CN105624164B - 氯胺酮核酸适体、检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了氯胺酮核酸适体、检测试剂盒及其应用。具体地，本发明人采用SELEX技术，基于特殊结构的ssDNA文库，成功地筛选得到对氯胺酮有高亲和力和特异性的核酸适体。本发明的适体可应用于现场快速、灵敏地检测氯胺酮。

Description

氯胺酮核酸适体、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域和刑事鉴定技术领域。具体地，本发明涉及氯胺酮核酸适体、检测试剂盒及其应用，尤其在在毒物检测中的应用。

背景技术

氯胺酮[2-氯苯-2-甲基胺环己酮]是一种高效麻醉剂，服用后能产生“分离性幻觉”，因此在很多社交场合和性侵犯案件中成为很常见的滥用药物。氯胺酮的分析检测手段有很多也很成熟，包括GC–MS,LC–MS/MS。尽管目前这些方法都对氯胺酮的检测有很好的灵敏性和特异性，但是都需要昂贵的仪器设备，不能快速、现场检测氯胺酮。此外，现有的免疫检测方法容易与美沙酮、美沙芬发生交叉反应。

近年来，现场快速检测毒品的方法是以单克隆抗体为基础，取得了良好的效果。但是，单抗的检测仍然存在一定的局限性：

一，单抗来源于动物，因此，在制备单抗时会出现某些限制；如，某些毒品、毒物的毒性为动物无法忍受，还有某些免疫性很差的小分子都会给制备单抗带来困难。

二，杂交瘤的制备仅限于大小鼠和兔子，大大限制了抗体的应用。不同来源的抗体应用于检测，可能会发生非特异的结合所产生假阳性结果。

三，单克隆抗体的制备工作量较大，对某些稀有的抗体需要筛选大量的克隆，成本较昂贵。

四，抗体制备有自身的缺陷，细胞株必须冻藏，如冻藏不好极易发生意外细胞死亡。

五，通常扩增单克隆抗体是通过将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内产生腹水，从腹水中纯化抗体。但是，某些杂交瘤细胞很难产生腹水，限制了抗体的产生。

六，每批生产的抗体的表现都不同，免疫检测试剂每一批新抗体都要重新调试。

七，抗体识别都是在生理条件下进行，抗体与抗原的结合动力学参数无法根据需要而改变。

最重要的是，氯胺酮代谢迅速，尿中的氯胺酮原体含量很低，要求高度灵敏的检测，而这些抗体无法实现。

综上，本领域尚缺乏令人满意的高灵敏度的、可适用现场检测的氯胺酮的检测方法，因此迫切需要研制开发具有灵敏、快速、可靠、特异性佳等优点的氯胺酮的检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏、快速、可靠、特异性佳等优点的氯胺酮的技术。

在本发明的第一方面，提供了一种核酸适体，所述的适体特异性结合于氯胺酮。

在另一优选例中，所述的特异性结合指所述适体结合于氯胺酮但不结合于以下任何一种物质：美沙酮、美沙芬、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA、吗啡、可待因、海洛因、福尔可定、单乙酰吗啡、二氢可待因、二氢埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬太尼、曲马多、右丙氧芬、纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、可乐宁、洛非西丁、东莨菪碱、益安口服液、正通宁片、扑热息痛、阿斯匹林、布洛芬、阿米替林、丙米嗪、氯丙嗪、异丙嗪、水合氯醛、安定、三唑仑、阿普唑仑、苯巴比妥、速可眠、异戊巴比妥、咖啡因、氟哌酸、先锋IV、黄连素、乳糖、普鲁卡因、康复新胶囊、水合氯醛、奥复沙星、非那西丁、去痛片、度冷丁、麻黄素、左旋麻黄素、右旋麻黄素、蒂巴因、四氢大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙诺啡、苯丙醇胺和苯乙胺。

在另一优选例中，所述的适体是通过SELEX技术，从ssDNA文库中筛选获得的单链核酸分子。

在另一优选例中，所述的适体包括DNA、RNA、或DNA/RNA杂合分子。

在另一优选例中，所述的适体的长度为30-100个碱基。

在另一优选例中，所述的适体为单链或双链。

在另一优选例中，所述的适体带有可检测标记物。

在另一优选例中，所述的适体是分离的或纯化的。

在另一优选例中，所述的适体的纯度≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％。

在另一优选例中，所述的适体的序列如SEQ ID NO.:1、2、3、或4所示。

在本发明的第二方面，提供了一种偶联物，所述偶联物包括本发明第一方面所述的核酸适体以及与所述核酸适体相连的可检测标记物。

在另一优选例中，所述的可检测标记物包括生物素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、放射性同位素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、受体、或其组合。

在本发明的第三方面，提供了一种复合物，所述的复合物是(a)本发明第一方面所述的核酸适体或本发明第二方面所述的偶联物与(b)氯胺酮所形成的复合物。

在本发明的第四方面，提供了一种检测制品，所述检测制品含有本发明第一方面所述的核酸适体或本发明第二方面所述的偶联物。

在另一优选例中，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。

在另一优选例中，所述的检测制品用于检测氯胺酮。

在本发明的第五方面，提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含本发明第一方面所述的核酸适体，本发明第二方面所述的偶联物和/或本发明第四方面所述的检测制品。

在本发明的第六方面，提供了如本发明第一方面所述的核酸适体或本发明第二方面所述偶联物的用途，它们被用于制备检测氯胺酮的检测制品或试剂盒。

在另一优选例中，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。

在本发明的第七方面，提供了一种检测氯胺酮的方法，包括以下步骤：

(a)提供待检测的样品；

(b)将该样品与本发明第一方面所述的核酸适体或本发明第二方面所述的偶联物混合，形成混合物；

(c)检测所述混合物中“氯胺酮-核酸适体复合物”的存在与否，其中如果存在所述复合物，则表明所述样品中存在氯胺酮；如果不存在所述复合物，则表明所述样品中不存在氯胺酮。

在另一优选例中，所述的检测包括定性检测和定量检测。

在另一优选例中，在步骤(c)中，包括与标准品或标准曲线进行比较，从而确定在所述混合物中是否存在复合物，和/或所述复合物的数量。

在另一优选例中，所述方法用于毒品检测、药物检测或食品安全检测，更优选的，所述方法用于毒品检测。

在本发明第八方面，提供了一种核酸序列，所述核酸序列是序列如SEQ ID NO.:1-4所示序列的反义序列。

在本发明第九方面，提供了一种组合物，所述的组合物含有(i)载体以及(ii)本发明第一方面所述的核酸适体、本发明第二方面所述的偶联物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了PCR条件优化产物2％琼脂糖凝胶电泳结果。

图2显示了适体对氯胺酮的结合性检测。MB:裸磁珠；MB-氯胺酮:偶联氯胺酮的磁珠。

图3显示了SEQ ID NO.:1-4的特异性的检测。

图4显示了SEQ ID NO.:1-2的Kd值检测

图5显示了SEQ ID NO.:1-4的ssDNA的二级结构

图6显示了本发明的一种层析侧流片(或试纸条)的结构，其中，1样品垫，2适体释放垫，3检测线，4反应膜，5对照线，6吸收垫，和7背衬。

图7显示了本发明一个实施例中的层析检测片的检测示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了特异性针对氯胺酮的核酸适体。本发明人采用SELEX技术以及磁珠筛选技术，基于特殊结构的ssDNA文库，通过十几轮的筛选，成功地筛选得到对氯胺酮有高亲和力和高特异性的核酸适体。本发明的适体的Kd值达到了亚微摩尔级，与常规方法筛选的适体相比，提高了1-2个数量级。此外，本发明利用竞争性结合的方法对适体的特异性也进行了研究，表明不会与美沙酮和美沙芬等其他毒品发生交叉反应。本发明适体可应用于现场快速、灵敏、特异地检测氯胺酮。在此基础上完成本发明。

具体地，本发明人先在体外构建了全长为约78bp的ssDNA文库，进行SELEX筛选；并利用SPR测定每轮ssDNA文库和氯胺酮的结合亲和力，通过MFOLD分析软件对适体进行二级结构预测和结合位点分分析。通过多次试验，本发明人获得了特异性适体得到逐步富集的文库。经过进一步测序、分析和验证，本发明人确定了多个具有茎-环结构的、与氯胺酮存在有效结合的核酸适体。

试验表明，本发明的氯胺酮核酸适体可特异性结合于氯胺酮并用于检测氯胺酮，与其它药物、毒品不发生任何交叉反应，证实了本发明核酸适体具有高度的特异性和灵敏度。在鉴别不同的毒品和类似物方面，具有重大的使用价值。

本发明的核酸适体本身是一段单链DNA或RNA，可以耐受高温，pH值得变化，比抗体具有更高的稳定性，易于长期保存。核酸适体还具有可体外人工化学合成、精确性高、重复性好、无批次间差异等特点，在毒品、毒物的检测方面具有广阔的前景。

术语

如本文所用，术语“含有”或“包括”可以是开放式的或封闭式的，即包括了“由……构成”和“含有......”。

SPR

SPR(表面等离子共振，Surface Plasmon Resonance)是利用金属膜/液面界面光的全反射连接引起的一种物理光学现象来分析生物分子间相互作用的仪器。

SELEX筛选

SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，指数富集配体系统进化技术)技术，指由Tuerk和Gold等人开发研究的一种新的组合化学技术。它应用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，可获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适体(aptamer)。

SELEX筛选具有库容量大、靶分子范围广等优点。

在本发明中，基于本发明人特殊构建的一个ssDNA文库，通过SELEX技术，并经过多次和多轮筛选，成功获得了多个特异性针对氯胺酮的核酸适体。

本发明所用的ssDNA文库中，ssDNA的全长78bp，中间为40bp的随机核苷酸序列，由A、G、C、T密码子随机组合。这样，在理论上，可提供4⁴⁰个序列组合，即理论库容量为10¹⁵，因此可以很好地满足筛选适体的需求。

在本发明的一个优选实施例中，SELEX筛选方法包括以下步骤：

1.DNA适体库的建立

第一步是化学合成具有随机序列的核酸适体库，通常选择40个碱基对的随机单链核苷酸序列，同时包括两端的PCR引物序列，这样的核酸适体库将包含10¹⁴-10¹⁵种不同的可能序列。

2.建立特异性的DNA适体的筛选方法

DNA适体与靶分子结合的方法可以选择：1)亲和层析柱方法；2)纳米颗粒偶联法；3)硝酸纤维膜结合方法、或其组合。

一种筛选是用2nmol RND40单链DNA，在50μl反应缓冲液中94℃变性10分钟，加入20μl小分子抗原，37℃孵育30分钟，通过离心13000rpm 15分钟除去未结合的DNA，并用250μl反应缓冲液洗涤两次。最终的单链DNA和抗原的复合物溶于50μl水中，进行下一轮筛选。

3.DNA适体与结合的靶分子的分离

在本发明中，适用的分离技术包括(但不限于)：使用毛细管电泳结合液相分离，磁珠分离技术，层析分离技术和离心分离技术等。具体地，本发明可通过磁珠分离技术。

4.多循环的扩增筛选

对筛选到的DNA适体序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增生成次级文库,用于下轮筛选.经过数轮反复的体外筛选、扩增后,对已达到高亲和力的文库进行单克隆及测序,从而获得特异性识别靶分子的适配体。从而筛选出高特异性和高亲和力的核酸适体。

整个筛选步骤通常可包括同样条件的10轮或更多轮筛选，从而筛选出高特异性和高亲和力的核酸适体。

适体

如本文所用，“适体”、“适配体”、“适配子”和“aptamer”可以互换使用，指能够与特定的靶分子(如氯胺酮)结合的核酸序列，包括DNA适体、RNA适体、杂合类型的适体、或其他类型的适体。此外，在本发明中，适体还包括单链和双链形式，尤其是单链形式的适体。

如本文所用，“核酸适体”和“寡核苷酸适体”可以互换使用。核酸适体是通过SELEX技术筛选得到的一类寡核苷酸分子，能与靶分子强特异、高亲和力地结合。通常，核酸适体是一种小的(通常约40-100碱基对)的合成寡核苷酸。

如本文所用，术语“本发明的适体”、“本发明的核酸适体”可互换使用，指能够特异性地和高亲和力地与氯胺酮结合的核酸适体。

在本发明中，一类优选的适体是通过SELEX筛选获得的，序列如SEQ ID NO.:1-4所示的核酸适体。

本发明的核酸适体的分子质量小、免疫原性低，且可进行化学合成、改造与标记。

如本文所用，术语“特异性”是指本发明的适体能结合于氯胺酮，较佳地，指那些能与氯胺酮结合但不识别和结合于其它毒物(尤其是美沙酮和美沙芬)的适体。

本发明的适体可以用常规方法进行制备，例如人工全合成或PCR方法。

本发明核酸适体(Aptamer)是可以折叠成三维结构的、通过空间构型互补与靶分子结合的一段短的单链寡核苷酸序列,即单链DNA(ssDNA)或RNA。

另外,本发明适体可体外人工化学合成，具有精确性高、重复性好、无批次间差异、变性与复性可逆、稳定性好并易于长期保存等优点。

此外，在本发明中，还可将多功能的分子或可检测标记物准确、有效地连接到适配体特定位点，从而使得适体更适合对靶分子进行检测。

研究表明，适体与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似，但本发明适体对靶分子(氯胺酮)具有极高的特异性和亲和力，并且易于进行功能化修饰，故非常适合制备灵敏、快速、可靠的现场检测制剂和测试片。

本发明的核酸适体是从随机的序列库中筛选出来，具有广泛的适用性和高效率。

本发明还提供了基于本发明高亲和性和特异性核酸适体的传感器。胶体金纳米颗粒(GNPs)具有独特的电子、光电和催化特征，使得它的应用十分引人注目。在以往的研究中，用胶体金来开发核酸适体生物传感器，胶体金通常用来作为重要的显色物质，因为胶体金颗粒具有很强的可见颜色特征。

在本发明中，可通过胶体金交联的核酸适体与互补序列杂交的原理，来检测靶分子(氯胺酮)。

检测制品

本发明还提供了可用于检测氯胺酮的检测制品。

在本发明中，代表性的检测制品包括(但并不限于)：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。

在本发明中，检测试剂的形式没有特别限制，可以是固态、或液体，也可以是微球、胶体等形式。

一类特别有用的检测试剂是本发明适体与可检测标记物形成的偶联物。

在本发明中，可检测标记物的种类没有特别限制，代表性的可检测标记物包括(但并不限于)：生物素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、放射性同位素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、受体、或其组合。

在另一优选例中，所述的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的化学荧光基团包括Eva Green、罗丹明、FITC、TRITC、或其组合。

在另一优选例中，放射性同位素包括³²P、¹²⁵I、³⁶S等。

在另一优选例中，所述的化学发光基团包括鲁米诺等。

在本发明中，一类特别优选的检测制品是核酸芯片。在所述核酸芯片上，通常特定有多种探针，其中，所述芯片包括本发明的特异性针对氯胺酮的核酸适体，利用本发明适体与氯胺酮可形成“适体-氯胺酮”二元复合物的原理，可检测样本中所含氯胺酮的存在与否以及含量。

一种优选的检测氯胺酮的芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸，所述的寡核苷酸的序列SEQ ID NO:1-4中任一所示的序列。其中，所述固相载体没有特别限制，可采用基因芯片领域的各种常用材料，代表性的固相载体包括但不限于：尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

层析侧流片

一种优选的便于现场快速检测的检测制品是利用本发明适体所制备的层析侧流片。

在本发明中，一种优选的检测试剂是利用侧流原理的层析侧流片(板)或层析试纸条。

本发明的一种层析侧流片(或试纸条)的结构如图6所示，其中包括：1样品垫，2适体释放垫，3检测线，4反应膜，5对照线，6吸收垫，和7背衬。

在本发明中，所述侧流片的各组成元件(或组件)可选用本领域已有的材料制成。

为了便于理解本发明，给出本发明层析侧流片的检测原理。应理解，本发明的保护范围并不受该原理的影响或限制。

如果待测样品中含有氯胺酮，则氯胺酮将与本发明核酸适体结合形成“核酸适体-氯胺酮”复合物，一起沿硝酸纤维膜向前流动，到达检测线位置时，被固定在膜上的捕获剂捕获(例如可将适体带有生物素标记物，而检测线带有亲和素)，形成有色的条带，则为阳性，反之，则为阴性。此外，对照线(或质控线)用于说明检测系统工作正常。

当然，也可以采用其他方式来检测“核酸适体-氯胺酮”复合物的形成与否和/或数量。

本发明的检测板结构简单、轻便，易于携带，可以现场检测，而且不需要昂贵的设备。使用本发明的检测板检测氯胺酮，整个测试可在3-5分钟内完成，检测的灵敏度可达约5-10ng(例如5ng/ml)，与其他常见药物、毒品没有交叉反应。

检测时，可平放检测板，将试样滴在滤样纸上，适量试样(通常约120μl)，3～5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果，

阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；

阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；

无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。

如果检测线较浅于质控线说明被测者吸食过此毒品但已代谢到末尾或用量较小，所以质控线也是检测板判别吸毒状况的标准。

检测试剂盒

本发明还提供了可用于检测氯胺酮的检测试剂盒。

在本发明中，检测试剂盒中可含有本发明的核酸适体、偶联物、复合物(作为对照品或标准品)、检测试剂、和/或检测芯片。

所述的试剂盒可用于检测本发明的核酸适配体-氯胺酮复合物，从而用于检测氯胺酮这类小分子毒物。

此外，所述的试剂盒中还可包括任选的用于检测的其他试剂，例如用于显色等所需的各种试剂，包括但不限于：酶、对照液、显色液等。

所述的试剂盒中还可包括使用说明书。优选地，所述说明书中可包括标准曲线等信息。

本发明的主要优点包括：

1.灵敏度高，达到亚微摩尔水平，比单克隆抗体的检测方法灵敏度要高出至少10-20倍。

2.特异性强，经特异性测试中，对提供的数十种常见毒品和药物，尤其是美沙酮和美沙芬，在一定的浓度范围内进行交叉实验，测试结果无交叉反应。

3.简便快速，一次性扫描检测时间仅为3-5分钟。

4.质量稳定可靠，产品有效期长达两年或以上。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用实验方法：

材料与方法：

1.1材料：

DNA序列，实验中所使用的DNA序列如表1所示,均由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 DNA序列

注：ssDNA Library为78bp，两端为引物结合区，

40N表示ssDNA库的随机区，B代表生物素，F代表荧光

1.2试剂

M-280 Tosylactivated(Dynal)磁珠购于Life technologies；链霉亲和素磁珠、LB-Agarose、pMD18-Vector和50bp DNA Marker都购于Sigma公司；2×PCR Mix、感受态细胞DH5α购自天根生物有限公司；修饰的氯胺酮购于上海市唯卓生物科技有限公司；96孔板(Corning)购于上海百赛生物技术有限公司；其它试剂均为国外或国产分析纯。DNA序列测定于上海英骏生物技术有限公司。

1.3仪器

高速冷冻离心机(美国Thermo公司)；多功能荧光检测仪(美国BioTEK公司，Synergy 4)；Veriti PCR仪(美国AB公司)；全自动凝胶成像分析仪(英国Syngene公司)；Tanon电泳仪(广州誉维生物科技仪器有限公司)；磁力架(美国Thermo公司)；振荡培养箱(SHEL LAB)。

1.4解离常数Kd值的检测

Kd值的检测方法类似SELEX筛选过程，固定浓度的氯胺酮-磁珠(1×10⁷个)和不同浓度的适体(0–1600nM)进行孵育，反应后检测孵育前的ssDNA库、孵育后的上清(未结合的ssDNA)、洗脱液(结合的ssDNA)的荧光强度。与氯胺酮结合的ssDNA和适体浓度做出非线性饱和曲线得到Kd值，利用公式(1)，其中x为适体的浓度，y和y₀为孵育后上清和孵育前ssDNA的荧光强度。

y₀–y＝B_max*x/(Kd+x) (1)

实施例1 建立DNA适体库

选择40个碱基对的随机单链核苷酸序列，同时包括两端的PCR引物序列，这样的核酸适体库将包含10¹⁴-10¹⁵种不同的可能序列。本发明中设计的随机的核酸适体库包括：(1)中间的40个核苷酸随机序列(RND40)和(2)两端的18个核苷酸的引物，结构如图1和SEQ IDNO.:5所示：

5-ATCGTCTGCTCCGTCCAATA-N40-TTTGGTGTGAGGTCGTGC-3'(SEQ ID NO.:5)。

实施例2 SELEX筛选

2.1氯胺酮-磁珠的偶联：

表面修饰甲苯磺酰基的磁珠重悬洗涤后取3×10⁹个磁珠与5mg/mL 400μL的接有氨基手臂的氯胺酮振荡孵育，37℃过夜。磁力架分离收集上清，用1×PBS(pH7.4，NaCl137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L)洗涤5次，1×PBS(含1％Tween 20)洗涤3次，1×PBS洗涤3次。洗涤后重悬于3mL PBS中，4℃保存。反应后检测偶联率。采用LC-MS/MS方法对偶联反应前后溶液测定，通过峰面积比值计算得到偶联反应后上清液中氯胺酮的残留浓度，最后得到反应偶联率。

利用LC-MS/MS方法检测了修饰氨基的氯胺酮与甲苯磺酰基活化的磁珠的偶联率，通过峰面积的比值，得到了偶联率为75％，说明偶联后的磁珠可以进行氯胺酮适体的筛选。

2.2SELEX筛选

(1)筛选

每轮筛选取氯胺酮-磁珠用1×binding buffer(PH7.4，20mmol/L Tris-HCl，137mmol/L NaCl 5mmol/L KCl，2mmol/L CaCl₂，1mol/l MgCl₂)洗涤5次后使用，1-5轮取2×10⁸个氯胺酮-磁珠，6-13轮取1×10⁸个。预先将20μM 100μL的随机ssDNA文库95℃热变性10min，迅速冷却放至室温。将ssDNA文库和洗涤后的氯胺酮-磁珠于500μL 1×bindingbuffer中振荡孵育，37℃30min。磁力架分离，弃上清液，用1×binding buffer洗涤磁珠5次后重悬于100μL 1×binding buffer中得到偶联溶液，并随着轮数的增加，洗涤磁珠次数递增到9次。在第5、10轮时用裸磁珠进行反筛。

(2)PCR扩增

PCR扩增体系：2×TaqMix 50μL，(1)中的偶联溶液48μL，上游引物F(5'-ATCGTCTGCTCCGTCCAATA-3'；SEQ ID NO.:6)和下游引物R-B(5'-Biotin-GCACGACCTCACACCA AA-3'；SEQ ID NO.:7)各1μL，PCR扩增条件：96℃预变性5min，96℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，25轮，72℃延伸10min，每轮对退火温度和循环轮数进行优化，用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，直至扩增条带清晰单一，无非特异性扩增为止。扩增结束后利用磁力架分离，收集上清PCR产物。

(3)ssDNA次级文库的制备

将纯化后PCR产物与链酶亲和素磁珠在1×B&W缓冲液(pH7.4，10mM Tris-HCL，1mMEDTA，2M NaCl)中37℃孵育30min。用1×B&W缓冲液洗2～3次，加入100mL 0.15M NaOH使dsDNA变性解链获得ssDNA，作为下一轮筛选的ssDNA次级文库，重复以上筛选13轮，所获得的结果如图1所示。

结果

经过多轮筛选，筛选得到数十个可与氯胺酮高特异性结合的核酸适体，选择第13轮筛选的产物共15个序列，用R代替R-B进行PCR，纯化后连接到pUC-T载体上，转化到感受态细胞DH5α中，用含有Amp的固体培养基过夜培养，挑出40个单一的Amp抗性转化子放入液态培养基过夜培养，由上海英骏生物技术有限公司测定序列。其中，部分与氯胺酮有高特异性结合特性的序列如下：

GGGGGGCGGGTGTAGGCTGTGTAGCGTTGTATGCTGCTCC(SEQ ID NO.:1，Apt#4)

GGGGGGACGGGGCGGGACGTGGTGTGTGGTTCGTGTCCCC(SEQ ID NO.:2，Apt#8)

GGGGGGGATACACATCACACCACACCACCCACGCTGGTCC(SEQ ID NO.:3，Apt#3)

GGGGGGGGGACACACCAAGATCCGCTGCTCCCGTCCCTCC(SEQ ID NO.:4，Apt#3.1)

实施例3 亲和性检测

取1×10⁷个氯胺酮-磁珠和裸磁珠用1×binding buffer洗涤5次。将合成好的标记荧光(FAM)的适体(SEQ ID NO.:1-4)200nmol，95℃热变性10min，迅速冷却，然后放至室温。将ssDNA适体和氯胺酮-磁珠于500μL 1×binding buffer中振荡孵育，37℃30min。孵育后磁力架分离，用1×binding buffer洗涤磁珠5次后，加100μL 1×binding buffer，80℃，7min，微摇后磁珠分离收集洗脱液。适体与裸磁珠的反应同上。用多功能荧光检测仪检测孵育前的ssDNA、孵育后的上清(未结合的ssDNA)、洗脱液(结合的ssDNA)的荧光强度。检测条件：激发波长494nm/发射波长522nm，溶液置于96孔黑板中，每孔100μL。通过分析荧光强度得到四种适体的亲和性。

结果图2所示，四种适体与氯胺酮的结合明显高于裸磁珠，即SEQ ID NOs.:1-4的结合活性都非常高。

实施例4

DNA适体探针检测毒品技术平台的建立

4.1胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原氯金酸(HAuC1₄)法制备40nm胶体金颗粒。将HAuC1₄先配制成0.01％的水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.0mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。

4.2.胶体金KET-BSA结合物复合物的制备

胶体金标记氯胺酮完全抗原(KET-BSA)的制备：取已制备的胶体金100.0mL，用0.1mol/L K₂CO₃将胶体金溶液调至pH 9.0，在磁力快速搅拌下迅速加入1.0～2.0mg氯胺酮-BSA，搅拌10min后加入1.0mL的10％的牛血清白蛋白，再继续搅拌10min。用高速冷冻离心机于4℃、12000rpm/min下离心30min，吸去上清液，沉淀即为胶体金KET-BSA结合物。用0.01mol/L、pH 8.2Tris-HCl缓冲液稀释至一定浓度后，均匀的浸在玻璃纤维膜上，37℃干燥备用。

4.3层析测试条的制备

依次将样品垫膜、玻璃纤维(固相的胶体金KET-BSA结合物)、硝酸纤维薄膜和样品垫粘贴于PVC支持材料上。在硝酸纤维素膜上用点膜机分别划检测线和质控线，检测线为氯胺酮核酸适体(SEQ ID NO.:1、2、3或4，0.8mg/mL)，质控线(C线)为鼠抗BSA单抗(1.0mg/mL)，干燥后以封闭液1％OVA(卵清蛋白)0.01mol/L PBS封闭2小时；用0.01mol/L PBS洗涤3次，真空干燥后切成0.4cm×6.0cm的测试条。

4.4试剂盒的组装

将上述免疫层析测试条置于塑料盒内，加样孔对准检测条样品垫位置，压紧后组装成氯胺酮检测试剂盒，加入干燥剂密封保存。

4.5检测盒检测原理

如图6所示，本实施例主要采用核酸适体和层流检测技术。即尿样中的氯胺酮与胶体金标记的(KET-BSA)竞争性地与固相于硝酸纤维膜上的氯胺酮核酸适体结合，通过观察窗检测区(T)位置有无紫红色带进行判断检测结果。无论样品中有无氯胺酮成分，胶体金标记的(KET-BSA)都会与质控区抗BSA抗体相结合，形成一条C线。

4.6结果判断

从密封袋中取出试剂盒，用塑料吸管垂直滴加3滴样本(尿样、唾液、血样等约120μl)于加样孔内，在5分钟时间内读取检测结果(见图6)。

阳性(+)：仅在质控区(C)出现一条紫红色带，在检测区“T”位置均未出现紫红色带,说明氯胺酮为阳性。阳性结果表明：样品中氯胺酮浓度均在检测阈值之上。

阴性(-)：如在质控区(C)出现一条紫红色带，仅在检测区“T”出现的紫红色带，说明氯胺酮为阴性。阴性结果表明：氯胺酮浓度均在检测阈值之下。检测区(T)的紫红色带可显现出颜色深浅的现象，在规定的观察时间内，无论该色带颜色深浅，应判定为阴性结果。阴性结果表明：氯胺酮浓度均在检测阈值之下。

无效：本设计的质控区(C)有两个目的，一是无论样本中是否含有毒品成分，胶体金标记的(KET-BSA)总能与固相于质控区(C)硝酸纤维素膜上的鼠抗BSA抗体结合，在质控区(C)处形成一条紫红色带，该色带是样本阳性或阴性的指示线。二是指示检测过程是否正常和试剂盒是否变质的标准。若质控区(C)没有出现色带，无论T线位置是否出现色带，检测结果均为无效，应重新换取试剂盒检测。

实施例5 核酸适体的特异性

5.1选用的交叉反应物质为美沙酮、美沙芬、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA、吗啡、可待因、海洛因、福尔可定、单乙酰吗啡、二氢可待因、二氢埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬太尼、曲马多、右丙氧芬、纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、可乐宁、洛非西丁、东莨菪碱、益安口服液、正通宁片、扑热息痛、阿斯匹林、布洛芬、阿米替林、丙米嗪、氯丙嗪、异丙嗪、水合氯醛、安定、三唑仑、阿普唑仑、苯巴比妥、速可眠、异戊巴比妥、咖啡因、氟哌酸、先锋IV、黄连素、乳糖、普鲁卡因、康复新胶囊、水合氯醛、奥复沙星、非那西丁、去痛片、可卡因、度冷丁、麻黄素、左旋麻黄素、右旋麻黄素、蒂巴因、四氢大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙诺啡、苯丙醇胺和苯乙胺。

将上述检测物质配制成一定浓度的溶液，用实施例4所述的试剂盒进行检测。

结果表明：核酸适体检测试剂(SEQ ID NO.:1-4中每一种)都仅与氯胺酮发生反应，与其他物质没有交叉反应，氯胺酮核酸适体检测试剂盒具有特异性强、准确可靠的性能。之后再进行Kd值的检测。

5.2由于氯胺酮与美沙酮、美沙芬的交叉反应最常见，因此进一步利用竞争性结合法检测在美沙酮和美沙芬存在下，SEQ ID NOs.:1-4的特异性，结果显示(图3)，可见在美沙酮、美沙芬的存在下不会影响适体对氯胺酮的检测，具有很强的特异性。

Kd值用GraphPad Prism 6.0拟合计算得到，Apt#8、Apt#4的Kd值分别为0.66μM和0.59μM(图4)。目前，针对小分子筛选得到的适体Kd值一般在1-10μM，而本发明适体的Kd值达到了亚微摩尔级，实现了重大的突破。

实施例6

核酸适体的灵敏度

灵敏度测试：在空白尿样中添加氯胺酮，分别配制成一系列梯度浓度(1.0～2000.0ng/mL)的溶液来测试氯胺酮试剂盒。

结果显示本发明核酸适体的氯胺酮的最低检测灵敏度均为10.0ng/mL以下。此外，SEQ ID NO.:1-2所示的适体则达到了1-5ng/ml，可见在极低浓度下，本发明核酸适体也能灵敏地检出氯胺酮。与胶体金标记氯胺酮单克隆抗体的免疫检测试剂盒相比，其灵敏度高出至少10-20倍。

上述试验结果表明，本发明首次建立了可用于筛选特异性识别毒品、毒物小分子的DNA适体的筛选平台，并成功研发出对氯胺酮有非常高特异性和亲和力的核酸适体。本发明核酸适体与其它药物、毒品，尤其是美沙酮和美沙芬不发生任何交叉反应，证实了核酸适体具有高度的特异性。本发明提供的核酸适体和检测试剂盒比单克隆抗体的检测的灵敏度要高出至少10-20倍，此外，本发明特异性、稳定性、快速检测和现场检测等方面，也具有显著的技术优点。

由于本发明具有重复性好、无批次间差异等特点，因此在毒品、毒物的检测方面具有广阔的前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (20)

1.一种核酸适体，其特征在于，所述的适体特异性结合于氯胺酮；

并且，所述的特异性结合指所述适体结合于氯胺酮但不结合于以下任何一种物质：美沙酮、美沙芬、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA、吗啡、可待因、海洛因、福尔可定、单乙酰吗啡、二氢可待因、二氢埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬太尼、曲马多、右丙氧芬、纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、可乐宁、洛非西丁、东莨菪碱、益安口服液、正通宁片、扑热息痛、阿斯匹林、布洛芬、阿米替林、丙米嗪、氯丙嗪、异丙嗪、水合氯醛、安定、三唑仑、阿普唑仑、苯巴比妥、速可眠、异戊巴比妥、咖啡因、氟哌酸、先锋IV、黄连素、乳糖、普鲁卡因、康复新胶囊、水合氯醛、奥复沙星、非那西丁、去痛片、可卡因、度冷丁、麻黄素、左旋麻黄素、右旋麻黄素、蒂巴因、四氢大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙诺啡、苯丙醇胺或苯乙胺；

并且，所述的适体的序列如SEQ ID NO.: 1、2、3、或4所示。

2.如权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，所述的适体带有可检测标记物。

3.如权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，所述的适体是分离的或纯化的。

4.如权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，所述的适体的纯度≥90%。

5.一种偶联物，其特征在于，所述偶联物包括权利要求1所述的核酸适体以及与所述核酸适体相连的可检测标记物。

6.如权利要求5所述的偶联物，其特征在于，所述的可检测标记物包括生物素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、放射性同位素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、受体、或其组合。

7.一种复合物，其特征在于，所述的复合物是(a)权利要求1所述的核酸适体或权利要求5所述的偶联物与(b)氯胺酮所形成的复合物。

8.一种检测制品，其特征在于，所述检测制品含有权利要求1所述的核酸适体或权利要求5所述的偶联物。

9.如权利要求8所述的检测制品，其特征在于，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。

10.如权利要求8所述的检测制品，其特征在于，所述的检测制品用于检测氯胺酮。

11.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1所述的核酸适体，权利要求5所述的偶联物和/或权利要求8所述的检测制品。

12.如权利要求1所述的核酸适体或权利要求5所述偶联物的用途，其特征在于，用于制备检测氯胺酮的检测制品或试剂盒。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。

14.一种检测氯胺酮的方法，包括以下步骤：

(a) 提供待检测的样品；

(b) 将该样品与权利要求1所述的核酸适体或权利要求5所述的偶联物混合，形成混合物；

(c) 检测所述混合物中“氯胺酮-核酸适体复合物”的存在与否，其中如果存在所述复合物，则表明所述样品中存在氯胺酮；如果不存在所述复合物，则表明所述样品中不存在氯胺酮。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的检测包括定性检测和定量检测。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，包括与标准品或标准曲线进行比较，从而确定在所述混合物中是否存在复合物，和/或所述复合物的数量。

17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法用于毒品检测、药物检测或食品安全检测。

18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法用于毒品检测。

19.一种核酸序列，所述核酸序列是序列如SEQ ID NO.: 1-4所示序列的反义序列。

20.一种组合物，所述的组合物含有(i)载体以及(ii)权利要求1所述的核酸适体、或权利要求5所述的偶联物。

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