KR102572199B1 - 압타머 쌍을 이용한 샌드위치 방식의 황색포도상구균 검출용 조성물, 바이오센서 및 검출 방법 - Google Patents
압타머 쌍을 이용한 샌드위치 방식의 황색포도상구균 검출용 조성물, 바이오센서 및 검출 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102572199B1 KR102572199B1 KR1020210176540A KR20210176540A KR102572199B1 KR 102572199 B1 KR102572199 B1 KR 102572199B1 KR 1020210176540 A KR1020210176540 A KR 1020210176540A KR 20210176540 A KR20210176540 A KR 20210176540A KR 102572199 B1 KR102572199 B1 KR 102572199B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- aptamer
- staphylococcus aureus
- seq
- aptamers
- sequence
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56938—Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 타겟인 황색포도상구균에 결합이 가능한 압타머 쌍을 포함하는 황색포도상구균 검출용 조성물, 이를 이용한 구체적인 검출 방법 및 바이오센서를 제공한다. 본 발명은 샌드위치 방식을 이용함으로써 황색포도상구균 검출에 대한 민감도를 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 식중독을 일으키는 황색포도상구균에 결합하는 압타머 쌍을 이용한 황색포도상구균 검출용 조성물, 바이오센서 및 검출 방법에 관한 것으로, 식품, 의료분야 등에서 황색포도상구균을 검출하는 데 사용될 수 있다.
황색포도상구균(S.aureus, Staphylococcus aureus)은 그람양성균인 포도상구균의 한 종으로, 포도상구균은 자연계에 널리 분포되어 있는 세균 중 하나이며 건강한 사람의 30% 이상의 비강, 인후두, 피부, 털에 집락된 채로 보균되어 있는 균이다. 포도상구균은 여러 종류가 있지만, 식중독을 일으키는 균은 황색포도상구균이다. 황색포도상구균이 증식한 식품에서는 장 독소가 생산되고, 이 독소가 들어있는 식품을 섭취하면 위 또는 장에 흡수되면서 구토, 설사, 복통 등이 발생한다. 주로 식품 취급자가 오염의 주체이지만, 식품 취급 기구도 오염원이 될 수 있다. 따라서, 황색포도상구균을 경제적이면서도 간단하게 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
압타머(aptamer)는 1012-14 정도의 다양성을 가지는 랜덤 핵산 라이브러리로부터 얻어지는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA 분자 구조체 이다. 압타머는 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체와는 달리 핵산구조체이므로 열 안정성이 우수하며, 시험관 내(in vitro)에서 합성되기 때문에, 동물이나 세포가 따로 필요하지 않아 생산 비용 면에서도 경제적이다. 또한, 타겟 물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자 물질부터 환경호르몬, 항생제, 잔류 의약품 등의 저분자 유기화학 물질, 박테리아, 바이러스 등의 다양한 타겟에 대한 압타머를 합성할 수 있다. 압타머는 식품 내 극미량의 식품 유해균 검출 방법에 도입하기에 매우 적절한 물질이며, 이를 활용한 나노 바이오 기술을 통해 특정 식품 유해균을 검출하는데도 응용할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 황색포도상구균 검출 방법의 개선을 위해 예의 연구 노력한 결과, 황색포도상구균에 결합할 수 있는 압타머 쌍과, 이를 이용한 샌드위치 결합방식의 검출용 조성물, 바이오센서 및 검출 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 황색포도상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머 쌍을 포함하는 조성물을 제공하고, 이를 이용하여 민감하게 황색포도상구균을 검출할 수 있는 구체적인 방법 및 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 압타머 중 동일 또는 상이한 압타머를 2개 이상 포함하고,
상기 2개 이상의 압타머 중 하나 이상은 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 것인, 샌드위치 방식의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 조성물.
2. 대상 시료에 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 압타머 중 동일 또는 상이한 압타머를 2개 이상 가하여, 2개 이상의 압타머의 샌드위치 방식의 결합 여부를 확인하는 단계;를 포함하고,
상기 2개 이상의 압타머 중 하나 이상은 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 방법.
3. 위 2에 있어서, 상기 대상 시료에 상이한 압타머를 동시 또는 순차적으로 가하는 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 방법.
4. 위 3에 있어서, 상기 대상 시료에 서열번호 3의 서열로 이루어진 압타머를 가하고, 그 이후에 서열번호 4의 서열로 이루어진 압타머를 가하는 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 방법.
5. 전극에 고정된, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 1차 압타머;
서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 2차 압타머; 및
상기 2차 압타머에 결합된, 상기 전극이 감지하는 전기화학적 신호를 발생시키는 신호발생원;을 포함하는,
황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 바이오센서.
6. 위 5에 있어서, 상기 신호 발생원은 형광물질, 양자점, 방사능 표지, 금속 나노입자, 효소 및 전기화학적 작용기 중에서 선택된 표지 물질을 포함하는 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 바이오센서.
7. 위 5에 있어서, 상기 1차 압타머는 서열번호 3의 서열로 이루어진 것이고, 상기 2차 압타머는 서열번호 4의 서열로 이루어진 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 바이오센서.
8. 전극에 고정된, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 1차 압타머에 대상 시료를 처리하는 단계;
상기 처리된 시료에 신호발생원이 결합된 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 2차 압타머를 처리하는 단계;
세척하여 황색포도상구균에 결합하지 않은 2차 압타머를 제거하는 단계; 및
상기 신호발생원으로부터 발생하는 신호를 감지하는 단계를 포함하는, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 방법.
본 발명에 따른 압타머 쌍은 식품 등에 존재하는 극소량의 황색포도상구균의 민감한 검출을 가능하게 하므로, 식중독을 예방하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 압타머 쌍을 이용한 황색포도상구균의 분리는 검출용 조성물, 검출 방법, 바이오센서는 낮은 비용으로 생산이 가능한 압타머를 이용하므로 경제적이다.
도 1은 본 발명에서 사용된 압타머의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 압타머 각각이 황색포도상구균에 결합하여 나타내는 형광 신호를 통해 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 압타머 후보 6종의 황색포도상구균에 대한 반응특이성을 유세포 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 4는 유세포 분석을 통하여 본 발명 압타머 후보 6종의 농도의존성 및 결합 친화도값(Kd)을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명 압타머 4종의 황색포도상구균에 대한 반응특이성 확인을 위한 공초점 레이저 주사 현미경 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 압타머 4종의 압타머 쌍으로서의 결합력 분석을 위한 흡광도를 측정값을 나타낸 것이다.
도 7 내지 10은 각 순서대로 본 발명의 서열번호 1 내지 4 중 하나의 염기서열로 이루어진 압타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 서열번호 3 및 4로 이루어진 압타머 듀오를 샌드위치 방식으로 사용한 경우의 원형편광이색성 분광기(CD, circular dichroism) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12a는 서열번호 3 및 4로 이루어진 압타머 듀오의 황색포도상구균에 대한 반응특이성 확인을 위한 공초점 레이저 주사 현미경 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12b는 본 발명 압타머 SA37과 SA81에 각각 다른 염료를 붙여 황색포도상구균과 반응시켰을 때 타겟인 황색포도상구균에 SA37과 SA81이 동시 결합한 결과를 공초점 레이저 주사 현미경 이미지로 확인한 것이다.
도 13은 쌍 압타머 듀오를 이용한 황색포도상구균 검출 실험 방식을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 압타머 SA37의 농도 1uM, 2uM, 4uM별 신호 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 각 0.1% BSA, 1% BSA, 5% BSA, 5% BSA+0.05% Tween 20, 5% HSA를 이용한 전극 코팅별 신호 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 압타머 SA81과 streptavidin-HRP를 1/30배, 1/20배, 1/10배로 희석한 농도별 신호 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 작업전극에 순차적으로 처리함에 따라 순환 전압전류법(Cyclic Voltammetry, CV)을 이용하여 전압 변화에 따른 작업전극의 전류량 변화를 측정한 결과이다.
도 18은 서열번호 3 및 4로 이루어진 압타머 쌍이 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 신호 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 19 및 20은 농도별 타겟 검출 결과를 나타낸 것이다. 도 19는 완충액(버퍼) 상에서, 도 20은 실제 샘플인 수돗물 상에서 황색포도상구균 농도 변화에 따른 검출 결과이다.
도 2는 본 발명 압타머 각각이 황색포도상구균에 결합하여 나타내는 형광 신호를 통해 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 압타머 후보 6종의 황색포도상구균에 대한 반응특이성을 유세포 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 4는 유세포 분석을 통하여 본 발명 압타머 후보 6종의 농도의존성 및 결합 친화도값(Kd)을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명 압타머 4종의 황색포도상구균에 대한 반응특이성 확인을 위한 공초점 레이저 주사 현미경 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 압타머 4종의 압타머 쌍으로서의 결합력 분석을 위한 흡광도를 측정값을 나타낸 것이다.
도 7 내지 10은 각 순서대로 본 발명의 서열번호 1 내지 4 중 하나의 염기서열로 이루어진 압타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 서열번호 3 및 4로 이루어진 압타머 듀오를 샌드위치 방식으로 사용한 경우의 원형편광이색성 분광기(CD, circular dichroism) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12a는 서열번호 3 및 4로 이루어진 압타머 듀오의 황색포도상구균에 대한 반응특이성 확인을 위한 공초점 레이저 주사 현미경 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12b는 본 발명 압타머 SA37과 SA81에 각각 다른 염료를 붙여 황색포도상구균과 반응시켰을 때 타겟인 황색포도상구균에 SA37과 SA81이 동시 결합한 결과를 공초점 레이저 주사 현미경 이미지로 확인한 것이다.
도 13은 쌍 압타머 듀오를 이용한 황색포도상구균 검출 실험 방식을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 압타머 SA37의 농도 1uM, 2uM, 4uM별 신호 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 각 0.1% BSA, 1% BSA, 5% BSA, 5% BSA+0.05% Tween 20, 5% HSA를 이용한 전극 코팅별 신호 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 압타머 SA81과 streptavidin-HRP를 1/30배, 1/20배, 1/10배로 희석한 농도별 신호 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 작업전극에 순차적으로 처리함에 따라 순환 전압전류법(Cyclic Voltammetry, CV)을 이용하여 전압 변화에 따른 작업전극의 전류량 변화를 측정한 결과이다.
도 18은 서열번호 3 및 4로 이루어진 압타머 쌍이 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 신호 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 19 및 20은 농도별 타겟 검출 결과를 나타낸 것이다. 도 19는 완충액(버퍼) 상에서, 도 20은 실제 샘플인 수돗물 상에서 황색포도상구균 농도 변화에 따른 검출 결과이다.
본 발명은 황색포도상구균에 대해 특이적으로 높은 친화도를 갖는 2개 이상의 압타머를 샌드위치 방식으로 이용함으로써, 황색포도상구균 검출에 대한 민감도를 향상시킬 수 있는 조성물을 제공한다. 나아가, 상기 압타머의 결합신호를 이용하여 효과적으로 황색포도상구균 검출할 수 있는 구체적인 검출 방법 및 바이오센서를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 압타머 중 동일 또는 상이한 압타머를 2개 이상 포함하고, 상기 2개 이상의 압타머 중 하나 이상은 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 것인, 샌드위치 결합방식의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 대상 시료에 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 압타머 중 동일 또는 상이한 압타머를 2개 이상 가하여, 2개 이상의 압타머의 샌드위치 방식의 결합 여부를 확인하는 단계;를 포함하고, 상기 2개 이상의 압타머 중 하나 이상은 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 압타머는 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하는 한, 상기 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
상기 압타머는 이 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 화학 합성할 수 있다.
상기 “검출”은 특정 물질에 대한 선택적 반응을 통해 상기 특정 물질의 존재를 확인하는 모든 행위(예를 들면, 형광 변화, 흡광 변화 등)를 포함한다.
상기 "샌드위치 방식"은 타겟에 2개 이상의 압타머가 결합하는 방식을 의미한다. 상기 샌드위치 방식으로 사용되는 압타머는 서로 동일 또는 상이한 것일 수 있다. 예를 들면 동일한 압타머 2개 이상을 사용할 때, 상기 압타머는 황색포도상구균 서로 다른 2개 이상의 부위에 결합이 가능한 것일 수 있다.
상기 샌드위치 방식을 이용함으로써, 단일 압타머를 사용하는 경우와 비교하여 타겟에 대한 검출의 민감도를 높일 수 있다.
상기 압타머는 조합이나, 상기 압타머를 사용하는 순서에 따라서 타겟인 황색포도상구균의 검출능이 달라질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 실시예에서 보이는 바와 같이, 단일 압타머로써 황색포도상구균에 대한 결합친화도가 높은 압타머라도, 다른 압타머와의 조합이나 압타머가 처리되는 순서에 따라서 상이한 결합능을 가질 수 있다.
본 발명의 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 압타머의 경우, 단일 압타머로서의 결합친화도가 우수하고, 자기 자신 또는 다른 압타머와 함께 사용될 경우의 샌드위치 결합 효과도 높게 나타난다.
따라서, 상기 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 압타머를 샌드위치 방식을 위한 압타머에 포함할 경우, 샌드위치 결합능이나 결합친화도를 더 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 압타머를 순차적으로 처리할 경우에는, 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 압타머를 나중에 사용하는 것이 샌드위치 방식에 더 효과적이다.
본 발명의 압타머는, 황색포도상구균에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기 (예를 들어, 리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것일 수 있다. 당잔기에서 수식되는 부위는, 예를 들면 당잔기의 2’부위, 3’부위 및/또는 4’부위의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 종류로서는, 예를 들면 플루오로화, O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예, -NH)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145 등에 기재된 공지의 방법을 사용한 것일 수 있다.
상기 압타머는 또한 황색포도상구균에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산 염기(예를 들면, 푸린, 피리미딘)가 변형(예를 들면, 화학적 치환)된 것일 수 있으며, 예를 들면, 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환일 수 있다.
또는, 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성을 갖도록 상기 압타머에 포함되는 인산기가 변형된 것일 수 있다. 예를 들면, P(O)O기가, P(O)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, R(O)OR’, CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3’-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환된 것일 수 있다. 상기 각각의 R 또는 R’는 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)일 수 있다. 연결기는 예를 들면 -O-, -N- 또는 -S-일 수 있고, 이들 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
상기 변형은 또한, 캡핑과 같은 3’ 및 5’의 변형을 포함한다.
상기 변형은 또한, 폴리에틸렌클리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(Myristoyl), 리쏘콜릭-올레일(Lithocolic-oleyl), 도코사닐(Docosanyl), 라우로일(Lauroyl), 스테아로일(Stearoyl), 팔미토일(Palmitoyl), 올레오일(Oleoyl), 리놀레오일(Linoleoyl), 그 외 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가하는 것일 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호에 기재된 방법이 사용될 수 있다.
또한, 상기 압타머는 발색 효소, 형광물질, 방사성 동위 원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색 효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 압타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다.
본 발명의 황색포도상구균의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
상기 시료는 물, 토양, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 물은 강수, 해수, 호수 및 우수 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인간을 포함한다.
