JP5042237B2 - 血小板抗原特異抗体の結合を中和するペプチドアプタマー並びにそれを含む診断及び治療への応用 - Google Patents
血小板抗原特異抗体の結合を中和するペプチドアプタマー並びにそれを含む診断及び治療への応用 Download PDFInfo
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Description
(i)バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン及びグリシンから成る群から選択される4つの脂肪族アミノ酸、
(ii)アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される2つの酸性アミノ酸、
(iii)1つのプロリン、
(iv)アルギニン、リシン及びヒスチジンから成る群から選択される1つの塩基性アミノ酸、
(v)アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される2つの酸性アミノ酸、
(vi)トレオニン及びセリンから成る群から選択される1つのアルコールアミノ酸、及び、
(vii)トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから成る群から選択される1つの芳香族アミノ酸、
の配列を有する、少なくとも1つのドデカペプチド、
(B)少なくとも1つのポリペプチド、及び必要に応じて、
(C)1つ又は複数の検出可能なマーカー、
を含む、ペプチドアプタマーが提供される。
(i)ヒト血小板抗原特異抗体の検査を受けるヒト血清を準備する工程、
(ii)ヒト血清を上記のペプチドアプタマーと接触させる工程、及び、
(iii)ペプチドアプタマーのヒト血小板抗原特異抗体との直接又は間接相互作用を検出する工程、
を含む、ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法に関する。
FliTrx(商標)ペプチドライブラリ及びモノクローナル抗体
Lu et al.(Lu Z, Murray KS, Van Cleave V, LaVallie ER, Stahl ML, McCoy JM.「フラジェリンとの機能融合としての大腸菌細胞表面上のチオレドキシンランダムペプチドライブラリの発現:タンパク質−タンパク質相互作用の探査のために設計されたシステム(Expression of thioredoxin random peptide libraries on the Escherichia coli cell surface as functional fusions to flagellin: a system designed for exploring protein-protein interactions)」Biotechnology (N Y). 1995 Apr; 13(4): 366-72)により記載されたシステムに基づく、FliTrx(商標)ランダムペプチドライブラリは、Invitrogen(San Diego, CA)より入手した。表現型HPA−1aに特異的なGPIIb/IIIaタンパク質に対するmAb Camtranは、Cambridge(Griffin H. M., Ouwehand W. H.,「V遺伝子ファージディスプレイライブラリ由来の血小板糖タンパク質IIIaのロイシン33に特異的なヒトモノクローナル抗体(HPA−1a)(A human monoclonal antibody specific for the Leucine 33 (HPA-1a) form of platelet glycoprotein IIIa from V gene phage display library)」Blood 1995, 86, 12: 4430-4436)より入手した。
細胞培養及び一般的なパンニング法を製造業者のプロトコルに記載の通り実施する。発現を駆動するPLバクテリオファージプロモータを含有するpFliTrx(商標)を、clリプレッサの発現がtrpプロモータの支配下にある大腸菌(GI826)中で伝播する。プラスミドを含む大腸菌細胞を、100μg/mlのアンピシリンを含有するIMC培地(1×M9塩(40mM Na2HPO4、20mM KH2PO4、8.5mM NaCl、20mM NH4Cl)、0.2%カザミノ酸、0.5%グルコース、1mM MgCl2)中で25℃で一晩、飽和状態になるまで増殖する。100μg/mlのトリプトファンにより、ペプチド挿入を含むチオレドキシン−フラジェリン融合タンパク質の発現を25℃で6時間誘導する。次に、10mlの誘導大腸菌培養物に0.1gの脱脂粉乳、300μlの5M NaCl及び500μlの20%α−メチルマンノシドの混合物を添加する。得られた溶液は、以下のスクリーニングのためのペプチドライブラリとして使用される。
60mm組織培養プレート(Nunc)をペプチドライブラリスクリーニングに使用する。1mlの滅菌水で希釈した抗体20μgを用いて、20〜25℃で1時間、プレートをプレコートする。液体を除去した後、10mlの滅菌水でプレートを洗浄し、次に10mlのブロッキング溶液(IMC培地中、1%脱脂粉乳、150mM NaCl、1%α−メチルマンノシド及び100μg/mlのアンピシリン)を補充し、1時間穏やかに攪拌する。6時間のペプチドライブラリ誘導の終了の直前に、ブロッキング溶液をデカントし、得られた溶液の10mlアリコートをプレートに添加する。プレートを水平振盪機で75rpmで1分間穏やかに攪拌し、20〜25℃で1時間インキュベートする。細菌培養物をデカントし、100μg/mlのアンピシリン及び1%α−メチルマンノシドを含有するIMC培地10mlで、5分間穏やかに攪拌することでプレートを洗浄する。さらに4回洗浄した後、1mlのIMCで30秒間ボルテックスすることで、結合細菌を分離する。残存する分離細菌をプレートから回収し、次回のバイオパンニングのために増殖する。続く4回のバイオパンニングで同様の手順を実施する。5回のバイオパンニング後、細菌のコロニーをRMG(1×M9塩、2%カザミノ酸、0.5%グルコース、1mM MgCl2、100μg/mlのアンピシリン及び1.5%アガー)プレートから無作為に取り出し、30℃で一晩増殖する。
基本的には製造業者のプロトコルに従って、ウエスタンブロットにより陽性クローンの同定を行う。簡潔に述べると、RMGプレートの40のクローンを2mlのRM培地(1×M9塩、2%カザミノ酸、1%グリセロール、1mM MgCl2)100μg/mlのアンピシリンを含む)に移し、30℃で飽和状態になるまで振盪しながら増殖する。一晩培養物からの40μlの試料を、細胞密度がOD600、0.75になるまで、100μg/mlのアンピシリン及び100μg/mlのトリプトファンを含有するIMC2ml中に37℃で接種した。誘導細胞培養物の1.5mlアリコートを採取し、10000gで1分間遠心分離した。ペレットをSDSポリアクリルアミドゲルローディングバッファーに再懸濁し、5分間煮沸し、8%SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。分離したタンパク質を、液体電気泳動転写セル(Bio-Rad)のニトロセルロースメンブレン(PROTRAN(登録商標)BA79、Schleicher & Schuell)にブロットする。次にメンブレンをTBS(10mM Tris(pH7.2)及び0.15M NaCl)5%粉乳を用いて、4℃で一晩ブロッキングした後、TBS1%粉乳、0.05%Tween20で1:100に希釈したcamtran抗体を用いて、20〜25℃で2時間インキュベートする。TBS0.05%Tween20で3回洗浄した後、1:92000に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ヒトIgG(Fc特異的)(Sigma、A0170)を用いて、20〜25℃で40分間、メンブレンをインキュベートする。TBS0.05%Tween20でさらに3回洗浄した後、Lumi−LightPLUSウエスタンブロット基質(Roche)により結合複合体を検出する。次に、HPA−1b表現型に特異的なGPIIb/IIIaタンパク質に反応するヒト血清を用いて、ウエスタンブロットを行うことにより陽性クローンを再分析する。
同定したクローンのプラスミドDNAを、Wizard(登録商標)Plus SVミニプレップDNA精製システム(Promega)を使用して単離する。FliTrx(商標)フォワードシークエンシングプライマー(5’−ATTCACCTGACTGACGAC−3’)を使用して、ヌクレオチド配列をMWGにより決定する。
事前に選択したpFlitrxプラスミドを用いて、チオレドキシンペプチドをコードするcDNAをPCR反応により増幅する。PCR条件は次の通りである:95℃で1分、続いて95℃で45秒、36℃で30秒、72℃で45秒の12サイクル、次に95℃で45秒、45℃で30秒、72℃で45秒の20サイクル、そして反応を完全にするために72℃で3分間。3’末端に、プライマー配列5’−TGTCGACCAGGTTAGCGTC−3’はSalI部位を誘導し、5’末端に、プライマー配列5’−TCATATGATGAGCGATAAAATTA−3’はNdeI部位を誘導する。PCRで生成したDNA断片をpGEM(登録商標)−TイージーベクターシステムI(Promega)にサブクローニングする。次に、プラスミド構築物を、制限酵素NdeI及びSalIにより増幅及び消化する。消化されたDNA断片を、SaltI部位の下流の停止コドンの前の6つのHisコドンをコードする、アンピシリン耐性ベクターpT7−7(T7ポリメラーゼ発現系に基づくベクター)のNdeI部位及びSalI部位にクローニングする。プラスミドを大腸菌株DH5αに形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを単離する。耐性コロニーを増殖することでプラスミドの大規模な産生と精製が可能になる。プラスミドの適切な構築をDNAシークエンシングにより確認する。
Trx−HPA−1a(JT−PLP01)の過剰発現及び精製
プラスミドを大腸菌株C41(DE3)に形質転換する(Miroux B, Walker JE.「大腸菌におけるタンパク質の過剰産生:幾つかの膜タンパク質及び球状タンパク質の高レベルの合成を可能にする突然変異宿主(Overproduction of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels)」J Mol Biol. 1996 Jul 19; 260(3): 289-98)。新たに形質転換したコロニーを20μg/mlのアンピシリンを含有する400mlの2YT培地(16%バクトトリプトン、10%バクト酵母抽出物、85.5mM NaCl)に接種し、0.7mM イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシドでの誘導前に、OD600が0.6〜0.8になるまで37℃で増殖する。37℃での一晩培養後、細胞を遠心分離により採取する。ペレットを再懸濁し、10mLの溶菌バッファー(20mM Tris−HCl(pH8.0)、20%グリセロール、500mM NaCl、0.1%Triton X−100、1mM PMSF、1mg/mLのリゾチーム、1/2錠のComplete Mini EDTA−free(Roche)及び250単位/mLのBenzonase(Merck))中で、4℃で30分間インキュベートする。画分(5ml)を30秒間の超音波処理により破砕する。上清の4回の遠心分離(9000gで30分間)後、リゾチーム及びBenzonaseを含まない溶菌バッファー中で予め平衡化した7ml Ni−NTAアガロースカラム(Qiagen)にその可溶性画分をアプライする。混合物を4℃で1時間、浴中でインキュベートする。リゾチーム及びBenzonaseを含まない溶菌バッファー、次いで20mM Tris−HCl(pH8.0)、20%グリセロール、100mM KCl、0.5mM PMSF、及び20mMイミダゾールを含む溶菌バッファーでカラムを洗浄し、100mMイミダゾールを含有する同じバッファーでTrx−HPA−1aを溶出する。SDS−PAGEによりTrx−HPA−1aを含有すると判断された画分をプールする。試料のバッファーを交換し、5kDaカットオフのVivaspin Concentratorメンブレン(Vivascience)及び20mM Tris(pH8.0)、10mM NaClを用いて、遠心分離により試料を濃縮する。1mL Q−セファロースカラム(Mono Q HR 5/5、Amersham Pharmacia Biotech)に試料をアプライする。20mM Tris(pH8.0)、10mM NaClでカラムを洗浄し、10mM〜1M NaClの直線勾配でTrx−HPA−1aを溶出する。Trx−HPA−1aに富む画分をプールし、1〜15mg/mlに濃縮し、PBS又は滅菌水中、Vivaspin Concentratorで平衡化し、使用するまで−20℃で保管する。タンパク質濃度をブラッドフォード法(Kruger NJ.「タンパク質定量化のためのブラッドフォード法(The Bradford method for protein quantitation)」Methods Mol. Biol. 1994; 32: 9-15)により求める。
エレクトロスプレー装置API 165(Applied Biosystems)を使用して質量スペクトルを得る。ペプチドマスフィンガープリンティング及びMaldi−Tof分析(voyager−DE TM PRO、Applied Biosystems)により同定する。
100mM Tris−HCl(pH8)中で予め平衡化した250μlml プロテインAセファロースビーズカラム(P3391、Sigma-Aldrich)に、10%の1M Tris−HCl(pH8)で平衡化したヒト血清をアプライする。カラムを10容量の100mM Tris−HCl(pH8)及び10容量の10mM Tris−HCl(pH8)で洗浄する。全IgGを100mMグリシン(pH3)で溶出する。溶出画分を10%の1M Tris−HCl(pH8)で中和する。IgGを含有する画分を濃縮し、5kDaカットオフのVivaspin Concentratorメンブレン及びPBSでバッファーを交換する。SDS−PAGEで試料を分析し、IgG濃度をブラッドフォード法(Kruger NJ.「タンパク質定量化のためのブラッドフォード法(The Bradford method for protein quantitation)」Methods Mol. Biol. 1994; 32: 9-15)により求める。
免疫共沈降
1μgのTrx−HPA−1aタンパク質を、バッファーA(PBS、0.5Mトレハロース)又は0.01%Tween20、0.1%NP40、若しくは0.05%Tritonを含むバッファーA中、ヒト血清からのIgG抽出物30μgで20〜25℃で2時間インキュベートする。10%の1M Tris−HClを混合物に添加し、100mM Tris−HCl(pH8)で予め平衡化した25μlのプロテインAセファロースビーズを用いて4℃で45分インキュベートする。次に、ビーズを100mM Tris−HCl(pH8)、0.2%Tween20で4℃で10分3回洗浄し、10mM Tris−HCl(pH8)、0.2%Tween20で3回洗浄する。プロテインA−セファロース−IgG−Trx−HPA−1a複合体の沈殿(fall)を作成するために、混合物を10000gで2分間遠心分離する。SDSサンプルバッファー中で煮沸することによりタンパク質を溶出し、溶出物を15%SDSポリアクリルアミドゲル上で溶解し、液体電気泳動転写セルのニトロセルロースメンブレン(PROTRAN(登録商標)BA79、Schleicher & Schuell)上にブロットする。次に、TBS5%粉乳でメンブレンを4℃で一晩ブロッキングした後、TBS1%粉乳、0.05%Tween20で1:200に希釈した抗His抗体(Hisプローブ、Santa Cruz Biotechnology)を用いて、20〜25℃で1時間10分インキュベートする。TBS0.05%Tween20で3回洗浄した後、1:3000に希釈したHRP結合ヤギ抗ウサギIgG(Dakocytomation)を用いて、メンブレンを20〜25℃で50分間インキュベートする。TBS0.05%Tween20でさらに3回洗浄した後、Lumi−LightPLUSウエスタンブロット基質により結合複合体を検出する。
イムノキャプチャー
Rachel et al.により発表された技法(Med Lab Sci: 1985, 42; 194-199)によると、イムノキャプチャーは、血小板に対するIgG抗体を検出する古典的な技法である。
イムノアッセイ
ヒト血清中のHPA−1a特異抗体を、炭酸バッファー中1ウエル当たり100ngのTrx−HPA−1aで、4℃で一晩コートしたマイクロタイトレーションプレート(Nunc)を使用して、ELISA試験により決定する。プレートを250μLのPBSで2回すすぐ。1%ウシ血清アルブミン(BSA)(A7030、Sigma)を含有するPBS250μlを用いて、非特異部位を20〜25℃で1時間30分インキュベートすることによりブロッキングする。プレートを250μLのPBSで1回すすぎ、次に100μlのPBS1%BSAで希釈したヒト血清10μlを用いて、20〜25℃で45分間、振盪培養器でインキュベートする。0.05%Tween20を含有するPBSで3回、及びPBSで1回の洗浄後、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG(Fc断片特異的)(Jackson ImmunoResearch)を用いて、プレートを20〜25℃で40分間、振盪培養器でインキュベートする。PBS0.05%Tween20で3回、及びPBSで2回の洗浄後、製造業者の使用説明書に従って、ペルオキシダーゼ基質OPD(1,2−フェニレンジアミン二塩酸塩)(DakoCytomation)を添加することにより、抗HPA−1a抗体の結合を検出する。25〜30分にわたって、492nmでの吸収をELISAプレートリーダーを使用して測定する。反応を停止するには、0.5M H2SO4100μlをウエルに添加する。次に、OPDのインキュベート時間に従う、吸光度の進展(evolution)の曲線を分析する。
この実験では、Trx−HPA−1aのヒトIgGHPA−1a特異的ポリクローナル同種抗体の結合を中和する能力を、MAIPA技術により判定する。MAIPA技術は、Kiefel et al.(Blood: 1987, 70; 1722-1727)により記載されているように使用される。MAIPA技術は、血小板の同種抗体及び自己抗体を検出及び同定する、より特別な技法である。
実施例6
MAIPA及びELISAを使用した抗HPA−1a抗体の検出
血液試料(表1、左)は匿名のドナー又はNAIT患者からのものである。粗血清(表1、「MAIPA」)又はプロテインA精製免疫グロブリン(表1、「MAIPA pure」)についてMAIPAを実施する。ドナーの大部分は、MAIPA及びELISAの双方を使用して、陰性であることが判明した。MAIPAが0.1を上回る光学密度(OD>0.1)を示すことで、またELISA(終点測定)により、7つの試料は陰性であることが判明した。しかしながら、全てのドナー試料について、経時的分析は、光学密度は時間と共に直線的に増加し、一次導関数は一定であり(dOD/dt=一定)、二次導関数はゼロに等しい(d2OD/dt2=0)ことを示す。したがって、ELISAを使用してd2OD/dt2=0であった場合、所与の試料は陰性であることが割り出される。ELISA経時的分析の結果は、指定の欄に表示される(表1、「曲線」):全てのドナー試料は陰性であると試験される(d2OD/dt2=0)、一方、NAIT患者(Pan, St Camb, Bru)からの3つの試験された試料は陽性であることが判明する(d2OD/dt2>0)。その結果、所与の試料は、本明細書中に記載のELISAを用いて、以下の基準の1つを満たす場合、陰性である:0.1を下回る光学密度(終点)又はd2OD/dt2=0(経時変化)。全ての試料は、終点プロトコルを用いて陰性であると判明したが、経時的プロトコルを用いても同様に陰性であると判明することが指摘されるべきである。また、NAIT患者(Pan、Sch、Ac mB2)からの3つの試料の免疫除去は、精製ペプチドアプタマー(表1、「neutr.」)を用いて首尾よく行われる。HPA遺伝子座のジェノタイピングが示される(表1、「geno.」)。
Claims (15)
- (A)N末端からC末端の方向に、
(i)バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン及びグリシンから成る群から選択される4つの脂肪族アミノ酸、
(ii)アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される2つの酸性アミノ酸、
(iii)1つのプロリン、
(iv)アルギニン及びリシンから成る群から選択される1つの塩基性アミノ酸、
(v)アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される2つの酸性アミノ酸、
(vi)トレオニン及びセリンから成る群から選択される1つのアルコールアミノ酸、及び、
(vii)トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから成る群から選択される1つの芳香族アミノ酸、
の配列を有する、少なくとも1つのドデカペプチド、及び
(B)少なくとも1つのポリペプチド、
を含む、ペプチドアプタマー。 - さらに(C)1つ又は複数の検出可能なマーカーを含む、請求項1に記載のペプチドアプタマー。
- 前記ドデカペプチドの配列が配列番号1の配列を有する、請求項1又は2に記載のペプチドアプタマー。
- 前記ポリペプチドがチオレドキシン(Trx)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、コイルドコイルポリペプチド、ジスルフィド架橋を形成可能なシステイン含有ポリペプチド、又は1つ又は複数のそれらの断片から成る群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドアプタマー。
- 前記検出可能なマーカーが蛍光マーカー、放射性マーカー、Hisタグ、グルタチオントランスフェラーゼ(GST)、Flagタグ、ビオチン、Haタグ、Mycタグ及びXPressタグから成る群から選択される、請求項2〜4のいずれか1項に記載のペプチドアプタマー。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチドアプタマーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
- ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法であって、
(i)ヒト血小板抗原特異抗体の検査を受けるヒト血清を請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチドアプタマーと接触させる工程、及び、
(ii)前記ペプチドアプタマーのヒト血小板抗原特異抗体との直接又は間接相互作用を検出する工程、
を含む、ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法。 - 前記検出する工程(ii)がイムノブロット、免疫沈降、イムノキャプチャー、血小板抗原のモノクローナル抗体固定化、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、フローサイトメトリー、プロテインアレイ技術、分光法、質量分析、クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴、蛍光消光(fluorescence extinction)及び蛍光エネルギー移動から成る群から選択される1つ又は複数の検出方法を含む、請求項7に記載の方法。
- 検出又は同定される前記ヒト血小板抗原特異抗体が抗HPA−1aである、請求項7又は8に記載の方法。
- 免疫性血小板減少症の症状を患う患者の血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出及び/又は同定する、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫性血小板減少症が特発性(ideopathic)血小板減少性紫斑病(ITP)、新生児/胎児同種免疫性血小板減少症(NAIT)、輸血後紫斑病(PTP)又は血小板不応状態から成る群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチドアプタマーを含む、ヒト血小板抗原特異抗体のスクリーニング及び/又は同定のための診断キット。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチドアプタマーを使用することを含む、採取されたヒト血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出するイムノアッセイ。
- 治療に有効な量の請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチドアプタマーを含む、薬学的組成物。
- 更に薬学的に許容される塩、補助剤、希釈剤及び溶剤、又はそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される1つ又は複数の追加成分を含む、請求項14に記載の薬学的組成物。
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EP06002496.5 | 2006-02-07 | ||
PCT/EP2007/001042 WO2007090630A2 (en) | 2006-02-07 | 2007-02-07 | Peptide aptamer for neutralizing the binding of platelet antigene specific antibodies and diagnostic and therapeutic applications containing the same |
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