에서 300rpm 속도로 반응시킨 후, 0.05% BSA가 포함된 버퍼용액(50mM Tris-HCl, 5mM KCl, 100mM NaCl, 1mM MgCl2, pH 7.4)으로 3번 워싱하였다. 동일한 방식으로 카운터 타겟(Salmonella enterica, Listeria monocytogene, Staphylococcus saprophyticus, Escherichia coli)에 대해서도 반응시켰다. 최종 혼합액을 유세포 분석기에 주입하여 Cy5 입자의 형광 값을 측정하였다. 그 결과, 도 20 및 21에 개시된 바와 같이, 6종 앱타머 모두 황색포도상구균의 농도에 비례하여 형광값이 증가하는 것을 확인하였으며, 또한, 카운터 타겟에 비해 타겟에 값이 크게 나타나는 것을 통해 각각의 앱타머가 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
이에 더하여, 6종의 앱타머 중에서도 황색포도상구균에 민감하게 결합하는 앱타머 4종(SA-9R-25, SA-10R-35, SA-10R-37, SA-10R-81)에 대하여 반응 특이성(specificity)를 다음과 같이 공초점 레이저 주사 현미경 이미징 분석을 통하여 추가 확인하였다.
상기 유세포 분석 방법과 동일한 방식으로 준비한 최종 혼합액을 현미경용 슬라이드 글라스(slide glass)에 고정하여 공초점 레이저 주사 현미경을 통해 육안으로 형광 신호를 확인하였다. 그 결과, 도 22에 개시된 바와 같이, 모든 앱타머의 형광 신호가 카운터 타겟에서는 보이지 않고, 타겟에서만 보이는 것을 통해, 각각의 4종 앱타머가 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
7. DNA 앱타머의 황색포도상구균과의 앱타머 듀오로서의 결합력 분석
서로 다른 4종의 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 앱타머를 쌍으로 조합하여 얻어진 16개의 앱타머 쌍에 대하여 어떤 조합의 쌍이 황색포도상구균에 결합할 수 있는지를 다음과 같이 자성비드 기반 색도 분석을 통해 확인하였다.
10mg/ml 스트렙타아비딘(steptavidin)이 연결된 자성 비드 50ul에 1uM 비오틴(biotin)이 표지된 첫 번째 앱타머(primary aptamer, capturing aptamer) 각 4종 100ul을 혼합하여 30분간 상온에서 반응시켰다. 동시에, 스트렙타아비딘(steptavidin)이 연결된 HRP 1ul와 4uM 비오틴(biotin)이 표지된 두 번째 앱타머(secondary aptamer, signaling aptamer) 각 4종 100ul을 혼합하여 2시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 만들어진 복합체에 대하여 워싱 버퍼 용액(washing buffer)으로 각 3회 반복 워싱하였다.
상기 과정을 통해 고정된 MB-STV-biotin-apt 복합체(complex) 용액에 1x106 황색포도상구균 100ul을 혼합하여 30분간 상온에서 반응시키고, 결합하지 않은 타겟을 워싱(washing)을 통해 제거하였다. 차례로, HRP-STV-biotin-apt 복합체(complex)를 넣어 30분간 상온에서 반응시켰다. 최종적으로 결합된 1st apt-S.aureus-2nd apt 복합체가 포함된 용액을 플레이트 리더기(plate reader, Spectramax I3) 장비를 통해 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 도 23에 개시된 바와 같이, [SA-10R-37]-[SA-10R-81] 앱타머 쌍 조합이 가장 큰 흡광도 값을 가지는 것을 통해 황색포도상구균에 가장 큰 결합력을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
즉, STV-MB에 결합된 SA-10R-37과, HRP-STV에 결합된 SA-10R-81를 동시에 듀오로서 이용하여, 결합력을 측정한 결과, 도 23에 개시된 바와 같이, 앱타머 듀오를 샌드위치 방식으로 이용할 경우, 그 결합력이 가장 좋음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 24에 개시된 바와 같이, 선정한 앱타머 듀오를 샌드위치 방식으로 이용할 경우, 원형편광이색성 분광기(CD, circular dichroism) 분석 통해 황색포도상구균에 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다.
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Claims (5)
- 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 앱타머.
- 청구항 1의 앱타머를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 분리 또는 검출용 조성물.
- 청구항 1의 앱타머를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 분리 또는 검출용 키트.
- 청구항 1의 앱타머를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 분리 또는 검출 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 시료는 물, 토양, 식품, 폐기물 또는 인간을 포함한 동식물에서 채취한 세포 또는 조직인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 분리 또는 검출 방법.
Priority Applications (1)
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20150057262A (ko) | 2013-11-19 | 2015-05-28 | 대한민국(농촌진흥청장) | 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
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2021
- 2021-11-11 KR KR1020210155015A patent/KR20230068834A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150057262A (ko) | 2013-11-19 | 2015-05-28 | 대한민국(농촌진흥청장) | 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |