WO2016181836A1 - 標識ペプチドおよびその使用 - Google Patents

標識ペプチドおよびその使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2016181836A1
WO2016181836A1 PCT/JP2016/063175 JP2016063175W WO2016181836A1 WO 2016181836 A1 WO2016181836 A1 WO 2016181836A1 JP 2016063175 W JP2016063175 W JP 2016063175W WO 2016181836 A1 WO2016181836 A1 WO 2016181836A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
integer
protein
labeled peptide
fusion protein
residue
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/063175
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
善和 舛廣
Original Assignee
学校法人日本大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人日本大学 filed Critical 学校法人日本大学
Publication of WO2016181836A1 publication Critical patent/WO2016181836A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to labeled peptides and uses thereof.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2015-095480 filed in Japan on May 8, 2015, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Patent Document 1 The motif disclosed in Patent Document 1 that can suppress the degradation of the protein contributes to the stabilization of the protein. However, since a plurality of homologous amino acid sequences exist in nature, it is used as a tag for protein detection or purification. Not suitable for use.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a technique capable of stabilizing a protein and easily detecting the protein. Another object of the present invention is to provide a labeled peptide, a nucleic acid, a vector, a fusion protein, a method for stabilizing the target protein, a specific binding substance, a detection method for the fusion protein, and a purification method for the fusion protein.
  • a labeled peptide comprising a non-naturally occurring amino acid sequence represented by the following formula [1].
  • each X independently represents an aspartic acid residue or a glutamic acid residue
  • F represents a phenylalanine residue
  • N represents an asparagine residue
  • m represents an integer of 0 to 5.
  • N represents an integer of 1 to 5
  • p represents an integer of 1 to 20
  • q represents an integer of 1 to 4.
  • a fusion protein of the target protein and the labeled peptide according to (1) A nucleic acid encoding the fusion protein according to (4).
  • a vector comprising the nucleic acid according to (5).
  • a method of stabilizing the target protein comprising a step of binding a labeled peptide comprising a non-naturally occurring amino acid sequence represented by the following formula [1] to the target protein.
  • each X independently represents an aspartic acid residue or a glutamic acid residue
  • F represents a phenylalanine residue
  • N represents an asparagine residue
  • m represents an integer of 0 to 5.
  • N represents an integer of 1 to 5
  • p represents an integer of 1 to 20
  • q represents an integer of 1 to 4.
  • the fusion protein comprising the step of bringing a specific binding substance for the labeled peptide into contact with a fusion protein of the target protein and a labeled peptide comprising a non-naturally occurring amino acid sequence represented by the following formula [1] Detection method.
  • XFNXN m X p (XFNXN ) n X q [1]
  • each X independently represents an aspartic acid residue or a glutamic acid residue
  • F represents a phenylalanine residue
  • N represents an asparagine residue
  • m represents an integer of 0 to 5.
  • N represents an integer of 1 to 5
  • p represents an integer of 1 to 20
  • q represents an integer of 1 to 4.
  • the fusion protein comprising a step of bringing a specific binding substance for the labeled peptide into contact with a fusion protein of the target protein and a labeled peptide consisting of a non-naturally occurring amino acid sequence represented by the following formula [1] Purification method.
  • XFNXN m X p (XFNXN ) n X q [1]
  • each X independently represents an aspartic acid residue or a glutamic acid residue
  • F represents a phenylalanine residue
  • N represents an asparagine residue
  • m represents an integer of 0 to 5.
  • N represents an integer of 1 to 5
  • p represents an integer of 1 to 20
  • q represents an integer of 1 to 4.
  • the present invention it is possible to stabilize and easily detect a protein that is originally promptly degraded by proteasome, autophagy, and other proteolytic enzymes. Furthermore, it can be utilized as a tool for the purification, functional analysis and other molecular biological analysis of the protein.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram explaining one Embodiment of the detection method of a fusion protein. It is the image which compared the expression level of the fusion protein obtained from pcDNA in Example 1 by the Western blotting method. It is the image which compared the expression level of the fusion protein obtained from pcDNA in Example 2 by the western blotting method. It is the image which compared the expression level of the fusion protein obtained from pcDNA in Example 3 by the Western blotting method. It is the image which compared the expression level of the fusion protein obtained from pcDNA in Example 4 by the Western blotting method.
  • the present invention provides a labeled peptide consisting of a non-naturally occurring amino acid sequence represented by the following formula [1].
  • X each independently represents an aspartic acid residue or a glutamic acid residue
  • F represents a phenylalanine residue
  • N represents an asparagine residue
  • m represents an integer of 0 to 5
  • n represents an integer of 1 to 5
  • p represents an integer of 1 to 20
  • q represents an integer of 1 to 4.
  • a fusion protein described later can be prevented from being decomposed and stabilized. Furthermore, since it is an amino acid sequence that does not exist in nature, the protein fused with the labeled peptide can be detected with high sensitivity and purified with high purity by using a specific binding substance for the labeled peptide described later. Can do.
  • protein is stabilized means that by adding the standard peptide of the present embodiment, the protein becomes difficult to be degraded by a proteolytic enzyme or the like, or the protein synthesis rate is increased. means. For example, when a protein is introduced into a cell, it means that the half-life of the protein is longer than usual. Furthermore, whether or not the protein is stabilized can be evaluated by preparing a protein fused with a labeled peptide and a protein not fused, and detecting the protein using a normal Western blotting method.
  • non-naturally occurring amino acid sequence means an amino acid sequence that does not exist in a naturally occurring protein.
  • an nr database ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/
  • blastp a labeled peptide sequence
  • the alignment score is 80 or less, more preferably 60 or less, and even more preferably 50 or less. It means that only protein hits.
  • the number of glutamic acid residues represented by X in the formula [1] is preferably larger than the number of aspartic acid residues.
  • M is preferably 0-2.
  • n is preferably 1.
  • p is preferably 8.
  • q is preferably 4.
  • Specific examples of the labeled peptide include labeled peptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 10, 18, and 20.
  • the present invention provides a labeled peptide comprising a non-naturally occurring amino acid sequence represented by the following formula [2].
  • the labeled peptide of the present embodiment is a methionine residue on the N-terminal side of the labeled peptide represented by the formula [1] from the N-terminal toward the C-terminal. And valine residues added in this order.
  • the fusion protein having the labeled peptide of the present embodiment at the N-terminus has an increased expression level and improved stability.
  • M represents a methionine residue and V represents a valine residue.
  • X, F, N, m, n, p, and q represent the meanings as described above.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding the labeled peptide described above.
  • the nucleic acid encoding the labeled peptide is, for example, a nucleic acid consisting of the base sequence described in SEQ ID NOs: 9, 17, 19 or 80% or more, for example, 85% with the base sequence described in SEQ ID NOs: 9, 17, 19
  • the base sequences shown in SEQ ID NOs: 9, 17, and 19 are the base sequences of nucleic acids that encode labeled peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 18, and 20 used in Examples described later.
  • the present invention provides a vector comprising the nucleic acid described above.
  • the vector of this embodiment is preferably an expression vector.
  • the expression vector is not particularly limited. For example, plasmids derived from E.
  • coli such as pBR322, pBR325, pUC12, and pUC13; plasmids derived from Bacillus subtilis such as pUB110, pTP5, and pC194; plasmids derived from yeast such as pSH19 and pSH15; Bacteriophages; viruses such as adenoviruses, adeno-associated viruses, lentiviruses, vaccinia viruses, baculoviruses; and modified vectors thereof. These may be used for preparing a fusion protein expression vector.
  • the promoter for expressing the labeled peptide is not particularly limited.
  • animal cells such as EF1 ⁇ promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, HSV-tk promoter, etc.
  • Expression promoter cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, REF (rubber elongation factor) promoter and other expression promoters, polyhedrin promoter, p10 promoter and other insect cells as hosts
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • REF rubber elongation factor promoter
  • polyhedrin promoter polyhedrin promoter
  • p10 promoter p10 promoter and other insect cells as hosts
  • a promoter for expression as described above can be used. These promoters can be appropriately selected depending on the host that expresses the fusion protein.
  • the above-described expression vector may further have a multicloning site, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a replication origin, and the like.
  • the present invention provides a fusion protein of a target protein and the above-described labeled peptide.
  • the target protein exists as a fusion protein bound to the above-described labeled peptide, so that even when introduced into a cell, degradation by a proteolytic enzyme or the like is suppressed and stabilized. be able to.
  • the target protein of the present embodiment is not particularly limited, and examples thereof include a protein localized in the nucleus of the cell, a protein localized in the cytoplasm or cell membrane, and the like.
  • proteins localized in the nucleus include transcription factors such as Sox-2, Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, and Glis1, which are cell reprogramming factors, and DP-1, p53 that are factors related to the cell cycle, and the like.
  • Transcription factors such as GAL4 and Foxp3 that activate transcription, receptors such as RAR ⁇ that is a nuclear receptor, and the like.
  • proteins localized in the cytoplasm or cell membrane include factors such as Socs3, Dkk1, and Wnt3, which are factors related to signal transduction.
  • the position of fusion between the target protein and the target peptide is not particularly limited as long as the target protein is not degraded and the activity of the target protein is not affected.
  • the target peptide may be located anywhere in the fusion protein, and the target protein may be located on the N-terminal side, the C-terminal side of the target protein, or inside the target protein. The effect of stabilizing can be exhibited.
  • the fusion protein of this embodiment may further have a cell-permeable motif.
  • the cell permeability motif include MTM (Membrane translocating motif).
  • MTM is a peptide consisting of an amino acid sequence derived from the hydrophobic signal sequence region of human FGF4 (Fibroblast growth factor 4), which is a fibroblast growth factor.
  • FGF4 Fibroblast growth factor 4
  • MTM is a peptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 ( Hawiger et al., 2005 Nature Medicine vol.11 No. (8): 892-8), and the like, but is not limited thereto. Since the fusion protein has MTM, it has cell membrane permeability, can be easily introduced into the cell membrane, and can function without losing activity.
  • the position of MTM fusion is not particularly limited, and may be linked to either the N-terminal side or the C-terminal side of the fusion protein.
  • the fusion protein can be prepared, for example, by the following method. First, a host is transformed with an expression vector containing a nucleic acid encoding a fusion protein. Subsequently, the host is cultured to express the fusion protein. Conditions such as medium composition, culture temperature, time, addition of inducer, etc. can be determined by those skilled in the art according to known methods so that the transformant grows and the fusion protein is efficiently produced. For example, when an antibiotic resistance gene is incorporated into an expression vector as a selection marker, a transformant can be selected by adding an antibiotic to the medium. Subsequently, the fusion protein expressed by the host is purified by an appropriate method to obtain the fusion protein.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding the fusion protein described above.
  • a protein with improved stability can be expressed.
  • the present invention provides a vector comprising a nucleic acid encoding the fusion protein described above.
  • the vector of this embodiment is preferably an expression vector.
  • Examples of the expression vector include the same vectors as those containing a nucleic acid encoding the above-described labeled peptide.
  • the present invention provides a method for stabilizing the protein of interest comprising the step of binding the above-described labeled peptide to the protein of interest.
  • the step of binding the labeled peptide to the target protein can be performed by linking a nucleic acid fragment encoding the target protein and a nucleic acid fragment encoding the labeled peptide by ligation or the like.
  • the fusion protein obtained by expressing the above nucleic acid has improved stability compared to the target protein that does not have a labeled peptide.
  • the present invention provides a specific binding substance for the above-mentioned labeled peptide.
  • Specific binding substances of the present embodiment include antibodies, antibody fragments, aptamers, receptors, etc. against the above-mentioned labeled peptides.
  • An antibody can be prepared, for example, by immunizing a rodent animal such as a mouse with a labeled peptide as an antigen. Further, for example, it can be prepared by screening a phage library. Examples of antibody fragments include Fv, Fab, scFv and the like.
  • An aptamer is a substance having a specific binding ability to a labeling substance.
  • aptamers include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • the nucleic acid aptamer having a specific binding ability to the labeled peptide can be selected, for example, by a systematic evolution of ligand by exponential enrichment (SELEX) method.
  • Peptide aptamers having specific binding ability to the labeled peptide can be selected by, for example, the two-hybrid method using yeast.
  • the above-described fusion protein can be detected with high sensitivity.
  • the fusion protein can be purified with high purity.
  • the present invention provides a method for detecting the fusion protein comprising the step of bringing the fusion protein described above into contact with a specific binding substance for the labeled peptide described above.
  • the above-mentioned fusion protein can be easily detected because the above-mentioned labeled peptide consists of an amino acid sequence that does not exist in nature.
  • the step of bringing the specific binding substance into contact with the fusion protein can be performed, for example, as follows. First, the host in which the fusion protein is expressed is suspended in a buffer and destroyed by a method such as ultrasonic disruption. Subsequently, for example, the crushed liquid is separated by the difference in molecular weight by SDS (Sodium dodecyl sulfate) -polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) method. Furthermore, the protein separated by electrophoresis is transferred from the gel to the membrane, and the membrane is coated with a blocking agent. Subsequently, a specific binding substance for the above-mentioned labeled peptide is brought into contact with the fusion protein on the membrane and detected.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating one embodiment of a method for detecting a fusion protein.
  • the primary antibody 4 against the aforementioned labeled peptide derived from a mouse is used, the primary antibody 4 is directly bound to the fusion protein 3.
  • the labeled secondary antibody 5 labeled with an antibody that binds to a mouse-derived protein can be reacted with the primary antibody 4 to finally detect the fusion protein 3 (see FIG. 1).
  • a known method such as a system using an enzyme or a system using fluorescence can be used.
  • a secondary antibody labeled with HRP (Horseadish Peroxidase) or AP (Alkaline Phosphatase) is reacted with the primary antibody and detected by color development or chemiluminescence due to enzyme activity.
  • Detection by chemiluminescence requires exposure to X-ray film or a scanner capable of detecting chemiluminescence, but it is 10 to 50 times more sensitive than the color development method, so it is easy to detect trace amounts of protein. become.
  • the fluorescence method is excellent in quantification because the secondary antibody labeled with Cy3 or Cy5 is detected by fluorescence.
  • the present invention provides a method for purifying the fusion protein, comprising the step of contacting the fusion protein described above with a specific binding substance for the labeled peptide described above.
  • the above-mentioned labeled peptide consists of an amino acid sequence that does not exist in nature, the above-described fusion protein can be easily purified.
  • purification can be called “separation”, “recovery”, “adsorption” and the like.
  • the purification method of the present embodiment can be performed, for example, as follows. First, the host in which the fusion protein is expressed is suspended in a buffer and destroyed by a method such as ultrasonic disruption. Subsequently, a solid phase on which a specific binding substance for the labeled peptide is immobilized is brought into contact with a disruption solution containing the fusion protein. Then, the fusion protein can be adsorbed to the solid phase by adsorbing the labeled protein in the fusion protein to the specific binding substance for the labeled peptide.
  • the fusion protein adsorbed on the solid phase is washed with a buffer solution or the like. Thereafter, the fusion protein may be dissociated from the solid phase and recovered, for example, by changing the pH or adding a salt to the fusion protein adsorbed on the solid phase.
  • the solid phase is not particularly limited as long as it is used in the conventional purification method. For example, measurement using a bead, membrane, hollow fiber membrane, plastic substrate, well plate, slide glass, surface plasmon resonance measuring apparatus, etc. The sensor chip of an apparatus etc. are mentioned.
  • the solid phase in the form of beads, membranes, etc. may be packed in a column.
  • kozak-Met indicates a Kozak sequence.
  • the Kozak sequence is a consensus sequence that appears in eukaryotic mRNA and is mainly involved in the initiation of translation. In vertebrates, it is expressed as “(gcc) gccRccAUGG”. Among them, R (purine base / adenine or guanine) 3 bases upstream of the start codon (AUG) and G next to the start codon are considered to play an important role. ing.
  • the “AUG” part encodes the N-terminal methionine residue of the protein. This time, the base sequence represented by “ccgcc (kozak) -AUG (Met)” was used.
  • the base sequence and amino acid sequence of the labeled peptide used this time are described in SEQ ID NOs: 1 to 20 in the Sequence Listing.
  • the base sequence and amino acid sequence of human Sox2 are shown in SEQ ID NOs: 23 and 24 in the sequence listing.
  • the Flag tag is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, and detection by Western blotting becomes extremely easy by peptideizing this sequence (HRP fusion Flag antibody used for Western blotting (SIGMA)). Can detect Flag tag fusion proteins with extremely high sensitivity.).
  • Each single-cloned E. coli containing each plasmid was cultured using LB medium containing ampicillin. After collection by centrifugation, the expression plasmid was purified using alkaline SDS and PEG precipitation.
  • HEK293T cells (cells obtained by adapting human embryonic kidney (HEK) cells to serum-free medium and making them floating cells) Dulbecco's Modi-ed Eagle Medium (DMEM) containing 10% FBS (antibiotics) As well as penicillin and streptomycin).
  • DMEM Dulbecco's Modi-ed Eagle Medium
  • FBS antibiotics
  • penicillin and streptomycin penicillin and streptomycin
  • Transfected HEK293T cells were transfected with the expression plasmids of Test Examples 1-27.
  • As the expression plasmid 200 ng of each of the above-mentioned ones were used, and for the correction, pcDNA expression plasmids were added to a total of 3.0 ⁇ g. Further, TE buffer 20 ⁇ L (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid ( Ethylenediaminetic acetic acid (EDTA)) 2 M calcium chloride solution 3 ⁇ L was added.
  • HBS buffer (20 mM HEPES (pH 7.1), 280 mM NaCl, 1.5 mM Na 2 HPO 4 ) was used as a transfection reagent.
  • 20 ⁇ L of HBS buffer was slowly added in two portions and suspended by stirring.
  • the mixture was allowed to stand for 30 minutes. Meanwhile, the cell culture medium was changed.
  • the complex of DNA in the expression plasmid solution and calcium phosphate was added to the medium and mixed slowly. Placed in a CO 2 incubator, the culture was continued under conditions of 5% CO 2 concentration and 37 ° C.
  • Detection of fusion protein by Western blotting (1) Preparation of cell extract After transfection, discard the medium from the cells that have been cultured for 24 hours, add 1 mL phosphate buffered saline (PBS), and lightly The cells were detached by pipetting and transferred to a 1.5 mL tube. Cells were collected by centrifugation at 1.5 krpm, and the supernatant was discarded.
  • PBS phosphate buffered saline
  • NET-N + buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 1 mM EDTA (pH 7.9), 150 mM NaCl, 1% NP-40 and protease inhibitor cocktail added immediately before use) to the precipitated cells And extracted by pipetting several times and centrifuged at 13.5 krpm and 4 ° C. The supernatant was transferred to another new 1.5 mL tube and 80 ⁇ L of 2 ⁇ SDS-PAGE sample buffer was added and stirred. It was boiled at 98 ° C. for 1 minute to prepare a sample for electrophoresis.
  • the expression of human Sox2 fused with the labeled peptides of SEQ ID NOs: 2, 10, 18, and 20 was particularly high. Therefore, it was revealed that the labeled peptide of the present invention has sufficient degradation resistance activity in a protein fused with human Sox2.
  • HDP-1 ⁇ C395 refers to a mutant lacking the C-terminal region having resistance to proteolysis in human DP-1 protein.
  • the cDNA of “hDP-1 ⁇ C395” was amplified by PCR using the following primers (Forward and Reverse 1). Further, cDNAs encoding the fusion proteins shown in Test Examples 57 and 58 in Table 3 were amplified by PCR using the following primers (Forward and Reverse 2).
  • the PCR reaction solution had the following composition.
  • the PCR reaction solution having the above composition was reacted in the following cycle.
  • the PCR amplification product was treated with a restriction enzyme, ligated and inserted into a pcDNA3-Flag vector treated with the same restriction enzyme. Insertion was confirmed by treatment with a restriction enzyme after miniprep. The sequence was confirmed by sequencing.
  • proteins can be stabilized and easily detected or purified.
  • a rapidly degrading protein can be stabilized and used as a tool for functional analysis or other molecular biology.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本発明は、下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドである。　(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　［１］ ［式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０～５の整数を表し、ｎは１～５の整数を表し、ｐは１～２０の整数を表し、ｑは１～４の整数を表す。］

Description

標識ペプチドおよびその使用
　本発明は、標識ペプチドおよびその使用に関する。
　本願は、２０１５年５月８日に、日本に出願された特願２０１５－０９５４８０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、細胞膜透過性タンパク質を応用したタンパク質療法の開発が顕著である。しかし、タンパク質を用いた療法では、細胞や個体に投与後、タンパク質がプロテオソームやファゴソーム、オートファジーやタンパク質分解酵素等によって分解され、その結果、投与タンパク質があまり効力を発揮しない場合や、極めて頻繁に投与する必要が生じる場合が多い。そのため、タンパク質の分解を抑制し、安定化する方法が求められている。
　これまでに、タンパク質の分解を抑制する活性を有するアミノ酸配列として、ネイスセリア・メンニギチジスのＰ６４Ｋ抗原のＮ末端領域の最初の４７アミノ酸から誘導されたモチーフ等が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
特許第４０７１２８２号公報
　特許文献１に開示されているタンパク質の分解を抑制可能なモチーフは、タンパク質の安定化に寄与するが、相同性を有するアミノ酸配列が天然に複数存在するため、タンパク質の検出又は精製用のタグとしての用途には適さない。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、タンパク質を安定化させ、かつ、容易に検出することができる技術を提供することを目的とする。また、本発明は、標識ペプチド、核酸、ベクター、融合タンパク質、対象タンパク質を安定化する方法、特異的結合物質、融合タンパク質の検出方法および融合タンパク質の精製方法を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
（１）下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチド。
　(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　　［１］
［式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０～５の整数を表し、ｎは１～５の整数を表し、ｐは１～２０の整数を表し、ｑは１～４の整数を表す。］
（２）（１）に記載の標識ペプチドをコードする核酸。
（３）（２）に記載の核酸を含むベクター。
（４）対象タンパク質と（１）に記載の標識ペプチドとの融合タンパク質。
（５）（４）に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（６）（５）に記載の核酸を含むベクター。
（７）対象タンパク質に、下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドを結合する工程を備える前記対象タンパク質を安定化する方法。
　(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　　［１］
［式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０～５の整数を表し、ｎは１～５の整数を表し、ｐは１～２０の整数を表し、ｑは１～４の整数を表す。］
（８）（１）に記載の標識ペプチドに対する特異的結合物質。
（９）対象タンパク質と、下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の検出方法。
　(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　　［１］
［式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０～５の整数を表し、ｎは１～５の整数を表し、ｐは１～２０の整数を表し、ｑは１～４の整数を表す。］
（１０）対象タンパク質と、下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の精製方法。
　(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　　［１］
［式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０～５の整数を表し、ｎは１～５の整数を表し、ｐは１～２０の整数を表し、ｑは１～４の整数を表す。］
　本発明によれば、本来プロテアソーム、オートファジーやその他タンパク質分解酵素などによって速やかに分解されるタンパク質を安定化させ、かつ、容易に検出することができる。さらに、上記タンパク質の精製、機能解析やその他分子生物学的な解析のためのツール等として活用することができる。
融合タンパク質の検出方法の一実施形態を説明する模式図である。 実施例１におけるｐｃＤＮＡから得られた融合タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により比較した画像である。 実施例２におけるｐｃＤＮＡから得られた融合タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により比較した画像である。 実施例３におけるｐｃＤＮＡから得られた融合タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により比較した画像である。 実施例４におけるｐｃＤＮＡから得られた融合タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により比較した画像である。
　以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
＜標識ペプチド＞
（第一実施形態）
　一実施形態において、本発明は、下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドを提供する。
　(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　　［１］
式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０～５の整数を表し、ｎは１～５の整数を表し、ｐは１～２０の整数を表し、ｑは１～４の整数を表す。
　本実施形態の標識ペプチドによれば、後述の融合タンパク質を分解から防ぎ安定化させることができる。さらに、天然に存在しないアミノ酸配列であることから、後述の標識ペプチドに対する特異的結合物質を用いることで、標識ペプチドと融合したタンパク質を高感度で検出することができ、また高純度で精製することができる。
　本明細書において、「タンパク質が安定化した」とは、本実施形態の標準ペプチドを付加することにより、タンパク質がタンパク質分解酵素等によって分解されにくくなること、又は、タンパク質の合成速度が早まることを意味する。例えば、細胞内にタンパク質を導入した場合に、当該タンパク質の半減期が通常よりも長いことを意味する。さらに、タンパク質が安定化したか否かについては、標識ペプチドを融合したタンパク質および融合していないタンパク質を作製し、通常のウエスタンブロッティング法を用いて、タンパク質を検出することにより評価することができる。
　本明細書において、「天然に存在しないアミノ酸配列」とは、天然に存在するタンパク質内に存在しないアミノ酸配列を意味する。例えば、標識ペプチド配列をクエリーとして、２０１５年２月２５日付けのｎｒデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／）を、ｂｌａｓｔｐ（ｖｅｒ.　２．２．３０）（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＝Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）プログラムを用いて検索した結果、アライメントスコアが８０以下、より好ましくは６０以下、さらに好ましくは５０以下のタンパク質しかヒットしてこないことを意味する。
　タンパク質を安定化させる活性が高い観点から、式［１］中のＸで表される、グルタミン酸残基の数はアスパラギン酸残基の数より多いことが好ましい。また、ｍは、０～２であることが好ましい。ｎは、１であることが好ましい。ｐは、８であることが好ましい。ｑは、４であることが好ましい。具体的な標識ペプチドとしては、例えば、配列番号１０、１８および２０で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドが挙げられる。
（第二実施形態）
　また、一実施形態において、本発明は、下記式［２］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドを提供する。下記式［２］で表されるように、本実施形態の標識ペプチドは、上記式［１］で表される標識ペプチドのＮ末端側に、Ｎ末端からＣ末端側に向かって、メチオニン残基およびバリン残基がこの順に付加したものである。本実施形態の標識ペプチドをＮ末端に有する融合タンパク質は、発現量が上昇し、安定性が向上している。
ＭＶ(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　　［２］
式［２］中、Ｍはメチオニン残基を表し、Ｖはバリン残基を表す。Ｘ、Ｆ、Ｎ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑは、上述したとおりの意味を表す。
＜標識ペプチドをコードする核酸＞
　一実施形態において、本発明は、上述した標識ペプチドをコードする核酸を提供する。前記標識ペプチドをコードする核酸としては、例えば、配列番号９、１７、１９に記載の塩基配列からなる核酸、又は、配列番号９、１７、１９に記載の塩基配列と８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の同一性を有し、タンパク質を安定化する活性を有するペプチドをコードする塩基配列からなる核酸等が挙げられる。なお、配列番号９、１７、１９に示す塩基配列は、後述の実施例で用いられた配列番号１０、１８、２０のアミノ酸配列からなる標識ペプチドをコードする核酸の塩基配列である。
＜標識ペプチドをコードする核酸を含むベクター＞
　一実施形態において、本発明は、上述した核酸を含むベクターを提供する。本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス等のウィルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。これらは融合タンパク質発現ベクター作製用であってもよい。
　上述の発現ベクターにおいて、標識ペプチド発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＨＳＶ－ｔｋプロモーター等の動物細胞を宿主とした発現用のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＲＥＦ（ｒｕｂｂｅｒ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）プロモーター等の植物細胞を宿主とした発現用のプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等の昆虫細胞を宿主とした発現用のプロモーター等を使用することができる。これらプロモーターは、融合タンパク質を発現する宿主に応じて、適宜選択することができる。
　上述の発現ベクターは、さらに、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
＜融合タンパク質＞
（第一実施形態）
　一実施形態において、本発明は、対象タンパク質と上述した標識ペプチドとの融合タンパク質を提供する。
　本実施形態の融合タンパク質によれば、対象タンパク質は、上述した標識ペプチドと結合した融合タンパク質として存在することで、細胞内に導入した場合でも、タンパク質分解酵素等による分解が抑制され、安定化させることができる。
　本実施形態の対象タンパク質は、特に限定されないが、例えば、細胞の核内に局在するタンパク質、細胞質又は細胞膜に局在するタンパク質等が挙げられる。核内に局在するタンパク質としては、細胞の初期化因子であるＳｏｘ－２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｇｌｉｓ１等の転写因子、細胞周期に係る因子であるＤＰ－１、ｐ５３等の転写因子、転写を活性化させる因子であるＧＡＬ４、Ｆｏｘｐ３等の転写因子、核内受容体であるＲＡＲα等の受容体等が挙げられる。細胞質又は細胞膜に局在するタンパク質としては、シグナル伝達に関連する因子であるＳｏｃｓ３、Ｄｋｋ１、Ｗｎｔ３等の因子等が挙げられる。
　本実施形態の融合タンパク質において、対象タンパク質が分解されず、かつ、対象タンパク質の有する活性等に影響がない限り、対象タンパク質と標的ペプチドとの融合の位置は特に限定されない。後述する実施例で示すように、標的ペプチドは融合タンパク質のどこに位置していてもよく、対象タンパク質のＮ末端側、Ｃ末端側又は対象タンパク質の内部のいずれに位置していても、対象タンパク質を安定化する効果を発揮することができる。
（第二実施形態）
　本実施形態の融合タンパク質は、細胞透過性のモチーフをさらに有していてもよい。細胞透過性のモチーフとしては、例えば、ＭＴＭ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ）等が挙げられる。ＭＴＭは、繊維芽細胞増殖因子であるヒトのＦＧＦ４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ４）の疎水性シグナル配列領域に由来するアミノ酸配列からなペプチドであり、例えば、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｈａｗｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．,　２００５　Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｖｏｌ．１１　Ｎｏ．（８）：８９２‐８）等が挙げられるがこれに限定されない。融合タンパク質はＭＴＭを有することで、細胞膜透過性を有し、容易に細胞膜内に導入され、活性を失うことなく機能することができる。本実施形態の融合タンパク質において、ＭＴＭの融合の位置は特に限定されず、融合タンパク質のＮ末端側又はＣ末端側のいずれに連結してもよい。
　融合タンパク質は、例えば次のような方法により作成することができる。まず、融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養して融合タンパク質を発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、融合タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現した融合タンパク質を適宜の方法により精製することにより、融合タンパク質が得られる。
＜融合タンパク質をコードする核酸＞
一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本実施形態の核酸を導入した発現ベクターを作製することで、安定性が向上したタンパク質を発現させることができる。
＜融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター＞
　一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては、上述した標識ペプチドをコードする核酸を含むベクターと同様のものが挙げられる。
＜対象タンパク質を安定化する方法＞
　一実施形態において、本発明は、対象タンパク質に、上述した標識ペプチドを結合する工程を備える前記対象タンパク質を安定化する方法を提供する。
　対象タンパク質に標識ペプチドを結合する工程は、具体的には、対象タンパク質をコードする核酸断片と、標識ペプチドをコードする核酸断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ等により連結させることにより、実施することができる。上記の核酸を発現させて得られる融合タンパク質は、標識ペプチドを有していない対象タンパク質と比較して、安定性が向上している。
＜標識ペプチドに対する特異的結合物質＞
　一実施形態において、本発明は、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を提供する。本実施形態の特異的結合物質としては、上述した標識ペプチドに対する抗体、抗体断片、アプタマー、受容体等が挙げられる。
　抗体は、例えば、マウス等のげっ歯類の動物に標識ペプチドを抗原として免疫することによって作製することができる。また、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
　アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標識ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標識ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
　詳細については後述するが、本実施形態の特異的結合物質によれば、上述した融合タンパク質を高感度に検出することができる。また、融合タンパク質を高純度に精製をすることができる。
＜融合タンパク質の検出方法＞
　一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質に、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の検出方法を提供する。
　本実施形態の検出方法によれば、上述した標識ペプチドが天然に存在しないアミノ酸配列からなることから、上述した融合タンパク質を容易に検出することができる。
　融合タンパク質に特異的結合物質を接触させる工程は、例えば、次のように実施することができる。まず、融合タンパク質を発現させた宿主を緩衝液に懸濁して超音波破砕等の方法で破壊する。続いて、例えば、破砕液をＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）法により、分子量の違いにより分離する。さらに、電気泳動で分離したタンパク質をゲルからメンブレンに移し、ブロッキング剤でメンブレン上をコーティングする。続いて、メンブレン上の融合タンパク質に、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させ、検出する。
図１は、融合タンパク質の検出方法の一実施形態を説明する模式図である。例えば、マウス由来の上述した標識ペプチドに対する一次抗体４を用いた場合、前記一次抗体４を融合タンパク質３に直接結合させる。さらに、マウス由来のタンパク質に結合する抗体に標識をつけた標識二次抗体５を前記一次抗体４に反応させて、最終的に融合タンパク質３を検出することができる（図１参照）。
　標識には酵素を用いる系、蛍光を用いる系など、公知の方法を用いることができる。例えば、酵素を用いる系では、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）や ＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）などで標識した二次抗体を一次抗体に反応させて、酵素活性による発色や化学発光により検出する。化学発光による検出には、Ｘ線フィルムへの露光検出、あるいは化学発光を検出可能なスキャナーを必要とするが、発色法に比べ１０～５０倍以上も感度が高いので、微量タンパク質の検出が容易になる。蛍光法は、Ｃｙ３やＣｙ５で標識した二次抗体を蛍光検出するので、定量性に優れている。
＜融合タンパク質の精製方法＞
　一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質に、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の精製方法を提供する。
本実施形態の精製方法によれば、上述した標識ペプチドが天然に存在しないアミノ酸配列からなることから、上述した融合タンパク質を容易に精製することができる。
　本明細書において、「精製」は、「分離」、「回収」、「吸着」等といいかえることができる。
　本実施形態の精製方法は、例えば、次のように実施することができる。まず、融合タンパク質を発現させた宿主を緩衝液に懸濁して超音波破砕等の方法で破壊する。続いて、標識ペプチドに対する特異的結合物質が固定された固相と、前記融合タンパク質を含む破砕液を接触させる。すると、融合タンパク質中の標識タンパク質が標識ペプチドに対する特異的結合物質に吸着することにより、融合タンパク質を固相に吸着させることができる。
　続いて、固相に吸着した融合タンパク質を緩衝液等で洗浄する。その後、固相に吸着した融合タンパク質に、例えば、ｐＨを変化させること、又は、塩を添加すること等により、融合タンパク質を固相から解離させ回収すればよい。
　上述の固相としては、従来の精製方法において用いられるものであれば特に限定はなく、例えば、ビーズ、膜、中空糸膜、プラスティック基板、ウェルプレート、スライドガラス、表面プラズモン共鳴測定装置等の測定機器のセンサーチップ等が挙げられる。ビーズ、膜等の形態である固相は、カラムに充填されていてもよい。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜実験例１＞
１－１．発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトＳｏｘ２タンパク質（以下、「ｈＳｏｘ２」という場合がある。）からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、ｐｃＤＮＡ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）に、下記表１に示す試験例１～２７の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎにより挿入した。融合タンパク質には、Ｆｌａｇタグ（以下、「Ｆｌａｇ」という場合がある。）も導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１中、「ｋｏｚａｋ-Ｍｅｔ」は、コザック配列を示している。コザック配列(Ｋｏｚａｋ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ)は、真核生物のｍＲＮＡに出現する共通配列であり、主に翻訳の開始に関与している。脊椎動物では「（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ」と表され、なかでも開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のＲ（プリン塩基・アデニンまたはグアニン）と開始コドンの次のＧが重要な役割を果たすと考えられている。「ＡＵＧ」の部分は、タンパク質のＮ末端のメチオニン残基をコードしている。今回は、「ｃｃｇｃｃ（ｋｏｚａｋ）－ＡＵＧ（Ｍｅｔ）」で表される塩基配列を用いた。
今回使用した標識ペプチドの塩基配列およびアミノ酸配列については、配列表の配列番号１～２０に記載した。また、ヒトＳｏｘ２の塩基配列およびアミノ酸配列については、配列表の配列番号２３および２４に記載した。
　Ｆｌａｇタグは、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、この配列をペプチドすることで、ウエスタンブロッティングによる検出が極めて容易になること（ウエスタンブロッティングに用いるＨＲＰ融合Ｆｌａｇ抗体（ＳＩＧＭＡ社）は極めて高感度でＦｌａｇタグ融合タンパク質を検出可能である。）から使用した。
　各プラスミドを含む単一クローン化した大腸菌を各々アンピシリン入りＬＢ培地を用いて培養した。遠心分離により集菌後、アルカリＳＤＳ法およびＰＥＧ沈殿法を用い、発現プラスミドを精製した。
１－２．細胞培養
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｋｉｄｎｙ（ＨＥＫ）の細胞を無血清培地に馴化し浮遊細胞化した細胞）を１０％ＦＢＳ入りダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉ－ｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）（抗生物質としてペニシリンとストレプトマイシンを含む）により培養した。トランスフェクション用には、トランスフェクション時に５０％コンフルエントとなるように、前日に１２ウェルディッシュにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を撒いた。
１－３．トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に試験例１～２７の発現プラスミドをトランスフェクションした。発現プラスミドは、上述のものを各２００ｎｇ用い、補正用にｐｃＤＮＡ発現プラスミドを各々計３．０μｇとなるように加え、さらにＴＥバッファー２０μＬ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ、ＥＤＴＡ））、２Ｍ塩化カルシウム溶液３μＬを加えた。トランスフェクション試薬には、ＨＢＳバッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）、２８０ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４）を用いた。発現プラスミド溶液に、ＨＢＳバッファー２０μＬを２回に分けてゆっくりと加え、撹拌懸濁した。発現プラスミド溶液中のＤＮＡと、リン酸カルシウムとの複合体を形成するため、３０分間静置した。その間、細胞の培地を交換した。発現プラスミド溶液中のＤＮＡと、リン酸カルシウムとの複合体を培地に添加し、ゆっくりと混ぜ合わせた。ＣＯ２インキュベーターに置き、５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下で培養を続けた。
１－４．ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
（１）細胞抽出液の調製
　トランスフェクション後、２４時間培養を続けた細胞から培地を捨て、１ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）を加え、軽いピペッティングで細胞を剥がし、１．５ｍＬのチューブに移した。１．５ｋｒｐｍの遠心分離で細胞を回収し、上清を捨てた。沈殿した細胞に８０μＬのＮＥＴ－Ｎ＋バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　ＮＰ－４０およびプロテアーゼインヒビターカクテルを使用直前に添加したもの）を加え、数回ピペッティングにより抽出し、１３．５ｋｒｐｍ、４℃で遠心分離を行った。上清を別の新しい１．５ｍＬのチューブに移し、８０μＬの２×ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、撹拌した。９８℃で１分間煮沸し、電気泳動用のサンプルを調製した。
（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法による融合タンパク質の分離
　１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにより、各レーンの細胞抽出液サンプルを５μＬずつロードし電気泳動した。電気泳動後、ゲル板からゲルを外した。
（３）ゲルからメンブレンへの転写
　電気泳動により得られたゲルをトランスファーバッファーに浸した。ゲルをトランスファーブロット（ＢｉｏＲＡＤ社）にセットし、ゲル上に分離したサンプルタンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレン（ミリポア社）に転写した。
（４）ブロッキング
サンプルタンパク質を移したＰＶＤＦメンブレンをブロッキングバッファー（ナカライ社）に浸した。
（５）抗体反応
　ＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄後、一次抗体としてＨＲＰ融合抗Ｆｌａｇ抗体、またサンプルの抽出液の均一性を補正するためにハウスキーピング遺伝子であるβ－アクチンに特異的な抗体（抗β-アクチン, モノクローナル抗体, ペルオキシダーゼ結合）を用いた。
（６）検出
　検出はケミルミワン（Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ　Ｏｎｅ）（ナカライ社）をＨＲＰの基質として用い、発色をハイパーフィルム（ＧＥヘルスケア社）によって検出した。結果は、図２に示した。
１－５．結果
　対照である試験例１よりも発現量が多いものは、分解抑制活性を有すると判断できる。図２から、Ｎ末端領域に標識ペプチドが配置した融合タンパク質では、配列番号４、１０、１２の標識ペプチドを融合したヒトＳｏｘ２の発現が特に高かった。
　また、Ｃ末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、配列番号２、１０、１８、２０の標識ペプチドを融合したヒトＳｏｘ２の発現が特に高かった。
　さらに、Ｋｏｚａｋ－Ｍｅｔおよび標識ペプチドをＮ末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号２、１０、１８、２０の標識ペプチドを融合したヒトＳｏｘ２の発現が特に高かった。
　従って、本発明の標識ペプチドは、ヒトＳｏｘ２と融合したタンパク質において、分解耐性活性を十分に有することが明らかになった。
＜実験例２＞
２－１．発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトＲＡＲαタンパク質（以下、「ｈＲＡＲα」という場合がある。）からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、ｐｃＤＮＡ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）に、表２に示す融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎにより挿入した。融合タンパク質には、Ｆｌａｇタグも導入した。また、ヒトＲＡＲαの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号２５および２６に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
２－２．細胞培養
　実験例１の１－２．と同様に行った。
２－３．トランスフェクション
　実験例１の１－３．と同様の手順により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に試験例２８～５４の発現プラスミドをトランスフェクションした。
２－４．ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
実験例１の１－４．と同様に行った。結果を図３に示した。
２－５．結果
　図３から、Ｎ末端領域に標識ペプチドが配置した融合タンパク質では、配列番号２、４、６、１６の標識ペプチドを融合したヒトＲＡＲαの発現が特に高かった。
　また、Ｃ末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、配列番号１０、１８、２０の標識ペプチドを融合したヒトＲＡＲαの発現が特に高かった。
　さらに、Ｋｏｚａｋ－Ｍｅｔおよび標識ペプチドをＮ末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号１２の標識ペプチドを融合したヒトＲＡＲα以外はすべてにおいて発現が高かった。
　従って、本発明の標識ペプチドは、ヒトＲＡＲαと融合したタンパク質においても、分解耐性活性を十分に有していることが明らかになった。
＜実験例３＞
３－１．発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトＤＰ－１タンパク質（以下、「ｈＤＰ－１」という場合がある。）からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、ｐｃＤＮＡ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）に、表３に示す融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎにより挿入した。融合タンパク質には、Ｆｌａｇタグも導入した。また、ヒトＤＰ－１の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号２７および２８に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　なお、「ｈＤＰ－１ΔＣ３９５」とは、ヒトＤＰ－１タンパク質中のタンパク質分解に抵抗性を有するＣ末端領域を欠損した変異体を示す。「ｈＤＰ－１ΔＣ３９５」のｃＤＮＡは、以下のプライマー（ＦｏｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅ１）を用いたＰＣＲにより増幅した。また、表３中の試験例５７および５８に示す融合タンパク質をコードするｃＤＮＡは、以下のプライマー（ＦｏｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅ２）を用いたＰＣＲにより増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＰＣＲ反応液は以下の組成であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上の組成のＰＣＲ反応液を以下のサイクルで反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＰＣＲ増幅産物を制限酵素処理し、同制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３－ＦｌａｇベクターにＬｉｇａｔｉｏｎし挿入した。挿入はミニプレップ後、制限酵素処理し確認した。また全配列が正しいことをシークエンスにより確認した。
３－２．細胞培養
実験例１の１－２．と同様に行った。
３－３．トランスフェクション
　実験例１の１－３．と同様に行った。
３－４．ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
　実験例１の１－４．と同様に行った。結果を図４に示した。
３－５．結果
　図４から、Ｃ末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、ヒトＤＰ－１の発現が見られなかった。
　さらに、Ｋｏｚａｋ－Ｍｅｔおよび標識ペプチドをＮ末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号２０の標識ペプチドを融合したヒトＤＰ－１の発現が特に高かった。
　従って、本発明の標識ペプチドとヒトＤＰ－１との融合したタンパク質では、Ｎ末端領域に配置した場合において、分解耐性活性を有することが明らかになった。
＜実験例４＞
４－１．発現プラスミドの作製
　標識ペプチドおよびヒトＦｏｘｐ３タンパク質（以下、「ｈＦｏｘｐ３」という場合がある。）からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、ｐｃＤＮＡ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）に、表７に示す融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎにより挿入した。融合タンパク質には、Ｆｌａｇタグも導入した。また、ヒトＦｏｘｐ３の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号３１および３２に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
４－２．細胞培養
実験例１の１－２．と同様に行った。
４－３．トランスフェクション
　実験例１の１－３．と同様に行った。
４－４．ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
　実験例１の１－４．と同様に行った。結果を図５に示した。
４－５．結果
　図５から、Ｃ末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、配列番号１８および２０の標識ペプチドを融合したヒトＦｏｘｐ３の発現が特に高かった。
　さらに、Ｋｏｚａｋ－Ｍｅｔおよび標識ペプチドをＮ末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号１８および２０の標識ペプチドを融合したヒトＦｏｘｐ３の発現が特に高かった。
　従って、本発明の標識ペプチドは、ヒトＦｏｘｐ３と融合したタンパク質においても、分解耐性活性を十分に有していることが明らかになった。
　本発明によれば、タンパク質を安定化させ、かつ、容易に検出又は精製することができる。本発明によれば、分解が速いタンパク質を安定化させ、機能解析やその他分子生物学のツールとして活用することができる。
　１…メンブレン、２…ブロッキング剤、３…融合タンパク質、４…一次抗体（標識ペプチドに対する抗体）、５…標識二次抗体、６…その他のタンパク質。

Claims (10)

  1. 　下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチド。
    　(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　　［１］
    ［式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０～５の整数を表し、ｎは１～５の整数を表し、ｐは１～２０の整数を表し、ｑは１～４の整数を表す。］
  2. 　請求項１に記載の標識ペプチドをコードする核酸。
  3. 　請求項２に記載の核酸を含むベクター。
  4. 　対象タンパク質と請求項１に記載の標識ペプチドとの融合タンパク質。
  5. 　請求項４に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
  6. 　請求項５に記載の核酸を含むベクター。
  7. 　対象タンパク質に、下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドを結合する工程を備える前記対象タンパク質を安定化する方法。
    　(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　　［１］
    ［式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０～５の整数を表し、ｎは１～５の整数を表し、ｐは１～２０の整数を表し、ｑは１～４の整数を表す。］
  8. 　請求項１に記載の標識ペプチドに対する特異的結合物質。
  9. 　対象タンパク質と、下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の検出方法。
    　(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　　［１］
    ［式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０～５の整数を表し、ｎは１～５の整数を表し、ｐは１～２０の整数を表し、ｑは１～４の整数を表す。］
  10. 　対象タンパク質と、下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の精製方法。
    　(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ　　［１］
    ［式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０～５の整数を表し、ｎは１～５の整数を表し、ｐは１～２０の整数を表し、ｑは１～４の整数を表す。］
PCT/JP2016/063175 2015-05-08 2016-04-27 標識ペプチドおよびその使用 WO2016181836A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-095480 2015-05-08
JP2015095480A JP6646310B2 (ja) 2015-05-08 2015-05-08 標識ペプチドおよびその使用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016181836A1 true WO2016181836A1 (ja) 2016-11-17

Family

ID=57248861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/063175 WO2016181836A1 (ja) 2015-05-08 2016-04-27 標識ペプチドおよびその使用

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6646310B2 (ja)
WO (1) WO2016181836A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022050423A1 (ja) * 2020-09-07 2022-03-10 学校法人日本大学 スタビロン改変体に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008175750A (ja) * 2007-01-20 2008-07-31 Iwai Chemicals Co Ltd 被検物質の検出方法
WO2010134226A1 (ja) * 2009-05-20 2010-11-25 学校法人日本大学 タンパク質療法や細胞の分化/未分化制御、抗体療法に応用可能な細胞内でのタンパク質の安定化を可能にする酸性アミノ酸からなるモチーフの確立
JP2010535853A (ja) * 2007-08-14 2010-11-25 エルエフベー ビオテクノロジーズ 標的タンパク質の精製／検出方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008175750A (ja) * 2007-01-20 2008-07-31 Iwai Chemicals Co Ltd 被検物質の検出方法
JP2010535853A (ja) * 2007-08-14 2010-11-25 エルエフベー ビオテクノロジーズ 標的タンパク質の精製／検出方法
WO2010134226A1 (ja) * 2009-05-20 2010-11-25 学校法人日本大学 タンパク質療法や細胞の分化/未分化制御、抗体療法に応用可能な細胞内でのタンパク質の安定化を可能にする酸性アミノ酸からなるモチーフの確立

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARAKAWA TAKASHI ET AL.: "Identification of significant regions of transcriptional factor DP-1(TFDP-1) involved in stability/instability of the protein", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 397, no. 2, 2010, pages 345 - 349, XP029620699 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022050423A1 (ja) * 2020-09-07 2022-03-10 学校法人日本大学 スタビロン改変体に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント

Also Published As

Publication number Publication date
JP6646310B2 (ja) 2020-02-14
JP2016210724A (ja) 2016-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2015356180B2 (en) Tim protein-bound carrier, methods for obtaining, removing and detecting extracellular membrane vesicles and viruses using said carrier, and kit including said carrier
Pennington et al. H-IPSE is a pathogen-secreted host nucleus-infiltrating protein (infiltrin) expressed exclusively by the Schistosoma haematobium egg stage
Solomons et al. Structural basis for ESCRT-III CHMP3 recruitment of AMSH
US20100286070A1 (en) Affinity tag
AU2021239879A1 (en) Modified angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and use thereof
JP4604184B2 (ja) 新規糖鎖認識蛋白質及びその遺伝子
JP2017525936A (ja) ｍＴＯＲＣ１を調節するための組成物および方法
US20210189010A1 (en) Development of recombinant chicken igy scfv antibody raised against human tymidine kinase 1 expressed in prokaryotic cells and use thereof
WO2016181836A1 (ja) 標識ペプチドおよびその使用
CN112111015B (zh) PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白及其构建方法、应用
Mankotia et al. Development of an immunoassay for detection of torque Teno virus (TTV) antibodies using the N22 expression product from TTV genotype 2
JP5042237B2 (ja) 血小板抗原特異抗体の結合を中和するペプチドアプタマー並びにそれを含む診断及び治療への応用
EP2423218A1 (en) Tag peptide having protease recognition sequence and utilization of same
US9975941B2 (en) Method for purifying teriparatide
EP4366767A2 (en) Oligonucleotides and viral untranslated region (utr) for increasing expression of target genes and proteins
ES2612427T3 (es) Método para purificar teriparatida (PTH1-34)
JP7021122B2 (ja) プレニル化アッセイ
JP5961380B2 (ja) ペプチド、融合タンパク質、核酸、発現ベクター、形質転換体、医薬組成物、抗体タンパク質
CA2908295C (en) Method for purifying teriparatide
Kohno et al. Intracellular localization of influenza C virus NS2 protein (NEP) in infected cells and its incorporation into virions
US20200190151A1 (en) Kv1.3-blocking venom peptide variants and related uses
KR101784455B1 (ko) Ｃ형 간염 바이러스의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그를 포함하는 c형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 방법
Yoshikawa et al. Ligand-independent assembly of purified soluble magic roundabout (Robo4), a tumor-specific endothelial marker
RU2509805C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА G2 ХАНТАВИРУСА ДОБРАВА В КЛЕТКАХ E.coli
CN117624374A (zh) 高致病性冠状病毒受体结合域异源多聚体蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16792561

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16792561

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1