JP2008175750A - 被検物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 溶液中の被検物質を簡便な方法で迅速に検出することができる被検物質の検出方法、目的物質を高い純度で効率よく分離精製する方法、及び本発明の方法を用いたキットを提供する。
【解決手段】 本発明の被検物質の検出方法は、 試料溶液から被検物質を検出する方法であって、（１）被検物質を含む試料溶液に標識プローブを接触させて、前記被検物質と標識プローブとの複合体を形成させる工程、（２）前記試料溶液へ被検物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体を加えて、遊離の標識プローブと担持担体との複合体を形成させる工程、及び（３）前記遊離の標識プローブと担持担体との複合体を、被検物質と標識プローブとの複合体から分離又は隔離して、試料溶液中の被検物質と標識プローブとの複合体を検出する工程を含んでいる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、標識されたプローブを用いて少ない工程で標的タンパク質を簡便に検出する方法に関する。

ＥＬＩＳＡ法は、高価な装置を用いることなく微量物質を高い感度で検出することができる方法として広く用いられている。ＥＬＩＳＡ法は、抗原・抗体反応と酵素基質反応を利用した方法であって、具体的には、（１）マイクロプレート等の固相に目的物質を認識する抗体を固定化し、（２）抗体が固定化されていないプレート表面をブロッキングし、（３）該プレートにサンプル溶液を添加し、（４）夾雑物を洗浄により除去した後、（５）酵素標識抗体を添加して固相化抗体／標的物質／酵素標識抗体を形成させ、次いで（６）遊離の酵素標識抗体を洗浄により除去し、（７）酵素の基質となる発光試薬を添加した後、（８）プレートリーダーで吸光度を測定し、濃度既知の標準品で作成した標準曲線からサンプル中の目的物質を定量するという工程で構成されている。このようなＥＬＩＳＡ法は、同一のタンパク質を異なるエピトープで認識する抗体を準備する必要があり、このように原理上目的物質に２分子上の抗体が結合する必要があるため、目的物質の分子量が小さいと測定できず、また、固相に固定化される抗体の量が少ないとサンプルに含まれる目的物質を全て結合できないため定量性が損なわれるなどの問題があった。

特開２００４−１６３３３２号公報には、ヒト血清中のＩｇＥ抗体価を、固相化抗原を用いて感度よく測定することができる酵素免疫的な測定方法が開示されている。しかし、この方法ではサンプル中に含まれる抗体を検出することは可能であるが、抗体以外の標的物質をサンプル中から検出する方法に用いることは困難である。また、固相化抗原と抗体との複合体を合させることにより、該抗原特異的な抗体を結合させる方法であるため抗体以外の標的物質の検出に適用できず、また、従来のＥＬＩＳＡ法と同様、工程数が多いため、作業が煩雑であるという問題があった。

特開２００４−１５０４７公報には、ラテックス凝集法を用いてポリヌクレオチドを分析する方法が開示されて、前記分析には「検出」と「定量」との両方が含まれることが記載されている。ラテックス凝集法は、液相の比濁法により被検物質の存在を確認する方法であるが、比濁の差異によって物質の定量を行うことは一般に困難であり、特に微量の被検物質の検出・定量には向いておらず感度の向上の問題点があった。

特開２００４−１６３３３２号公報 特開２００４−１５０４７号公報

本発明の目的は、溶液中の被検物質を簡便な方法で迅速に検出することができる被検物質の検出方法、目的物質を高い純度で効率よく分離精製する方法、及び本発明の方法を用いたキットを提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、標識されたプローブと、被検物質と同じ物質又は等価物を固定化させた担体を用いることにより、溶液中に分散した状態で存在する被検物質を、少ない工程で迅速に感度よく検出することができること、さらに同様の工程を利用して目的物質を効率よく分離精製できることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、試料溶液から被検物質を検出する方法であって、
（１）被検物質を含む試料溶液に標識プローブを接触させて、前記被検物質と標識プローブとの複合体を形成させる工程、
（２）前記試料溶液へ被検物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体を加えて、遊離の標識プローブと担持担体との複合体を形成させる工程、及び
（３）前記遊離の標識プローブと担持担体との複合体を、被検物質と標識プローブとの複合体から分離又は隔離して、試料溶液中の被検物質と標識プローブとの複合体を検出する工程を含む被検物質の検出方法を提供する。

さらに、本発明は、試料溶液から目的物質を分離精製する方法であって、
（１）目的物質を含む試料溶液に標識プローブを接触させて、前記目的物質と標識プローブとの複合体を形成させる工程、
（２）前記試料溶液へ目的物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体を加えて、遊離の標識プローブと担持担体との複合体を形成させる工程、及び
（３）前記遊離の標識プローブと担持担体との複合体を、目的物質と標識プローブとの複合体から分離又は隔離して、試料溶液中の目的物質と標識プローブとの複合体を分離精製する工程を含む分離精製方法を提供する。

本発明の被検物質の検出方法又は分離精製方法において、標識プローブは、特異的に結合するプローブが直接又はリンカーを介して標識物質と連結された構造であってもよい。前記方法において、前記被検物質又は目的物質の標的が主にタンパク質であり、プローブが被検物質又は目的物質に特異的に結合するアプタマーであることが好ましい。また、前記担持担体は、被検物質又は目的物質と同じ物質あるいはその等価物がビーズ表面に固定化された磁気ビーズであってもよい。

本発明の被検物質の検出方法は、被検物質と標識プローブとの複合体を、試料溶液中に分散した状態で検出する方法であっても良く、固相表面に固定化した状態で検出する方法であっても良い。また、本発明の分離精製方法は、目的物質と標識プローブとの複合体を、試料溶液中に分散した状態で分離精製する方法であっても良く、固相表面に固定化した状態で分離精製する方法であっても良い。

本発明は、また、試料溶液から被検物質を検出するためのキットであって、被検物質を含む試料溶液に接触させて、被検物質と複合体を形成可能な標識プローブと、前記試料溶液へ添加して遊離の標識プローブと複合体を形成可能な被検物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体とを含む被検物質検出用キットを提供する。本発明の被検物質検出用キットは、例えば上記本発明の被検物質の検出方法に用いることができる。

さらに、本発明は、試料溶液から目的物質を分離精製するためのキットであって、目的物質を含む試料溶液に接触させて、目的物質と複合体を形成可能な標識プローブと、前記試料溶液へ添加して遊離の標識プローブと複合体を形成可能な目的物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体とを含む分離精製用キットを提供する。本発明の分離精製用キットは、例えば上記本発明の分離精製方法に用いることができる。

本発明の被検物質の検出方法は、遊離の標識プローブを固相へ捕獲することにより、工程数を少なくできるため、溶液中に存在する被検物質を効率よく高感度で検出することができる。特に、被検物質が低分子量物質に対しても感度よく検出可能なため、広範な物質を対象とする定性分析に有用であり、また、工程数が少なく、作業中に被検物質のロスを低減できるため定量性に優れている。さらに、同様の工程を分離精製方法に利用することにより、目的物質を効率よく分離することができる。特にプローブとしてアプタマーを用いることにより、複数の抗体が入手困難で従来法では検出、分離精製が困難であった物質などを検出、分離精製することができる。本発明は、多様な物質を高感度で効率よく検出する方法として、また目的物質を効率よく高い純度で分離精製する方法として広範な分野で利用することができる。

以下、本発明を、必要に応じて図面を参照しつつ詳細に説明する。図１は本発明の被検物質の検出方法の一例を示す工程図である。本発明の被検物質の検出方法は、（１）被検物質１を含む試料溶液３に標識プローブ４を接触させて、前記被検物質１と標識プローブ４との複合体５を形成させる工程［図１（ａ）（ｂ）］、（２）前記試料溶液３へ被検物質と同じ物質あるいはその等価物６１が担体６２に固定化された担持担体６を加えて、遊離の標識プローブ４と担持担体６との複合体７を形成させる工程［図１（ｃ）］、及び（３）前記遊離の標識プローブ４と担持担体６との複合体７を、被検物質１と標識プローブ４との複合体５から分離又は隔離して、試料溶液３中の被検物質１と標識プローブ４との複合体５を検出する工程［図１（ｄ）（ｅ）］を含んでいる。

図１（ａ）は、反応容器中に被検物質１と他の成分２を含む試料溶液３を添加した状態を示している。被検物質１としては、天然物と合成物、低分子化合物と高分子化合物、有機物と無機物のいずれであってもよい。このような被検物質１としては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等からなるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等の核酸及び核酸類似体等の核酸類；抗原等のペプチド、抗体、酵素、受容体、タンパク質間相互作用能を有するタンパク質、ＤＮＡ結合性タンパク質等のペプチド類；糖、ＬＰＳやペプチドグリカン等の糖誘導体等の糖類；脂質類；合成高分子化合物；アミノ酸、ヒスタミンやビオチン等のタンパク質又は核酸に結合能を有する物質、キレート錯体等の低分子化合物；及びアルカリ金属イオンやナトリウムイオン等の金属イオン及び金属化合物等の無機物等が挙げられる。なかでも、オリゴヌクレオチド、ペプチド類、低分子化合物類が好ましく、タンパク質等のペプチド類等が好ましい。また、被検物質１として、病原体、ウイルス、菌、細胞、生物等の生体由来物などを用いた場合には、これらに起因する疾患の発症を予測したり、症状を把握する手段として極めて有用である。

試料溶液３は、少なくとも被検物質１と他の成分２とで構成された溶液、好ましくは水溶液で構成されている。他の成分２としては、特に限定されず、例えば上記被検物質１として例示の物質のうち被検物質１を構成する物質を除く物質；水、有機溶媒等の溶媒；ｐＨ調整剤、界面活性剤、乳化剤、安定剤等の無機系又は有機系添加物等が挙げられる。

このような試料溶液３としては、特に限定されないが、例えば、病原体（ウイルス、細菌、プリオン、真菌、カビ、真核微生物、寄生虫等）から得られた溶液、その他の微生物、動物等の生物体；血液、血清、血漿、リンパ液、尿、腹水、胸水、唾液、涙、汗および骨髄液等の体液；及びこれらの処理物等の生体試料溶液が好ましく用いられる。前記処理物としては、生物体や体液等に、濾過、濃縮、抽出、晶析、再結晶、吸着、カラムクロマトグラフィ等の分離、精製処理を施したものであってもよい。前記処理物は、水溶液であることが好ましく、例えば溶媒置換や固形分の溶解に用いる溶媒として、生理食塩水や緩衝液等が好ましく用いられる。

本発明においては、反応容器は、特に限定されず、慣用のものから適宜選択して用いることができる。図１に示されるように、被検物質を分散状態で検出する場合には、特に容器内表面に被検物質が接着又は吸着しにくい特性を有するものが好適である。

図１（ｂ）は、反応容器に標識プローブ４を添加し、被検物質１と標識プローブ４とを接触させて、前記被検物質１と標識プローブ４との複合体５を形成させた状態を示している。標識プローブ４は、プローブ４１にリンカー４２を介して標識物質４３が連結された構造を有している。ある種のプローブにおいては前記リンカー４２を用いることにより、標識物質４３とプローブ４１との間に物理的な空間ができるため、プローブ４１が被検物質１と相互作用を形成しやすく、検出感度が向上するという利点がある。なお、本発明においては、標識プローブ４の構成物としてリンカー４２は必須ではなく、プローブ４１が標的物質４３と直接連結した構造であってもよい。

前記プローブ４１としては、被検物質１に特異的に結合して複合体５を形成でき、分子生物学的手法でプローブとして使用可能であれば特に限定されず、被検物質１の種類及び結合能等に応じて適宜選択して利用できる。このようなプローブ４１としては、例えば、被検物質１として上記に例示のものを利用できるが、これらに結合能の向上や基質分解能の抑制等の目的で変異が施された変異体や合成物等も利用できる。本願明細書中、「変異」とは、アミノ酸配列又は塩基配列に、１又は２以上の塩基又はアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾が施されることを意味している。

前記の条件を満たすプローブ４１としては、例えばアンチセンスオリゴ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、ＰＮＡ、リボザイム等の被験物質１と結合能を有する核酸及び核酸類似体等の核酸類；結合性ペプチド、変異型抗体、変異型酵素、その他の結合能が亢進された変異型タンパク質等のペプチド類；及び有機化合物結合性低分子化合物、キレート錯体等の低分子化合物が挙げられる。本願明細書中、「変異型」とは、アミノ酸配列又は塩基配列に上記変異が施された物質又は生物を意味している。

本発明における好ましいプローブ４１としては、被験物質１と結合する、核酸類、抗体、結合性ペプチド、変異型酵素、キレート錯体等が挙げられ、より好ましくはアンチセンスオリゴ、アプタマー等の核酸類、結合性ペプチド、抗体等、特にアプタマーが好適である。これらのプローブ４１は単独で又は複数を組み合わせて利用できる。

本発明におけるプローブ４１として、具体的には、変異型αアミラーゼ（J. Mol. Biol. (1998) 277, 393-407など）等の変異型酵素；ファスジル（Structure. 2006 Mar;14(3):589-600など）、カルボキシペプチダーゼＡ阻害剤としてのベンジルコハク酸等の有機化合物結合性低分子化合物；イミノジ酢酸及びその誘導体（Trends in Biotechnology 3, 1（1985）、特開平２−１８７１４３号公報など）等のキレート剤等を利用できる。具体的には、イミノジ酢酸及びその誘導体は、例えば、ヒスチジン、システイン、トリプトファン残基が表面に露出しているタンパク質に結合するプローブや、イミノジ酢酸と金属イオン（銅、亜鉛、ニッケル、クロムなど）とを担体表面に固定化して形成された複合体からなる、金属結合性を利用したタンパク質検出用プローブ（Hutchens,T.W. et al., J. Chromatogr., 536, 1-15 (1991)）等として用いることができる。

プローブ４１がアプタマー、ペプチド、又はタンパク質であるときは、その長さは、取扱性、検出感度等を考慮して構成する物質の種類に応じて適宜選択できる。具体的には、核酸類からなるプローブ４１の長さは、例えば８〜５０ｍｅｒ、好ましくは１０〜４０ｍｅｒ程度；ペプチドの場合は、例えば４〜３０残基、好ましくは１０〜２５残基、より好ましくは１４〜２０残基程度；タンパク質（抗体等）の場合は、分子量が、例えば３０００〜５０００００、好ましくは５０００〜４０００００程度である。プローブ４１が短すぎると、標識物による立体障害から結合能の低下が見られ、プローブ４１が長すぎるプローブ自身による立体障害、プローブ全体の立体構造変化から結合能の低下見られる傾向にあり好ましくない。

本発明において、被検物質１とプローブ４１との組み合わせとしては、例えば、核酸／相補プローブ、抗原／抗体、酵素／基質又は基質類似体、リガンド／受容体、金属イオン／キレート錯体等が挙げられ、被検物質１とプローブ４１とは、相互に交換することも可能である。

標識物質４３としては、物理・化学・生物学的な手段により検出可能な物質であれば特に限定されず慣用のものを利用することができ、例えば酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、発色物質等が挙げられる。なかでも、標識物質４３としては、試料溶液３中の被検物質１に結合しないか、結合性が低いものが好ましく用いられる。微量物質が結合する以外の部分に結合する物質の結合および活性部位が好ましい。なかでも、検出操作が容易な点で蛍光・発光物質が好ましく用いられる。標識は、プローブ中の、測定すべき水溶液中の微量物質が結合する以外の部分に結合させて用いられる。

プローブが核酸又はその類似体の場合、標識部位は任意であるが、その３‘末端又は５’末端側に連結することが容易である。核酸又はその類似体は、標識化反応を容易にするため、アミノ変性が施されていてもよい。アミノ変性したオリゴヌクレオチドは、慣用の方法で合成でき、また市販品を利用できる。アミノ変性したオリゴヌクレオチドは、リンカーとの結合も容易にできる。

リンカー４２としては、炭化水素鎖；ポリエチレングリコール；核酸及びその類似体；プロテインＡ、プロテインＧ、これらの組換え体等のポリペプチド又はタンパク質等が挙げられる。なかでも、核酸及びその類似体、ポリエチレングリコール、炭化水素鎖等が好ましい。前記炭化水素鎖は、直鎖状又は分岐鎖状の飽和炭素鎖であっても、不飽和炭素鎖であってもよい。

リンカー４２の長さは、リンカーを構成する物質の種類や用途に応じて適宜選択して用いることができる。例えば、核酸又は核酸類似体からなるリンカー４２は、例えば３〜５０ｍｅｒ、好ましくは５〜４０ｍｅｒ程度の長さで用いられる。ペプチドからなるリンカー４２は、例えば４〜２０残基、好ましくは６〜１６残基、より好ましくは８〜１４残基程度で用いられる。リンカー４２が短すぎると、プローブ４１と標識物質４３との立体障害により、標識物質４３の活性を阻害したり、プローブ４１が被検物質１と相互作用しにくくなるなど検出効率や感度の向上効果が得られにくく、リンカー４２が長すぎるとプローブによる立体障害、プローブ全体の立体構造変化による相互作用の低下があるため好ましくない。

本発明における標識プローブ４は、単独で構成することもでき、２以上の組合せで構成することもできる。後者の具体例として、標識プローブ４を２成分の組合せで構成した例は図２を用いて後述する。

標識プローブ４の使用量は、被検物質１と標識プローブ４との種類及び組み合わせに応じて適宜設定でき、少なくとも試料溶液３中に含まれる被検物質１全体を結合可能な量を下限とし、検出効率及び感度を損なわない量を上限として用いられる。

被検物質１と標識プローブ４との複合体５を形成する際の温度、ｐＨ、時間、圧力等は、通常、被検物質１の種類、及び被検物質１とプローブ４１との相互作用反応の条件に応じて適宜設定することができる。体液を試料溶液３として、被検物質１として酵素を、アプタマーをプローブ４１に用いて検出する場合には、通常、室温、中性付近で、常圧下、１〜１５時間程度保持することにより、酵素に標識されたアプタマーが酵素に特異的に結合して複合体を形成することができる。

図１（ｃ）は、前記試料溶液３へ被検物質と同じ物質あるいはその等価物６１が担体６２に固定化された担持担体６を加えて、遊離の標識プローブ４と担持担体６との複合体７が形成された状態を示している。

被検物質と同じ物質あるいはその等価物６１とは、被検物質１として例示の物質と同一の物質であってもよく、当該被検物質１に対し、プローブ４１との結合能を保持しつつ一部修飾が施された物質であってもよい。なかでも後者の物質が好ましく、特に被検物質１と比較してプローブ４１に対する結合能が低くなるように修飾が施された物質が好ましく用いられる。前記構成の被検物質と同じ物質あるいはその等価物６１によれば、試料溶液３中に存在する過剰な標識プローブ４を確実に結合させて系外へ除去しやすく、しかも標識プローブ４と被検物質１との複合体５を破壊しにくいため、検出効率及び感度を向上しやすいという利点がある。

被検物質と同じ物質あるいはその等価物を固定化させる担体としては、液相と容易に分離可能な固相であれば特に限定されない。ここで、「液相と容易に分離可能」とは、慣用の方法で、液相中の特定箇所に収集できること、又は液相より取り出すことができることを意味している。

このような担体６２としては、例えば、マイクロタイター・プレート、膜、及びビーズ等が挙げられる。前記担体を構成する素材としては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類等の有機系重合体又は各種ラテックス；フェライト、ガラス、シリコン等の無機系重合体等が挙げられる。これらの中でも、被検物質とプローブの特異性、結合力、親和性と同等もしくは弱いものが好ましく用いられる。担体の形状は、特に限定されず、粉末状、粒状、ストランド状、平板状、筒状等のいずれであってもよい。

担体６２の表面に被検物質と同じ物質あるいはその等価物６１を固定化する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、担体６２がタンパク質との結合性を向上する処理が施された磁気ビーズであり、被検物質と同じ物質あるいはその等価物６１がタンパク質である場合は、両者を所定期間共存下で静置することにより、ビーズ表面にタンパク質の結合反応を進行させた後、ビーズ表面のタンパク質非結合部位をブロッキングして得ることができる。

上記構成の担持担体６によれば、表面の被検物質と同じ物質あるいはその等価物６１が遊離の標識プローブ４と結合して過剰のプローブを捕獲することができる。特に、被検物質と同じ物質あるいはその等価物６１として、プローブとの結合性が低い被検物質の変異体を用いることにより、サンプル中に含まれる標的物質（被検物質）と標的プローブとの複合体を破壊しにくいため、定量性に優れ、高い感度で検出することができる。

担持担体６の使用量は、標識プローブ４の種類や使用量等に応じて適宜選択できるが、過剰の標識プローブ４を確実に捕獲でき、しかも複合体５を形成する被検物質１と標識プローブ４との結合と競合しない程度の量を上限として用いられる。

図１（ｄ）は、前記標識プローブ４と担持担体６との複合体７を複合体５と分離する状態（矢印）、及び（ｅ）は、試料溶液３中の被検物質１と標識プローブ４との複合体５を検出する状態を示している。

前記複合体７の分離は、複合体５から複合体７を分離可能であれば特に限定されず、担持担体６、特に担体６２の種類等に応じて適宜選択され、例えば磁気、遠心分離、カラムクロマトグラフィ等の慣用の分離手段を利用して行うことができる。例えば、担体６２が磁気ビーズで構成される担持担体６と遊離の標識プローブ４との複合体７は、マグネットを利用する公知の方法で、複合体５を含む液相から容易に分離回収することができる。なお、本発明においては、「複合体７の分離」を「複合体７の隔離」に代えることも可能である。すなわち、複合体７は、複合体５が存在する系（図１における試料溶液３）から分離される場合に限定されず、複合体５と同じ系（試料溶液３）の局所に集めるなどの方法で、系内の複合体７の分布範囲を複合体５と隔離する態様であってもよい。複合体７の隔離は、複合体５の検出作業を損なわない範囲で、慣用の方法を用いて行うことができる。

被検物質１と標識プローブ４との複合体５の検出は、標識物質４３の種類に応じて適宜な基質や装置等を用い、慣用の方法で行うことができる。例えば、標識物質４３が蛍光物質である場合には、蛍光光度計により蛍光強度を測定する方法を利用して、複合体５を定量することができる。

図２は、本発明の被検物質の検出方法の他の例を示す工程図である。図２に示す方法は、上記図１に示す方法において、（ｉ）標識プローブを２成分の組合せで構成し（ｂ、ｇ）、（ｉｉ）被検物質に一のプローブを結合させた複合体をタンパク質吸着プレートに移し替えた点（ｅ、ｆ）以外は図１と同様である。

前記（ｉ）について、標識プローブを構成する２成分としては、ビオチン４３ａがリンカー４２ａを介してプローブ４１ａに連結されているプローブ４ａ（図２（ｂ）の点線枠内）と、ストレプトアビジン４１ｂがリンカー４２ｂを介して標識物質４３ｂに連結されているプローブ４ｂ（図２（ｇ）の点線枠内）との組合せを利用できる。ビオチン４３ａ及びストレプトアビジン４１ｂに代えて、検出感度を損なうことなく相互に結合することが知られている慣用の物質の組合せを用いることもできる。このように標識プローブを２成分の組合せで構成することにより、検出感度を向上できる。

前記（ｉｉ）について、標識プローブ４ａと被検物質１との複合体５０を含む試料溶液を、タンパク質吸着プレートに移し替えることにより、微量の被検物質に対する検出効率を向上することができる他、既存のマイクロタイタープレートを用いたハイスループットシステムに特段の改良なしに使用できるという利点がある。タンパク質吸着プレートは、タンパク質を吸着可能に表面処理が施されたプレートであれば特に限定されず、市販のものを利用可能である。

本発明の被検物質の検出方法によれば、溶液中に混在する標的物質を、少ない工程数で簡便に検出することができる。このため、安定性が低いために、従来の方法では検出や定量が困難であった被検物質を、速やかに効率よく高い感度で検出できる。特にプローブとしてアプタマーを用いることにより、被検物質の抗体が入手困難な場合や、被検物質自体が比較的低分子量である等の理由でＥＬＩＳＡ法によっては検出不能であった物質を、高い感度で容易に検出することができるため、極めて有用である。

また、上述の被検物質と複合体を形成可能な標識プローブと、被検物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体とは、被検物質検出用キットとして有用である。本発明の被検物質検出用キットは、特に上記本発明の被検物質の検出方法に用いられるが、他の被検物質の検出方法にも利用することができる。前記キットによれば、多様な被検物質を、簡便な方法で迅速に効率よく高感度で検出することができる。

また、本発明においては、上記被検物質の検出方法と同様の工程を、目的物質を分離精製する方法に適用することも可能である。本発明の分離精製方法は、試料溶液から目的物質を分離精製する方法であって、（１）目的物質を含む試料溶液に標識プローブを接触させて、前記目的物質と標識プローブとの複合体を形成させる工程、（２）前記試料溶液へ目的物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体を加えて、遊離の標識プローブと担持担体との複合体を形成させる工程、及び（３）前記遊離の標識プローブと担持担体との複合体を、目的物質と標識プローブとの複合体から分離又は隔離して、試料溶液中の目的物質と標識プローブとの複合体を分離精製する工程を含んでいる。

本発明の分離精製方法において、目的物質としては、上記検出方法における被検物質として例示のものを適用でき、目的物質の等価物には、標的物質の等価物として上記に例示のものを利用できる。また、試料溶液、標識プローブ及び担体の具体例、担持担体の構成と製造法、さらに各工程その他の物質や工程は上記検出方法と同様である。本発明の分離精製方法は、上記工程中又は工程の前後に、例えば、濾過、濃縮、蒸留、抽出、晶析、再結晶、吸着、カラムクロマトグラフィーなどの公知の分離手段を用いた工程を組合せた方法であってもよい。

本発明の被検物質の分離精製方法によれば、溶液中に混在する目的物質を、少ない工程数で簡便に分離精製することができる。このため、安定性が低かったり、低濃度で存在するために、従来の方法では分離が困難であった目的物質を、速やかに効率よく高い純度で分離精製することができる。特にプローブとしてアプタマーを用いることにより、より簡便にしかも高い純度で分離精製することができるため、極めて有用である。

また、本発明においては、上述の目的物質と複合体を形成可能な標識プローブと、目的物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体とは、分離精製用キットとして有用である。本発明の分離精製用キットは、特に上記本発明の分離精製方法に用いられるが、他の分離精製方法にも利用することができる。前記キットによれば、多様な目的物質を、簡便な方法で迅速に効率よく高い純度で分離精製することができる。

以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

調製例１
トロンビン結合ビーズの調製
トロンビン１ｍｇを０．１Ｍホウ酸緩衝液１ｍｌに溶解したトロンビン溶液を調製する。
２ｍｌのラウンドチューブに、１ｍｌのビーズ溶液（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ」、Ｄｙｎａｌ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を入れ、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄する。得られたビーズペレットに、上記トロンビン溶液１ｍｌを加えて十分に混和した後、３７℃、２４時間転倒攪拌する。上清を捨て、ビーズを０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄する。洗浄して得たビーズペレットに、０．１％ＢＳＡを含む０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を１ｍｌ加える。３７℃、４時間〜一晩、転倒混和してビーズ表面のトシル基をブロッキングする上清を捨てて、ビーズを０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１ｍｌで１回洗浄し、次いで０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で１ 回洗浄する。上清を捨て、ビーズを０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１ｍｌで１回洗浄する。上清を捨て、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１ｍｌで懸濁する。

調製例２
調製例１において、トロンビンの代わりにトロンビンに修飾を施した低結合型トロンビンを用いた点以外は調製例１と同様の操作を行って、低結合型トロンビン結合ビーズを調製する。

実施例１
プローブとしてアプタマーを用いた検出法
トロンビンへ特異的に結合するアプタマー（配列番号１：ｇｇｔｔｇｇｔｇｔｇｇｔｔｇｇ）に、慣用の用法でビオチンを連結させたビオチン化トロンビンアプタマーを調製した。
内表面にタンパク質が接着しにくい特性を有するラウンドボトムの２ｍｌチューブ（商品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｗ ｂｉｎｄ ｔｕｂｅ １０００」、エッペンドルフ社製）に、トロンビン１．８ｎＭ（０．１ ＮＩＨユニット）の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（（ｐＨ ７．４）、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１００ｍＭ ＮａＣｌ）溶液と、前記ビオチン化トロンビンアプタマー６．０ ｎＭとの１００μｌを３７℃で１５分間加温して、トロンビンにビオチン化トロンビンアプタマーが結合した複合体（サンプル複合体）を形成させた。
調製例１で得たトロンビン結合ビーズをチューブへ添加した後、遊離のビオチン化トロンビンアプタマーがビーズ表面のトロンビンに結合された複合体（ビーズ複合体）を形成させた。次いで、ビーズを磁石に吸着させることによりチューブ底面へ前記ビーズ複合体を集めた。
上清を回収し、タンパク質と高親和性の表面からなる市販の９６ウェルプレート（商品名「９６Ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｎｏｔ Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ」、コーニング社製）へ移すことにより、ビーズ複合体と分離し、サンプル複合体を容器表面に吸着させた。次いで、容器にＢＳＡを添加してブロッキングを行った後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合タンパク質を加え、室温で静置させる。上清を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ：ＨＲＰの基質）を加え、暗所にて１０分静置し、その後硫酸を加えて反応を停止させる。分光光度計を用いて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。

実施例２
プローブとして抗体を用いた検出法
抗トロンビン抗体の市販品に、慣用の用法でビオチンを連結させたビオチン化抗トロンビン抗体を調製する。
内表面にタンパク質が接着しにくい特性を有するラウンドボトムの２ｍｌチューブに、トロンビン１．８ｎＭ（０．１ ＮＩＨユニット）の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（（ｐＨ ７．４）、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１００ｍＭ ＮａＣｌ）溶液と、前記ビオチン化抗トロンビン抗体６．０ ｎＭとの１００μｌを３７℃で１５分間加温して、トロンビンにビオチン化抗トロンビン抗体が結合した複合体（サンプル複合体）を形成させる。
調製例１で得たトロンビン結合ビーズをチューブへ添加した後、遊離のビオチン化抗トロンビン抗体がビーズ表面のトロンビンに結合された複合体（ビーズ複合体）を形成させる。次いで、ビーズを磁石に吸着させることによりチューブ底面へ前記ビーズ複合体を集める。
上清を回収し、タンパク質と高親和性の表面からなる市販の９６ウェルプレートへ移すことにより、ビーズ複合体と分離し、サンプル複合体を容器表面に吸着させる。次いで、容器にＢＳＡを添加してブロッキングを行った後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合タンパク質を加え、室温で静置させる。上清を除去し、ＰＢＳで２回洗浄する。
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ：ＨＲＰの基質）を加え、暗所にて１０分静置し、その後硫酸を加えて反応を停止させる。分光光度計を用いて波長４５０ｎｍの吸光度を測定する。

本発明の被検物質の検出方法の一例を示す概略工程図であり、（ａ）は、反応容器中に被検物質と他の成分を含む試料溶液を添加した状態、（ｂ）は、反応容器に標識プローブを添加し、被検物質と標識プローブを接触させて、前記被検物質と標識プローブとの複合体を形成させた状態、（ｃ）は、試料溶液へ被検物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体を加えて、遊離の標識プローブと担持担体との複合体が形成された状態、（ｄ）は、標識プローブと担持担体との複合体を被検物質が結合された複合体と分離する状態、（ｅ）は、試料溶液中の被検物質と標識プローブとの複合体を検出する状態を示している。 本発明の被検物質の検出方法の他の例を示す概略工程図であり、（ａ）は、反応容器中に被検物質と他の成分を含む試料溶液を添加した状態、（ｂ）は、反応容器に標識プローブを添加し、被検物質と標識プローブを接触させて、前記被検物質と標識プローブＡとの複合体を形成させた状態、（ｃ）は、試料溶液へ被検物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体を加えて、遊離の標識プローブと担持担体との複合体が形成された状態、（ｄ）は、標識プローブと担持担体との複合体を被検物質が結合された複合体と分離する状態、（ｅ）から（ｆ）は、被検物質と標識プローブとの複合体と他の成分を含む試料溶液を別の反応容器に移し替え、容器底面に当該複合体と他の成分が底面に固定化した状態、（ｇ）は、試料溶液へ標識プローブと該標識プローブに結合可能な他の標識プローブを加え、被検物質と前者の標識プローブと後者の標識プローブとの複合体を形成した状態、（ｈ）は、遊離の標識プローブを反応容器から分離する状態、（ｉ）は、試料溶液中の被検物質と標識プローブと該標識プローブに結合可能な他の標識プローブとの複合体を検出する状態を示している。

符号の説明

１ 被検物質
２ 他の成分
３ 試料溶液
４ ４ａ ４ｂ 標識プローブ
41 41ａ プローブ
42 42ａ 42ｂ リンカー
43 43ｂ 標識物質
43ａ ビオチン
41ｂ ストレプトアビジン
５ 50 51 被検物質と標的プローブとの複合体
６ 担持担体
61 被検物質と同じ物質あるいはその等価物
62 担体
７ 70 遊離の標識プローブと担持担体との複合体

Claims (16)

1. 試料溶液から被検物質を検出する方法であって、
   （１）被検物質を含む試料溶液に標識プローブを接触させて、前記被検物質と標識プローブとの複合体を形成させる工程、
   （２）前記試料溶液へ被検物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体を加えて、遊離の標識プローブと担持担体との複合体を形成させる工程、及び
   （３）前記遊離の標識プローブと担持担体との複合体を、被検物質と標識プローブとの複合体から分離又は隔離して、試料溶液中の被検物質と標識プローブとの複合体を検出する工程を含む被検物質の検出方法。
2. 標識プローブが、特異的に結合するプローブが直接又はリンカーを介して標識物質と連結された構造である請求項１記載の被検物質の検出方法。
3. 被検物質が標的タンパク質であり、プローブが該標的タンパク質に特異的に結合するアプタマーである請求項１又は２記載の被検物質の検出方法。
4. 担持担体が、被検物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された磁気ビーズである請求項１〜３の何れかの項に記載の被検物質の検出方法。
5. 被検物質と標識プローブとの複合体を、試料溶液中に分散した状態で検出する請求項１〜４の何れかの項に記載の被検物質の検出方法。
6. 被検物質と標識プローブとの複合体を、固相表面に固定化した状態で検出する請求項１〜４の何れかの項に記載の被検物質の検出方法。
7. 試料溶液から被検物質を検出するためのキットであって、被検物質を含む試料溶液に接触させて、被検物質と複合体を形成可能な標識プローブと、前記試料溶液へ添加して遊離の標識プローブと複合体を形成可能な被検物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体とを含む被検物質検出用キット。
8. 請求項１記載の被検物質の検出方法に用いられる請求項７記載の被検物質検出用キット。
9. 試料溶液から目的物質を分離精製する方法であって、
   （１）目的物質を含む試料溶液に標識プローブを接触させて、前記目的物質と標識プローブとの複合体を形成させる工程、
   （２）前記試料溶液へ目的物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体を加えて、遊離の標識プローブと担持担体との複合体を形成させる工程、及び
   （３）前記遊離の標識プローブと担持担体との複合体を、目的物質と標識プローブとの複合体から分離又は隔離して、試料溶液中の目的物質と標識プローブとの複合体を分離精製する工程を含む分離精製方法。
10. 標識プローブが、特異的に結合するプローブが直接又はリンカーを介して標識物質と連結された構造である請求項９記載の分離精製方法。
11. 目的物質が標的タンパク質であり、プローブが該標的タンパク質に特異的に結合するアプタマーである請求項９又は１０記載の分離精製方法。
12. 担持担体が、目的物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された磁気ビーズである請求項９〜１１の何れかの項に記載の分離精製方法。
13. 目的物質と標識プローブとの複合体を、試料溶液中に分散した状態で分離精製する請求項９〜１２の何れかの項に記載の分離精製方法。
14. 目的物質と標識プローブとの複合体を、固相表面に固定化した状態で分離精製する請求項９〜１２の何れかの項に記載の分離精製方法。
15. 試料溶液から目的物質を分離精製するためのキットであって、目的物質を含む試料溶液に接触させて、目的物質と複合体を形成可能な標識プローブと、前記試料溶液へ添加して遊離の標識プローブと複合体を形成可能な目的物質と同じ物質あるいはその等価物が担体に固定化された担持担体とを含む分離精製用キット。
16. 請求項９記載の分離精製方法に用いられる請求項１５記載の分離精製用キット。

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