KR102334083B1

KR102334083B1 - 형광 단백질을 발현하는 재조합 광견병 바이러스 및 이를 이용한 항체 검출 방법

Info

Publication number: KR102334083B1
Application number: KR1020200053396A
Authority: KR
Inventors: 김하현; 양동군; 유재영; 현방훈; 지미련
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-05-04
Filing date: 2020-05-04
Publication date: 2021-12-03
Also published as: KR20210135115A

Abstract

본 발명은 형광 단백질을 발현하는 재조합 광견병 바이러스 및 이를 이용한 항체 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형광 단백질을 발현하는 재조합 광견병 바이러스는 염색 및 고정 등의 추가 과정 없이도 형광 현미경을 통해 바이러스를 바로 확인할 수 있으며, 이를 적용한 형광 항체 바이러스 중화 시험법은 현장에서 사용되는 표준 항체 시험법 결과와 유의한 차이가 없고, 높은 상관 관계가 있음을 확인하였다. 본 발명의 재조합 광견병 바이러스는 광견병 바이러스 검출 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

형광 단백질을 발현하는 재조합 광견병 바이러스 및 이를 이용한 항체 검출 방법{Recombinant rabies virus expressing fluorescent protein and antibody detection method using the same}

본 발명은 형광 단백질을 발현하는 재조합 광견병 바이러스 및 이를 이용한 항체 검출 방법에 관한 것이다.

광견병은 광견병 바이러스에 감염된 동물과 직접 접촉에 의해 전파되는 질병으로, 증상 발현시 100% 가까운 높은 치사율을 나타내는 인수 공통 전염병이다. 광견병은 치사율이 높아 치명적이나, 백신 접종을 통해 충분히 예방이 가능하다. 따라서 광견병 백신을 접종하는 것이 전파를 차단하기 위한 가장 중요한 수단이다.

한편, 백신 접종 후 접종받은 개체가 광견병 바이러스를 방어할 만큼 충분히 면역이 됐는지 항체 검사를 통해 확인하는 것은 매우 중요하다. 이를 위해 세계동물보건기구(OIE)에서는 혈청학적 검사법으로 바이러스 중화 시험법인 형광 항체 중화 시험법(Fluorescent Antibody Viral Neutralization, FAVN)과 신속 형광 반점 억제 시험법(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT), 및 효소 면역 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 인정하고 있다. 그러나 국제 동물 이동을 위한 중화 항체가 표준 혈청 검사법은 바이러스 중화 시험법인 형광 항체 중화 시험법과 신속 형광 반점 억제 시험법만 인정받고 있다. 이 2종의 표준 혈청 검사법에서 사용하는 광견병 고정주 바이러스(CVS-11)는 육안으로 관찰할 수 있는 세포변성 효과를 나타내지 않는다. 따라서, 상기 고정주 바이러스(CVS-11)를 사용하는 혈청 검사법에서는 감염 세포를 아세톤으로 고정한 후 형광 인자가 결합되어 있는 광견병 바이러스 항체(FITC anti-rabies conjugate)를 이용하여 형광 염색한 후 감염 세포를 관찰해야 한다. 이러한 바이러스 중화시험은 세포 고정 및 형광 염색을 수행하는 과정이 있어 복잡하고 시간도 길어지게 된다. 따라서 대량 검사 시 고가의 컨쥬게이트 또는 항체를 다량 수급해야 하는 어려움이 있다.

한국 등록특허 제10-1073984호

이에 본 발명자들은 바이러스 중화 시험법을 개선하기 위해 노력하던 중 형광 단백질을 발현하는 재조합 광견병 바이러스를 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 재조합 광견병 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 재조합 광견병 바이러스를 생물학적 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 광견병 바이러스에 결합하는 항체 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 광견병 바이러스를 포함하는 광견병 바이러스 검출 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 광견병 바이러스를 생물학적 시료와 반응시키는 단계 및 반응물을 육안으로 관찰하는 단계를 포함하는 광견병 바이러스 감염에 대한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 재조합 광견병 바이러스를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 광견병 바이러스를 생물학적 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 광견병 바이러스에 결합하는 항체 검출 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 광견병 바이러스를 포함하는 광견병 바이러스 검출 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 광견병 바이러스를 생물학적 시료와 반응시키는 단계 및 반응물을 육안으로 관찰하는 단계를 포함하는 광견병 바이러스 감염에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 형광 단백질을 발현하는 재조합 광견병 바이러스는 염색 및 고정 등의 추가 과정 없이도 형광 현미경을 통해 바이러스를 바로 확인할 수 있으며, 이를 적용한 형광 항체 바이러스 중화 시험법은 현장에서 사용되는 표준 항체 시험법 결과와 유의한 차이가 없고, 높은 상관 관계가 있음을 확인하였다. 본 발명의 재조합 광견병 바이러스는 광견병 바이러스 검출 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 녹색 형광 단백질(GFP, Green Fluorescent Protein) 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP) 제작 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2A 및 2B는 PstI과 NotI 제한효소 사이트를 추가하기 위해 제작된 F1 및 F2 단편을 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2C 및 2D는 P 유전자 시그널 서열 및 폴리에이 서열을 포함한 GFP 유전자를 포함하는 F3 단편; 및 말단에 DraIII 제한효소 사이트가 추가된 F3(2nd) 단편;을 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2E는 F1, F2 및 F3(2nd) 단편을 포함하는 단편을 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 재조합 광견병 바이러스를 제작하기 위한 벡터 pUC19 rERAGSGFP의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 4A는 본 발명에 따른 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP) 확인을 위한 실험을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 4B는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 및 전기영동을 통해 본 발명에 따른 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4C는 본 발명에 따른 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 시퀀싱 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 전자 현미경 분석을 통해 감염 세포 내에서 본 발명에 따른 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 바이러스 입자 생성 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 PLA(Peroxidase Linked Assay)법 및 직접 관찰을 통해 감염 세포 내에서 본 발명에 따른 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 바이러스 입자 생성 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 아세톤 고정 및 형광 염색 여부에 따른 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 형광 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 다양한 세포에서 본 발명에 따른 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 바이러스 역가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 다양한 세포에서 본 발명에 따른 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP) 및 고정주 바이러스(CVS11)의 바이러스 역가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 바이러스 배양 기간에 따른 본 발명에 따른 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 바이러스 역가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 단순 선형 회귀 분석(Simple linear regression analysis)을 통해, 본 발명에 따른 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 이용한 형광 항체 바이러스 중화 시험법(FAVN); 및 고정주 바이러스(CVS11)의 형광 항체 바이러스 중화 시험법(FAVN);으로 확인한 항체가를 비교한 결과를 나타낸 도이다(R²:결정계수, R:상관계수).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 재조합 광견병 바이러스를 제공한다.

본 발명에 있어서, “광견병 바이러스”는 랍도바이러스군에 속하며, 포유동물에게 감염되어 광견병을 발생시킬 수 있는 바이러스를 제한없이 포함한다. 상기 광견병 바이러스의 예로는 CVS11, ERA 및 ERAGS 등이 있다. 상기 광견병 바이러스 CVS11은 형광 항체 바이러스 중화 시험법(FAVN)에서 사용하는 고정주이다. 또한 상기 광견병 바이러스 ERAGS는 광견병 바이러스 ERA의 돌연변이체로, 보다 상세하게는 광견병 바이러스 ERA의 G 단백질이 194번째 아미노산 아스파라긴에서 세린으로, 333번째 아미노산이 아르기닌에서 글루탐산으로 치환된 것이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 광견병 바이러스는 광견병 바이러스 CVS11, ERA 및 ERAGS로 이루어진 군에서 선택된 1 이상에서 유래된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체예에서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein), 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein), 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein), 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein) 및 적색 형광 단백질(red fluorescent protein)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 녹색 형광 단백질일 수 있다.

본 발명에 있어서, “녹색 형광 단백질(GFP, Green Fluorescent Protein)”은 발광해파리가 갖고 있는 형광 단백질의 일종으로, 세포 내에서 발현될 경우 강한 녹색 형광을 나타낸다. 상기 녹색 형광 단백질은 산소의 존재 하에 N-말단으로부터 65~67번째 아미노산 잔기 사이에서 일어나는 고리화에 의해 형성되는 구조가 발색단이 되므로, 기질 없이도 발광된다.

본 발명에의 구체예에서, 본 발명의 재조합 광견병 바이러스는 상기 서열번호 3의 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 광견병 바이러스는 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자가 G 유전자 및 L 유전자 사이에 작동 가능하게 삽입된 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합할 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 광견병 바이러스는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 P 유전자 시그널 서열을 더 포함하는 것이 바람직하며, 목적을 달성할 수 있다면 이에 제한되지 않는다. 상기 시그널 서열은 재조합 광견병 바이러스에서 녹색 형광 단백질의 C-말단과 작동 가능하게 연결되며, 녹색 형광 단백질의 mRNA 발현을 크게 증가시킬 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 광견병 바이러스는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 P 유전자 폴리에이 서열(Poly A sequence)을 더 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리에이 서열은 재조합 광견병 바이러스에서 녹색 형광 단백질의 N-말단과 작동 가능하게 연결되며, 녹색 형광 단백질 mRNA의 안전성 및 번역 효율을 높일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 재조합 광견병 바이러스를 생물학적 시료와 반응시키는 단계;를 포함하는 광견병 바이러스에 결합하는 항체 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, “생물학적 시료”는 임의의 동물, 예컨대 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원용, 스포츠용 또는 애완용 동물, 예컨대, 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 포유동물로서 분류되는 임의의 동물로부터 분리된 신체 시료를 의미하며, 바람직하게는 광견병 바이러스에 면역되었거나, 면역된 것으로 의심되는 동물 유래의 시료이다.

상기 시료는 생물학적 체액, 예컨대, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함한다. 바람직하게는, 동물로부터 분리된 혈청이다. 상기 혈청은, 동물로부터 얻어진 혈액으로부터 혈괴를 제거하고 얻어진 상층액을 사용하되 용혈된 혈청은 제외하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체예에서, 상기 항체 검출 방법은 백신주를 접종받은 개체가 광견병 바이러스를 방어할 만큼 면역이 되었는지 확인하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체예에서, 상기 항체 검출 방법은 형광 항체 중화 시험법(Fluorescent Antibody Viral Neutralization, FAVN), 신속 형광 반점 억제 시험법(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT) 및 효소 면역 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.

상기 광견병 바이러스 검출 키트는 바이러스 검출 시험에 사용되는 도구 및 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 도구 및 시약으로는 담체, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 상기 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액 또는 불용성 담체를 일 수 있다. 상기 완충액의 예로는 PBS(phosphate-buffered saline) 등이 있으며, 불용성 담체의 예로는 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합이 있다.

또한 본 발명은 상기 재조합 광견병 바이러스를 생물학적 시료와 반응시키는 단계; 및 반응물을 육안으로 관찰하는 단계;를 포함하는 광견병 바이러스 감염에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 광견병 바이러스 감염에 대한 정보 제공 방법은 생물학적 시료와 재조합 광견병 바이러스를 반응시킨 후 육안으로 형광을 확인함으로써, 광견병 바이러스 감염에 대한 정보를 얻을 수 있다. 상기 감염에 대한 정보의 예로는 형광의 세기 등의 확인을 통한 감염 강도(infection intensity) 확인 등이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 녹색 형광 단백질을 발현하는 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 제작

도 1과 같이 광견병 바이러스(ERAGS)의 유전체 플라스미드의 G 유전자와 L 유전자 사이에 녹색 형광 단백질(GFP, Green Fluorescent Protein) 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스 ERAGS-GFP를 제작하였다.

1-1. PstI 및 NotI 제한효소 사이트가 포함된 광견병 바이러스 유전자 증폭

광견병 바이러스 벡터 pUC19 rERAGS에 NotI 제한효소 사이트를 추가하여 GFP 유전자를 삽입하기 위해, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 F1 및 F2 단편을 얻었다. 상기 PCR에 사용된 프라이머는 표 1에 나타내었다.

증폭산물	프라이머 이름	프라이머 서열	사이즈
F1	F1_For_PstI (서열번호 6)	tcacttgtttacct ctgcag ¹	806 bp
F1	F1_rev (서열번호 7)	cttccctctactggaggtaaaaatgtcacaagac	806 bp
F2	F2_For (서열번호 8)	gacatttttacctccagtagagggaagagagcatc	1008 bp
F2	F2_rev (서열번호 9)	gatggttcgaaaggaggggtgtt gcggccgc ² ttttttttcaaaaagaacc	1008 bp

¹PstI 제한효소 사이트

²NotI 제한효소 사이트

증폭된 F1 및 F2 단편을 전기영동을 통해 확인한 결과는 도 2A 및 2B에 각각 나타내었다.

1-2. 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자 증폭

벡터 pEGFP-N를 PCR을 통해 증폭하여, GFP 유전자를 포함하는 F3 단편을 얻었다. 또한 DraIII 제한효소 사이트를 추가하기 위하여, 상기 F3 단편을 2차 증폭하여 F3(2nd) 단편을 얻었다. 상기 PCR은 P 유전자 시그널 서열(서열번호 2)를 포함하는 프라이머 F3_For 및 P 유전자 폴리에이 서열(서열번호 4)을 포함하는 프라이머 F3_rev_1st를 이용하였으며, 2차 증폭은 프라이머 F3_For 및 F3_rev_2nd_DraIII를 이용하였다. 상기 프라이머의 구체적인 서열은 표 2에 나타내었다.

증폭산물	프라이머 이름	프라이머 서열	사이즈
F3	F3_For (서열번호 10)	gcggccgc ¹aacacccctcctttcgaac catcccaaacatggtgagcaagggcgag	817 bp
F3	F3_rev_1st (서열번호 11)	catctcggactttattgtctagagggactgaggggagaggttcggttacttgtacagctcgtc	817 bp
F3(2nd)	F3_For (서열번호 12)	gcggccgc ¹aacacccctcctttcgaac catcccaaacatggtgagcaagggcgag	861 bp
F3(2nd)	F3_rev_2nd_DraIII (서열번호 13)	agtcacccgaga caccccgtg ²tttttttcatgttgactttaggacatctcggactttattgt	861 bp

¹NotI 제한효소 사이트

²DraIII 제한효소 사이트

증폭된 F3 및 F3(2nd) 단편을 전기영동을 통해 확인한 결과는 도 2C 및 2D에 각각 나타내었다.

상기 F3(2nd) 단편, 즉 증폭된 GFP 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시되며, C-말단에 시그널 서열(서열번호 2)을 포함하며, N-말단에 폴리에이 서열(서열번호 4)를 포함한다.

1-3. GFP 유전자가 삽입된 클론 제작

상기 실시예 1-1 및 1-2의 F1, F2, F3(2nd) 증폭산물을 overlap PCR법을 이용하여 하나의 단편으로 증폭시켰다. 증폭된 단편(즉, GFP 유전자)을 전기영동을 통해 확인한 결과는 도 2E에 나타내었다.

클로닝을 위해 광견병 바이러스 벡터 pUC19 rERAGS을 PstI 제한효소 및 DraIII 제한효소로 절단하여 준비하였다. 상기 증폭된 GFP 유전자 및 제한효소가 처리된 벡터 pUC19 rERAGS을 라이게이션(ligation)시켜 재조합 벡터 pUC19 rERAGSGFP를 얻었다. 상기 재조합 벡터 pUC19 rERAGSGFP의 개열지도는 도 3에 나타내었다.

1-4. 형질주입

GFP 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pUC19 rERAGSGFP를 BHK/T7 세포에 형질주입하였다. 구체적으로, 형질주입을 위하여, GFP 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pUC19 rERAGSGFP (2000 ng/μL) 20 μL; N 유전자 헬퍼 벡터(400 ng/μL) 1 μL; P 유전자 헬퍼 벡터(100 ng/μL) 0.2 μL; 및 L 유전자 헬퍼 벡터(200 ng/μL) 0.4 μL을 준비하였다. 형질주입(transfection) 시약 2 μL; 및 Opti-MEM 배지 200 μL를 튜브에 넣고 조심스럽게 혼합하였다. 희석된 형질주입 시약에 상기에 준비한 벡터를 각각 첨가하고 조심스럽게 혼합한 후 30분 동안 실온에서 반응시켜 형질주입 시약-DNA 혼합액을 제조하였다. 상기 형질주입 시약-DNA 혼합액을 BHK/T7 세포에 시계방향으로 떨어트리고 조심스럽게 배양 용기를 흔들어 형질주입 시약-DNA 혼합액이 잘 퍼지도록 흔든 후, 72시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

형질주입 후, 형질전환된 세포의 특이현상을 매일 관찰하였고, 형질전환 3일 후 형광 염색 과정 없이도 형광이 발현되는 것을 형광 현미경를 통해 관찰하였다.

