CN117624374A

CN117624374A - 高致病性冠状病毒受体结合域异源多聚体蛋白及其应用

Info

Publication number: CN117624374A
Application number: CN202211052222.9A
Authority: CN
Inventors: 张林琦; 刘亚萍; 张绮; 史宣玲
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2022-08-31
Filing date: 2022-08-31
Publication date: 2024-03-01

Abstract

本发明公开了高致病性冠状病毒受体结合域异源多聚体蛋白及其应用。本发明的融合蛋白包括SARS‑CoV,MERS‑CoV，SARS‑CoV‑2原始株的受体结合域，用重组表达的方式利用293F系统生产出大量的抗原蛋白，该类蛋白可以在体外成功表达并能在BALB/c小鼠模型中诱导出高效的免疫反应。因此，该融合蛋白对广谱疫苗的研究设计、评估和动物实验等具有重要的参考价值。

Description

高致病性冠状病毒受体结合域异源多聚体蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及高致病性冠状病毒受体结合域异源多聚体蛋白及其应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的疾病命名为属于β属冠状病毒，属于高致病性冠状病毒。随着SARS-CoV-2突变株的流行，现有新冠疫苗针对突变株的效果下降明显，诱导广谱中和新冠突变株及其它高致病性冠状病毒的疫苗亟待研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种高致病性冠状病毒受体结合域异源多聚体蛋白及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种融合蛋白。

本发明要求保护的融合蛋白包括SARS-CoV-2原始株的S蛋白受体结合域或其截短体、SARS-CoV的S蛋白受体结合域或其截短体，和，MERS-CoV的S蛋白受体结合域或其截短体。

进一步地，所述融合蛋白还包括SARS-CoV-2原始株突变株的S蛋白受体结合域或其截短体和/或其他冠状病毒的S蛋白受体结合域或其截短体。

其中，上述来自不同冠状病毒的S蛋白受体结合域RBD或其截短体均可以以首尾相连的任意排列组合，不限定RBD排列顺序及数量。

上述截短体为不影响S蛋白受体结合域功能的截短体。

在本发明的一些案例中，所述融合蛋白还含有信号肽和/或蛋白标签。

进一步地，所述融合蛋白可为如下任一：

(A1)融合蛋白A1：自N端到C端依次由SARS-CoV-2原始株的S蛋白受体结合域、SARS-CoV的S蛋白受体结合域和MERS-CoV的S蛋白受体结合域连接而成；

(A2)融合蛋白A2：自N端到C端依次由信号肽、SARS-CoV-2原始株的S蛋白受体结合域、SARS-CoV的S蛋白受体结合域和MERS-CoV的S蛋白受体结合域连接而成；

(A3)融合蛋白A3：在所述融合蛋白A1的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；

(A4)融合蛋白A4：在所述融合蛋白A2的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

在本发明的具体实施方式中，所述蛋白标签为His标签。

其中，所述信号肽为分泌型信号肽，具体为tPA信号肽。

上述信号肽的氨基酸序列如序列2的第1-35位所示；和/或

所述SARS-CoV-2原始株的S蛋白受体结合域的氨基酸序列如序列2的第36-254位所示；和/或

所述SARS-CoV的S蛋白受体结合域的氨基酸序列如序列2的第255-472位所示；和/或

所述MERS-CoV的S蛋白受体结合域的氨基酸序列如序列2的第473-708位所示。

在本发明的实施例中，所述融合蛋白为如下(a1)-(a6)任一种：

(a1)序列表中序列2的第36-708位所示蛋白质(对应前文所述融合蛋白A1)；

(a2)序列表中序列2的第1-708位所示蛋白质(对应前文所述融合蛋白A2)；

(a3)序列表中序列2的第36-716位所示蛋白质(对应前文所述融合蛋白A3)；

(a4)序列表中序列2所示蛋白质(对应前文所述融合蛋白A4)；

(a5)将(a1)-(a4)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

(a6)与(a1)-(a4)任一种具有70％、80％、90％或98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述98％以上的同源性可为至少99％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％的同一性。所述70％以上的同源性可为至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％的同一性。

第二方面，本发明要求保护一种核酸分子。

本发明所要求保护的核酸分子为编码前文第一方面中所述融合蛋白的核酸分子。

在本发明中，所述核酸分子可为DNA也可为RNA，如mRNA。

进一步地，在所述核酸分子中，

编码所述信号肽的核苷酸序列如序列1的第1385-1489位所示；和/或

在所述核酸分子中，编码所述SARS-CoV-2原始株的S蛋白受体结合域的核苷酸序列如序列1的第1490-2146位所示；和/或

在所述核酸分子中，编码所述SARS-CoV的S蛋白受体结合域的核苷酸序列如序列1的第2147-2800位所示；和/或

在所述核酸分子中，编码所述MERS-CoV的S蛋白受体结合域的核苷酸序列如序列1的第2801-3508位所示。

在本发明的案例中，所述核酸分子具体为如下任一所示DNA分子：

(b1)序列表中序列1的第1490-3508位所示DNA分子(编码前文所述融合蛋白A1)；

(b2)序列表中序列1的第1385-3508位所示DNA分子(编码前文所述融合蛋白A2)；

(b3)序列表中序列1的第1490-3532位所示DNA分子(编码前文所述融合蛋白A3)；

(b4)序列表中序列1的第1385-3532所示DNA分子(编码前文所述融合蛋白A4)；

(b5)与(b1)-(b4)任一种限定的核苷酸序列具有70％、80％、90％或95％以上同一性，且编码前文所述融合蛋白的DNA分子；

(b6)在严格条件下与(b1)-(b4)任一限定的核苷酸序列杂交，且编码前文所述融合蛋白的DNA分子。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述98％以上的同源性可为至少99％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％的同一性。所述70％以上的同源性可为至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％的同一性。

第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达前文第一方面中所述融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动所述核酸分子转录的启动子，还可包括终止所述核酸分子转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

第四方面，本发明要求保护一种产品。

本发明所要求保护的产品其活性成分为前文第一方面中所述的融合蛋白或前文第二方面中所述的核酸分子。

所述产品为如下(B1)或(B2)：

(B1)冠状病毒疫苗；

(B2)预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的药物。

所述冠状病毒疫苗可为蛋白亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗或核酸疫苗等。进一步地，上述核酸疫苗具体可以为mRNA疫苗或DNA疫苗。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒疫苗为蛋白亚单位疫苗，由所述融合蛋白A3和免疫佐剂组成。其中，所述免疫佐剂为Addavax佐剂。所述免疫佐剂与抗原(即所述融合蛋白A3的溶液)按照1：1的体积比混合。所述融合蛋白A3的溶液中所述融合蛋白A3的含量为200μg/mL，混合后的终浓度为100μg/mL。

第五方面，本发明要求保护如下任一应用：

(C1))前文第一方面中所述的融合蛋白作为活性成分在制备冠状病毒疫苗中的应用；

(C2))前文第一方面中所述的融合蛋白作为活性成分在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的药物中的应用；

(C3)前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备前文第一方面中所述的融合蛋白中的应用；

(C4)前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备冠状病毒疫苗中的应用；

(C5)前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的药物中的应用；

(C6)前文第一方面中所述的融合蛋白或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备用于中和冠状病毒的产品中的应用。

在上述各方面中，所述冠状病毒可为SARS-CoV、SARS-CoV-2和/或MERS-CoV。

进一步地，所述SARS-CoV-2可为SARS-CoV-2原始株或其变异株(具体如D614G、BA.5、BA.1.617.2及其它变异株等)。

本发明的融合蛋白包括SARS-CoV,MERS-CoV，SARS-CoV-2原始株的受体结合域，用重组表达的方式利用293F系统生产出大量的抗原蛋白，该类蛋白可以在体外成功表达并能在BALB/c小鼠模型中诱导出高效的免疫反应。因此，该融合蛋白对广谱疫苗的研究设计、评估和动物实验等具有重要的参考价值。

附图说明

图1为3ht RBD表达载体的设计。

图2为3ht RBD蛋白制备中洗脱过程的色谱图。

图3为3ht RBD蛋白非还原型(non-reduced)和还原型(reduced)SDS-PAGE电泳图。

图4为3ht RBD与受体蛋白ACE2和DPP4的平衡解离常数计算。

图5为小鼠免疫实验的设计方案。

图6为免疫小鼠血清对SARS-CoV,MERS-CoV和SARS-CoV-2原始株的受体结合域蛋白的结合情况。

图7为免疫小鼠血清对SARS-CoV,MERS-CoV和SARS-CoV-2原始株D614G毒株和BA.5毒株，B.1.617.2(Delta)毒株的假病毒中和情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、融合蛋白3htRBD的制备

融合蛋白3htRBD结构设计如图1所示。

融合蛋白3htRBD的氨基酸序列如序列2所示。序列2的第1-35位为tPA信号肽，第36-254位为SARS-CoV-2原始株的S蛋白受体结合域(简称SARS-CoV-2原始株RBD)、第255-472位为SARS-CoV的S蛋白受体结合域(简称SARS-CoV RBD)，第473-708位为MERS-CoV的S蛋白受体结合域(简称MERS-CoV RBD)，第709-716位为His标签。融合蛋白3htRBD中的tPA信号肽引导新合成的蛋白进入内质网腔，随后被信号肽酶切除，使成熟蛋白分泌到胞外。其中，3ht RBD蛋白以三聚体形式存在，三聚体的预期分子量约为79.9KDa。

融合蛋白3htRBD的编码基因的核苷酸序列为序列表的序列1第1385-3535位核苷酸所示的DNA分子。其中，序列1的第1385-1489位为编码信号肽的核苷酸；在所述核酸分子中，序列1的第1490-2146位为编码SARS-CoV-2原始株的S蛋白受体结合域的核苷酸；序列1的第2147-2800位为编码SARS-CoV的S蛋白受体结合域的核苷酸；序列1的第2801-3508位为编码MERS-CoV的S蛋白受体结合域的核苷酸。

一、重组质粒的构建

利用同源重组方式将质粒pVRC8400的Bam HI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列1第1385-3535位核苷酸所示的DNA分子，得到重组质粒pVRC8400-3ht RBD，该重组质粒的核苷酸序列为序列表中序列1。

重组质粒pVRC8400-3ht RBD的CDS区设计如图1所示。

二、融合蛋白3ht RBD的表达和纯化

1、利用PEI转染试剂，将步骤一得到的重组质粒pVRC8400-3ht RBD转染至293F细胞(每2.5×10⁶个细胞转染1μg重组质粒)，用无血清SMM293-TII培养基培养4天。

2、完成步骤1后，4000rpm离心15min，收集上清液。

3、用50μm滤膜过滤步骤2中的上清液，收集其滤液。

4、步骤3得到的滤液利用浓缩泵进行体系置换，置换溶液为PBS缓冲液，最终得到100ml产物。

5、将步骤4得到的产物在4℃、13000rpm离心30min，收集上清液。

6、取步骤5得到的全部上清液，与镍柱4℃过夜孵育，用100ml 25mM的咪唑溶液洗涤杂蛋白，之后用10ml 500mM咪唑溶液洗脱并收集洗脱液，采用30kD浓缩管进行浓缩，最终得到体积为1ml的浓缩液。

7、将步骤6得到的浓缩液在4℃、13000rpm离心10min，取上清后利用superdex200柱(GE healthcare)进行分子筛层析，采用PBS(pH7.2)作为洗脱缓冲液，收集洗脱液，得到3htRBD蛋白溶液(带有His标签且无信号肽)。

洗脱过程的色谱图见图2(横坐标为流出体积)，可以看出，3ht RBD蛋白的均一性较好。

三、检测

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

将步骤二制备的3ht RBD蛋白溶液分别进行还原型SDS-PAGE和非还原型SDS-PAGE。

取1-3ug蛋白，与5×Loading buffer混合后加水补至20ul，利用4％-12％的预制胶进行蛋白大小和纯度鉴定。

电泳结果如图3所示，可以看出，得到预期大小的目标蛋白3ht RBD。

2、受体蛋白ACE2和DPP4的生产

Buffer1：利用PBS缓冲液粉末(聚合美)加水至2L，0.22um滤膜过滤除菌。

Buffer2(pH8.0)：含100mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、5mM Desthiobiotin，余量为水。

血管紧张素转化酶2(Angiotensin-Converting Enzyme 2,ACE2)为SARS-CoV和SARS-CoV-2原始株的受体蛋白组成；二肽基肽酶4(Dipeptidyl-Peptidase 4),DPP4)为MERS-CoV的受体蛋白。

其制备方法如上述一和二，差异在于用编码ACE2和DPP4的序列替代3ht RBD的序列，分别为序列3和序列4以及使用Strep-Tactin Sepharose(iba)进行亲和纯化，利用Buffer1洗杂蛋白，Buffer 2进行蛋白洗脱。

3、利用表面等离子体共振(SPR)计算与受体蛋白的平衡解离常数

使用包被Anti-His抗体的CM5芯片，方法使用Multi-cycle kinetics usingcapture。

每个循环均首先进行capture，Startup循环和实验循环中上样3ht RBD浓度为2.5ug/ml(对应ACE2蛋白)和25ug/ml(对应DPP4蛋白)。接触时间为60s，流速为10ul每分钟。

Startup循环进行Analyte，上样PBST(含0.05％Tween20的PBS)，接触时间60秒，流速30uL每分钟，解离时间60秒。实验循环进入Analyte步骤后，由低浓度到高浓度逐步上样5个浓度的ACE2蛋白和DPP4蛋白，浓度呈2倍梯度稀释。ACE2最高浓度为250nM,DPP4最高浓度为500nM。每个浓度接触时间60秒，流速30uL每分钟，解离时间为600秒。

每个循环中均最后进行重生，上样0.1M Glycine溶液(pH＝1.5),接触时间30秒，流速30uL每分钟。

使用Multi-cyclekineticsusingcapture-Evaluationmethod进行数据分析，使用1：1binding进行模型拟合，获得拟合曲线的平衡解离常数KD值。

结果如图4所示，3ht RBD蛋白与受体蛋白ACE2的平衡解离常数为7.08nM，与受体蛋白DPP4的平衡解离常数为104nM，说明3ht RBD蛋白功能正常。

实施例2、融合蛋白3ht RBD在小鼠模型中的抗原性探究

一、小鼠免疫及采样策略

1、免疫

选择8周左右的BALB/C雌性小鼠，采用0-2-4两周的免疫策略，共进行三次免疫。在蛋白每次免疫后一周，即1-3-5周进行采血，如图5。

分组如下：

对照组：免疫PBS；

实验组：免疫融合蛋白3ht RBD(100ug/只)。

免疫采用Addavax佐剂，与实施例1的二制备的3ht RBD蛋白溶液按照1：1的体积比混合，使蛋白终浓度为100μg/mL；

实验组每只小鼠免疫10μg蛋白/100μl，左右两侧大腿肌肉各50μl。

对照组每只小鼠左右两侧大腿肌肉各50μl PBS。

2、血清收集

分离小鼠血清用于特异性结合抗体和中和抗体等相关分析，将采集的血清放置在4℃过夜，在预冷的离心机以3000rpm先离心30min，取上清后再以10000rpm离心15min，分离出血清后进行分装，取50ul在56℃灭活30min，其余冻在-80℃备用。该血清作为待检抗体。

二、血清结合抗体水平ELISA检测

1、制备SARS-CoV RBD,MERS-CoV RBD和SARS-CoV-2原始株RBD蛋白，制备方法如实施例1的二，差异在于用编码SARS-CoV RBD，MERS-CoV RBD和SARS-CoV-2原始株RBD的序列替代3ht RBD的序列，分别为序列5，序列6和序列7。

2、使用ELISA方法检测时，将制备的SARS-CoV RBD,MERS-CoV RBD和SARS-CoV-2原始株RBD按100ng/孔的量包被至酶标板中，放置在4℃包被过夜。

3、弃去包被液，在洁净的滤纸上拍净残留包被液。

4、每孔加入300μl含5％BSA的PBS(封闭液)封闭液，37℃孵育2小时以封闭未包被上目的蛋白的酶标板空隙。

5、随后弃封闭液，在洁净的滤纸上拍净残留液体。

6、用封闭液稀释抗体，将小鼠血清按照一定比例稀释，首孔加150μl，其余各孔加100μl，从首孔吸出50μl进行3倍梯度稀释，37℃孵育1小时。

7、弃一抗，用PBST(含0.05％Tween20的PBS)清洗3次，在洁净的滤纸上拍净残留液体。用封闭液将抗鼠HRP抗体(Promega)按照1:4000稀释，每孔加入100μl，37℃孵育45分钟。

8、弃二抗，用PBST的清洗3次，在洁净的滤纸上拍净残留液体，每孔加入100μl的TMB底物显色液，室温避光反应5分钟，加入50μl 1M的硫酸终止反应，使用多功能酶标仪在450nm和655nm波长进行吸光度检测。

9、利用graphpad软件将0D450与0D655的差值同相对应的血清稀释度分别作为纵横坐标绘制曲线图，计算出ED50值。

3ht RBD免疫小鼠第三周和第五周获得的血清对SARS-CoV,MERS-CoV和SARS-CoV-2原始株中的RBD蛋白的结合抗体水平结果如图6所示，免疫3ht RBD蛋白的小鼠血清对SARS-CoV RBD,MERS RBD和SARS-CoV-2原始株RBD的结合能力相对免疫PBS组有显著提升，说明3ht RBD蛋白具有较强的抗原性。

三、假病毒包装及血清中和抗体水平检测

骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase，即含有Luciferase的骨架质粒pNL4-3R-E(即文献中的vector with the luciferase gene containing backbone pNL4-3R-E)：Wang Q,Liu L,Ren W,Gettie A,Wang H,Liang Q,Shi X,Montefiori DC,Zhou T,Zhang L.CellRep.2019。

1、pcDNA3.1-冠状病毒S(全长S蛋白)，用于生产冠状病毒假病毒，通过将冠状病毒S插入pcDNA3.1(+)载体的BamHII和EcoRI酶切位点之间，得到带有对应膜蛋白的重组质粒，所述冠状病毒S分别为来自详见SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2D614G、SARS-CoV-2BA.5和SARS-CoV-2B.1.617.2病毒的S蛋白编码核酸，序列依次为序列8到序列12。

2、提前一天将293T细胞传至六孔板，控制密度至转染时能达到80 90％

将4μg骨架质粒PNL4pNL4-3R-E-luciferase,1μg携带冠状病毒S蛋白的pcDNA3.1载体质粒(即上述的pcDNA3.1-冠状病毒S)和16ul PEI加到200μl的无血清DMEM培养基中，混匀后静置10 30分钟。

3、将混合液轻柔加入293T细胞培养上清中，8小时后弃去原有细胞上清，每孔补充3ml新鲜含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48小时后收取细胞上清。

4、4000rpm离心10分钟后，取上清使用或分装置于80℃冰箱中保存。分别得到SARS-CoV假病毒、MERS-CoV假病毒、SARS-CoV-2D614G假病毒、SARS-CoV-2BA.5假病毒和SARS-CoV-2B.1.617.2假病毒。

5、取平底96孔细胞培养板，在细胞对照孔加入150μl培养基，首孔稀释孔加入140μl培养基，病毒对照孔和其余稀释孔加入100μl培养基。向首孔稀释孔中加入10μl步骤一得到的小鼠血清，与细胞培养基混合均匀(即为小鼠血清稀释液)，每组实验设定两个复孔。

6、取多道移液器吸取50μl首孔的小鼠血清稀释液，加入到100μl细胞培养基中混匀，依次三倍比稀释，共八个稀释度，最后稀释孔混匀后吸出50μl液体弃掉。取50ul的上述假病毒，加入至除细胞对照孔之外的其余各孔。

7、将96孔培养板置于37℃细胞培养箱中孵育1小时。将预先培养好的Huh 7靶细胞消化，离心后按2×105/ml的密度重悬，向孵育后的96孔板每孔加入100μl细胞。将96孔板置于37℃细胞培养箱中，继续培养60小时。

8、培养60小时后弃细胞上清，加入100μl荧光素酶检测试剂(诺唯赞)，反应2分钟后将96孔板置于化学发光检测仪中，读取相对荧光强度(RLU)。

中和抑制率的计算方法为抑制率(％)＝[1(各稀释度RLU–细胞对照组RLU)/(病毒对照组RLU－细胞对照组RLU)]×100％。

9、利用graphpad软件将计算出的抑制率同相对应的血清稀释度分别作为纵横坐标绘制中和曲线，计算出ID50值,ID50为半数抗原被中和时的血清稀释度。

免疫3ht RBD的小鼠血清针对SARS-CoV,MERS-CoV和SARS-CoV-2D614G/BA.5/BA.1.617.2假病毒的中和抗体水平见图7，该抗原能够诱导出高水平的针对高致病性冠状病毒的中和抗体，对于新冠突变株BA.5和BA.1.617.2也有中和效果，可以作为广谱疫苗的候选。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.融合蛋白，包括SARS-CoV-2原始株的S蛋白受体结合域或其截短体、SARS-CoV的S蛋白受体结合域或其截短体，和，MERS-CoV的S蛋白受体结合域或其截短体。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白还含有信号肽和/或蛋白标签。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：

所述融合蛋白，为如下任一：

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：

所述融合蛋白为如下(a1)-(a6)任一种：

(a1)序列表中序列2的第36-708位所示蛋白质；

(a2)序列表中序列2的第1-708位所示蛋白质；

(a3)序列表中序列2的第36-716位所示蛋白质；

(a4)序列表中序列2所示蛋白质；

5.编码权利要求1-4中任一所述融合蛋白的核酸分子。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于：

所述核酸分子为如下(b1)-(b6)任一种：

(b1)序列表中序列1的第1490-3508位所示DNA分子；

(b2)序列表中序列1的第1385-3508位所示DNA分子；

(b3)序列表中序列1的第1490-3532位所示DNA分子；

(b4)序列表中序列1的第1385-3532所示DNA分子；

(b5)与(b1)-(b4)任一种限定的核苷酸序列具有70％、80％、90％或95％以上同一性，且编码权利要求1-4中任一所述蛋白质的DNA分子；

(b6)在严格条件下与(b1)-(b4)任一限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1-4中任一所述蛋白质的DNA分子。

7.含有权利要求5-6中任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

8.一种产品，其活性成分为权利要求1-4中任一所述的融合蛋白或权利要求5-6中任一所述的核酸分子或权利要求7所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述产品为如下(B1)或(B2)：

(B1)冠状病毒疫苗；

(B2)预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的药物。

9.如下任一应用：

(C1)权利要求1-4中任一所述的融合蛋白作为活性成分在制备冠状病毒疫苗中的应用；

(C2)权利要求1-4中任一所述的融合蛋白作为活性成分在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的药物中的应用；

(C3)权利要求5-6中任一所述的核酸分子或权利要求7所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备权利要求1-4中任一所述融合蛋白中的应用；

(C4)权利要求5-6中任一所述的核酸分子或权利要求7所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备冠状病毒疫苗中的应用；

(C5)权利要求5-6中任一所述的核酸分子或权利要求7所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的药物中的应用；

(C6)权利要求1-4中任一所述的融合蛋白或权利要求5-6中任一所述的核酸分子或权利要求7所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备用于中和冠状病毒的产品中的应用。

10.根据权利要求8所述的产品或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述冠状病毒为SARS-CoV、SARS-CoV-2和/或MERS-CoV；

或，所述疫苗为蛋白亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗或核酸疫苗。