JP2010535853A

JP2010535853A - 標的タンパク質の精製／検出方法

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Publication number: JP2010535853A
Application number: JP2010520612A
Authority: JP
Inventors: シレ，ローラン; シュトロ，アブデサタール; ダノー，フレデリック; ペレ，ジェラール
Original assignee: エルエフベービオテクノロジーズ
Priority date: 2007-08-14
Filing date: 2008-08-13
Publication date: 2010-11-25
Anticipated expiration: 2028-08-13
Also published as: WO2009024726A2; ES2599303T3; US9175034B2; AU2008290416B2; ES2636453T3; FR2920024A1; US20160009761A1; WO2009024726A3; AU2008290416A1; CN105859829A; CN101821282A; US20110097715A1; BRPI0815410A2; EP2508533B1; JP6006472B2; CA2696363A1; AR067924A1; KR20100058479A; EP2178901A2; FR2920024B1

Abstract

【課題】溶液中に存在する標的タンパク質を精製または検出する方法
【解決手段】実際の検出または精製段階を実施する前に、上記溶液を、標的タンパク質と特異的に結合するアプタマーと接触させる段階を含み、このアプタマーは、溶液中に存在する可能性のある標的タンパク質と相同なタンパク質には結合しない。

Description

本発明はタンパク質の精製および検出方法の分野に関するものである。
本発明は特に、培地、特に溶液中の目標タンパク質およびそれと相同なタンパク質を特異的に精製または検出するためのアプタマー（aptamere）の使用に関するものである。

目標タンパク質（proteine d'interet）(「標的タンパク質（proteine cible）」ともよばれる)の精製／検出方法では一般に、目標タンパク質を含むテスト培地を目標タンパク質に結合可能な化合物と接触させる段階を含む。この標的タンパク質に結合可能な化合物には種々の種類があり、（ｉ）タンパク質に結合する特性を有する化学基を含む有機化合物（例えばＤＥＡＥ，第四アンモニウム、アルキル鎖、シラノール）や、（ｉｉ）タンパク質（例えば抗体）、グリコサミノグリカン（ヘパリン）、色素（cibacronブルーＦ３ＧＡ）または核酸（例えばアプタマー）等がある。

標的タンパク質の精製／検出方法の効率は特に標的タンパク質に結合する化合物の親和性と特異性に依存する。

複雑な組成を有する或る種の出発培地、特に多数の異なるタンパク質を含む出発溶液では標的タンパク質を精製／検出するのは難しい。特に、標的タンパク質が高度に相同な異なる一種または複数のタンパク質と共存している複合出発培地の場合には精製／検出が難しい。すなわち、標的タンパク質がこの標的タンパク質と相同な一種または複数のタンパク質と一緒に溶液中に存在する場合には、通常の精製／検出法を用いても、標的タンパク質とそれ以外の相同タンパク質とを高レベルで区別する精製／検出は難しい。事実、標的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体でも標的タンパク質との構造相同性を有する複数のタンパク質と交差反応性することが多い。

互いに相同なタンパク質を特異的に精製／検出するのが難しいということは多くの用途で問題（欠点）となる。例えば標的タンパク質の特異性を、この標的タンパク質と相同な他のタンパク質と無関係に、研究をする学術研究分野や、公知の精製／検出ツールに比べて調節または管理要件との適合性が改善された新規な効率的精製／検出ツールを開発する工業分野の両方で問題になる。

互いに相同なタンパク質を特異的に精製／検出できないという問題はタンパク質がトランスジェニック生物または微生物中で組み換え型で産生される時にも生じ、トランスジェニックタンパク質と相同なタンパク質も自然に発現する（以下、トランスジェニックタンパク質とよぶ）。特に、トランス遺伝子によってコードされる組み換えタンパク質と高度に相同なタンパク質をコードする「オルソログ（orthologue）」とよばれる遺伝子をゲノム中に固有に有する生物から得られる組み換えタンパク質の場合である。

トランスジェニック動物で発現されるるヒトまたは動物のトランスジェニックタンパク質はトランスジェニック動物で自然に発現する内因性タンパク質と一般に相同である。トランスジェニックタンパク質と天然の内因性相同タンパク質との共抽出または共検出を避ける場合には、天然の内因性相同タンパク質が技術的に大きな問題になる。

トランスジェニック組み換えタンパク質が薬剤製造用の治療目的のタンパク質の場合には、組み換えタンパク質の精製製剤中にトランスジェニックタンパク質と相同な内因性タンパク質が存在すると、薬剤を投与された患者に望ましくない副作用、例えば汚染天然タンパク質に対する望ましくない免疫応答が誘発され、それによって薬物療法の効率が損なわれ、場合によっては患者の健康を害する可能性のある自己免疫応答に至ることさえある。トランスジェニック動物で産生される治療用トランスジェニックタンパク質の使用量が増えるため、上記のような問題がますます頻繁に生じる。高度に安全な治療薬が利用できるようにするためには望ましくない相同タンパク質がごく少量しか存在しない状態、できれば望ましくない相同タンパク質が全く存在しない状状態で、トランスジェニックタンパク質を特異的に精製する必要がある。また、標的タンパク質の検出方法は特異的、高感度かつ効率的でなければならない。

ＳＥＬＥＸとして知られる方法で選択したＲＮＡ型のアプタマー、一本鎖リボ核酸分子は、目標タンパク質に特異的に結合できる。非特許文献１の著者はウシトロンビンには結合するが、ヒトトロンビンには結合しないＲＮＡ型のアプタマーを開示している。この論文はＳＥＬＥＸ法によって溶液中の相同タンパク質を識別できる高度に特異的なＲＮＡアプタマーを選択できることを示している。