실시예 2. 녹색 형광 단백질 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 유전학적 분석

2-1. RT-PCR을 통한 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP) 확인

상기 실시예 1-4에서 형질주입된 세포를 4회 계대배양하여 수득한 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)로부터 RNA를 추출하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이 추출된 RNA를 이용하여 G 유전자 및 L 유전자 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 실시하였다. 상기 G 유전자 및 L 유전자 프라이머 세트의 구체적인 서열은 표 3에 나타내었다.

프라이머 이름	프라이머 서열
rERAGS_G_F (서열번호 14)	agtcaatcgatcagaacc
rERAGS_L_R (서열번호 15)	agagttgagattgtagtc

본 실험의 대조군은 백신주 광견병 바이러스 ERA 및 ERAGS를 사용하였다. RT-PCR 결과는 도 4B에 나타내었다.

도 4B에 나타낸 바와 같이, GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)는 PCR 산물의 크기가 대조군(광견병 바이러스 ERA 및 ERAGS)보다 증가한 것을 확인하였다.

2-2. 시퀀싱을 통한 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 서열 분석

상기 실시예 2-1의 PCR 산물을 시퀀싱하여, GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 서열을 분석하였다. 시퀀싱 결과는 도 4C에 나타내었다.

도 4C에 나타낸 바와 같이, GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)는 G 유전자 및 L 유전자 사이(슈도 유전자 일부 포함)에 GFP 유전자가 포함된 것을 확인하였다. 보다 상세하게는, 상기 재조합 광견병 바이러스의 PCR 산물은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 G 유전자 일부, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 시그널 서열, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 GFP 유전자, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 폴리에이 서열 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 슈도 유전자의 일부 서열을 포함한다.

실시예 3. 감염된 세포 내에서 녹색 형광 단백질 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 바이러스 입자 생성 여부 확인

3-1. 전자 현미경 분석을 통한 바이러스 입자 생성 여부 확인

GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)가 감염된 세포 내에서 바이러스 입자 생성 여부를 확인하였다. 구체적으로, GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 Vero CCL81 세포에 접종한 후 전자 현미경으로 관찰하였다. 본 실험의 대조군은 백신주 광견병 바이러스 ERA 및 ERAGS를 사용하였다. 바이러스 입자 생성 여부를 확인한 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP) 및 대조군(ERA 및 ERAGS)은 모두 감염 세포 내에서 탄환 모양의 바이러스 입자를 생성하는 것을 확인하였다.

3-2. PLA(Peroxidase Linked Assay)법을 통한 바이러스 입자 생성 여부 확인

PLA법을 통하여, 감염된 세포 내에서 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 확인하였다. 구체적으로, GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 십진 희석하여 Vero CCL81 세포 및 Vero CRL1586 세포에 각각 감염시켰다. 광견병 바이러스 N 단백질 특이 단클론항체를 이용하여, 상기 감염된 세포를 PLA-DAB 염색하였다. 염색 후 현미경으로 감염된 세포 내의 바이러스를 확인하였다. 대조군은 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)가 감염된 세포를 염색하지 않고 형광 현미경으로 관찰하였다. 관찰 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)는 PLA-DAB 염색에서 관찰한 것과 같이 감염된 세포 내에서 관찰되었다. 또한 GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 10^-6배 희석하여 감염시킨 세포에서도 바이러스가 발현하는 형광이 관찰되었다.

3-3. 아세톤 고정 및 형광 염색 여부에 따른 형광 발현 차이 확인

추가적으로, GFP 유전자가 삽입된 10⁷ TCID₅₀/mL 역가의 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 10^-6으로 희석하고 3종의 세포(Vero CCL81, BHK21 및 Vero CRL1586)에 각각 100 μL씩 접종한 후 약 3일 배양하였다. 배양된 세포를 염색 없이 형광 현미경으로 직접 관찰한 후, 차가운 80% 아세톤으로 약 20분동안 고정한 후 형광현미경으로 관찰하였다. 관찰 후 1시간 동안 건조하였으며, PBS로 3회 세척하였다. 세척된 세포와 광견병 바이러스 N 단백질 특이 단클론항체를 1시간 동안 반응시킨 후 FITC가 컨쥬게이트된 2차 항체와 반응시켜 형광염색하였다. 염색된 세포는 형광현미경으로 관찰하였다. 관찰 결과는 (i) 염색 없이 형광 현미경으로 직접 관찰한 군; (ii) 아세톤 고정 후 형광 현미경으로 관찰한 군; 및 (iii) 형광 염색 후 형광 현미경으로 관찰한 군;으로 비교하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)는 염색 과정 없이도 형광 현미경으로 관찰할 수 있었으며, 관찰 결과는 형광 염색 후 관찰한 결과와 유사했다. 반면에, 아세톤 고정 후 관찰한 군은 형광이 약한 것을 확인하였다.

실시예 4. 녹색 형광 단백질 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)의 바이러스 역가 측정

4-1. 광견병 바이러스에 따른 바이러스 역가 측정

GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 3종의 세포(Vero CCL81, BHK21 및 Vero CRL1586)에 각각 약 0.5 MOI로 접종하고 4일 동안 배양하였다. 배양 후 바이러스 배양액을 수확하였다. 수확된 바이러스 배양액을 배지를 이용하여 10진 계단 희석한 후 3개의 다른 96 웰 플레이트에 100 μL씩 분주하였다. 각각의 세포(2×10⁵ cells/mL)를 상기 96 웰 플레이트에 100 μL씩 넣고 3일 동안 배양하였다. 배양된 세포를 형광현미경으로 관찰하여, 감염된 세포가 관찰되는 마지막 희석배수를 찾았다. 그 후 Spearman-Karber formula를 이용하여 역가를 계산하였다. 본 실험의 대조군은 백신주 광견병 바이러스 ERA 및 ERAGS를 사용하였다. 바이러스 역가를 측정한 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)가 3종의 세포(Vero CCL81, BHK21 및 Vero CRL1586)에서 모두 역가가 10⁷ TCID₅₀/mL 이상으로, 잘 증식된 것을 확인하였다.

추가적으로, GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP) 및 표준 혈청 검사법인 형광 항체 바이러스 중화 시험법(FAVN)에서 사용하는 고정주 바이러스(CVS11)의 바이러스 역가를 위와 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, GFP 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)는 3종의 세포에서 역가가 10⁷ TCID₅₀/mL 이상인 반면, 고정주 바이러스는 Vero CCL81 세포 및 Vero 1586 세포에서 역가가 낮은 것을 확인하였다.

4-2. 바이러스 배양 기간에 따른 바이러스 역가 측정

3종의 세포(BHK21, Vero CCL81, Vero CRL1586)를 각각 8개의 T-25 플라스크에 동일한 수(6×10⁵cells/flask)로 넣고 24시간 동안 배양하였다. GFP가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 동일한 역가(0.5 MOI)로 각 세포에 접종하였다. 바이러스 접종 후 1일 마다 각 T-25 플라스크 1개에서 바이러스 배양액을 수확한 후 바이러스 역가를 측정하였다. 배양 기간에 따른 바이러스 역가 측정 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, GFP가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)는 모든 세포에서 접종 5일 후 바이러스 역가가 가장 높은 것을 확인하였다.

실시예 5. 녹색 형광 단백질 유전자가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 이용한 형광 항체 바이러스 중화 시험법(Fluorescent Antibody Viral Neutralization, FAVN)

GFP가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 이용한 형광 항체 바이러스 중화 시험법(GFP-FAVN)을 통해 개 혈청 62개를 분석하였다. 비교를 위하여, 고정주 바이러스(CVS11)를 이용한 형광 항체 바이러스 중화 시험법(CVS11-FAVN)을 통해 위와 동일한 방법으로 분석하였다.

각 시험법의 항체가(IU/mL)를 Paired two-tailed t-test를 통해 비교하였다.

그 결과, P 값은 0.2129였으며, 이는 두 시험법의 결과 값은 유의적 차이가 없다는 것을 의미한다.

또한 항체가(IU/mL)를 단순 선형 회귀 분석(Simple linear regression analysis)으로 통계학적으로 비교하였으며, 그 결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 결정계수(R², coefficient of determination)는 0.9212이고, 상관계수(R, coefficient of correlation)는 0.9597임을 확인하였다. 상기 결과는 두 시험법간의 높은 상관 관계가 있다는 것을 의미한다.

종합적으로 본 발명자들은 현재 표준 혈청 검사법인 형광 항체 바이러스 중화 시험법(CVS11-FAVN)에서 사용하고 있는 고정주(CVS-11)보다 증식이 잘 되고 안전한 광견병 바이러스 백신주 ERAGS를 이용하여, GFP가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 제작하였다. 상기 GFP가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)는 염색 및 고정 등의 추가 과정 없이도 형광 현미경을 통해 바이러스를 바로 확인할 수 있다. 또한 상기 GFP가 삽입된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS-GFP)를 적용한 형광 항체 바이러스 중화 시험법은 현장에서 사용되는 표준 항체 시험법 결과와 유의한 차이가 없고, 높은 상관 관계가 있음을 확인하였다. 본 발명의 GFP가 삽입된 재조합 광견병 바이러스는 광견병 바이러스 검출 및 감염 정보 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Recombinant rabies virus expressing fluorescent protein and antibody detection method using the same <130> 1-103 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 206 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Rabies virus G gene terminal <400> 1 gattagtcaa tcgatcagaa cctacgcaac acaatctcag agggacaggg agggaggtgt 60 cagtcactcc ccaaagcggg aagatcatat cttcatggga atcacacaag agtgggggtg 120 agaccagact gtgaggactg gccgtccttt caacgatcca agtcctgaag atcacctccc 180 cttggggggt tctttttgaa aaaaaa 206 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 2 gcggccgcaa cacccctcct ttcgaaccat ccca 34 <210> 3 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Green Fluorescent Protein <400> 3 aacatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 60 gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 120 tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 180 accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 240 aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 300 ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 360 ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 420 cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 480 aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 540 gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 600 cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 660 gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 720 taa 723 <210> 4 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poly A sequence <400> 4 ccgaacctct cccctcagtc cctctagaca ataaagtccg agatgtccta aagtcacatg 60 aaaaaaaca 69 <210> 5 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudo gene partial fregment <400> 5 cggggtgtct cgggtgactc tgtgcttggg cacagacaaa ggtcatggtg tgttcctgat 60 aacggactca ggatgagtta attgagaaag g 91 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1_For_PstI <400> 6 tcacttgttt acctctgcag 20 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1_rev <400> 7 cttccctcta ctggaggtaa aaatgtcaca agac 34 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2_For <400> 8 gacattttta cctccagtag agggaagaga gcatc 35 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2_rev <400> 9 gatggttcga aaggaggggt gttgcggccg cttttttttc aaaaagaacc 50 <210> 10 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3_For <400> 10 gcggccgcaa cacccctcct ttcgaaccat cccaaacatg gtgagcaagg gcgag 55 <210> 11 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3_rev_1st <400> 11 catctcggac tttattgtct agagggactg aggggagagg ttcggttact tgtacagctc 60 gtc 63 <210> 12 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3_For <400> 12 gcggccgcaa cacccctcct ttcgaaccat cccaaacatg gtgagcaagg gcgag 55 <210> 13 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3_rev_2nd_DraIII <400> 13 agtcacccga gacaccccgt gtttttttca tgttgacttt aggacatctc ggactttatt 60 gt 62 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rERAGS_G_F <400> 14 agtcaatcga tcagaacc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rERAGS_L_R <400> 15 agagttgaga ttgtagtc 18

Claims

서열번호 3의 염기서열로 표시되는 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자;
서열번호 2의 염기서열로 표시되는 P 유전자 시그널 서열; 및
서열번호 4의 염기서열로 표시되는 P 유전자 폴리에이 서열(Poly A sequence);을 포함하고,
광견병 바이러스 ERAGS 유래인, 재조합 광견병 바이러스.
삭제
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제1항에 따른 재조합 광견병 바이러스를 생물학적 시료와 반응시키는 단계;를 포함하는 광견병 바이러스에 결합하는 항체 검출 방법.
제7항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인, 방법.
제1항에 따른 재조합 광견병 바이러스를 포함하는, 광견병 바이러스 검출 키트.
제1항에 따른 재조합 광견병 바이러스를 생물학적 시료와 반응시키는 단계; 및
반응물을 육안으로 관찰하는 단계;를 포함하는 광견병 바이러스 감염에 대한 정보 제공 방법.