상기 검출 방법에 있어서, 동일 또는 상이한 압타머는 동시 또는 순차적으로 가해지는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "1차 압타머"는 샌드위치 방식으로 결합하는 압타머를 순차적으로 가할 경우, 먼저 가해지는 압타머를 지칭하며, "2차 압타머"는 상기 1차 압타머 이후 가해지는 압타머를 지칭한다.
예를 들면, 상기 검출 방법은 2개 이상의 압타머를 동시에 가한 후 샌드위치 방식의 결합여부를 확인하거나, 1차 압타머를 가한 뒤 2차 압타머를 가하여 샌드위치 방식의 결합여부를 확인하거나, 또는 1차 압타머를 가한 뒤 압타머와 결합하지 않은 시료는 세척 등의 방법으로 제거하고, 2차 압타머를 가하는 것일 수 있다.
상기 1차 압타머는 서열번호 3의 서열로 이루어진 것이고, 상기 2차 압타머는 서열번호 4의 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 후술하는 실시예를 통해 확인된 바와 같이 상기 1차 및 2차 압타머의 조합이 황색포도상구균 검출에 가장 효과가 높았다.
상기 샌드위치 방식의 결합 여부를 확인하는 방식은, 본 발명이 속한 당업자에 의해 타겟 물질인 황색포도상구균에 2개 이상의 압타머가 결합된 것을 확인할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 아니한다.
예를 들면, "자성 비드 색도분석법 기반 쌍 압타머 듀오 스크리닝"을 이용할 수 있고, 상기 자성 비드 색도분석법 기반 쌍 압타머 듀오 스크리닝이란 임의로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA 쌍 듀오를 선별하여 색도변화를 관찰함으로서 해당분자의 결합 서열 쌍 듀오를 알아내는 방법을 의미한다.
또는, 황색포도상구균에 특이적으로 결합 가능한 압타머 쌍을 원형편광이색성 분광기(CD, circular dichroism) 분석을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 실시예에서 편광이색성 분광기분석을 수행한 결과, 도 11에 개시된 바와 같이, 서열번호 3의 서열로 이루어진 압타머인 SA-10R-37 및 황색포도상구균, 서열번호 4의 서열로 이루어진 SA-10R-81 압타머가 동시에 모두 결합 하였을 때, 220nm에서 가장 낮은 피크 높이를 보여줌으로써 두 압타머가 하나의 황색포도상구균에 동시에 결합할 수 있음을 확인하였다.
또는, 황색포도상구균에 특이적으로 결합 가능한 압타머 쌍을 공초점 레이저 주사 현미경 이미징 분석을 이용하여 확인할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 실시예에서는 서열번호 3의 서열로 이루어진 압타머 SA-10R-37 및 서열번호 4의 서열로 이루어진 SA-10R-81 압타머에 대하여, 공초점 레이저 주사 현미경 이미징 분석을 이용하여 결합 특이성 분석을 수행하였으며, 도 12a 및 b에 개시된 바와 같이, 해당 쌍 압타머 듀오가 황색포도상구균에 동시에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
본 발명은 상기 압타머의 샌드위치 결합을 나타내는 신호를 증폭시키고, 이를 감지하는 바이오센서 형태로 제공하는 것을 포함한다. 샌드위치 방식의 바이오센서의 경우 하나의 타겟물질에 결합하는 2 개 이상의 리셉터 물질이 필요하며, 센서의 민감도 향상을 시킬 수 있는 수단이 형광물질, 양자점, 방사능 표지, 금 나노입자, 효소, 효소 기질, 및 전기화학적 작용기 (electrochemical functional group)로 표지함으로써 다양하여 광범위하게 사용될 수 있다.
상기 바이오센서는 전기화학 방식 뿐만 아니라 샌드위치 방식을 사용하는 다른 모든 바이오센서 플랫폼에도 적용이 가능하다.
이에, 또한 본 발명은, 전극에 고정된, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 1차 압타머; 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 2차 압타머; 및 상기 2차 압타머에 결합된, 상기 전극이 감지하는 전기화학적 신호를 발생시키는 신호발생원;을 포함하는, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 바이오센서에 관한 것이다.
상기 "압타머", "샌드위치 방식" 및 "검출"에 관해서는 전술한 바와 같으므로 중복을 피하기 위하여 설명을 생략한다.
상기 바이오센서는 분석 시간이 길지 않고, 분석 비용이 비교적 적으며, 소형화 및 집적화가 쉽기 때문에 고속분석기술이나 현장 분석 기술에 적용하기 유리하다.
상기 전극은, 예를 들면 3전극인 SPGE(screen printed gold electrode)기반의 전기화학적 분석을 사용하는 것일 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, 전극의 표면을 개질하여 1차 압타머를 전극위에 고정시킨 후 비특이적 결합을 막기 위하여 표면을 개질하는 단계를 거쳐, 타겟물질을 농도별로 반응시키고, 효소반응 등을 통해 전기적 신호를 생성할 수 있는 2차 압타머를 통해 그 결합력을 확인하며, 특이적 결합능 분석을 위해 다른 카운터 타겟 물질에 대한 결합력을 테스트하였다.
또한, 상기 서열번호 3의 서열로 이루어진 압타머인 SA-10R-37 및 서열번호 4의 서열로 이루어진 압타머 SA-10R-81에 대하여, 전위가변장치인 Potentiostat을 이용하여 도 13에 개시된 바와 같이 동시 결합 특이성 분석을 수행하였다. 도 17 내지 도 20에 개시된 바와 같이, 해당 쌍 압타머 듀오가 황색포도상구균에 동시에 특이적으로 결합함을 확인할 수 있다.
상기 신호발생원은 형광물질, 양자점, 방사능 표지, 금속 나노입자, 효소 및 전기화학적 작용기 중에서 선택된 것일 수 있으며, 2차 압타머에 결합하고 전극을 통해 신호전달이 가능한 물질이면 특별히 제한되지 않는다.
상기 신호발생원은 압타머에 결합된 타겟 물질의 존재를 확인하는 표지 물질로서, 신호증폭을 통해 센서의 감도를 개선할 수 있다.
상기 효소는, 전기화학적 신호를 발생시킬 수 있는 효소이면 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들면 Horseradish peroxidase (HRP), Glucose oxidase (GOx), Alcohol oxidase (AOx), Putrescine oxidase/peroxidase, p-aminophenol (AP) 등의 산화효소 또는 과산화효소가 사용될 수 있다.
상기 형광물질은, 예를 들면 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광색소나, 루시퍼라아제(luciferase), GFP와 같은 형광 단백질이 사용될 수 있다. 상기 형광물질을 표지물질로서 사용한 경우, 예를 들면 타겟 물질의 존재 시 발광 또는 색 변화가 발생하므로, 이를 측정함으로써 타겟물질을 검출할 수 있다. 구체적으로 형광염료를 탐지할 수 있는 이미지 스캐너 등을 통하여 반응을 일으킨 웰을 스캔하여 타겟물질의 검출 여부를 확인할 수 있고, 이미지를 소프트웨어를 통해 진하기 정도를 측정함으로써 검출량을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 전극에 고정된, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 1차 압타머에 대상 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료에 신호발생원이 결합된 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 2차 압타머를 처리하는 단계; 세척하여 황색포도상구균에 결합하지 않은 2차 압타머를 제거하는 단계; 및 상기 신호발생원으로부터 발생하는 신호를 감지하는 단계를 포함하는, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 방법 에 관한 것이다.
상기 "전극", "압타머", "대상 시료", "검출"에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 검출 방법의 원리는, 황색포도상구균에 결합할 수 있는 상기 1차 압타머 및 2차 압타머를 순차적으로 처리하고, 샌드위치 방식 결합 여부를 확인함으로써 높은 민감도로 황색포도상구균을 검출하는 것으로, 전술한 내용과 중복되어 기재를 생략한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. DNA 압타머의 황색포도상구균에 대한 결합력 분석
본 발명의 압타머가 황색포도상구균에 대한 결합력이 있는지를 확인하였다.
구체적으로, 5' 말단에 Cyanine 5(Cy5)을 연결한 압타머와 타겟을 완충용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도한 뒤, 타겟에 결합하지 않은(unbound) 압타머를 원심분리 통해 제거한 혼합액에 대해 마이크로 플레이트 리더(plate reader) 장비를 통해 황색포도상구균을 검출하였다. 그 결과, 형광이 표지된 압타머가 타겟에 결합함으로써 발생하는 형광 신호가 증가함에 따라, 도 2에 개시된 바와 같이, 본 발명에서 사용된 압타머 후보 14종 모두가 타겟에 결합함을 확인하였다.
2. DNA 압타머의 황색포도상구균에 대한 농도의존성 및 반응 특이성 분석
상기 서로 다른 14종의 황색포도상구균과 결합하는 압타머 중에서 6종(SA-9R-25, SA-10R-28, SA-10R-35, SA-10R-37, SA-10R-40, SA-10R-81)의 타겟에 대한 농도의존성(Dose-dependency) 및 반응특이성(Specificity)를 유세포 분석을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 5’ 말단에 Cyanine 5(Cy5)을 연결한 DNA 500nM과 황색포도상구균 1x106 cells (OD600=0.1)을 각 100ul 씩 혼합하여, 상온에서 40분간 쉐이커(shaker) 상에서 300rpm 속도로 반응시킨 후, 0.05% BSA가 포함된 버퍼용액(50mM Tris-HCl, 5mM KCl, 100mM NaCl, 1mM MgCl2, pH 7.4)으로 3번 워싱하였다. 동일한 방식으로 카운터 타겟(Salmonella enterica, Listeria monocytogene, Staphylococcus saprophyticus, Escherichia coli)에 대해서도 반응시켰다. 최종 혼합액을 유세포 분석기에 주입하여 Cy5 입자의 형광 값을 측정하였다. 그 결과, 도 3 및 4에 개시된 바와 같이, 6종 압타머 모두 황색포도상구균의 농도에 비례하여 형광값이 증가하는 것을 확인하였으며, 또한, 카운터 타겟에 비해 타겟에 값이 크게 나타나는 것을 통해 각각의 압타머가 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
이에 더하여, 6종의 압타머 중에서도 황색포도상구균에 민감하게 결합하는 압타머 4종(SA-9R-25, SA-10R-35, SA-10R-37, SA-10R-81)에 대하여 반응 특이성(specificity)을 다음과 같이 공초점 레이저 주사 현미경 이미징 분석을 통하여 추가 확인하였다.
상기 유세포 분석 방법과 동일한 방식으로 준비한 최종 혼합액을 현미경용 슬라이드 글라스(slide glass)에 고정하여 공초점 레이저 주사 현미경을 통해 육안으로 형광 신호를 확인하였다. 그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이, 모든 압타머의 형광 신호가 카운터 타겟에서는 보이지 않고, 타겟에서만 보이는 것을 통해, 각각의 4종 압타머가 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
3. 비드 색도분석법 기반 쌍 압타머 듀오 스크리닝
하나의 황색포도상구균에 결합하는 쌍 압타머 듀오를 스크리닝하기 위한 비드 색도분석법 기반 압타머 듀오 스크리닝의 원리는 도 6에 나타내었다. 간략하게, 스트렙타비딘이 코팅된 마그네틱 비드(MB-STV, Sigma) 50ul 10mg/ml를 먼저 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 이후 세척된 MB-STV 용액에 바이오틴 기가 표기된 1차 압타머를 1μM 100ul를 첨가하고 30분간 회전시켜 배양하였다. 이후 106 S. aureus 박테리아 세포를 압타머가 고정된 MB-STV에 첨가하고 30분 동안 배양하였다. 결합되지 않은 S. aureus를 제거하고 신호물질로 사용된 효소 HRP가 표기된 2차 압타머를 추가하였다. 쌍 압타머 듀오가 황색포도상구균과 반응하면 HRP의 효소반응 의해 푸른색이 발현된다. 이 색도변화를 투명한 96well plate를 이용하여 450nm파장에서 흡광도를 플레이트 판독기(Spectramax I3)로 측정하였으며 그 결과를 도 6에 그래프로 나타내었다. 이를 통해 최종적으로 쌍 압타머 듀오로 사용될 서열번호 1 내지 4의 서열로 이루어진 압타머를 선별하였으며, 각각의 2차구조를 m-fold프로그램을 이용하여 예측한 결과를 도 7 내지 10에 나타내었다.
4. 원형편광이색성 분광기(CD, circular dichroism) 분석을 통한 쌍 압타머 듀오 특이성 확인
CD 스펙트럼 조사는 S. aureus 박테리아 세포와 결합 시 압타머의 구조적 변화를 연구하기 위해 수행하였다. Quartz cuvette(Hellma Analytics, Germany)가 해당 분석에 사용되었다. S. aureus의 세균 세포 106개, 또는 반대 표적(S. saprophyticus, L. monocytogene, E. coli 및 S. enterica) 1μM 각 압타머(1차 압타머 SA37 및 2차 압타머 SA81)를 다른 조합으로 측정하였다. 분석의 온도는 25℃ 였으며 각 측정은 5회 반복 측정하였다. 도 11에 개시된 바와 같이, 선정한 압타머 듀오를 샌드위치 방식으로 이용할 경우, 원형편광이색성 분광기(CD, circular dichroism) 분석을 통해 황색포도상구균에 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다.
5. 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 사용한 쌍 압타머 듀오 이미징
공초점 레이저 주사 현미경(LSM 700, Carl-Zeiss. Germany)을 사용하여 압타머 듀오가 황색포도상구균에 결합하는 이미지를 확인하였다.
스트렙타비딘이 코팅된 자성 비드와 연결된 1차 압타머(SA37)를 사용하였으며, 형광 신호를 관찰하기 위해 Cy5-5' 형광이 표지된 2차 압타머(SA81) 사용하였다. 결합 분석 후, 박테리아 세포를 폴리-L-리신 으로 코팅딘 슬라이드글라스에 고정시켰다. 음성 대조군은 표적이 없는 동일한 성분으로 사용되며, S. saprophyticus는 negative 카운터 타겟으로 사용하였으며, 그 결과, 형광이 표지된 압타머가 타겟에 결합함으로써 발생하는 형광신호를 통해, 도 12a에 개시된 바와 같이, 쌍 압타머 듀오가 타겟에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
또한, 1차 압타머(SA37)를 FAM으로, 2차 압타머(SA81)를 Cy5으로 서로 다른 형광 염료로 표지하여 황색포도상구균과 반응시킨 결과를 도 12b에 나타내었으며, 각 압타머의 형광신호를 통해, 쌍 압타머 듀오가 타겟인 황색포도상구균에 동시 결합함을 확인할 수 있다.
6. 쌍 압타머 듀오를 이용한 샌드위치형 전기화학 바이오센서
도 13에 표기된 바와 같이, 쌍 압타머 듀오를 이용한 황색포도상구균을 검출방식의 실험 방식은 다음과 같다. 본 발명에 사용된 3전극인 SPGE(screen printed gold electrode)는 작업전극(금), 기준전극(은) 및 상대전극(금)으로 이루어진 단일 전극이다. 1차 압타머의 고정화를 진행하기 전, SPGE는 0에서 +1.2V 사이의 전위 사이클을 갖는 조건 하에 0.5M H2SO4 용액으로 처리하여 전기화학적으로 세척하였다. 이후 SPGE를 초순수로 헹구고 N2 가스로 건조시켰다. 티올기로 변형된 1차 압타머(SA37)는 도 14에 개시된 바와 같이, 1uM, 2uM, 4uM 중, 배경신호가 낮으며 신호가 비례하여 증대하는 폭이 가장 큰 4uM 5ul를 작업전극 표면에 떨어뜨리고 16시간 동안 배양하여 고정하였다.
그 후, 도 15에 개시된 바와 같이, 2mM의 MCH 용액을 1시간 동안 첨가한 후, 비특이적 흡착을 방지하기 위해 0.1% BSA, 1% BSA, 5% BSA, 5% BSA+0.05% Tween 20, 5% HSA를 이용한 코팅 중, 타겟의 농도가 증가할수록 비례하여 신호가 증가하며, 배경 신호가 가장 낮은 조건인 5%의 BSA로 코팅하였다. 신호 생성용 2차 압타머(SA81@HRP)는 도 16에 개시된 바와 같이, 바이오틴으로 변형된 SA81과 streptavidin-HRP를 1/30배, 1/20배, 1/10배 중 타겟 농도에 따라 신호가 비례적으로 증가하는 1/10배로 희석하여 4℃에서 2시간 동안 배양시켜 제조하였다. 전기화학적 분석의 절차는 다음과 같은 순서로 진행하였다. 완충액 또는 수돗물에 다른 세포 수를 가진 5 μl의 살아있는 S. aureus를 작업전극에 떨어뜨리고 40분 동안 배양하였다. 결합되지 않은 박테리아 세포를 제거한 후, HRP가 표지된 2차 압타머인 SA81를 5μl를 첨가하고 40분간 배양하였다. 전극을 1x BB + 0.05% tween 20(pH 7.4)으로 헹구어 결합하지 않은 물질들을 모두 제거하였다. 마지막으로 45μl의 TMB 용액을 적용하고 시간대전류법(chronoamperometry) 및 순환 전압전류법(cyclic voltammetry)을 통해 분석하였다. 각 전극의 모든 배양 단계는 실온에서 수분 포화 상태의 페트리 접시에서 수행하였다. 도 17 내지 도 20에 개시된 바와 같이, 쌍 압타머 듀오가 타겟에 동시에 특이적으로 결합하며, 농도 별 타겟 검출능을 확인하였다.
<110> Korea University Research & Business Foundation
<120> Sandwich-type compositions, biosensor and method for detecting
Staphylococcus aureus using aptamer pair
<130> 21P09047
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 1
gcttccagct tattgaatgg ggaaggtcgt ccgacgaacc cggtcagata gggtgggggc 60
gctgaagcgc ggaagc 76
<210> 2
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 2
gcttccagct tattgaatca caggtgtggg gaggtcccca tggaggtggt tcaatggcgc 60
tgaagcgcgg aagc 74
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 3
gcttccagct tattgaataa agacgggggg ggggaccggc gtatgagtga agatgggggc 60
gctgaagcgc ggaagc 76
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 4
gcttccagct attgaaaacg aggcgcaggg ggagggggtg gtacagataa gatgggggcg 60
ctgaagcgcg gaagc 75
Claims (8)
- 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 압타머 중 동일 또는 상이한 압타머를 2개 이상 포함하고,
상기 2개 이상의 압타머 중 하나 이상은 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 것인, 샌드위치 방식의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 조성물.
- 대상 시료에 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 압타머 중 동일 또는 상이한 압타머를 2개 이상 가하여, 2개 이상의 압타머의 샌드위치 방식의 결합 여부를 확인하는 단계;를 포함하고,
상기 2개 이상의 압타머 중 하나 이상은 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 대상 시료에 상이한 압타머를 동시 또는 순차적으로 가하는 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 대상 시료에 서열번호 3의 서열로 이루어진 압타머를 가하고, 그 이후에 서열번호 4의 서열로 이루어진 압타머를 가하는 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 방법.
- 전극에 고정된, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 1차 압타머;
서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 2차 압타머; 및
상기 2차 압타머에 결합된, 상기 전극이 감지하는 전기화학적 신호를 발생시키는 신호발생원;을 포함하는,
황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 바이오센서.
- 청구항 5에 있어서, 상기 신호 발생원은 형광물질, 양자점, 방사능 표지, 금속 나노입자, 효소 및 전기화학적 작용기 중에서 선택된 표지 물질을 포함하는 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 바이오센서.
- 청구항 5에 있어서, 상기 1차 압타머는 서열번호 3의 서열로 이루어진 것이고, 상기 2차 압타머는 서열번호 4의 서열로 이루어진 것인, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 바이오센서.
- 전극에 고정된, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열로 이루어진 1차 압타머에 대상 시료를 처리하는 단계;
상기 처리된 시료에 신호발생원이 결합된 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 2차 압타머를 처리하는 단계;
세척하여 황색포도상구균에 결합하지 않은 2차 압타머를 제거하는 단계; 및
상기 신호발생원으로부터 발생하는 신호를 감지하는 단계를 포함하는, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210176540A KR102572199B1 (ko) | 2021-12-10 | 2021-12-10 | 압타머 쌍을 이용한 샌드위치 방식의 황색포도상구균 검출용 조성물, 바이오센서 및 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210176540A KR102572199B1 (ko) | 2021-12-10 | 2021-12-10 | 압타머 쌍을 이용한 샌드위치 방식의 황색포도상구균 검출용 조성물, 바이오센서 및 검출 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230087892A KR20230087892A (ko) | 2023-06-19 |
| KR102572199B1 true KR102572199B1 (ko) | 2023-08-28 |
Family
ID=86988324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210176540A KR102572199B1 (ko) | 2021-12-10 | 2021-12-10 | 압타머 쌍을 이용한 샌드위치 방식의 황색포도상구균 검출용 조성물, 바이오센서 및 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102572199B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017507668A (ja) | 2014-02-18 | 2017-03-23 | ソマロジック・インコーポレーテッド | 微生物検出のための組成物及び方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101566476B1 (ko) | 2013-11-19 | 2015-11-05 | 대한민국 | 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
-
2021
- 2021-12-10 KR KR1020210176540A patent/KR102572199B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017507668A (ja) | 2014-02-18 | 2017-03-23 | ソマロジック・インコーポレーテッド | 微生物検出のための組成物及び方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Abbaspour Abdolkarim et al, Biosensors and Bioelectronics (2015.), vol 68: 149. |
| Cao Xiaoxiao et al, Nucleic acids research (2009.), vol 37.14, pp 4621-4628. |
| Seo Ho Bin et al, Journal of Biological Engineering (2017.), vol 11, pp 1-7. |
| Shahdordizadeh Mahin et al, Sensors and Actuators B: Chemical (2017.), vol 241, pp 619-635. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230087892A (ko) | 2023-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240003892A1 (en) | Heterogeneous single cell profiling using molecular barcoding | |
| Bu et al. | Ultrasensitive detection of pathogenic bacteria by CRISPR/Cas12a coupling with a primer exchange reaction | |
| Nguyen et al. | A new cognate aptamer pair-based sandwich-type electrochemical biosensor for sensitive detection of Staphylococcus aureus | |
| Kim et al. | Aptamer cocktails: enhancement of sensing signals compared to single use of aptamers for detection of bacteria | |
| Yue et al. | Selection of broad-spectrum aptamer and its application in fabrication of aptasensor for detection of aminoglycoside antibiotics residues in milk | |
| Suss et al. | Broad applications of thiazole orange in fluorescent sensing of biomolecules and ions | |
| CN105392895A (zh) | 改进的测定方法 | |
| Cui et al. | Low-background and visual detection of antibiotic based on target-activated colorimetric split peroxidase DNAzyme coupled with dual nicking enzyme signal amplification | |
| CN104880498A (zh) | 用于卡那霉素a检测的核酸适配体电化学传感器和制作及其应用方法 | |
| Xu et al. | Highly sensitive homogeneous electrochemiluminescence biosensor for microRNA-21 based on cascaded signal amplification of target-induced hybridization chain reaction and magnetic assisted enrichment | |
| Vishwakarma et al. | Aptamer-based approaches for the detection of waterborne pathogens | |
| Zheng et al. | An ultrasensitive and specific ratiometric electrochemical biosensor based on SRCA-CRISPR/Cas12a system for detection of Salmonella in food | |
| Wen et al. | Exonuclease III-assisted positive feedback signal amplification strategy for ultrasensitive electrochemical detection of nucleic acids | |
| Zhou et al. | Double-stranded DNA nanobridge enhanced fluorescence of crystal violet/G-quadruplex complex for detection of lead ions and crystal violet | |
| CN113340863B (zh) | 一种无酶循环放大核酸适配体传感器及其制备方法和应用 | |
| Amini et al. | Recent developments in biosensor technologies for pathogen detection in water | |
| KR102572199B1 (ko) | 압타머 쌍을 이용한 샌드위치 방식의 황색포도상구균 검출용 조성물, 바이오센서 및 검출 방법 | |
| Jiang et al. | A dual-labeled fluorescence quenching lateral flow assay based on one-pot enzyme-free isothermal cascade amplification for the rapid and sensitive detection of pathogens | |
| Gao et al. | Recent aptamer-based biosensors for Cd2+ detection | |
| Zhou et al. | Sensitive monitoring of RNA transcription levels using a graphene oxide fluorescence switch | |
| Wang et al. | Bridge-DNA synthesis triggered by an allosteric aptamer for the colorimetric detection of pathogenic bacteria | |
| CN114457083A (zh) | 一组特异识别孔雀石绿的单链dna核酸适配体及其应用 | |
| EP2929351B1 (en) | Cell-free biofragment compositions and related systems, devices, and methods | |
| CN107922978A (zh) | 用于性别和类别识别的电化学dna生物传感器 | |
| Wang et al. | Reagentless detection of staphylococcal enterotoxin B via electrochemical interrogation of conformational changes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |