CN109055587A

CN109055587A - 检测大肠杆菌含量的试剂盒、特异性引物和探针及应用

Info

Publication number: CN109055587A
Application number: CN201811108227.2A
Authority: CN
Inventors: 安志远; 周怀谷; 李发院; 柳勇; 赵鹏; 郭育林; 夏子芳; 郑卫国
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF CRIMINAL SCIENCE AND TECHNOLOGY; Wuxi Agcu Scientech Inc; SHANGHAI PUBLIC SECURITY COLLEGE
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF CRIMINAL SCIENCE AND TECHNOLOGY; Wuxi Agcu Scientech Inc; SHANGHAI PUBLIC SECURITY COLLEGE
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2018-12-21

Abstract

本发明提供了一种一组大肠杆菌特异性引物和探针序列，从而建立一种能应用于大鼠死后心血中大肠杆菌含量检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR检测的方法。根据本发明的一方面，提供了一种用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，特异性引物和探针以保守片段序列为靶目标。本发明采用基因克隆技术，将大肠杆菌LacZ基因特异性片段插入到载体pMD18‑T中，获得含有LacZ基因特异性片段的重组质粒，以此作为标准品。根据大肠杆菌LacZ基因特异性片段序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。

Description

检测大肠杆菌含量的试剂盒、特异性引物和探针及应用

技术领域

本发明属于本发明属于分子生物学和体外诊断试剂技术领域，特别涉及死后大肠杆菌的检测。

背景技术

β-半乳糖苷酶由β-半乳糖苷酶基因(LacZ基因)编码，是由4个亚基组成的四聚体，一般可催化乳糖分解为一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖。从不同物种提取的β-半乳糖苷酶的蛋白质序列有着较高的同源性和相似性。β-半乳糖苷酶的分子质量在100～850ku之间，其中大肠杆菌的β-半乳糖苷酶分子质量最大，为520～850ku。

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)是腐败菌的主要菌群之一，是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，几乎占粪便干重的1/3。在个体死后，大肠杆菌属于具有较强分解蛋白质能力的腐败菌种，且由于其周身鞭毛能运动，最易出现细菌移位(bacterial translocation,BT)，个体健康存活时，血液中是不存在或仅存在极少量细菌的，否则将引起菌血症方面的疾病。当个体死后，细胞开始出现变性、死亡，然而细菌则继续生长，紧接着肠粘膜屏障功能受损以致功能消失，大量大肠杆菌出现移位，部分大肠杆菌出现在血液中，目前，国内外将实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)技术运用于检测尸体样本中腐败菌DNA含量的研究极少有报道，并且现有检验死亡时间的手段对检验人员的经验要求较高。

发明内容

针对现有技术的缺陷与不足，本发明运用qPCR技术，以大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ基因)为目的基因，构建qPCR扩增体系，通过检测不同死亡时间下的腐败菌LacZ基因含量，建立两者之间的相关性，根据这种相关性，检测未知死亡时间的血样中大肠杆菌含量，进而推断死亡时间，具有非常重要的研究前景和应用价值。

PCR技术作为一种分子生物学工具，可以选择性体外扩增DNA或RNA片段，操作简单、特异性强、快速、敏感性高等特点。Taq Man探针法检测特异性强，灵敏度高，本发明优化反应条件，其中一种应用能够用于大鼠死后心血中大肠杆菌含量的快速检测。

本发明的其中一个目的在于设计一组大肠杆菌特异性引物和探针序列，从而建立一种能应用于动物死后心血中大肠杆菌含量检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR检测的方法。本发明采用基因克隆技术，将大肠杆菌LacZ基因特异性片段插入到载体pMD18-T中，获得含有LacZ基因特异性片段的重组质粒，以此作为标准品。根据大肠杆菌LacZ基因特异性片段序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。

根据本发明的一方面，提供了一种用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，特异性引物和探针以保守片段序列内序列为靶目标，保守片段序列为SEQ No.1：

5’-TGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATAT-3’。

本发明其中一种方案中靶目标为保守片段序列SEQ No.1内的：5’-CTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGC-3’。

根据本发明的其中一方面，提供了一种用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，上述探针序列如SEQ No.2：5’-ACCGCTGGGATCTGCCATTGT-3’；上述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：

上游引物序列如SEQ No.3：5’-ACTATCCCGACCGCCTTACTG-3’，

下游引物序列如SEQ No.4：5’-GCGCAGACCGTTTTCGCTCGG-3’。

根据本发明的其中一方面，提供了一种用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，上游引物和所述下游引物序列为以所述SEQ No.3和SEQ No.4为基础向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

根据本发明的其中一方面，提供了一种用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，其探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，探针3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

根据本发明的另一些一方面，提供了用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含上述任意一种用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针。

根据本发明的另一些一方面，提供了用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，在20μl PCR反应体系中，上游引物PCR终浓度为0.5μM，下游引物PCR终浓度为0.5μM，探针PCR终浓度为0.2μM。

根据本发明的另一些一方面，提供了用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，上述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品和阳性对照；系列浓度标准品是将大肠杆菌LacZ基因与载体连接，转化至感受态细胞中诱导表达，提取重组质粒，将重组质粒定量后稀释，得到系列浓度标准品。

根据本发明的另一些一方面，提供了用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其中标准品的核苷酸序列如SEQ No.1：

本发明还提供了上述检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒的应用，其可以应用于如下任意一种用途：

(1)定性或定量检测或辅助检测大肠杆菌；

(2)测定大鼠死后心血中大肠杆菌含量，进而推断死亡时间；

(3)尸检中推断死亡时间；

上述的应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

本发明还提供了推断死亡时间的方法，测定动物死后心血中大肠杆菌含量进而推断死亡时间；测定动物死后心血中大肠杆菌含量使用上述任意一种用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒。

根据本发明的还有一些方面，该推断死亡时间的方法，分别以系列浓度标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。

根据本发明的还有一些方面，该推断死亡时间的方法，实时荧光定量PCR的反应条件为：50℃2min，95℃10min，95℃15s、60℃1min并收集荧光信号，40个循环。

本发明提供用于大肠杆菌进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取大肠杆菌的基因组DNA，结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中大肠杆菌含量的目的，具有高灵敏度：灵敏度为1.00×10²copies/ml。

本发明所提供的引物和探针可对大肠杆菌含量进行定性、定量分析，以大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ基因)为目的基因，构建qPCR扩增体系，通过检测不同死亡时间下的腐败菌LacZ基因含量，建立两者之间的相关性，根据这种相关性，检测未知死亡时间的样血样本中大肠杆菌含量，进而推断死亡时间，具有非常重要的研究前景和价值。

附图说明

图1、本发明一实施例中大肠杆菌LacZ基因保守区NCBI数据库Blast比对结果；

图2、本发明一实施例中LacZ外围大片段引物序列Blast比对结果；

图3、本发明一实施例中重组质粒pMD18-T-LacZ测序报告图；

图4、本发明一实施例中标准曲线扩增曲线图；

图5、本发明一实施例中标准曲线线性拟合图；

图6、本发明一实施例中大鼠心血样本DNA检测图谱(死亡时间为60-96h)；

图7、本发明一实施例中标准曲线线性拟合图(标×位置为实际样本)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 LacZ基因标准品制备

要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。β-D-半乳糖苷酶合成基因(LacZ基因)广泛存在于大肠杆菌中，具有很高的保守性。本发明采用大肠杆菌LacZ基因作为靶序列。本实施例主要采用PCR技术扩增大肠杆菌LacZ基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-LacZ，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。

一、模板DNA的制备

提取大肠杆菌(标准菌株)基因组DNA，用作LacZ基因PCR扩增的模板。采用天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌基因组提取试剂盒来提取，具体提取方法如下：

①取细菌培养液1ml，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，尽量吸净上清。

②向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

③向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀。

④加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑤加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑥将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑦向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑧向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑩将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

二、LacZ基因片段PCR扩增

1、引物的设计与合成

利用LacZ基因进行序列比对，选择大肠杆菌LacZ基因最为保守的一段区域设计大片段引物，本发明通过对NCBI数据库中大肠杆菌LacZ基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo7.0软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围大片段引物。选取的扩增的序列SEQ No.1：

此序列通过对NCBI数据库Blast结果显示见图1。图1为NCBI数据库Blast比对结果。由图1可知：此序列对大肠杆菌具有特异性。

该外围大片段引物序列如下：上游引物：LacZ-DF1 5’-TGAAGCGACCCGCATTG-3’，下游引物：LacZ-DR1 5’-ATATTCAGCCATGTGCCTTCTT-3’，扩增片段大小为：570bp。上下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果见图2。图2为上下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果。由图2可知：此对引物对大肠杆菌具有特异性。

2、PCR反应体系与反应条件

利用公司内现有试剂Reaction Mix、C-Taq酶(无锡中德美联生物技术有限公司)与合成的大片段克隆引物LacZ-DF1和LacZ-DR1对模板大肠杆菌DNA进行直接扩增获得的PCR产物。

扩增体系(10μl)：

Reaction Mix：	4μl
		5μM(LacZ-DF1、LacZ-DR1)：	1μl
5U/μl C-Taq酶：	0.4μl
		ddH<sub>2</sub>O：	3.6μl
模板：	1μl

扩增程序：

(1)	95℃	2min
			(2)	94℃	30s
(3)	60℃	1min
			(4)	72℃	1min
(5)	72℃	30min

(2)～(4)步骤进行35个循环

三、重组质粒pMD18-T-LacZ的构建与转化测序

1、感受态细胞的制备

直接使用TIANGEN的TOP10感受态细胞。

2、连接反应

采用TaKaRa公司生产的pMD18-T vector cloning Kit，在无菌操作台内进行连接，构建10μl反应体系，轻轻混匀后放入16℃反应2h或4℃过夜连接，试剂依次按以下加入：

总体积(10μl)：

Solution I： 5μl

pMD18-T： 0.5μl

PCR产物： 4.5μl

3、转化

(1)取出感受态细胞，在冰水中融解；

(2)加入3.5.3中连接液10μl，用枪头轻轻吸打混匀；

(3)冰浴30min后，于42℃热激90s，再冰浴1～3min；

(4)在超净工作台内，每管加入600μl已灭菌的LB液体培养基，37℃、150r/min培养1h；

(5)室温下4000r/min离心5min，去除部分上清后(约400μl)，将剩余菌体重悬，均匀涂布于平板上；

(6)将培养皿放入37℃恒温培养箱内过夜培养。

4、菌种筛选、测序

在无菌操作台内进行，依次用枪头挑取菌体，分别加入到1.5ml含有600μl的LB无菌液体培养基(其中含有0.1％Amp)的EP管中，用记号笔标记后，在37℃、150r/min培养4h。从培养结束的试管中，在超净工作台内分别吸取100μl菌液放入灭过菌的EP管中，经过PCR鉴定为阳性克隆后，包装好送测序，测序结果如图3,与LacZ保守区序列一致。

四、标准品的获取和定量

1、取步骤三得到的含有重组质粒pMD18-T-LacZ的大肠杆菌DH5α100μL转种于1mL的LB液体培养基，37℃200rpm过夜摇培；

2、采用质粒小量制备试剂盒(离心柱型)(上海捷瑞生物技术有限公司)对上述菌液进行质粒小提；

3、将重组质粒提取物1μl加入到核酸检测仪上((Thermo Scientific NanoDrop2000c))进行定量，测定其在260nm与280nm的A值，判断其纯度(A260/A280>1.8为纯品)，每个样本同时测定三次，从中算出平均值，然后得出质粒浓度，如下表1。

表1 重组质粒DNA浓度测定结果

样本	测量一(ng/μl)	测量二(ng/μl)	测量三(ng/μl)	均值(ng/μl)
					D2-1	27.5	27.4	27.1	27.3

4、由于本研究克隆片段为570bp，载体质粒pMD18-T全长2692bp，故重组质粒长度约为3262bp，依据换算公式：

浓度拷贝数(copies/μl)＝[(6.02×10²³copies/mol)×MWng/μl×10^－9]/(dsDNAlength×660)

可得出该质粒样本拷贝数浓度为：D2-1：7.63×10⁹copies/μl。

由于一般标准曲线建立都在10²～10⁷的范围，所以原始质粒标本进行用无菌去离子水稀释成1.0×10⁹copies/ul，分装并作好标记放入-20℃保存。

实施例2实时荧光定量PCR试剂盒

一、特异性引物和探针的设计与合成

本发明通过对NCBI数据库中大肠杆菌LacZ基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列内序列为靶目标(保守片段序列见实施例1)，并进一步应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo7.0软件，设计了多组实时荧光定量PCR引物与探针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于大肠杆菌的荧光定量PCR引物和探针。

该序列为：

5’-CTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGC-3’。

作为本发明的核心，一组用于大肠杆菌实时荧光PCR检测的引物和探针核苷酸序列如下：

表2 大肠杆菌荧光定量PCR引物和探针序列

二、实时荧光定量PCR试剂盒的建立

1、实时荧光定量PCR试剂盒包括以下组分：

2×Mastermix(2×TaqFast Advanced Master Mix为ABI生产)、终浓度为10μM的上游引物、终浓度为10μM的下游引物、终浓度为10μM的探针、实施例1制备的LacZ基因系列浓度标准品(系列浓度标准品的系列浓度为:1.0×10⁷copies/μl、1.0×10⁶copies/μl、1.0×10⁵copies/μl、1.0×10⁴copies/μl、1.0×10³copies/μl)、阳性对照(浓度为7.63×10⁹copies/μl的实施例1制备的重组质粒pMD18-T-LacZ)和ddH₂O，ddH₂O作为试剂和阴性对照使用。2、应用实时荧光定量PCR试剂盒测定标准品的标准曲线

以提取的LacZ基因克隆转化菌质粒DNA为模板标准，将其10倍梯度稀释至10⁷～10³copies/μl浓度，取各稀释梯度模板1μl进行荧光定量PCR扩增，反应体系20μl，均为三个复孔，在PCR过程中由实时荧光定量PCR仪自动绘制线性标准曲线。结果如下(扩增曲线见图4)：

体系组成(20μl)：

2×Mastermix	10μl
		10μM YF1	1μl
10μM YR1	1μl
		10μM Taqman	0.4μl
模板	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	6.6μl

扩增程序：

(1)	50℃	2min
			(2)	95℃	10min
(3)	95℃	15s
			(4)	60℃	1min

(3)～(4)步骤40个循环

以克隆质粒模板浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标建立LacZ荧光定量PCR检测的标准曲线，如图5。曲线回归得标准曲线方程为：Ct＝-3.51lgX+44.61(直线斜率A为-3.51，截距B为44.61，X为模板浓度，单位copies/μl)，曲线相关系数r为0.998，说明标准曲线线性较好。根据A＝-1/log(1+E)(E为荧光定量PCR反应的扩增效率)，得荧光定量PCR扩增效率为92.7％，符合荧光定量PCR对扩增效率的要求。

实施例3实时荧光定量PCR试剂盒对大鼠死后心血DNA样品的定量检测

1、大鼠死后心血DNA样品制备

18只健康大鼠，雌雄不限，体重180-200g。控制室内环境温度25℃，适应性饲养3d颈椎脱位法处死，按死亡时间随机分成9组，每组2只，其中1组对照组(死后0h)，8组实验组(死亡时间分别为：12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h)，置于密闭室内，分别在各时间点取心血100μl，然后应用EZ1 Advanced XL(美国Promega公司)按照EZ1DNA InvestigatorKit(美国Promega公司)说明书进行操作提取心血DNA，-20℃冰冻保存备用。

2、DNA样本的浓度测定

用分光光度法分别测量不同死亡时间下大鼠心血样本DNA浓度，取1μl DNA样品，加入Nano Drop(Thermo)上，检测每组样本DNA浓度，取平均值(见表3)。

表3 大鼠死后96h内心血样本DNA浓度测定

3、大鼠心血腐败菌LacZ基因检测

对死亡时间为0-48h的5个时间点大鼠心血样本进行腐败菌LacZ基因检测。根据标准曲线定量结果，几乎均无扩增，类似阴性，初步得出，死亡时间为0-48h，扩增Ct值均在35以后，说明大鼠心血中未有LacZ基因的存在，对PMI为60-96h的SD大鼠心血DNA样本进行腐败菌LacZ基因检测，同批次扩增标准品(系列浓度标准品的系列浓度为:1.0×10⁷copies/μl、1.0×10⁶copies/μl、1.0×10⁵copies/μl、1.0×10⁴copies/μl、1.0×10³copies/μl)，制备标准曲线，根据标准曲线定量结果，发现各时间点的样本均有扩增产物出现，(见图6)。以标准品浓度梯度稀释的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标建立LacZ荧光定量PCR检测的标准曲线(见图7)。曲线回归得标准曲线方程为：Ct＝-3.65lgX+27.04(直线斜率A为-3.65，截距B为27.04，X为模板浓度，单位pg/μl)，曲线相关系数R²为0.9822，说明标准曲线线性较好。根据A＝-1/log(1+E)(E为荧光定量PCR反应的扩增效率)，得该次荧光定量PCR扩增效率为88％，符合荧光定量PCR对扩增效率的要求。根据标准曲线，可计算出实际样本中LacZ基因的浓度，图中标“×”为实际样本扩增在标准曲线线性拟合图中的位置。检测结果显示在大鼠死后60h LacZ浓度开始增加，随着死亡时间的延长呈指数式增长，至死后96h达到高峰。对SD大鼠死后60-96h心血DNA样品检测LacZ基因浓度变化值经EXCEL软件相关分析，得出回归方程式：y＝3E-06e^0.1567x，死亡时间与DNA浓度的决定系数(R²)为0.9569，表明DNA浓度随着死亡时间的延长而呈增加趋势，两者之间存在着较强的正相关。

实施例4实时荧光定量PCR试剂盒在尸检死亡时间鉴定中的案例

1、主要实验材料和仪器

EZ1DNA Investigator Kit(美国Promega公司)；Taq DNA聚合酶(5U/μl，Takara)，10×Buffer Mg²⁺plus，dNTPs(2.5mM)购于宝生物工程(大连)有限公司；引物和Taqman探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；荧光定量PCR仪为ABI PISM-7900HT扩增系统；分光光度计(Thermo Scientific NanoDrop 2000c)；EZ1 Advanced XL(美国Promega公司)。

2、DNA样本采集

提取样本由上海市公安局物证鉴定中心提供，在同一季节天气变化相对稳定的情况且死亡时间不同下，尸表检验提取肛门拭子、阴道拭子，尸体解剖提取心血样本，包含5具不同尸体15个样本，-20℃冰冻保存备用。

3、实际样本基因组DNA浓度测定

用分光光度法分别测量不同尸体不同部位下基因组DNA样本浓度，取1μl DNA样品，加入NanoDrop 2000c(Thermo)上，每个样品重复测定三次，然后得出样本浓度，见表4：

表4：不同尸体不同部位基因组DNA样品浓度测定

样本编号	基本特征	样本DNA浓度(ng/μl)
			1-1	猝死2h，肛门	1.6
1-2	猝死2h，阴道	6
			1-3	猝死2h，心血	0.8
2-1	农药中毒6h，肛门	10.4
			2-2	农药中毒6h，阴道	2.7
2-3	农药中毒6h，心血	1.3
			9-1	猝死10h，肛门	27.5
9-2	猝死10h，阴道	6.7
			9-3	猝死10h，心血	13.7
10-1	溺水4天，肛门	71.2
			10-2	溺水4天，阴道	61.8
10-3	溺水4天，心血	6.8

3、尸体样本中大肠杆菌浓度测定

3.1、采用实施例3中制作的标准曲线

3.2、尸体样本中大肠杆菌检测结果汇总(表5)

表5：尸体样本中大肠杆菌检测结果汇总

注释：由于本研究大肠杆菌全基因组DNA长度为4641642bp，pMD18-T全长2692bp，扩增子LacZ基因序列长度分别为570bp，故重组质粒长度约为3262bp，依据换算公式：浓度拷贝数(copies/μl)＝[(6.02×10²³copies/mol)×MWng/μl×10^-9]/(dsDNA length×660)，可进行拷贝数浓度与质量浓度换算。

不同死亡时间，尸体样本DNA检测结果显示：在人死后2h大肠杆菌浓度开始增加，随着死亡时间的延长浓度有所上升，有一定的正相关，根据这种相关性，检测未知死亡时间的样血样本中大肠杆菌含量，进而推断死亡时间，具有非常重要的研究前景和价值。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 无锡中德美联生物技术有限公司

<120> 检测大肠杆菌含量的试剂盒、特异性引物和探针及应用

<141> 2018-09-21

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaagcgacc cgcattgacc ctaacgcctg ggtcgaacgc tggaaggcgg cgggccatta 60

ccaggccgaa gcagcgttgt tgcagtgcac ggcagataca cttgctgatg cggtgctgat 120

tacgaccgct cacgcgtggc agcatcaggg gaaaacctta tttatcagcc ggaaaaccta 180

ccggattgat ggtagtggtc aaatggcgat taccgttgat gttgaagtgg cgagcgatac 240

accgcatccg gcgcggattg gcctgaactg ccagctggcg caggtagcag agcgggtaaa 300

ctggctcgga ttagggccgc aagaaaacta tcccgaccgc cttactgccg cctgttttga 360

ccgctgggat ctgccattgt cagacatgta taccccgtac gtcttcccga gcgaaaacgg 420

tctgcgctgc gggacgcgcg aattgaatta tggcccacac cagtggcgcg gcgacttcca 480

gttcaacatc agccgctaca gtcaacagca actgatggaa accagccatc gccatctgct 540

gcacgcggaa gaaggcacat ggctgaatat 570

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accgctggga tctgccattg t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actatcccga ccgccttact g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgcagaccg ttttcgctcg g 21

Claims

1.用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引物和探针以保守片段序列内序列为靶目标，所述保守片段序列为SEQ No.1。

2.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，其特征在于：

所述探针序列如SEQ No.2：5’-ACCGCTGGGATCTGCCATTGT-3’；

所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：

上游引物序列如SEQ No.3：5’-ACTATCCCGACCGCCTTACTG-3’，

下游引物序列如SEQ No.4：5’-GCGCAGACCGTTTTCGCTCGG-3’。

3.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，其特征在于：所述上游引物和所述下游引物序列为以所述SEQ No.3和SEQ No.4为基础向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

4.根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，所述探针3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

5.用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1至4中所述任意一种用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针。

6.根据权利要求5所述的用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：在20μl PCR反应体系中，所述上游引物PCR终浓度为0.5μM，所述下游引物PCR终浓度为0.5μM，所述探针PCR终浓度为0.2μM。

7.根据权利要求5或6所述的用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品和阳性对照；所述系列浓度标准品是将大肠杆菌LacZ基因与载体连接，转化至感受态细胞中诱导表达，提取重组质粒，将重组质粒定量后稀释，得到系列浓度标准品。

8.根据权利要求7所述的用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述标准品的核苷酸序列如SEQ No.1。

9.检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒的应用，其特征在于：权利要求5至8中任意一种检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒的应用如下任意一种用途：

(1)定性或定量检测或辅助检测大肠杆菌；

(2)测定大鼠死后心血中大肠杆菌含量，进而推断死亡时间；

(3)尸检中推断死亡时间；

所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

10.推断死亡时间的方法，其特征在于：测定动物死后心血中大肠杆菌含量进而推断死亡时间；所述测定动物死后大肠杆菌含量使用权利要求5至8中任意一种用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒。

11.根据权利要求10所述的一种推断死亡时间的方法，其特征在于：分别以系列浓度标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。

12.根据权利要求11所述的一种推断死亡时间的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件为：50℃2min，95℃10min，95℃15s、60℃1min并收集荧光信号，40个循环。