しかし、相同タンパク質を識別するために高度に特異的なアプタマーを用いる工業プロセスを開示した文献は存在しない。

特異性が高いアプタマーを使用する場合には、多くの技術的問題がある。先ず最初に、アプタマーをＳＥＬＥＸ法によって溶液中で選択し、精製または検出方法で適切に使用できるようにアプタマーを固体担体上に固定化しなければならない。しかし、アプタマーを固定化するときに、アプタマー結合特性（親和性、特異性等）が損なわれるということが多くの文献に記載されている。さらに、従来技術に記載された唯一の高度に特異的なアプタマー型はＲＮＡ型のアプタマーで、室温で変化する極めて不安定な分子である。従って、ＲＮＡアプタマーは工業精製または検出プロセスには合わない。化学修飾ＲＮＡは代替物になりうるが、そうした分子の現在の合成コストでは工業規模で利用できないことは明らかである。

目標タンパク質に対して強い親和性およびかなり高い特異性を有する抗体はタンパク質を精製および検出する方法で広く用いられている。

しかし、抗体の使用は必ずしも標的タンパク質の精製または検出に適するとは限らない。実際には、抗体は生物系で作られ、病原体による汚染リスクを含めた固有の欠点と変性抗体の精製という困難な課題がある。しかも、抗体は一般に免疫原性で、患者に投与されたときに強い免疫反応を誘発することがある。治療用タンパク質の精製に抗体を用いると、抗体または抗体断片が治療用タンパク質含有溶液中に残り、この溶液を投与された患者に望ましくない反応を引き起こす危険もある。これらの理由で、精製法で抗体を使用することは多くの管理要件、特に農業食品工業および製薬工業での管理要件に合わない。さらに、抗体を用いる場合には（ｉ）変性状態下（例えば尿素、ＤＭＳＯ等の存在下）、（ｉｉ）強酸性または強塩基性ｐＨ値を用いる、（ｉｉｉ）有害な有機溶剤を用いる、または（ｉｖ）高温下での抗体のタンパク質感受性によって衛生化手段も限定されるという問題もある。その上、抗体の選択は長期（約６カ月）のプロセスで、抗体の精製は容易ではなく、選択と製造のコストが高くなる。

Liu達.ウシトロンビンに特異的なRNAアプタマー, J. Mol. Recognit., 2003:16, 23-27

従って、公知の方法に比べて効率的で、実施が容易で、信頼性が高い、目標タンパク質を精製または検出するための新規なツールを開発するというニーズがある。この方法は、溶液中に標的タンパク質と相同なタンパク質が含まれている可能性がある場合、溶液中に存在する標的タンパク質を選択的に精製または検出できなければならない。特に、トランスジェニック生物由来の治療用トランスジェニックタンパク質の産生で得られる産物に対してヒトの安全条件および保安条件を改善することができる新規な精製または検出ツールを開発するというニーズがある。

本発明の対象は、溶液中に存在する標的タンパク質を精製または検出する方法であって、検出または精製を実施する前に、上記溶液をスペーサーを介して固体担体上に固定化したＤＮＡアプタマーと接触させる段階を含み、固定化されたＤＮＡアプタマーは標的タンパク質に特異的に結合するが、標的タンパク質と相同なタンパク質とは結合しないことを特徴とする方法にある。

本発明の別の対象は、スペーサーを介して固体担体上に固定化したＤＮＡアプタマーの、標的タンパク質と相同なタンパク質を少なくとも一種含む可能性のある溶液中に存在する標的タンパク質を精製または検出する方法での使用にあり、その特徴は固定化されたＤＮＡアプタマーが標的タンパク質とは特異的に結合するが、標的タンパク質と相同なタンパク質には結合しない点にある。

本発明のさらに別の対象は、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の段階を含む、標的タンパク質を含み且つこの標的タンパク質と相同なタンパク質を含む可能性のある溶液から標的タンパク質を特異的に精製する方法にある：（ｉ）スペーサーによって固体担体上に固定化されたＤＮＡアプタマーを含む固体担体を提供し、この固定化されたアプタマーは上記標的タンパク質に特異的に結合するが、この標的タンパク質と相同なタンパク質には結合しない、（ｉｉ）上記固体担体を上記溶液と接触させ、（ｉｉｉ）上記アプタマーに結合した標的タンパク質を回収する。

本発明のさらに別の対象は、下記（ｉ）および（ｉｉ）の段階を含む、標的タンパク質を含み且つこの標的タンパク質と相同なタンパク質を含む多能性のある溶液から標的タンパク質を特異的に検出する方法にある：（ｉ）、スペーサーを介して固体担体上に固定化したＤＮＡアプタマーと上記溶液を接触させ、固定化されたＤＮＡアプタマーは標的タンパク質とは特異的に結合するが、標的タンパク質と相同なタンパク質には結合しない、（ｉｉ）アプタマーと標的タンパク質との間に形成された複合体を検出する。

ヒト因子VIIに特異的に結合するアプタマーと、ヒト血漿由来FVII（HP FVII）との結合を示す図で、ヒト抗FVIIアプタマーとHP FVII（HP FVII濃度は５０〜４００ｎM）との結合を時間の関数で表したグラフ。チップ上に固定化したアプタマーとHP FVIIとの相互作用の特異性を示し、ポリクローナル抗FVII抗体の存在下または非存在下で、チップ上に固定化したヒト因子VIIに特異的に結合するアプタマーと、HP FVIIとの結合を時間の関数で表したグラフ。ヒト因子VIIに特異的に結合するアプタマーと、ウサギ血漿由来FVIIとの間の結合の欠如を示し、ヒト因子VIIに特異的に結合するアプタマーと、ウサギ血漿由来因子FVII（ウサギ因子VII濃度は５０〜４００ｎM）との結合を時間の関数で表したグラフ。ヒト因子VIIに特異的に結合するアプタマーと、HP FVII、ウサギ因子VIIまたはトランスジェニックヒト因子VIIとの親和性の差を示し、ヒト因子VIIに特異的に結合するアプタマーと、HP FVII、ウサギ因子VIIまたはトランスジェニックヒト因子VII（各FVII濃度は４００ｎM）との結合を時間の関数として表したグラフ。

本発明方法は、溶液中に存在する標的タンパク質を精製または検出する方法であって、検出または精製段階を実施する前に、スペーサーを介して固体担体上に固定化したＤＮＡアプタマーと上記溶液を接触させる段階を含み、固定化されたＤＮＡアプタマーは標的タンパク質とは特異的に結合するが、標的タンパク質と相同なタンパク質には結合しないことを特徴とする。

本発明の別の対象は、スペーサーを介して固体担体上に固定化されたＤＮＡアプタマーの、溶液中に存在する標的タンパク質を精製または検出での使用にある。固定化されたＤＮＡアプタマーは標的タンパク質とは特異的に結合するが、標的タンパク質と相同なタンパク質には結合しない。上記溶液は標的タンパク質と相同なタンパク質を少なくとも一種含むことができる。

本発明の標的タンパク質の精製方法では、（ｉ）所定の標的タンパク質を特異的に認識するＤＮＡアプタマーと、（ｉｉ）出発培地、一般に出発溶液に含まれる標的タンパク質との間で複合体が選択的に生成される。その後、ＤＮＡアプタマーとの間に生成した複合体を解離して、精製すべき標的タンパク質を回収する。

本発明の標的タンパク質の検出方法では、（ｉ）所定の標的タンパク質を特異的に認識するＤＮＡアプタマーと（ｉｉ）出発培地、一般に出発溶液に含まれる標的タンパク質との間に複合体を選択的に生成させる。その後、（ｉ）ＤＮＡアプタマーと目標タンパク質との間に生成された複合体を検出するか、（ｉｉ）ＤＮＡアプタマーとの複合体になった標的タンパク質または複合体を解離して遊離させた標的タンパク質を検出する。

本発明の別の対象は、下記（ａ）〜（ｃ）の段階を含む、標的タンパク質を含み且つこの標的タンパク質と相同なタンパク質を含むことができる溶液から標的タンパク質を特異的に精製する方法にある：
（ａ）標的タンパク質に特異的に結合するが、この標的タンパク質と相同のタンパク質には結合しないＤＮＡアプタマーがスペーサーを介して固定された固体担体を提供し、
（ｂ）この固体担体と上記溶液とを接触させ、
（ｃ）上記ＤＮＡアプタマーに結合した標的タンパク質を回収する。

本発明のさらに別の対象は、下記（ａ）および（ｂ）の段階を含む、標的タンパク質を含み且つこの標的タンパク質と相同のタンパク質を含むことができる溶液から標的タンパク質を特異的に検出する方法にある：
（ａ）スペーサーを介して固体担体上に固定化された、標的タンパク質に特異的に結合するが、標的タンパク質と相同のタンパク質には結合しないＤＮＡアプタマーと上記溶液とを接触させ、
（ｂ）ＤＮＡアプタマーと標的タンパク質との間に形成された複合体を検出する。

本発明で「アプタマー、アプタメール、aptamere」とは、タンパク質に特異的に結合可能な一本鎖核酸分子を意味する。このアプタマーは一般に５〜１２０個のヌクレオチドを含み、ＳＥＬＥＸ（Systemmatic Evolution of Ligands by Exponential Enrichmemnt、指数関数的濃縮によるリガンド系統的展開法）でとして公知の方法でインビトロで選択できる。アプタマーは多くの利点を有する。アプタマーはオリゴヌクレオチドの性質を有するので、免疫原性が低く且つ厳密な(stringentes)物理化学的条件（尿素の存在、ＤＭＳＯ、強酸性または高塩基性ｐＨ値、有機溶剤の使用または高温）に対する耐性が高いので、アプタマーを親和性リガンドとして用いたときに種々の衛生化手段を実施することができる。さらに、アプタマーは選択性が高く、アプタマーの製造コストはかなり安くできる。

本発明で「ＤＮＡアプタマー」とは、リボヌクレオチドからなるＲＮＡアプタマーとは逆の、デオキシリボヌクレオチドからなるアプタマーを意味する。ＤＮＡアプタマーは溶液中で安定で、従って、標的タンパク質の精製または検出での工業用途を見出せるのが有利である。

本発明で「タンパク質」とはアミノ酸のポリマーを意味し、これにはタンパク質、タンパク質断片、遺伝子組み換えタンパク質、オリゴペプチドおよびその類似体が含まれる。タンパク質は抗体、抗ウイルスタンパク質、ホルモン、成長因子、凝固因子、例えば因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)、因子 X (FX)、因子IX (因子 IX)、因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子 XIII (FXIII)、因子 II (トロンビン)、抗トロンビン III (AT III), ヘパリン補因子 II (HCII), タンパク質 C (PC), トロンボモジュリン(TM), タンパク質S (PS)、因子 V (FV), フォンウィルブランド因子 (FvW)および組織因子経路阻害剤(TFPI)にすることができる。タンパク質は未変性または修飾因子VIIまたはその断片であるのが好ましい。

既に述べたように、本発明方法では標的タンパク質と選択的に結合可能な「スペーサーを介して固体触媒上に固定化されたＤＮＡアプタマー」（以降、単に「アプタマー」）を用いる。このアプタマーは標的タンパク質と「相同」なタンパク質に結合する能力が低いか、その能力がない。これは、本発明では、標的タンパク質と、標的タンパク質の構造に近い構造を有するが標的タンパク質とは異なるタンパク質とを識別する、優れた能力を有するアプタマーのみを用いる、ということを意味する。

本発明のいくつかの実施例では、標的タンパク質と標的タンパク質と「相同」なタンパク質とを識別するのに用いるアプタマーの能力は、解離定数値（Ｋｄ）（モル濃度で表記）で定義される標的タンパク質に対する親和性をアプタマーが有する能力である。上記解離定数値は、最も近い公知の「相同」タンパク質に対するアプタマーの解離定数値より少なくとも一桁小さい。

本発明の別の実施例では、アプタマーは標的タンパク質と「相同」なタンパク質には結合しない。本発明では、相同タンパク質とアプタマーとの結合が通常の測定手段、例えばビアコア(Biacore、登録商標）型の検出および結合測定技術によって検出できないときに、そのアプタマーは相同タンパク質に結合しないとする。一つの実施例では、ヒト因子VIIに選択的に結合するSEQ ID Nー1のアプタマーは結合測定システムBiacore（登録商標）を用いたときに、ウサギ因子VIIに検出可能な形では結合しない、ということがわかっている。

アプタマーが選択的に結合する「標的タンパク質」は任意のタンパク質にすることができる。標的タンパク質は特に治療目的のタンパク質にすることができる。
「相同タンパク質」または「標的タンパク質と相同な」タンパク質とは、標的タンパク質との強い構造的相同性を有するタンパク質を意味する。

本発明で「相同性、homologue」とは、（ｉ）標的タンパク質と相同タンパク質とのアミノ酸配列の差で生じる相同性、（ｉｉ）アミノ酸側鎖に共有結合した追加の化学基の差、例えばグリコシド鎖の差で生じる相同性の実質的には２種類の相同性を意味する。標的タンパク質と「相同な」タンパク質とは、アミノ酸配列の差およびグリコシド鎖の差の両方に関して、互いに異なる場合があることは当業者には理解できよう。例えば、標的タンパク質または相同タンパク質のグリコシル化部位にあるアミノ酸上にアミノ酸配列の差があるときに２種類の構造差がみられる。

本発明では、標的タンパク質と対応する相同タンパク質とが互いに少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有する配列を含む。本発明での２つのアミノ酸配列の間または２つのヌクレオチド配列の間の「同一性（identity）のパーセンテージ」はデフォルトパラメータ（特にギャップペナルティ：１０．０およびエクステンドペナルティ：０．５）を有するエンボスマッチャーのEBLOSUM62を用いて計算することができる。

標的タンパク質と相同タンパク質とのアミノ酸配列同一性は少なくとも50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%または99%であるのが好ましい。
既に述べたように、標的タンパク質と相同タンパク質との差は両タンパク質のグリコシル化の差によって生じうる。グリコシル化の差は同一のアミノ酸配列を有するまたは類似のアミノ酸配列を有するが異なるグリカン構造を有する２つのタンパク質に関する。グリカン構造はアミノ酸共通配列でのタンパク質にグラフトされた糖鎖である。グリコシル化の差はＮ−またはＯ−グリコシル化およびＮ−またはＯ−グリコシル化で生じるグリコシド分枝に関連付けることができる。グリコシル化の差はこのような鎖または分枝の有無およびフコース、マンノース、グルコースアミンまたはガラクトースアミン残基のようないくつかの糖の有無に関連付けることができる。タンパク質グリコシル化は多くの方法で分析できる。グリコシル化分析方法は一種または複数の酵素（PNGaseF、Ｎ−グリコシダーゼ）の使用または化学的経路（ヒドラジン分解、β−脱離）によってタンパク質を脱グリコシル化し、次いで、ゲル、キャピラリー電気泳動法またはＨＰＬＣ（紫外、蛍光またはＭＳ検出）で得られたグリカンを直接分析するか、または、酵素媒介の解重合（ノイラミニダーゼおよび（−ガラクトシダーゼ））、または、化学的に誘発した解重合（ヒドラジン分解、β−脱離）の後に分析して、上記グリカンを配列決定することにある。別の分析方法は、タンパク質全体に質量分析法を用いることにある。これらの技術はＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（飛行時間）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）として知られている。

本発明のいくつかの実施例では、本発明のアプタマーは因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)、因子 X (FX)、因子IX (因子 IX)、因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子 XIII (FXIII)、因子 II (トロンビン)、抗トロンビン III (AT III), ヘパリン補因子 II (HCII), タンパク質 C (PC), トロンボモジュリン(TM), タンパク質S (PS)、因子 V (FV), フォンウィルブランド因子 (FvW)および組織因子経路阻害剤(TFPI)の中から選択される凝固因子に特異的に結合するアプタマーにある。本発明のこのアプタマーはヒト因子VIIに特異的に結合するが、ウサギ因子VIIには結合しないのが好ましい。逆に、本発明の一つのアプタマーはウサギ因子VIIには結合するが、ヒト因子VIIには結合しない。

ヒト因子VIIに特異的に結合するが、ウサギ因子VIIには結合しないアプタマーはSEQ ID nー1と少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマーにすることができる。

本発明のアプタマーは１ｐＭ〜１０μＭ、好ましくは１０ｎＭ〜１０μＭの解離定数値（Ｋｄ）で特徴付けられる親和性を有する標的タンパク質に結合するのが有利である。標的タンパク質に対するアプタマーの親和性は相同タンパク質に対するアプタマーの親和性の１０００〜１０，０００倍であるのが有利である。
本発明の精製または検出方法ではＤＮＡアプタマーをスペーサーによって固体担体上に固定化する。固体担体に固定化したアプタマーは、溶液中に存在する標的タンパク質の検出または精製に特に適している。

本発明で「スペーサー」とはアプタマーと固体担体との間に挿入される分子を意味する。スペーサーはアプタマーの一端と固体担体との両方に結合するのが有利である。スペーサーを含む構造はアプタマーを固体担体に直接固定化しないのが有利である。スペーサーの種類は当業者の知見に従って選択でき、スペーサーは非特異的オリゴヌクレオチド配列またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるのが好ましい。スペーサーが非特異的オリゴヌクレオチド配列であるとき、この配列は好ましくは少なくとも５つのヌクレオチド、好ましくは５〜１５のヌクレオチドを含む。

アプタマーをスペーサーに固定化するために、アプタマーを共有結合で固定化できる基（例えばチオール、アミンまたは担体上に存在する化学基と反応できる任意のその他の基）またはアプタマーを非共有結合で固定化できる基（例えばビオチン−ストレプトアビジン系）のような種々の化学基でアプタマーを化学修飾できる。これらの方法はスペーサーの固体担体への固定化に用いることもできる。

アプタマーの自由端（すなわち、スペーサーに結合していない端）は、スペーサーを介して固体担体に固定化されたときに、化学修飾したヌクレオチド（例えば２’オメチルまたは２’フルオロピリミジン、２’リボプリン、ホスホラミダイト）、逆ヌクレオチドまたは化学基（ＰＥＧ、ポリカチオン、コレステロール）（これらに限定されるものではない）によって、修飾されるのが有利である。これらの修飾によってアプタマーの酵素分解を防止できる。

固体担体はアガロースまたはセルロース由来のゲルまたは合成ゲル、例えばアクリルアミド、メタクリレートまたはポリスチレン誘導体を含むアフィニティークロマトグラフィーカラム、チップ、例えば表面プラズモン共鳴に適合したチップ、膜、例えば、ポリアミド、ポリアクリロニトリルまたはポリエステル膜、磁気または常磁性ビーズにすることができる。

標的タンパク質を含み且つ標的タンパク質と相同なタンパク質を含むことができる溶液は生体液、例えば体液、細胞、細胞ホモジネート、組織、組織ホモジネート、器官または生物全体である。この溶液は動物から得られる液体の生体液、例えば血液、血液由来の産物、哺乳類のミルクまたはミルク由来の産物であるのが好ましい。この溶液は血漿、血漿寒冷沈降物、浄化ミルクまたはその誘導体にすることができる。本発明の動物は葉緑体を全く持たない非ヒト多細胞、真核生物である。特に好ましい実施例では、この溶液はトランスジェニック動物から得られる。この溶液は哺乳類のミルクまたはトランスジェニック哺乳類のミルク由来の産物であるのが有利である。本発明では、トランスジェニック哺乳類は哺乳類、例えばウシ、ヤギ、雌ウサギ、ブタ、サル、ラット、マウスまたはトリまたは昆虫、例えば蚊、蝿またはカイコである。好ましい実施例では、トランスジェニック動物はトランスジェニック哺乳類、好ましくはトランスジェニック雌ウサギである。トランスジェニック哺乳類のミルク中でトランスジェニックタンパク質の発現を可能にする特異的プロモータの制御下でトランスジェニックタンパク質を乳腺中で産生するのが有利である。

トランスジェニック動物のミルク中でトランスジェニックタンパク質を製造する方法は下記の段階を含むことができる：トランスジェニックタンパク質をコードする遺伝子を含むDNA分子（この遺伝子はミルク中で自然に分泌されるタンパク質をコードする遺伝子のプロモータ、例えばカゼインプロモータ、ベータカゼインプロモータ、ラクトアルブミンプロモータ、ベータラクトグロブリンプロモータまたは乳清酸性タンパクプロモータ（WAP）の制御下にある）を非ヒト哺乳類の胎仔に組み込む。次いで、胎仔を同じ種の雌の哺乳類に挿入する。胎仔由来の哺乳類が十分に発達すると、哺乳類ミルク分泌が誘発される。ミルクを採取する。採取したミルクは上記トランスジェニックタンパク質を含む。
ヒト以外の雌の哺乳類のミルク中のタンパク質調製方法の一例は特許文献１に挙げられている。
欧州特許第０５２７０６３号公報

この特許の内容は本発明のタンパク質の産生で再現できる。WAPプロモータを含むプラスミドは、WAP遺伝子プロモータを含む配列の導入により得られ、このプラスミドはWAP遺伝子プロモータの制御下に置かれた外来遺伝子を受け取ることができるように調製される。上記プロモータを含むプラスミド、および、本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、雄性前核に雌ウサギの胎仔をミクロ注入することによってトランスジェニック雌ウサギを産生するのに用いられる。その後、胎仔をホルモンによって調製された雌の卵管へ移動させる。トランス遺伝子の存在は、こうして得られたトランスジェニック幼ウサギから抽出されたDNAからサザンブロットによって明らかにされる。動物ミルク濃度を特異的放射免疫アッセイを用いて評価する。

他の文献には、ヒト以外の雌の哺乳類のミルク中でタンパク質を調製する方法が記載されている。一例としては特許文献２（トランスジェニックマウス)および特許文献３（フォンウィルブランド因子のトランスジェニック哺乳類中の産生）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
米国特許第７，０４５，６７６号明細書欧州特許第１７３９１７０号公報

従って、本発明の別の対象は、トランスジェニック雌ウサギのミルク中に存在するヒト因子VIIを精製または検出するための、スペーサーによって固体担体上に固定化したＤＮＡアプタマーの使用にある。この固定化アプタマーはヒト因子VIIに特異的に結合し、この固定化アプタマーはウサギ因子VIIに結合せず且つトランスジェニック雌ウサギのミルクはウサギ因子VIIを含むことができる。

本発明のさらに別の対象は、トランスジェニック雌ウサギのミルク中に存在する可能性のあるウサギ因子VIIを検出するための、スペーサーによって固体担体上に固定化したＤＮＡアプタマーの使用にある。この固定化アプタマーはウサギ因子VIIに特異的に結合し、この固定化アプタマーはヒト因子VIIに結合せず且つトランスジェニック雌ウサギのミルクはヒト因子VIIを含む。

ヒト因子VIIおよびウサギ因子VIIのアミノ酸配列相同性は約７５％である（ＢＬＡＳＴで測定）。

本発明のさらに別の対象は、下記の段階を含む標的タンパク質に特異的に結合するが標的タンパク質と相同なタンパク質には結合しないアプタマーを選択する方法にある：
（ａ）アプタマー混合物を結合に有利な条件下で標的タンパク質に相同なタンパク質と接触させて、相同タンパク質に結合しなかったアプタマーを回収し、
（ｂ）（ａ）段階で得られたアプタマー混合物を結合に有利な条件下で標的タンパク質と接触させ、
（ｃ）標的タンパク質に結合しなかったアプタマーから非結合アプタマーを分離し、
（ｄ）アプタマー−標的タンパク質の対を解離し、
（ｅ）解離したアプタマーを増幅し、アプタマーを多く含む混合物を得る。この混合物は標的タンパク質に結合するが標的タンパク質と相同なタンパク質には結合しない、
（ｆ）標的分子に特異的に結合するが標的タンパク質と相同なタンパク質には結合しないアプタマーが得られるまで（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）段階を必要なサイクルだけ繰り返す。

本発明のアプタマーの選択方法は従来技術に記載のＳＥＬＥＸ法と多くの共通点があるが、いわゆる「サブトラクション」（（ａ）段階）をさらに含む。従って、本発明の方法は「サブトラクティブＳＥＬＥＸ」とよぶ。

アプタマー選択ＳＥＬＥＸ法は、タンパク質を、ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸組合せライブラリー（一般に１０¹⁵分子）と接触させ、標的に結合しない核酸を除去し、標的に結合する核酸を単離および増幅することにある。この方法を繰り返して、目標タンパク質に対して良好な親和性を有する核酸で溶液を十分に強化する。
Tuerk およびGold, "指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化: バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼに対するRNAリガンド" (1990) Science, 249(4968):505-10 EllingtonおよびSzostak, "特異的リガンドに結合するRNA分子のインビトロ選択", (1990) Nature Aug 30;346(6287):818-22).

ＳＥＬＥＸ法のその他の実施例は下記文献に示され、この開示は本発明のアプタマー選択法の実施で用いることができる。
欧州特許第０，７８６，４６９号公報欧州特許第６６８，９３１号公報欧州特許第１，６９５，９７８号公報欧州特許第１，４９３，８２５号公報

分離段階（（ｃ）段階）は、標的タンパク質に結合したアプタマー（アプタマー−標的タンパク質対とよばれる）を、標的タンパク質に結合しないアプタマーから分離することができる任意の方法によって行なうことができる。分離は従来技術で公知の種々の方法で行なうことができる。従って、アプタマー−標的タンパク質対はニトロセルロースフィルタ上に保持することができ、遊離アプタマーは保持できない。アプタマー−標的タンパク質対を特異的に保持するカラムを分離段階に用いることもできる。その他の方法、例えば液液抽出、ゲルシフト法または密度勾配遠心分離法も用いることができる。分離法の選択は標的タンパク質の特性およびアプタマー−標的タンパク質対に依存し、その決定は当業者に周知な原理に基づいてなされる。

解離段階（（ｄ）段階）は化学種の解離を可能にする任意の方法によって行なうことができる。解離はイオン強度の増大またはｐＨ値の変化によって行うことができるのが有利である。

（ｅ）段階の増幅はアプタマーコピーの量または数を増やすことができる任意の方法によって行なうことができる。アプタマーの増幅はＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）によって行なうのが有利である。増幅はＤＮＡ用のＰＣＲまたはＲＮＡ用のＲＴ−ＰＣＲのいずれかによって行なうのが有利である。

「サブトラクティブＳＥＬＥＸ」法は、標的タンパク質と相同のタンパク質に結合するアプタマーの除去を可能にする「サブトラクション」（（ａ）段階）といわれる段階によって特徴付けられる。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を含むサイクルを実施した後に、それに続くサイクルは（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）段階de nuevoを含むか、または、前のサイクルの（ｅ）段階で増幅されたアプタマーのプールを有する（ｂ）段階から直接開始することができる。従って、サブトラクション段階（ａ）は新しいサイクルを始める度に行なうか、または、（ａ）段階を含まない少なくとも一つのサイクルを行った後に行なって、標的タンパク質に特異的に結合するが標的タンパク質と相同のタンパク質には結合しないアプタマーを得る。各（ａ）段階は第２または第３サイクルごとに行なうのが有利である。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。

実施例１
アプタマー（SEQ nー1）のヒト因子VIIへの結合
SEQ ID nー1を含むアプタマーはシヅマプロリゴ（Sigma-Proligo）社が合成した。
SEQ nー1:
5'PGGGAGAGAGGAAGAGGGAUGGGAGCCUAUGUAACAGAUGCAGAUCCCUAGUCGUCCCAACACCAUAAC-3'-ビオチン
このアプタマーはビオチンのグラフトによってその３’末端が修飾されている。太字（SEQ nー1）のヌクレオチド塩基は２’Ｏ−メチル化され、アプタマーがヌクレアーゼに対してより耐性になり、アプタマーを安定化させることができる。次いで、アビジン含有ＳＡチップ（Biacore GE）上にアプタマーを固定化した。このようにして、アプタマーを固定化率が２７００ＲＵ（１ＲＵは１ｍｍ²当たり１ｐｇの固定化産物にほぼ対応する）のその３’末端に向いた状態で固定化した。

いくつかの精製ヒト血漿由来因子VII（HP FVII、純度：９９％）をランバッファ（Hepes 20mM pH=8, NaCl 50mM, CaCl₂ 2mM および BSA 0.01%）に希釈し、ヒト血漿由来因子VII濃度レベルが５０、１００、２００および４００ｎMの４つのサンプルを得た。各サンプルを同じ固定化アプタマー含有チップにビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して続けて注入した。対照はランバッファのみを含んだブランクを注入して得た。注入は全て２０μｌ／分の流量で１２０秒間行う。これはランバッファを同じ流量で２４０秒間チップに注入した後に行なう。次いで、いくつかの溶出緩衝液（ＮａＣｌ、５Ｍ）を３０μｌ／分の流量で６０秒間注入し、ヒト血漿由来因子VIIをアプタマーから外した。各注入（サンプルおよびブランク）を繰り返した。このチップによって、ヒト血漿由来因子VIIと、固定化アプタマーとの相互作用の形成および分裂を表面プラズモン共鳴（ＲＰＳ）によってリアルタイムで観察することができる。固定化アプタマーへの結合によって装置で記録された信号増大（共鳴単位ＲＵで表される）が生じる（［図１］）。これらの測定はRPS Biacore T100装置(GE)で行なう。記録した相互作用のモデル化はBiaevaluationソフトウェア(GE)を用いて行なった。アロステリックな結合モデル化に基づいて、アプタマーとHP FVIIとの結合を表すＫｄ値を評価し、１．４μMであった。

固定化アプタマーに結合する産物が実際に因子VIIであることを確かめるために、（ｉ）ヒト血漿由来因子VII ２００ｎＭおよび（ｉｉ）抗FVIIポリクローナル抗体１００ｎＭ（Ａｂｃａｍ）を含む注入段階を同じチップに実施した。注入および分析条件は上記のものと同じである。アプタマーが実際にFVIIを保持する場合は、抗FVIIポリクローナル抗体の注入によって、抗体がFVIIに結合し、FVII自体がアプタマーに結合した後に、信号増大（ＲＵ）が生じる。対照として抗体のみを注入する。信号増大（ＲＵ）から、アプタマーがFVIIを認識することがはっきりわかる（［図２］）。

この実施例は、アプタマーが固定化されると、ヒト血漿由来因子VIIに有意な親和性で特異的に結合することを示している。

実施例２
アプタマー（SEQ nー1）とウサギ因子VIIとの結合
ウサギ血漿由来因子VII（American Diagnostica）を実施例１と同じ緩衝液に５０、１００、２００、４００ｎMの濃度レベルで希釈し、その後、固定化アプタマーを含む同じチップに実施例１と同じ条件下で注入した。
［図３］に示す記録されたＲＵ信号から、ウサギ血漿由来FVIIとヒト血漿由来FVIIとのアミノ酸配列相同性が強い（アミノ酸配列相同性は約７５％）にもかかわらず、アプタマーとウサギ血漿由来FVIIとの結合が完全に欠如していることがわかる。
この実施例から、アプタマーはヒト血漿由来FVIIに特異的に結合するがウサギ因子FVIIには結合しないことがわかる。

実施例３
ヒト血漿由来因子VII、トランスジェニック因子VIIおよびウサギ血漿由来因子FVIIの間のアプタマー（SEQ nー1）に対する親和性の差
ヒト血漿由来因子FVII、ウサギ血漿由来FVIIおよびヒトトランスジェニック因子VIIを、実施例１と同じ条件下に同じチップに連続して注入した。得られたデータ（［図４］）から、アプタマーがHP FVIIおよびトランスジェニックFVIIには互いに異なるが強い親和性で結合するが、ウサギ因子VIIには結合しないことがわかる。

Claims

溶液中に存在する標的タンパク質を精製または検出する方法であって、
検出または精製する段階を実施する前に、スペーサーを介して固体担体上に固定化されたＤＮＡアプタマーに上記溶液を接触させる段階を有し、固定化された上記ＤＮＡアプタマーは標的タンパク質とは特異的に結合するが、溶液中に存在する可能性のある標的タンパク質と相同なタンパク質には結合しないことを特徴とする方法。
標的タンパク質のアミノ酸配列が相同タンパク質と５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有する請求項１に記載の方法。
標的タンパク質が相同タンパク質とグリコシル化の相同性を有する請求項１または２に記載の方法。
標的タンパク質が因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)、因子 X (FX)、因子IX (因子 IX)、因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子 XIII (FXIII)、因子 II (トロンビン)、抗トロンビン III (AT III), ヘパリン補因子 II (HCII), タンパク質 C (PC), トロンボモジュリン(TM), タンパク質S (PS)、因子 V (FV), フォンウィルブランド因子 (FvW)および組織因子経路阻害剤(TFPI)の中から選択される凝固因子である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
標的タンパク質がヒト因子VIIまたはウサギ因子VIIである請求項４に記載の方法。
相同タンパク質がウサギ因子VIIまたはヒト因子VIIである請求項５に記載の方法。
アプタマーがSEQ ID nー1と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む請求項５または６に記載の方法。
固体担体がチップ、アフィニティークロマトグラフィーカラム、磁気ビーズまたは常磁性ビーズおよび膜の中から選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
スペーサーが非特異的オリゴヌクレオチド配列またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）型配列の中から選択される請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
上記溶液が体液、特にミルク、ミルク由来の産物、血液または血液由来の産物である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
上記溶液がトランスジェニック哺乳類のミルクまたはトランスジェニック哺乳類のミルク由来の産物である請求項１０に記載の方法。
下記（ａ）〜（ｃ）の段階を含む、標的タンパク質を含み且つこの標的タンパク質と相同なタンパク質を含む可能性のある溶液から標的タンパク質を特異的に精製する方法：
（ａ）上記標的タンパク質に特異的に結合するが、この標的タンパク質と相同なタンパク質とは結合しないＤＮＡアプタマーが固定化された固体担体を提供し、
（ｂ）この固体担体を上記溶液と接触させ、
（ｃ）上記ＤＮＡアプタマーに結合した標的タンパク質を回収する。
標的タンパク質のアミノ酸配列が相同タンパク質と５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有する請求項１２に記載の方法。
標的タンパク質が、因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)、因子 X (FX)、因子IX (因子 IX)、因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子 XIII (FXIII)、因子 II (トロンビン)、抗トロンビン III (AT III), ヘパリン補因子 II (HCII), タンパク質 C (PC), トロンボモジュリン(TM), タンパク質S (PS)、因子 V (FV), フォンウィルブランド因子 (FvW)および組織因子経路阻害剤(TFPI)の中から選択される凝固因子であり、好ましくはヒトまたはウサギ因子VIIである請求項１２または１３に記載の方法。
上記ＤＮＡアプタマーがSEQ ID nー1と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を有する請求項１４に記載の方法。
固体担体がチップ、クロマトグラフィーカラム、磁気ビーズまたは常磁性ビーズおよび膜の中から選択される請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
スペーサーが非特異的オリゴヌクレオチド配列またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）型配列の中から選択される請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
上記溶液が体液、特にミルク、ミルク由来の産物、血液または血液由来の産物である請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
上記ミルクがトランスジェニック哺乳類のミルクまたはトランスジェニック哺乳類のミルク由来の産物である請求項１８に記載の方法。
下記（ａ）および（ｂ）の段階を含む、標的タンパク質を含み且つこの標的タンパク質と相同なタンパク質を含む可能性のある溶液から標的タンパク質を特異的に検出する方法：
（ａ）標的タンパク質に特異的に結合し、標的タンパク質と相同のタンパク質には結合しないＤＮＡアプタマーをスペーサーを介して固定化した固体担体と上記溶液とを接触させ、
（ｂ）ＤＮＡアプタマーと標的タンパク質との間に形成された複合体を検出する。
標的タンパク質のアミノ酸配列が相同タンパク質と５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有する請求項２０に記載の方法。
標的タンパク質が因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)、因子 X (FX)、因子IX (因子 IX)、因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子 XIII (FXIII)、因子 II (トロンビン)、抗トロンビン III (AT III), ヘパリン補因子 II (HCII), タンパク質 C (PC), トロンボモジュリン(TM), タンパク質S (PS)、因子 V (FV), フォンウィルブランド因子 (FvW)および組織因子経路阻害剤(TFPI)の中から選択される凝固因子であり、好ましくはヒトまたはウサギ因子VIIである請求項２０または２１に記載の方法。
ＤＮＡアプタマーがSEQ ID nー1と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む請求項２２に記載の方法。
固体担体がチップ、クロマトグラフィーカラム、磁気または常磁性ビーズおよび膜の中から選択される請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
スペーサーが非特異的オリゴヌクレオチド配列またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）型配列の中から選択される請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
上記溶液が体液、特にミルク、ミルク由来の産物、血液または血液由来の産物である請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
上記ミルクがトランスジェニック哺乳類のミルクまたはトランスジェニック哺乳類のミルク由来の産物である請求項２６に記載の方法。