JP6646310B2 - 標識ペプチドおよびその使用 - Google Patents
標識ペプチドおよびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6646310B2 JP6646310B2 JP2015095480A JP2015095480A JP6646310B2 JP 6646310 B2 JP6646310 B2 JP 6646310B2 JP 2015095480 A JP2015095480 A JP 2015095480A JP 2015095480 A JP2015095480 A JP 2015095480A JP 6646310 B2 JP6646310 B2 JP 6646310B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fusion protein
- protein
- labeled peptide
- seq
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 101
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 95
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 95
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 24
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 101001112293 Homo sapiens Retinoic acid receptor alpha Proteins 0.000 description 6
- 101000666370 Homo sapiens Transcription factor Dp-1 Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 102000050205 human TFDP1 Human genes 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101710099518 Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030074 Dickkopf-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710155964 Diuretic hormone 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003969 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102100023606 Retinoic acid receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043341 Socs3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108700020985 Wnt-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000052549 Wnt-3 Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 102000057231 human FGF4 Human genes 0.000 description 1
- 102000053917 human FOXP3 Human genes 0.000 description 1
- 102000047444 human SOX2 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000009163 protein therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 108091008726 retinoic acid receptors α Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
(1)配列番号18又は20で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチド。
(2)(1)に記載の標識ペプチドをコードする核酸。
(3)(2)に記載の核酸を含むベクター。
(4)対象タンパク質と(1)に記載の標識ペプチドとの融合タンパク質。
(5)(4)に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。
(6)対象タンパク質に、配列番号18又は20で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドを結合する工程を備える前記対象タンパク質を安定化する方法。
(7)(1)に記載の標識ペプチドに対する特異的結合物質。
(8)対象タンパク質と、配列番号18又は20で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の検出方法。
(9)対象タンパク質と、配列番号18又は20で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の精製方法。
(第一実施形態)
一実施形態において、本発明は、下記式[1]で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドを提供する。
(XFNXN)mXp(XFNXN)nXq [1]
式[1]中、Xは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Fはフェニルアラニン残基を表し、Nはアスパラギン残基を表し、mは0〜5の整数を表し、nは1〜5の整数を表し、pは1〜20の整数を表し、qは1〜4の整数を表す。
また、一実施形態において、本発明は、下記式[2]で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドを提供する。下記式[2]で表されるように、本実施形態の標識ペプチドは、上記式[1]で表される標識ペプチドのN末端側に、N末端からC末端側に向かって、メチオニン残基およびバリン残基がこの順に付加したものである。本実施形態の標識ペプチドをN末端に有する融合タンパク質は、発現量が上昇し、安定性が向上している。
MV(XFNXN)mXp(XFNXN)nXq [2]
式[2]中、Mはメチオニン残基を表し、Vはバリン残基を表す。X、F、N、m、n、p、qは、上述したとおりの意味を表す。
一実施形態において、本発明は、上述した標識ペプチドをコードする核酸を提供する。前記標識ペプチドをコードする核酸としては、例えば、配列番号9、17、19に記載の塩基配列からなる核酸、又は、配列番号9、17、19に記載の塩基配列と80%以上、例えば85%以上、例えば90%以上、例えば95%以上の同一性を有し、タンパク質を安定化する活性を有するペプチドをコードする塩基配列からなる核酸等が挙げられる。なお、配列番号9、17、19に示す塩基配列は、後述の実施例で用いられた配列番号10、18、20のアミノ酸配列からなる標識ペプチドをコードする核酸の塩基配列である。
一実施形態において、本発明は、上述した核酸を含むベクターを提供する。本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等の大腸菌由来のプラスミド;pUB110、pTP5、pC194等の枯草菌由来のプラスミド;pSH19、pSH15等の酵母由来プラスミド;λファージ等のバクテリオファージ;アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス等のウィルス;及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。これらは融合タンパク質発現ベクター作製用であってもよい。
(第一実施形態)
一実施形態において、本発明は、対象タンパク質と上述した標識ペプチドとの融合タンパク質を提供する。
本実施形態の融合タンパク質は、細胞透過性のモチーフをさらに有していてもよい。細胞透過性のモチーフとしては、例えば、MTM(Membrane translocating motif)等が挙げられる。MTMは、繊維芽細胞増殖因子であるヒトのFGF4(Fibroblast growth factor4)の疎水性シグナル配列領域に由来するアミノ酸配列からなペプチドであり、例えば、配列番号21で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(Hawiger et al., 2005 Nature Medicine vol.11 No.(8):892‐8)等が挙げられるがこれに限定されない。融合タンパク質はMTMを有することで、細胞膜透過性を有し、容易に細胞膜内に導入され、活性を失うことなく機能することができる。本実施形態の融合タンパク質において、MTMの融合の位置は特に限定されず、融合タンパク質のN末端側又はC末端側のいずれに連結してもよい。
一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本実施形態の核酸を導入した発現ベクターを作製することで、安定性が向上したタンパク質を発現させることができる。
一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては、上述した標識ペプチドをコードする核酸を含むベクターと同様のものが挙げられる。
一実施形態において、本発明は、対象タンパク質に、上述した標識ペプチドを結合する工程を備える前記対象タンパク質を安定化する方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を提供する。本実施形態の特異的結合物質としては、上述した標識ペプチドに対する抗体、抗体断片、アプタマー、受容体等が挙げられる。
一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質に、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の検出方法を提供する。
図1は、融合タンパク質の検出方法の一実施形態を説明する模式図である。例えば、マウス由来の上述した標識ペプチドに対する一次抗体を用いた場合、前記一次抗体を融合タンパク質に直接結合させる。さらに、マウス由来のタンパク質に結合する抗体に標識をつけた標識二次抗体を前記一次抗体に反応させて、最終的に融合タンパク質を検出することができる(図1参照)。
一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質に、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の精製方法を提供する。
1−1.発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトSox2タンパク質(以下、「hSox2」という場合がある。)からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、pcDNA発現プラスミド(Invitorogen社)に、下記表1に示す試験例1〜27の融合タンパク質をコードするcDNAをLigationにより挿入した。融合タンパク質には、Flagタグ(以下、「Flag」という場合がある。)も導入した。
今回使用した標識ペプチドの塩基配列およびアミノ酸配列については、配列表の配列番号1〜20に記載した。また、ヒトSox2の塩基配列およびアミノ酸配列については、配列表の配列番号23および24に記載した。
HEK293T細胞(human embryonic kidny(HEK)の細胞を無血清培地に馴化し浮遊細胞化した細胞)を10%FBS入りダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modi−ed Eagle Medium、DMEM)(抗生物質としてペニシリンとストレプトマイシンを含む)により培養した。トランスフェクション用には、トランスフェクション時に50%コンフルエントとなるように、前日に12ウェルディッシュにHEK293T細胞を撒いた。
HEK293T細胞に試験例1〜27の発現プラスミドをトランスフェクションした。発現プラスミドは、上述のものを各200ng用い、補正用にpcDNA発現プラスミドを各々計3.0μgとなるように加え、さらにTEバッファー20μL(10mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM エチレンジアミン四酢酸(ethylenediaminetetraacetic acid、EDTA))、2M塩化カルシウム溶液3μLを加えた。トランスフェクション試薬には、HBSバッファー(20mM HEPES(pH7.1)、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4)を用いた。発現プラスミド溶液に、HBSバッファー20μLを2回に分けてゆっくりと加え、撹拌懸濁した。発現プラスミド溶液中のDNAと、リン酸カルシウムとの複合体を形成するため、30分間静置した。その間、細胞の培地を交換した。発現プラスミド溶液中のDNAと、リン酸カルシウムとの複合体を培地に添加し、ゆっくりと混ぜ合わせた。CO2インキュベーターに置き、5%CO2濃度、37℃の条件下で培養を続けた。
(1)細胞抽出液の調製
トランスフェクション後、24時間培養を続けた細胞から培地を捨て、1mLリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline、PBS)を加え、軽いピペッティングで細胞を剥がし、1.5mLのチューブに移した。1.5krpmの遠心分離で細胞を回収し、上清を捨てた。沈殿した細胞に80μLのNET−N+バッファー(20mM Tris−HCl(pH7.9)、1mM EDTA(pH7.9)、150mM NaCl、1% NP−40およびプロテアーゼインヒビターカクテルを使用直前に添加したもの)を加え、数回ピペッティングにより抽出し、13.5krpm、4℃で遠心分離を行った。上清を別の新しい1.5mLのチューブに移し、80μLの2×SDS−PAGEサンプルバッファーを加え、撹拌した。98℃で1分間煮沸し、電気泳動用のサンプルを調製した。
12%SDS−PAGEゲルにより、各レーンの細胞抽出液サンプルを5μLずつロードし電気泳動した。電気泳動後、ゲル板からゲルを外した。
電気泳動により得られたゲルをトランスファーバッファーに浸した。ゲルをトランスファーブロット(BioRAD社)にセットし、ゲル上に分離したサンプルタンパク質をPVDF(ポリビニリデンジフロライド)メンブレン(ミリポア社)に転写した。
サンプルタンパク質を移したPVDFメンブレンをブロッキングバッファー(ナカライ社)に浸した。
TBSTバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.1% Tween20)で4回洗浄後、一次抗体としてHRP融合抗Flag抗体、またサンプルの抽出液の均一性を補正するためにハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンに特異的な抗体(抗β-アクチン, モノクローナル抗体, ペルオキシダーゼ結合)を用いた。
検出はケミルミワン(Chemi−Lumi One)(ナカライ社)をHRPの基質として用い、発色をハイパーフィルム(GEヘルスケア社)によって検出した。結果は、図2に示した。
対照である試験例1よりも発現量が多いものは、分解抑制活性を有すると判断できる。図2から、N末端領域に標識ペプチドが配置した融合タンパク質では、配列番号4、10、12の標識ペプチドを融合したヒトSox2の発現が高かった。
また、C末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、配列番号2、10、18、20の標識ペプチドを融合したヒトSox2の発現が高かった。
さらに、Kozak−Metおよび標識ペプチドをN末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号2、10、18、20の標識ペプチドを融合したヒトSox2の発現が高かった。
従って、配列番号2、10、18、20の標識ペプチドは、ヒトSox2と融合したタンパク質において、分解耐性活性を十分に有することが明らかになった。
2−1.発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトRARαタンパク質(以下、「hRARα」という場合がある。)からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、pcDNA発現プラスミド(Invitorogen社)に、表2に示す融合タンパク質をコードするcDNAをLigationにより挿入した。融合タンパク質には、Flagタグも導入した。また、ヒトRARαの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号25および26に記載した。
実験例1の1−2.と同様に行った。
2−3.トランスフェクション
実験例1の1−3.と同様の手順により、HEK293T細胞に試験例28〜54の発現プラスミドをトランスフェクションした。
2−4.ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
実験例1の1−4.と同様に行った。結果を図3に示した。
図3から、N末端領域に標識ペプチドが配置した融合タンパク質では、配列番号2、4、6、16の標識ペプチドを融合したヒトRARαの発現が高かった。
また、C末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、配列番号10、18、20の標識ペプチドを融合したヒトRARαの発現が高かった。
さらに、Kozak−Metおよび標識ペプチドをN末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号12の標識ペプチドを融合したヒトRARα以外はすべてにおいて発現が高かった。
従って、配列番号2、10、18、20の標識ペプチドは、ヒトRARαと融合したタンパク質においても、分解耐性活性を十分に有していることが明らかになった。
3−1.発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトDP−1タンパク質(以下、「hDP−1」という場合がある。)からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、pcDNA発現プラスミド(Invitorogen社)に、表3に示す融合タンパク質をコードするcDNAをLigationにより挿入した。融合タンパク質には、Flagタグも導入した。また、ヒトDP−1の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号27および28に記載した。
実験例1の1−2.と同様に行った。
3−3.トランスフェクション
実験例1の1−3.と同様に行った。
3−4.ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
実験例1の1−4.と同様に行った。結果を図4に示した。
図4から、C末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、ヒトDP−1の発現が見られなかった。
さらに、Kozak−Metおよび標識ペプチドをN末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号20の標識ペプチドを融合したヒトDP−1の発現が高かった。
従って、配列番号20の標識ペプチドとヒトDP−1との融合したタンパク質では、N末端領域に配置した場合において、分解耐性活性を有することが明らかになった。
4−1.発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトFoxp3タンパク質(以下、「hFoxp3」という場合がある。)からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、pcDNA発現プラスミド(Invitorogen社)に、表7に示す融合タンパク質をコードするcDNAをLigationにより挿入した。融合タンパク質には、Flagタグも導入した。また、ヒトFoxp3の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号31および32に記載した。
実験例1の1−2.と同様に行った。
4−3.トランスフェクション
実験例1の1−3.と同様に行った。
4−4.ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
実験例1の1−4.と同様に行った。結果を図5に示した。
図5から、C末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、配列番号18および20の標識ペプチドを融合したヒトFoxp3の発現が高かった。
さらに、Kozak−Metおよび標識ペプチドをN末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号18および20の標識ペプチドを融合したヒトFoxp3の発現が高かった。
従って、配列番号18および20の標識ペプチドは、ヒトFoxp3と融合したタンパク質においても、分解耐性活性を十分に有していることが明らかになった。
Claims (9)
- 配列番号18又は20で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチド。
- 請求項1に記載の標識ペプチドをコードする核酸。
- 請求項2に記載の核酸を含むベクター。
- 対象タンパク質と請求項1に記載の標識ペプチドとの融合タンパク質。
- 請求項4に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。
- 対象タンパク質に、配列番号18又は20で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドを結合する工程を備える前記対象タンパク質を安定化する方法。
- 請求項1に記載の標識ペプチドに対する特異的結合物質。
- 対象タンパク質と、配列番号18又は20で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の検出方法。
- 対象タンパク質と、配列番号18又は20で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の精製方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015095480A JP6646310B2 (ja) | 2015-05-08 | 2015-05-08 | 標識ペプチドおよびその使用 |
PCT/JP2016/063175 WO2016181836A1 (ja) | 2015-05-08 | 2016-04-27 | 標識ペプチドおよびその使用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015095480A JP6646310B2 (ja) | 2015-05-08 | 2015-05-08 | 標識ペプチドおよびその使用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016210724A JP2016210724A (ja) | 2016-12-15 |
JP6646310B2 true JP6646310B2 (ja) | 2020-02-14 |
Family
ID=57248861
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015095480A Active JP6646310B2 (ja) | 2015-05-08 | 2015-05-08 | 標識ペプチドおよびその使用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6646310B2 (ja) |
WO (1) | WO2016181836A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022050423A1 (ja) * | 2020-09-07 | 2022-03-10 | 学校法人日本大学 | スタビロン改変体に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008175750A (ja) * | 2007-01-20 | 2008-07-31 | Iwai Chemicals Co Ltd | 被検物質の検出方法 |
FR2920024B1 (fr) * | 2007-08-14 | 2012-12-14 | Lfb Biotechnologies | Procede de purification ou de detection d'une proteine cible |
WO2010134226A1 (ja) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | 学校法人日本大学 | タンパク質療法や細胞の分化/未分化制御、抗体療法に応用可能な細胞内でのタンパク質の安定化を可能にする酸性アミノ酸からなるモチーフの確立 |
-
2015
- 2015-05-08 JP JP2015095480A patent/JP6646310B2/ja active Active
-
2016
- 2016-04-27 WO PCT/JP2016/063175 patent/WO2016181836A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2016210724A (ja) | 2016-12-15 |
WO2016181836A1 (ja) | 2016-11-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2021229127B2 (en) | Tim protein-bound carrier, methods for obtaining, removing and detecting extracellular membrane vesicles and viruses using said carrier, and kit including said carrier | |
Becker-Hapak et al. | TAT-mediated protein transduction into mammalian cells | |
Ling et al. | Structural constraints for the binding of short peptides to claudin-4 revealed by surface plasmon resonance | |
Pennington et al. | H-IPSE is a pathogen-secreted host nucleus-infiltrating protein (infiltrin) expressed exclusively by the Schistosoma haematobium egg stage | |
Solomons et al. | Structural basis for ESCRT-III CHMP3 recruitment of AMSH | |
US9644020B2 (en) | Human Tim-3 fusion protein capable of blocking Tim-3 signaling pathway | |
CN110684740B (zh) | 一种抗人泛素羧基末端水解酶-1(uch-l1)的单克隆抗体及其应用 | |
JP4604184B2 (ja) | 新規糖鎖認識蛋白質及びその遺伝子 | |
JP6646310B2 (ja) | 標識ペプチドおよびその使用 | |
US20210189010A1 (en) | Development of recombinant chicken igy scfv antibody raised against human tymidine kinase 1 expressed in prokaryotic cells and use thereof | |
CN112111015B (zh) | PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白及其构建方法、应用 | |
Mankotia et al. | Development of an immunoassay for detection of torque Teno virus (TTV) antibodies using the N22 expression product from TTV genotype 2 | |
Zhao et al. | Prokaryotic expression, refolding, and purification of fragment 450–650 of the spike protein of SARS-coronavirus | |
EP2423218B1 (en) | Tag peptide having protease recognition sequence and utilization of same | |
Guo et al. | Determinants of lentiviral Vpx-CRL4 E3 ligase-mediated SAMHD1 degradation in the substrate adaptor protein DCAF1 | |
US20240117012A1 (en) | Anti-sars-cov-2 antibody | |
Duan et al. | Characterization of the nuclear import pathway for BLM protein | |
ES2612427T3 (es) | Método para purificar teriparatida (PTH1-34) | |
JP5961380B2 (ja) | ペプチド、融合タンパク質、核酸、発現ベクター、形質転換体、医薬組成物、抗体タンパク質 | |
Kim et al. | Built‐in RNA‐mediated chaperone (chaperna) for antigen folding tailored to immunized hosts | |
KR101784455B1 (ko) | C형 간염 바이러스의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그를 포함하는 c형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 방법 | |
Wanscher et al. | Production of functional human insulin-like growth factor binding proteins (IGFBPs) using recombinant expression in HEK293 cells | |
JP7021122B2 (ja) | プレニル化アッセイ | |
Yoshikawa et al. | Ligand-independent assembly of purified soluble magic roundabout (Robo4), a tumor-specific endothelial marker | |
KR20110026071A (ko) | 인간 호메오 도메인 유전자 유래의 단백질 도입 도메인 및 이를 이용한 단백질 도입 벡터 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180409 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20181109 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190312 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190509 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191015 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191211 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20191224 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20191227 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6646310 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |