KR20180057723A

KR20180057723A - 항-cd30 키메라성 항원 수용체

Info

Publication number: KR20180057723A
Application number: KR1020187013573A
Authority: KR
Inventors: 제임스 엔 코첸더퍼
Original assignee: 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2016-10-10
Publication date: 2018-05-30
Also published as: EP3362476B1; AU2016338747A1; IL258527A; US10815301B2; CN108137703A; US20190062426A1; BR112018006995A2; MX2018004503A; WO2017066122A1; CA3002000A1; AU2016338747B2; EP3362476A1; JP2018531014A

Abstract

본 발명은 CD30에 특이적으로 결합하고 면역학적으로 이를 인식하는 키메라성 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. CAR에 관련된 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포의 집단, 및 약학 조성물이 또한 개시된다. 포유동물에서 증상(이때 증상은 암임)을 치료하거나 예방하는 방법이 또한 개시된다.

Description

항-CD30 키메라성 항원 수용체

관련 출원의 상호참조

본원은 2015년 10월 15일자 출원된 미국 가출원 제62/241,896호(이의 전체내용은 본원에 참고로 인용됨)를 우선권 주장한다.

연방 지원된 연구 개발에 관한 진술

본 발명은 국립 보건원, 국립 암 연구소에 의해 ZIA BC 011660 03의 프로젝트 번호하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.

전자적으로 제출된 자료의 참고도입

본원과 동시에 제출되고 다음과 같이 식별된 컴퓨터-판독가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그의 전체가 본원에 참고로 인용된다: 2016년 8월 22일자의 "726313_ST25.txt"라는 명칭의 27,962 바이트 ASCII(텍스트) 파일.

암은 공중 보건학적 관심사이다. 화학요법과 같은 치료에서의 진전에도 불구하고, 림프종을 비롯한 많은 암들에 대한 예후는 좋지 못할 수 있다. 따라서, 암, 특별히 림프종을 위한 추가적인 치료에 대하여 충족되지 않은 요구가 남아 있다.

본 발명의 하나의 실시태양은: (a) 인간 중쇄 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region) 1, 인간 중쇄 CDR2, 인간 중쇄 CDR3, 인간 경쇄 CDR1, 인간 경쇄 CDR2 및 인간 경쇄 CDR3을 포함하는 항-CD30 항원 결합 도메인; (b) 인간 힌지(hinge) 도메인; (c) 인간 막관통 도메인; 및 (d) (i) 인간 세포내 T-세포 신호발송 도메인, 및 (ii) 인간 T-세포 보조자극 도메인중 하나 또는 둘 다를 포함하는, CD30에 대하여 항원 특이성을 갖는 키메라성 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)를 제공한다.

본 발명의 추가의 실시태양은 본 발명의 CAR과 관련된 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포의 집단, 및 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가적인 실시태양은 포유동물에서 증상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 이때 증상은 암이다.

도 1A 및 1B는 CD30⁺ HH 림프종 세포주(양성 대조군) 또는 지시된 정상 조직에서 qPCR에 의해 측정된 β-액틴 cDNA의 10⁵개 복사물 당 CD30 cDNA 복사물의 수를 보여주는 그래프이다.
도 2A 내지 2C는 5F11-28Z(A), 5F11-CD828Z(B) 및 5F11-CD8BBZ(C) CAR 각각의 구조를 도시하는 개략도이다.
도 3은 5F11-28Z를 발현하는 CFSE-표지화된 T-세포가 CD30-bv173 세포(CD30⁺, 충전된 흑색 히스토그램) 또는 음성 대조군 NGFR-bv173 세포(CD30-음성, 비어 있는 히스토그램)와 함께 배양되었을 때의 형광 염료 CFSE의 희석 정도를 보여주는 히스토그램이다.
도 4A는 배양의 다양한 시점(날짜)에서의 제1 공여체로부터의 살아있는 전체 세포의 수를 보여주는 그래프이고, 이때 T-세포는 형질도입되지 않거나(비어 있는 사각형), 또는 5F11-28Z(원형), AC10-28Z(▲), 또는 XmAb2513-28Z(비어 있는 삼각형)에 의해 형질도입되었다.
도 4B는 배양의 다양한 시점(날짜)에서의 제2 공여체로부터의 살아있는 전체 세포의 수를 보여주는 그래프이고, 이때 T-세포는 형질도입되지 않거나(다이아몬드형) 또는 5F11-28Z(원형), AC10-28Z(▲), 또는 XmAb2513-28Z(비어 있는 삼각형)에 의해 형질도입되었다.
도 5A 및 5B는 배양의 다양한 시점(날짜)에서의 제1 공여체(A) 및 제2 공여체(B)로부터의 살아있는 전체 세포의 수를 보여주는 그래프이고, 이때 T-세포는 형질도입되지 않거나(비어 있는 사각형), 또는 5F11-28Z(▼), 5F11-CD8BBZ(▲), 또는 5F11-CD8-28Z(원형)에 의해 형질도입되었다.
도 6은 다양한 효과자:표적 비에서 5F11-28Z CAR(효과자)이 형질도입된 T-세포(원형)와 HH 림프종 세포(표적)의 공동-배양 이후에 측정된 HH-특이적 세포독성 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 데이터는 CD30-음성 표적 세포 CCRF-CEM의 세포독성 퍼센트에 상대적인 HH 세포의 세포독성 퍼센트로서 제시된다. SP6-CD828Z CAR을 발현하는 T-세포(사각형)는 음성 대조군(효과자)으로서 사용되었다.
도 7A는 T-세포 주입 이후 다양한 시점(일)에서 5F11-28Z(비어 있는 원형), 5F11-CD828Z(충전된 원형), 또는 SP6-CD828Z(사각형)가 형질도입된 8 백만 T-세포의 정맥내 주입에 의해 치료되거나 치료되지 않은(비어 있는 삼각형) 마우스의 종양 크기(면적)(㎟)를 보여주는 그래프이다. 제시된 결과는 2회 실험의 합쳐진 결과이다. 결과는 평균의 표준 오차를 갖는 종양 크기로서 보고된다.
도 7B는 T-세포 주입 이후 다양한 시점(일)에서 5F11-28Z(비어 있는 원형), 5F11-CD828Z(충전된 원형), 또는 SP6-CD828Z(사각형)가 형질도입된 8 백만 T-세포의 정맥내 주입에 의해 치료되거나 치료되지 않은(비어 있는 삼각형) 종양-함유 마우스의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 8A는 T-세포 주입 이후 다양한 시점(일)에서 5F11-CD28Z가 형질도입된 0.67 x 10⁶(사각형), 2 x 10⁶(삼각형), 또는 6 x 10⁶(원형) T-세포의 단일 주입에 의해 치료되거나 치료되지 않은(충전된 원형) 마우스에서 종양 부피(mm³)를 보여주는 그래프이다.
도 8B는 T-세포 주입 이후 다양한 시점(일)에서 5F11-CD28Z가 형질도입된 0.67 x 10⁶(사각형), 2 x 10⁶(삼각형), 또는 6 x 10⁶(원형) T-세포의 단일 주입에 의해 치료되거나 치료되지 않은(충전된 원형) 종양-함유 마우스의 생존율을 보여주는 그래프이다.

본 발명의 하나의 실시태양은: (a) 인간 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 인간 중쇄 CDR2, 인간 중쇄 CDR3, 인간 경쇄 CDR1, 인간 경쇄 CDR2 및 인간 경쇄 CDR3을 포함하는 항-CD30 항원 결합 도메인; (b) 인간 힌지 도메인; (c) 인간 막관통(TM) 도메인; 및 (d) (i) 인간 세포내 T-세포 신호발송 도메인, 및 (ii) 인간 T-세포 보조자극 도메인중 하나 또는 둘 다를 포함하는, CD30에 대하여 항원 특이성을 갖는 CAR을 제공한다.

CAR은 T-세포 신호발송 도메인에 연결된 항체의 항원 결합 도메인(예를 들어, 단일 쇄 가변성 단편(scFv))을 함유하는 인공적으로 작성된 하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드이다. CAR의 특징으로는 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대한 반응성 및 T-세포 특이성을 재유도하여 단일클론성 항체의 항원-결합 특성을 촉진시키는 이들의 능력이 포함된다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 세포에게 항원 처리와 무관하게 항원을 인식하는 능력을 제공하여, 종양 도피(tumor escape)의 주요 기작을 건너뛰게 한다. 게다가, T-세포에서 발현될 경우, CAR은 유리하게는 내생성 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 쇄와 함께 이량체화하지 않는다.

본 발명의 CAR은 많은 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 CAR의 모든 또는 거의 모든 성분은 인간 서열일 수 있다. 따라서, 본 발명의 CAR의 인간 환자로의 투여는, 비-인간 서열, 예를 들어, 마우스 서열을 함유하는 CAR과 비교하여, 인간 환자에서 CAR에 대한 원치않는 면역 반응을 일으키는 경향이 더 적을 수 있다.

본 발명의 CAR은 인간 CD30(또한 종양 괴사 인자 수용체 상과(superfamily), 구성원 8(TNFRSF8)로서 지칭됨)에 대하여 항원 특이성을 갖는다. CD30은 다양한 인간 암 세포, 예컨대 림프종에 의해 발현되거나 과발현될 수 있다. CD30을 발현하거나 과발현하는 암의 예로는, 제한되지 않지만, B-세포 림프종[예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma), 원발성 종격동 B-세포 림프종(PMBL: primary mediastinal B-cell lymphoma), 호지킨 림프종(HL: Hodgkin lymphoma), 비-호지킨 림프종, 종격동 그레이존(gray zone) 림프종, 및 결절 경화 HL] 및 T-세포 림프종[예를 들어, 역형성 큰 세포 림프종(ALCL: anaplastic large cell lymphoma), 말초 T-세포 림프종-달리 명시되지 않음(PTCL-NOS: peripheral T cell lymphoma not otherwise specified), 및 혈관면역모세포성 T-세포 림프종(AITL: angioimmunoblastic T cell lymphoma)]이 포함된다. 특별한 이론 또는 기작에 얽매이지 않지만, CD30에 대한 항원-특이적 반응을 유발시킴으로써, 본 발명의 CAR은 다음중 하나 이상을 제공하는 것으로 여겨진다: CD30-발현 암 세포의 표적화 및 파괴, 암 세포의 감소 및 제거, 면역 세포의 종양 자리(들)로의 침투 촉진, 및 항암 반응의 향상/연장.

"항원(성) 특이성을 갖는" 및 "항원-특이적 반응을 유발하는"이라는 구절은, 본원에 사용될 경우, CAR이 항원(CD30)에 특이적으로 결합하고 면역학적으로 반응함으로써, 항원으로의 CAR의 결합이 면역 반응을 유발시킬 수 있음을 의미한다.

본 발명의 하나의 실시태양은 5F11 인간 항체("5F11")의 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. 5F11의 항원 결합 도메인은 CD30에 특이적으로 결합한다. 5F11 항체는 미국 특허 제7,387,776호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참고로 인용된다.

항원 결합 도메인은 5F11 항체의 임의의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 Fab 단편(Fab), F(ab')₂ 단편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 단일-쇄 가변성 영역 단편(scFv), 또는 디설파이드-안정화된 가변성 영역 단편(dsFv)일 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 항원 결합 도메인은 scFv이다. scFv는 합성 펩티드를 경유하여 항체 경쇄의 V 도메인에 연결되는 항체 중쇄의 가변성(V) 도메인을 포함하는 절단된(truncated) Fab 단편이고, 이는 관례적인 재조합 DNA 기술 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 그러나, 본 발명의 CAR에 이용되는 항-CD30 항원 결합 도메인은, 이러한 항체 단편의 예시적인 유형들로 제한되지 않는다.

항원 결합 도메인은 경쇄 가변성 영역 및/또는 중쇄 가변성 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 중쇄 가변성 영역은 상보성 결정 영역(CDR)1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 항원 결합 도메인은 인간 중쇄 CDR1, 인간 중쇄 CDR2 및 인간 중쇄 CDR3을 포함한다. 이와 관련하여, 항원 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된 중쇄 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된 중쇄 CDR3중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 중쇄는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열 모두를 포함한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 중쇄 가변성 영역은 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 및 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 항원 결합 도메인은 인간 경쇄 CDR1, 인간 경쇄 CDR2 및 인간 경쇄 CDR3을 포함한다. 이와 관련하여, 항원 결합 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된 경쇄 CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된 경쇄 CDR3중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 경쇄는 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열 모두를 포함한다. 특별히 바람직한 하나의 실시태양에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 모두 포함한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 항원 결합 도메인은 중쇄 가변성 영역 및 경쇄 가변성 영역을 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 항원 결합 도메인은 인간 중쇄 가변성 영역 및 인간 경쇄 가변성 영역을 포함한다. 항원 결합 도메인의 중쇄 가변성 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 항원 결합 도메인의 중쇄 가변성 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및/또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함한다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 서열번호 7 및 8 둘 다의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 경쇄 가변성 영역 및 중쇄 가변성 영역은 연결기에 의해 연결될 수 있다. 연결기는 임의의 적합한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 연결기는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 항원 결합 도메인은 리더(leader) 서열을 포함한다. 리더 서열은 경쇄 가변성 영역 또는 중쇄 가변성 영역의 아미노 말단에 위치될 수 있다. 바람직하게는, 리더 서열은 경쇄 가변성 영역의 아미노 말단에 위치된다. 리더 서열은 임의의 적합한 리더 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 리더 서열이 세포의 표면상에서 CAR의 발현을 촉진시킬 수 있지만, 발현된 CAR에서의 리더 서열의 존재는 CAR이 작용하기 위해 필수적인 것은 아니다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 세포 표면상에서 CAR의 발현시, 모든 또는 일부 리더 서열은 CAR을 분할시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR은 리더 서열이 결핍된다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR은 힌지 도메인 및 막관통(TM) 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 힌지 도메인은 인간 힌지 도메인이고 TM 도메인은 인간 TM 도메인이다. 힌지 도메인 및 TM 도메인은 인간 CD8α의 힌지 도메인 및 TM 도메인를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 인간 CD8α의 힌지 도메인 및 TM 도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR은 세포내 T-세포 신호발송 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 세포내 T-세포 신호발송 도메인은 인간 세포내 T-세포 신호발송 도메인이다. 세포내 T-세포 신호발송 도메인은 인간 CD28, 인간 4-1BB 및 인간 CD3ζ중 하나 이상의 세포내 T-세포 신호발송 도메인을 포함할 수 있다. CD28은 T-세포 공동-자극에서 중요한 T-세포 표지이다. 인간 CD28의 세포내 T-세포 신호발송 도메인은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 또한 CD137로서 지칭되는 4-1BB는, 강력한 보조자극 신호를 T-세포에 전송하여, 분화를 촉진시키고 T 림프구의 장기간의 생존을 향상시킨다. 인간 4-1BB의 세포내 T-세포 신호발송 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. CD3ζ는 TCR과 회합되어 신호를 생산하고 면역수용체 티로신-기제 활성화 모티프(ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif)를 함유한다. 인간 CD3ζ의 세포내 T-세포 신호발송 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR은 (i) 인간 CD8α의 힌지 도메인 및 TM 도메인; (ii) 인간 CD28의 세포내 T-세포 신호발송 도메인; 및 (iii) 인간 CD3ζ의 세포내 T-세포 신호발송 도메인을 포함한다. 이와 관련하여, CAR은 서열번호 11, 12 및 15 모두의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 11, 12 및 15 모두의 아미노산 서열을 포함하는 CAR은 추가로 본 발명의 다른 양태에 대하여 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, CAR은 (i) 서열번호 1 내지 6, 11, 12 및 15; (ii) 서열번호 7, 8, 11, 12 및 15; 또는 (iii) 서열번호 23, 11, 12 및 15의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR는 (i) 인간 CD8α의 힌지 도메인 및 TM 도메인; (ii) 인간 4-1BB의 세포내 T-세포 신호발송 도메인; 및 (iii) 인간 CD3ζ의 세포내 T-세포 신호발송 도메인을 포함한다. 이와 관련하여, CAR는 서열번호 11, 14 및 15의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 11, 14 및 15 모두의 아미노산 서열을 포함하는 CAR은 추가로 본 발명의 다른 양태에 대하여 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, CAR은 (i) 서열번호 1 내지 6, 11, 14 및 15; (ii) 서열번호 7, 8, 11, 14 및 15; 또는 (iii) 서열번호 23, 11, 14 및 15의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR은 (i) 인간 CD28의 힌지 도메인, TM 도메인 및 세포내 T-세포 신호발송 도메인, 및 (ii) 인간 CD3ζ의 세포내 T-세포 신호발송 도메인을 포함한다. 인간 CD28의 힌지 도메인, TM 도메인 및 세포내 T-세포 신호발송 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 인간 CD3ζ의 세포내 T-세포 신호발송 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 이와 관련하여, CAR은 서열번호 13 및 15 둘 다의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 13 및 15 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 CAR은 추가로 본 발명의 다른 양태에 대하여 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, CAR은 (i) 서열번호 1 내지 6, 13, 및 15; (ii) 서열번호 7, 8, 13 및 15; 또는 (iii) 서열번호 23, 13, 및 15의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양은 서열번호 16 내지 18중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 제공한다. 서열번호 16 내지 18중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CAR의 성분은 하기 표 1에 제시된다.

[표 1]

본 발명의 범주에 본원에 기재된 본 발명의 CAR의 작용성 변형체가 포함된다. "작용성 변형체"라는 용어는, 본원에 사용될 경우, 모 CAR에 실질적이거나 유의적인 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 CAR을 지칭하고, 이러한 작용성 변형체는 모 CAR의 생물 활성을 보유한다. 작용성 변형체는, 예를 들어, 모 CAR과 유사한 정도, 동일한 정도 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하는 능력을 보유하는 본원에 기재된 CAR(모CAR)의 변형체를 내포한다. 모 CAR과 관련하여, 작용성 변형체는 아미노산 서열에 있어서, 모 CAR에, 예를 들어, 적어도 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91 %, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상 동일성일 수 있다.

작용성 변형체는, 예를 들어, 적어도 1개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모 CAR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가적으로, 작용성 변형체는 적어도 1개의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 모 CAR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 비-보존적 아미노산 치환은 작용성 변형체의 생물 활성을 간섭하거나 저해하지 않는 것이 바람직하다. 비-보존적 아미노산 치환은 작용성 변형체의 생물 활성이 모 CAR과 비교하여 증가하도록 작용성 변형체의 생물 활성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 CAR의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 아미노산 치환은 당분야에 공지되어 있고, 특정한 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 하나의 아미노산이 동일하거나 유사한 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 교환되는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 산성/음성적으로 하전된 또 다른 극성 아미노산으로 치환되는 산성/음성적으로 하전된 극성 아미노산(예를 들어, Asp 또는 Glu), 극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val 등), 염기성/양성으로 하전된 또 다른 극성 아미노산으로 치환되는 염기성/양성으로 하전된 극성 아미노산(예를 들어, Lys, His, Arg 등), 극성 측쇄를 갖는 또 다른 비하전된 아미노산으로 치환되는 극성 측쇄를 갖는 비하전된 아미노산(예를 들어, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr 등), 베타-분지형 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, Ile, Thr, 및 Val), 방향족 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, His, Phe, Trp, 및 Tyr) 등을 포함한다.

CAR은, 다른 성분, 예를 들어, 다른 아미노산이 CAR의 생물 활성을 현저히 변화시키지 않도록, 본원에 기재된 특정화된 아미노산 서열 또는 서열들로 본질적으로 구성될 수 있다.

본 발명의 실시태양의 CAR은 임의의 길이일 수 있고, 즉 임의의 수의 아미노산을 포함할 수 있지만, CAR은 이들의 생물 활성, 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하거나 포유동물에서 증상을 치료하거나 예방하는 능력 등을 보유해야 한다. 예를 들어, CAR은 약 50 내지 약 5000개 아미노산 길이, 예컨대 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 이상의 아미노산 길이일 수 있다.

본 발명의 실시태양의 CAR은 하나 이상의 천연-발생 아미노산 대신에 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 아미노사이클로헥산 카복실산, 노르로이신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린(homoserine), S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카복시페닐알라닌, β-페닐세린, β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글리신, 인돌린-2-카복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-라이신, N',N'-디벤질-라이신, 6-하이드록시라이신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카복실산, α-아미노사이클로헥산 카복실산, α-아미노사이클로헵탄 카복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌, 및 α-3급-부틸글리신이 포함된다.

본 발명의 실시태양의 CAR은 글리코실화되거나, 아미드화되거나, 카복실화되거나, 인산화되거나, 에스테르화되거나, N-아실화되거나, 예를 들어 디설파이드 가교를 통해 환화되거나, 산 부가 염으로 전환되고/되거나, 이량체화 또는 중합체화될 수 있다.

본 발명의 실시태양의 CAR은 당분야에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. CAR은 폴리펩티드 또는 단백질을 제조하는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질을 드 노보(de novo) 합성하는 적합한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 또한, CAR은, 예를 들어, 그린(Green) 및 샘브룩(Sambrook)의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual(4^th Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)]에 기재된 바와 같이, 표준 재조합 방법에 의해 본원에 기재된 핵산을 이용해 재조합적으로 생산될 수 있다. 다르게는, 본원에 기재된 CAR은 회사, 예를 들어, 신페프(Synpep)(미국 캘리포니아주 두블린) 및 멀티플 펩티드 시스템즈(Multiple Peptide Systems)(미국 캘리포니아주 샌 디에고)에 의해 상업적으로 합성될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 CAR은 합성적 및/또는 재조합적일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에 의해 본원에 기재된 임의의 CAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 추가로 제공된다. 본 발명의 핵산은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 리더 서열, 연결기, 항원 결합 도메인, TM 도메인 및 세포내 T-세포 신호발송 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 핵산은 표 2에 제시된 뉴클레오티드 서열들중 임의의 하나를 포함한다.

[표 2]

"핵산"은, 본원에 사용될 경우, "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", 및 "핵산 분자"를 포함하고, 일반적으로 DNA 또는 RNA의 중합체를 의미하고, 이는 단일-가닥 또는 2중-가닥이고, 합성되거나 천연 공급원으로부터 수득될 수 있으며(예를 들어, 단리되고/되거나 정제됨), 이는 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 이는 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이에서 발견되는 포스포디에스테르 대신에, 천연, 비-천연 또는 변경된 인터뉴클레오티드 연결기, 예컨대 포스포로아미데이트 연결기 또는 포스포로티오에이트 연결기를 함유할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 핵산은 삽입, 결실, 역위(inversion), 및/또는 치환을 전혀 포함하지 않는다. 그러나, 몇몇 경우에, 핵산이 하나 이상의 삽입, 결실, 역위 및/또는 치환을 포함하는 것이 적합할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양의 핵산은 재조합적일 수 있다. 본원에 사용될 경우, "재조합"이라는 용어는 (i) 천연 또는 합성 핵산 분절을 살아있는 세포에서 복제가능한 핵산 분자에 연결시킴으로써 살아있는 세포 밖에서 작성되는 분자, 또는 (ii) 상기 (i)에 기재된 것의 복제로부터 생성되는 분자를 지칭한다. 본원에서 목적을 위해, 복제는 시험관내 복제 또는 생체내 복제일 수 있다.

핵산은, 다른 성분, 예를 들어, 다른 뉴클레오티드가 인코딩된 CAR의 생물 활성을 현저히 변화시키지 않도록, 본원에 기재된 특정화된 뉴클레오티드 서열 또는 서열들로 본질적으로 구성될 수 있다.

재조합 핵산은 천연적으로 발생하지 않는 서열을 갖는 핵산 또는 서열의 2개의 다른 별도의 분절의 인공적 조합에 의해 제조된 서열을 갖는 핵산일 수 있다. 인공적 조합은 종종 화학적 합성에 의해, 또는 더욱 흔히는 핵산의 단리된 분절의 인공적 조작에 의해, 예를 들어, 유전자 조작 기법, 예컨대 그린(Green) 등의 상기 문헌에 기재된 기법에 의해 달성된다. 핵산은 당분야에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 결찰 반응에 기반하여 작성될 수 있다. 예를 들어, 그린(Green) 등의 상기 문헌을 참조한다. 예를 들어, 핵산은 천연 발생 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 하이브리드화시 형성되는 이중물(duplex)의 물리적 안정성을 증가시키도록 고안된 다양하게 변형된 뉴클레오티드[예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘(acridine) 치환된 뉴클레오티드]를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산을 생성하기 위해 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예로는, 제한되지 않지만, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신(galactosylqueosine), 이노신, N⁶-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N⁶-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N⁶-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, 및 2,6-디아미노퓨린이 포함된다. 다르게는, 하나 이상의 본 발명의 핵산은 회사, 예를 들어, 매크로몰레큘라 리소시즈(Macromolecular Resources)(미국 콜로라도주 포트 콜린스) 및 신테겐(Synthegen)(미국 텍사스주 휴스턴)으로부터 구입될 수 있다.

핵산은 본원에 기재된 임의의 CAR을 인코딩하는 임의의 단리되거나 정제된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다르게는, 뉴클레오티드 서열은 임의의 서열에 대해 변성된 뉴클레오티드 서열 또는 변성된 서열의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양은 또한 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보성인 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격한 조건하에 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리되거나 정제된 핵산을 제공한다.

엄격한 조건하에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열은 매우 엄격한 조건하에 하이브리드화할 수 있다. "매우 엄격한 조건"은 뉴클레오티드 서열이 비-특이적 하이브리드화에 비해 검출가능하게 더 강한 양으로 표적 서열(본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열)에 특이적으로 하이브리드화함을 의미한다. 매우 엄격한 조건은, 뉴클레오티드 서열에 부합하는 소수의 작은 영역(예를 들어, 3 내지 10개 염기)을 갖게된 무작위 서열로부터 정확한 상보성 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 단지 소수의 산란된 부정합을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 구별하는 조건을 포함한다. 상보성의 이러한 작은 영역은 14 내지 17개 이상의 염기의 전장 보체에 비해 더욱 쉽게 용융되고, 매우 엄격한 하이브리드화는 이들이 쉽게 구별될 수 있도록 만든다. 상대적으로 매우 엄격한 조건은, 예를 들어, 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건, 예컨대 약 50 내지 70℃의 온도에서 약 0.02 내지 0.1 M NaCl 또는 등가에 의해 제공되는 조건을 포함한다. 이러한 매우 엄격한 조건은 뉴클레오티드 서열 및 주형 또는 표적 가닥 사이의, 존재하더라도 극히 적은 부정합을 용인하고, 본원에 기재된 임의의 본 발명의 CAR의 발현을 검출하는데 특히 적합하다. 일반적으로 조건은 포름아미드의 양을 증가시키면서 첨가함으로써 더욱 엄격하게 될 수 있는 것으로 인식된다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 핵산은 CAR을 인코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 특별한 이론 또는 기작에 얽매이는 것은 아니지만, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화가 mRNA 전사물의 번역 효율을 증가시키는 것으로 여겨진다. 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 동일한 아미노산을 인코딩하는 또 다른 코돈으로 고유의 코돈을 치환함을 포함할 수 있지만, 세포내에서 보다 쉽게 이용할 수 있는 tRNA에 의해 번역될 수 있고, 이에 따라 번역 효율을 증가시킨다. 뉴클레오티드 서열의 최적화는 또한 번역을 간섭할 수 있는 2차 mRNA 구조물을 감소시킴으로써, 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 이와 관련하여, CAR을 인코딩하는 핵산은 서열번호 20 내지 22중 임의의 하나의 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 적어도 약 70% 이상, 예를 들어, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 핵산은 재조합 발현 벡터내로 혼입될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 실시태양은 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본원에서 목적을 위해, "재조합 발현 벡터"라는 용어는, 작성물이 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 벡터가 세포내에서 발현된 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 갖기에 충분한 조건하에 세포와 접촉되는 경우, 숙주 세포에 의한 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 발현을 허용하는 유전자-변형된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 작성물을 의미한다. 본 발명의 벡터는 전반적으로 천연-발생성이 아니다. 그러나, 벡터의 일부는 천연-발생성일 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 유형의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 예컨대 제한되지 않지만 DNA 및 RNA가 포함되며, 이는 단일-가닥 또는 2중-가닥이고, 합성되거나 천연 공급원으로부터 부분적으로 수득되며, 이는 천연, 비-천연 또는 변경된 일부 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 천연-발생 또는 비-천연-발생의 인터뉴클레오티드 연결기, 또는 이들 유형의 연결기 둘 다를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 비-천연 발생 또는 변경된 뉴클레오티드 또는 인터뉴클레오티드 연결기는 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주 세포를 형질전환하거나 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 벡터로는 번식 및 확장을 위해 또는 발현을 위해, 또는 이들 둘 다를 위해 고안된 벡터, 예컨대 플라스미드 및 바이러스가 포함된다. 벡터는 pUC 시리즈[페르멘타스 라이프 사이언시즈(Fermentas Life Sciences), 미국 메릴랜드주 글렌 버니], 피블루스크립트(pBluescript) 시리즈[스트라타겐(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라호야], pET 시리즈[노바겐(Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨], pGEX 시리즈[파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech), 스웨덴 웁살라], 및 pEX 시리즈[클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아주 팔로 알토]로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 박테리오파아지(bacteriophage) 벡터, 예컨대 λGT10, λGT11, λZapII(스트라타겐), λEMBL4, 및 λMN1149가 또한 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 pBIO1, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(클론테크)가 포함된다. 동물 발현 벡터의 예로는 pEUK-C1, pMAM, 및 pMAMneo(클론테크)가 포함된다. 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 벡터는 감마-레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포존(transposon)이다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 재조합 발현 벡터는, 예를 들어, 그린(Green) 등의 상기 문헌에 기재된 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 환형 또는 선형인 발현 벡터의 작성물은, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 작용성인 복제 시스템을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은, 예를 들어, ColE1, 2 μ 플라스미드, λ, SV40, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.

재조합 발현 벡터는, 적절한 경우, 및 벡터가 DNA-기반인지 또는 RNA-기반인지의 여부를 고려하여, 벡터가 도입되는 숙주의 유형(예를 들어, 세균, 곰팡이, 식물 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 클로닝을 촉진시키는 제한 자리를 포함할 수 있다.

재조합 발현 벡터는 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 표지 유전자를 포함할 수 있다. 표지 유전자는 살생물제 내성, 예를 들어, 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 원영양체 조건(prototrophy)을 제공하기 위한 영양요구성 숙주에서의 상보성 등을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터에 적합한 표지 유전자로는, 예를 들어, 네오마이신(neomycin)/G418 내성 유전자, 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자, 히스티디놀(histidinol) 내성 유전자, 테트라사이클린(tetracycline) 내성 유전자, 및 암피실린(ampicillin) 내성 유전자가 포함된다.

재조합 발현 벡터는 본 발명의 CAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에, 또는 본 발명의 CAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보성이거나 이에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되는 고유의 또는 비-고유의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 강하거나, 약하거나, 유도가능하거나, 조직-특이적이거나, 발달-특이적인 프로모터의 선택은 당분야의 통상적인 기술내에 속한다. 유사하게, 프로모터와 뉴클레오티드 서열의 조합은 또한 당분야의 통상적인 기술내에 속한다. 프로모터는 비-바이러스성 프로모터 또는 바이러스성 프로모터일 수 있고, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스의 긴-말단 반복부(long-terminal repeat)에서 발견되는 프로모터이다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 일시적 발현을 위해, 안정한 발현을 위해, 또는 이들 둘 다를 위해 고안될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 구성적 발현 또는 유도성 발현을 위해 만들어질 수 있다.

추가로, 재조합 발현 벡터는 자살 유전자를 포함하도록 만들어질 수 있다. 본원에 사용될 경우, "자살 유전자"라는 용어는 자살 유전자를 발현하는 세포가 사멸되도록 하는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는, 유전자가 발현되는 세포상에서 제제, 예를 들어, 약물에 대한 감수성을 부여하고, 세포가 제제와 접촉되거나 이에 노출될 때 세포를 사멸시키는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 단순포진 바이러스(HSV: Herpes Simplex Virus) 티미딘 키나아제(TK: thymidine kinase) 유전자, 시토신 다미나아제(daminase), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(phosphorylase), 및 니트로환원효소(nitroreductase)가 포함된다.

본 발명의 하나의 실시태양은 본원에 기재된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본원에 사용될 경우, "숙주 세포"라는 용어는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 함유할 수 있는 임의의 유형의 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 식물, 동물, 곰팡이, 또는 조류(algae)이거나, 원핵 세포, 예를 들어, 세균 또는 원생동물일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 세포 또는 1차 세포, 즉 유기체, 예를 들어, 인간으로부터 직접 단리된 세포일 수 있다. 숙주 세포는 접착 세포 또는 현탁된 세포, 즉, 현탁액에서 성장하는 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, DH5α 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 중국 햄스터 난소 세포, 원숭이 VERO 세포, COS 세포, HEK293 세포 등이 포함된다. 재조합 발현 벡터를 증폭시키고 복제하기 위해, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어, DH5α 세포일 수 있다. CAR을 생산하기 위해, 숙주 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 숙주 세포는 인간 세포일 수 있다. 숙주 세포가 임의의 세포 유형이고, 임의의 유형의 조직으로부터 기원되며, 임의의 발달 단계일 수 있지만, 숙주 세포는 말초 혈액 림프구(PBL: peripheral blood lymphocyte) 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)일 수 있다. 숙주 세포는 B-세포, 천연 킬러(NK: natural killer) 세포, 또는 T-세포일 수 있다.

본원에서 목적을 위해, T-세포는 임의의 T-세포, 예컨대 배양된 T-세포, 예를 들어, 1차 T-세포, 또는 배양된 T-세포주로부터의 T-세포, 예를 들어, 주르캣(Jurkat), SupT1 등, 또는 포유동물로부터 수득된 T-세포일 수 있다. 포유동물로부터 수득된다면, T-세포는 다수의 공급원, 예컨대 제한되지 않지만 혈액, 골수, 림프절, 흉선, 또는 기타 조직 또는 체액으로부터 수득될 수 있다. T-세포는 또한 강화되거나 정제될 수 있다. T-세포는 인간 T-세포일 수 있다. T-세포는 인간으로부터 단리된 T-세포일 수 있다. T-세포는 임의의 유형의 T-세포일 수 있고, 임의의 발달 단계, 예컨대 제한되지 않지만, CD4⁺/CD8⁺ 2중 양성 T-세포, CD4⁺ 헬퍼 T-세포, 예를 들어, Th₁ 및 Th₂ 세포, CD8⁺ T-세포(예를 들어, 세포독성 T-세포), 종양 침투 세포, 기억 T-세포, 나이브(naive) T-세포 등일 수 있다. T-세포는 CD8⁺ T-세포 또는 CD4⁺ T-세포일 수 있다.

또한 본 발명의 하나의 실시태양에 의해 본원에 기재된 적어도 2개의 숙주 세포를 포함하는 세포의 집단이 제공된다. 세포의 집단은 기재된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를, 재조합 발현 벡터를 전혀 포함하지 않는 적어도 하나의 다른 세포, 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, T-세포), 또는 T-세포 이외의 세포, 예를 들어, B-세포, 대식세포, 호중구, 적혈구, 간세포, 내피 세포, 상피 세포, 근육 세포, 뇌 세포 등에 더하여 포함하는 이종성 집단일 수 있다. 다르게는, 세포의 집단은 실질적으로 동종성 집단일 수 있고, 이때 집단은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 주로 포함한다(예를 들어, 이로 실질적으로 구성된다). 집단은 또한 세포의 클론성 집단일 수 있고, 이때 집단의 모든 세포는 재조합 발현 벡터를 포함하는 단일 숙주 세포의 클론이어서, 집단의 모든 세포가 재조합 발현 벡터를 포함하게 된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 클론 집단이다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 집단중 세포의 수는 신속히 확장될 수 있다. CAR을 발현하는 세포의 수의 확장은, 예를 들어, 미국 특허 제8,034,334호; 미국 특허 제8,383,099호; 미국 특허출원공개 제2012/0244133호; 두들리(Dudley) 등의 문헌[J. Immunother., 26:332-42(2003)]; 및 리델(Riddell) 등의 문헌[J. Immunol. Methods, 128: 189-201(1990)]에 기재된 바와 같이 당분야에 공지된 임의의 다수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 세포 수의 확장은 T-세포를 OKT3 항체, IL-2, 및 피더(feeder) PBMC(예를 들어, 방사선조사된 동종이형성 PBMC)와 함께 배양함으로써 실행된다.

CAR, 작용성 변형체, 핵산, 재조합 발현 벡터, 및 숙주 세포(이의 집단 포함)[이들 모두는 이후 총체적으로 "본 발명의 항-CD30 물질"로서 지칭됨]는 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 용어 "단리된"은, 본원에 사용될 경우, 그의 천연 환경으로부터 제거됨을 의미한다. 용어 "정제된" 또는 "단리된"은 완전한 정제 또는 단리를 필요로하는 것은 아니고; 오히려 이는 상대적 용어로서 의도된다. 이에 따라, 예를 들어, 정제된(또는 단리된) 숙주 세포 제조물은, 숙주 세포가 신체내의 이들의 천연 환경에서의 세포에 비해 더욱 순수한 것이다. 이러한 숙주 세포는, 예를 들어, 표준 정제 기법에 의해 생산될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 숙주 세포의 제조물은 숙주 세포가 제조물의 총 세포 함량의 적어도 약 50%, 예를 들어, 적어도 약 70%를 나타내도록 정제된다. 예를 들어, 순도는 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%를 초과할 수 있거나, 약 100%일 수 있다.

본 발명의 항-CD30 물질은 조성물, 예컨대 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 실시태양은 본원에 기재된 임의의 본 발명의 항-CD30 물질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 임의의 본 발명의 항-CD30 물질을 함유한 본 발명의 약학 조성물은 하나 보다 많은 본 발명의 항-CD30 물질, 예를 들어, CAR 및 핵산을 포함할 수 있다. 다르게는, 약학 조성물은 본 발명의 CAR 물질을, 다른 약학적으로 활성인 제제 또는 약물, 예컨대 화학요법제, 예를 들어, 아스파라기나아제(asparaginase), 부설판(busulfan), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 플루오로우라실, 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아, 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 리툭시맙(rituximab), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 등과 조합하여 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명의 숙주 세포 또는 이의 집단을 포함한다.

바람직하게는, 담체는 약학적으로 허용가능한 담체이다. 약학 조성물에 관하여, 담체는 고려중인 특별한 본 발명의 CAR 물질을 위해 통상적으로 사용되는 임의의 담체일 수 있다. 투여가능한 조성물을 제조하는 방법은 당분야의 숙련가에게 공지되거나 명확하고, 예를 들어, 레밍턴(Remington)의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd Ed., Pharmaceutical Press (2012)]에 더욱 상세히 기재되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용 조건하에 해로운 부작용이나 독성을 갖지 않는 것이 바람직하다.

담체의 선택은 부분적으로 특별한 본 발명의 CAR 물질, 뿐만 아니라 본 발명의 CAR 물질을 투여하기 위해 사용되는 특별한 방법에 의해 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 다양한 적합한 제형이 존재한다. 적합한 제형으로는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 종양내, 또는 복강내 투여를 위한 임의의 제형이 포함될 수 있다. 본 발명의 CAR 물질을 투여하기 위해 하나 보다 많은 투여 경로가 사용될 수 있고, 특정 경우에, 특별한 경로는 또 다른 경로에 비해 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 CAR 물질은 주사에 의해, 예를 들어, 정맥내로 투여된다. 본 발명의 CAR 물질이 본 발명의 CAR을 발현하는 숙주 세포(또는 이의 집단)인 경우, 주사용 세포를 위한 약학적으로 허용가능한 담체로는 임의의 등장성 담체, 예를 들어, 일반 염수(약 0.90% w/v의 수중 NaCl, 약 300 mOsm/L의 수중 NaCl, 또는 물 1 L 당 약 9.0 g의 NaCl), 노르모졸(NORMOSOL) R 전해질 용액[애보트(Abbott), 미국 일리노이주 시카고], 플라스마-라이트(PLASMA-LYTE) A[박스터(Baxter), 미국 일리노이주 디어필드], 수중 약 5% 덱스트로즈, 또는 링거(Ringer)의 락테이트가 포함된다. 하나의 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 인간 혈청 알부민으로 보충된다.

"효과량" 또는 "치료에 효과적인 양"은 개별체에서 암을 예방하거나 치료하기에 적절한 투약량을 지칭한다. 치료학적 또는 예방학적 용도에 효과적인 양은, 예를 들어, 치료되는 증상의 단계 및 위중성, 환자의 연령, 체중, 및 일반적 건강 상태, 및 처방 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 투약량의 크기는 또한 선택된 항-CD30 물질, 투여 방법, 투여 시간 및 빈도, 특별한 항-CD30 물질의 투여와 동반될 수 있는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도, 및 원하는 생리학적 효과에 의해 결정될 것이다. 당분야의 숙련가라면, 다양한 증상(예를 들어, 암)은, 아마도 각각의 투여 또는 다양한 투여 라운드에서 본 발명의 항-CD30 물질(들)을 사용하는 다중 투여를 비롯한 장기간의 치료를 필요로 할 수 있음을 인식할 것이다.

본 발명의 CAR 물질의 투약량은 또한 특별한 본 발명의 CAR 물질의 투여와 동반될 수 있는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다. 전형적으로, 담당 의사는, 다양한 인자, 예컨대 연령, 체중, 일반적 건강, 식이, 성별, 투여되는 본 발명의 CAR 물질, 투여 경로, 및 치료되는 증상의 위중성을 고려하여, 각각의 개별 환자를 치료하는 본 발명의 CAR 물질의 투여량을 결정할 것이다. 본 발명의 CAR 물질이 세포의 집단인 하나의 실시태양에서, 주입 당 투여되는 세포의 수는 다양할 수 있고, 예를 들어, 약 1 x 10⁶ 내지 약 1 x 10¹²개 세포 이상이다.

본 발명의 목적을 위해, 투여되는 본 발명의 항-CD30 물질의 양 또는 투약량은 합리적인 기간에 걸쳐 피험체 또는 포유동물에서 치료학적 또는 예방학적 반응에 영향을 주기에 충분해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD30 물질의 투약량은 CD30에 결합하거나, 투여 시간으로부터 약 2 시간 이상, 예를 들어, 약 12 내지 약 24 시간 이상의 기간에 증상을 치료하거나 예방하기에 충분해야 한다. 특정 실시태양에서, 시간 기간은 더 길 수 있다. 투약량은 특별한 본 발명의 항-CD30 물질의 효능 및 포유동물(예를 들어, 인간)의 증상, 뿐만 아니라 치료되는 포유동물(예를 들어, 인간)의 체중에 의해 결정될 것이다.

본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 CAR을 발현하는 소정의 상이한 투약량의 T-세포가 각각 제공되는 포유동물 집합 중에서, 포유동물에게 이러한 T-세포의 소정의 투약량을 투여할 경우, 본 발명의 CAR을 발현하는 T-세포에 의해 표적 세포가 용해되고/되거나 IFN-γ가 분비되는 정도를 비교함을 포함하는 검정은, 포유동물에게 투여되는 출발 투약량을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 용량의 투여시 표적 세포가 용해되고/되거나 IFN-γ가 분비되는 정도는 당분야에 공지된 방법에 의해 검정될 수 있다.

본 발명의 항-CD30 물질(들)이 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여되는 경우, 하나 이상의 추가적인 치료제는 포유동물에게 공-투여될 수 있다. "공-투여"는, 본 발명의 항-CD30 물질(들)이 하나 이상의 추가적인 치료제의 효과를 향상시키거나 그 반대이도록 하나 이상의 추가적인 치료제 및 본 발명의 CAR 물질(들)을 충분히 가까운 시간이내에 투여함을 의미한다. 이와 관련하여, 본 발명의 항-CD30 물질(들)이 우선 투여되고, 하나 이상의 추가적인 치료제가 두 번째로 투여되거나, 그 반대이다. 다르게는, 본 발명의 항-CD30 물질(들) 및 하나 이상의 추가적인 치료제는 동시에 투여될 수 있다. CAR-발현 세포 작용을 향상시킬 수 있는 추가적인 치료제는, 예를 들어, 하나 이상의 사이토킨 또는 하나 이상의 항체(예를 들어, PD-1 작용을 저해하는 항체)를 포함할 수 있다. 항-CD30 물질(들)과 공-투여될 수 있는 예시적인 치료제는 IL-2이다. 특별한 이론 또는 기작에 얽매이는 것은 아니지만, IL-2가 본 발명의 항-CD30 물질(들)의 치료학적 효과를 향상시킬 수 있는 것으로 여겨진다.

본 발명의 항-CD30 물질 및 약학 조성물은 포유동물에서 증상을 치료 또는 예방하는 방법에 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 특별한 이론 또는 기작에 얽매이는 것은 아니지만, 본 발명의 항-CD30 CAR은 생물 활성, 예를 들어, CD30을 인식하여, 항-CD30 CAR이 세포에 의해 발현될 경우 항-CD30 CAR이 특이적인 CD30을 발현하는 세포에 대하여 면역 반응을 중재할 수 있도록 하는 능력을 갖는다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 실시태양은 포유동물의 증상을 치료하거나 예방하는데 효과적인 양으로 본 발명의 임의의 CAR, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포의 집단, 및/또는 약학 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 증상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 증상은 CD30의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 임의의 증상일 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 증상은 암이다.

본 발명의 하나의 실시태양은 본 발명의 항-CD30 물질(들)을 투여하기 이전에 포유동물을 림프구고갈(lymphodepletion)시킴을 추가로 포함한다. 림프구고갈의 예로는, 제한되지 않지만, 비-골수절제성(nonmyeloablative) 림프구고갈 화학요법, 골수절제성 림프구고갈 화학요법, 전신 방사선 치료 등이 포함된다.

숙주 세포 또는 세포의 집단이 투여되는 본 발명의 방법의 목적을 위해, 세포는 포유동물에 대해 동종이형성 또는 자가유래성 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 포유동물에 대해 자가유래성이다.

본원에 지칭된 포유동물은 임의의 포유동물일 수 있다. 본원에 사용될 경우, 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 지칭하고, 제한되지 않지만, 설치목(Rodentia)의 포유동물, 예컨대 마우스 및 햄스터, 및 중치목(Logomorpha)의 포유동물, 예컨대 토끼가 포함된다. 포유동물은 식육목(Carnivora)으로부터일 수 있고, 예컨대 고양이과(고양이) 및 개과(개)가 포함된다. 포유동물은 소과(소) 및 돼지과(돼지)를 비롯한 우제목(Artiodactyla), 또는 말과(말)를 비롯한 기제목(Perissodactyla)일 수 있다. 포유동물은 영장목(Primate), 세보이드(Ceboid), 또는 시모이드(Simoid) 목(원숭이), 또는 유인원목(Anthropoid)(인간 및 유인원)일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

본 발명의 방법에 있어서, 암은 임의의 암일 수 있다. 바람직하게는, 암은 림프종이다. 특별히 바람직한 하나의 실시태양에서, 암은 B-세포 림프종[예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 원발성 종격동 B-세포 림프종(PMBL), 호지킨 림프종(HL), 비-호지킨 림프종, 종격동 그레이존 림프종, 및 결절 경화 HL] 또는 T-세포 림프종[예를 들어, 역형성 큰 세포 림프종(ALCL), 말초 T-세포 림프종-달리 명시되지 않음(PTCL-NOS), 및 혈관면역모세포성 T-세포 림프종(AITL), 및 기타 T-세포 림프종]이다. 바람직하게는, 암은 CD30의 발현 또는 과발현을 특징으로 한다.

용어 "치료" 및 "예방" 뿐만 아니라 이로부터 유래된 단어는, 본원에 사용될 경우, 필수적으로 100% 또는 완전한 치료 또는 예방을 내포하는 것은 아니다. 오히려, 당분야의 숙련가가 잠재적 이점 또는 치료학적 효과를 갖는 것으로 인식하는 치료 또는 예방의 다양한 정도가 존재한다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 포유동물에서 증상을 치료 또는 예방하는 임의의 수준의 임의의 양을 제공할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 치료 또는 예방은, 치료되거나 예방되는 하나 이상의 증상, 예를 들어, 암 또는 이러한 증상의 증후를 치료 또는 예방함을 포함할 수 있다. 또한, 본원에서 목적을 위해, "예방"은 증상, 예를 들어, 암의 개시, 또는 이의 증후 또는 증상을 지연시킴을 내포할 수 있다. 다르게는 또는 추가적으로, "예방"은 증상, 예를 들어, 암, 또는 이의 증후 또는 증상의 재발을 지연시킴을 내포할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CAR을 인코딩하는 핵산은 본원에 기재된 임의의 벡터내로 도입된다. 반대로, 벡터는 임의의 적합한 기법, 예를 들어, 유전자 편집, 형질감염, 형질전환, 또는 형질도입에 의해 본원에 기재된 임의의 숙주 세포(예를 들어, NK 세포 또는 T-세포)내로 도입될 수 있다. 많은 형질감염 기법은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 인산 칼슘 DNA 공-침전; DEAE-덱스트란; 전기천공; 양이온성 리포솜-중재된 형질감염; 텅스텐 입자-촉진된 미립자 충격; 및 인산 스트론튬 DNA 공-침전이 포함된다. 파아지(phage) 또는 바이러스 벡터는, 적합한 패키지 세포(이중 대부분은 상업적으로 입수가능함)에서 감염성 입자의 성장 이후 숙주 세포내로 도입될 수 있다.

본 발명의 CAR을 인코딩하는 벡터가 도입되어진 하나 이상의 단리된 숙주 세포(예를 들어, NK 세포 또는 T-세포)는, 본 발명의 항-CD30 CAR을 발현하는 조건하에 생체외 배양되고, 이어서 CD30-발현 암을 앓는 포유동물(바람직하게는 인간)에게 직접 전달될 수 있다. 이러한 세포 전달 방법은 당분야에 "입양 세포 이식(ACT: adoptive cell transfer)"으로서 지칭된다.

숙주 세포(예를 들어, T-세포 또는 NK 세포)가 포유동물에게 투여되는 경우, 세포는 포유동물에 대해 동종이형성이거나 자가유래성이다. "자가유래" 투여 방법에서, 세포는 포유동물로부터 제거되고, 저장되고(임의적으로 변형되고), 다시 동일한 포유동물에게 되돌려진다. "동종이형" 투여 방법에서, 포유동물은 유전적으로 유사하지만 동일하지 않은 공여체로부터의 세포를 수여받는다. 바람직하게는, 세포는 포유동물에 대해 자가유래성이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 포유동물에게 투여되는 세포는 유전자 편집을 겪는다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 포유동물에서 증상을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위하여 임의의 본 발명의 CAR, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포의 집단, 또는 약학 조성물을 제공하고, 이때 증상은 암이다. 암은 본원의 다른 양태에 대하여 본원에 기재된 임의의 암일 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 그의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

하기 물질 및 방법을 실시예 1 내지 11에 기재된 실험에서 이용하였다.

세포주 및 1차 세포

본 실험에 사용된 CD30⁺ 표적 세포는 CD30⁺ 림프종 세포주 SU-DHL-1[림프종, 미국 종균협회(ATCC: American Type Culture Collection)], HH(T-세포 림프종, ATCC), 및 HDLM-2(호지킨 림프종, DSMZ)였다. bv173으로 지칭되는 백혈병 세포주[아드리안 위스트너(Adrian Wiestner)로부터의 기증, NHLBI]에, 감마레트로바이러스 벡터 MSGV[후게스(Hughes) 등의 문헌 "Human Gene Ther., 16(4): 457-472 (2005)"]를 사용하여 CD30을 위한 유전자를 형질도입함으로써 또 다른 CD30⁺ 표적(CD30-bv173)을 제공하였다. 다음의 CD30-음성 세포주를 사용하였다: 백혈병 세포주 ngfr-bv173(MSGV 감마레트로바이러스 벡터를 사용함으로써 저-친화도 신경 성장 인자 유전자가 형질도입된 bv173), T-세포 백혈병 세포주 CCRF-CEM(ATCC), Saos-2(골육종 세포주, ATCC); A549(폐 암종 세포주, ATCC); MDA-MB231(유방암 세포주, ATCC), 293GP[인간 배아 신장 세포주, 스티븐 로젠버그(Steven Rosenberg)의 기증, 국립 암 연구소(NCI: National Cancer Institute)], TC71[유잉 육종(Ewings sarcoma) 세포주, S.A. 로젠버그로부터의 기증, NCI), COLO205(결장 암종 세포주, NCI 종양 저장소), U251(교모세포종 세포주, NCI 종양 저장소) 및 패널(Panel) 0.05(췌장 암종 세포주, ATCC). 환자로부터의 1차 인간 CD34⁺ 조혈 모세포를 또한 표적으로서 사용하였다. NCI IRB-승인된 임상 실험에 등록한 환자로부터의 조직 샘플 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 T-세포 배양을 개시하였다.

CD30 전사 복사물을 정량화하기 위한 실시간 qPCR

인간 정상적 정량적 폴리머라아제 연쇄 반응(qPCR: quantitative polymerase chain reaction) 어레이(array)[오리겐(Origene), 미국 메릴랜드주 락빌]에 포함된 48개의 인간 조직으로부터의 cDNA의 샘플에서 CD30 cDNA 복사물을, CD30-특이적 프라이머 및 탐침자 세트[인비트로겐(Invitrogen), 미국 매사추세츠주 왈탐]에 의해 qPCR을 수행함으로써 정량화하였다. 양성 대조군으로서, CD30⁺ 림프종 세포주 HH의 cDNA중의 CD30 cDNA 복사물을 정량화하였다. RNEASY 미니 키트[퀴아겐(Qiagen), 네덜란드 벤로]에 의해 형질세포종 세포로부터 RNA를 추출하고, cDNA를 표준 방법에 의해 합성하였다. CD30의 전장 cDNA를 인코딩하는 플라스미드(오리겐)의 희석물을 증폭시킴으로써 CD30 qPCR에 대한 표준 곡선을 생성하였다. qPCR은 반응당 CD30의 10 내지 10⁹개 복사물의 복사 수를 정확히 검출하였다. 동일한 조직에서 β-액틴 cDNA 복사물의 수를 타크만(TAQMAN) β-액틴 프라이머 및 탐침자 키트[어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드]에 의해 또한 정량화하였다. β-액틴 플라스미드의 일련의 희석물을 증폭시킴으로써 β-액틴 표준 곡선을 생성하였다. 모든 qPCR 반응을 로슈(Roche) 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)480 기기상에서 실행하였다. 데이터를 CD30 cDNA 복사물/100,000 액틴 cDNA 복사물로서 표시하였다.

항-CD30 키메라성 항원 수용체(CAR)의 작성

4개의 항-인간 CD30 항체의 서열을 환자들로부터 수득하였다. 사용된 특이적 항체 서열은 완전한 인간 5F11 및 17G1 항체(미국 특허 제7,387,776호), AC10 뮤린 항체(미국 특허출원공개 제2005/0123536 호), 및 인간화된 XmAb2513 항체(미국 특허출원공개 제2012/0014943호)였다. 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식성(transgeinc)인 HuMab 마우스를 백신처리함으로써 5F11 및 17G1 항체를 수득하였다. 마우스는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식성이므로, 마우스는 완전한-인간 항체를 생성한다. 마우스를 인간 CD30에 의해 백신처리함으로써 cAC1O 뮤린 항체를 수득하였고, XmAb2513은 cAC1O의 인간화된 형태이다. 이들 항체의 중쇄 및 경쇄 가변성-영역 서열을 사용하여 하기 패턴을 갖는 단일 쇄 가변성 단편(scFv)을 고안하였다: 경쇄 가변성 영역-연결기-중쇄 가변성 영역. 연결기는 다음의 아미노산 서열을 갖는다: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호 10)[코헨데르퍼(Kochenderfer) 등의 문헌 "J. Immunother., 32(7): 689-702 (2009)"].

고안된 제1의 항-CD30 CAR DNA를 5F11-CD8BBZ(서열번호 18)로 지정하였다. 이러한 CAR의 서열은 5' 단부로부터 3' 단부까지 다음의 패턴을 따른다: CD8α 리더 서열(서열번호 9), 5F11 scFv(서열번호 23), 인간 CD8α 분자의 힌지 및 TM 영역(서열번호 11), 4-1BB(CD137) 분자의 세포질 부분(서열번호 14), 및 CO3ζ 분자의 세포질 부분(서열번호 15). 5F11-CD8BBZ의 2가지 형태를 합성하였다. 하나의 형태는 N-말단 RFVSS 아미노산 서열(서열번호 19)을 함유하는 4-1BB 서열을 포함하고; 나머지 형태는 RFVSS 서열(서열번호 19)이 결핍되었다. 다음으로 고안된 CAR은, scFv가 17G1 항체로부터의 가변성 영역을 갖는다는 점을 제외하고 5F11-CD8BBZ와 동일하였다. 다음으로, 일련의 CD28-함유 CAR을 고안하였다. 5F11-CD8BBZ의 4-1BB 부분을 CD28 분자의 세포질 도메인(서열번호 12)으로 대체함으로써 5F11-CD828Z(서열번호 17)를 고안하였다. 다음으로 5F11-28Z(서열번호 16)를 고안하였다. 이러한 CAR은 5' 단부로부터 3' 단부까지 하기 패턴을 가졌다: CD8α 리더 서열(서열번호 9), 5F11 scFv(서열번호 23), 인간 CD28 분자의 힌지 및 TM 및 세포질 영역(서열번호 13), 및 CD3ζ 분자의 세포질 부분(서열번호 15). 5F11-28Z의 5F11 scFv를 AC10 또는 XmAb2513 scFv로 각각 대체함으로써 AC10-28Z 및 XmAb2513-28Z를 작성하였다.

합텐(hapten) 2,4,6-트리니트로페닐을 인식하는 SP6 scFv를 함유하는 음성-대조군 CAR을 또한 작성하였다[에쉬하르(Eshhar) 등의 문헌 "PNAS, 90(2): 720-724 (1993)"]. 이러한 CAR을 SP6-CD828Z로서 지칭하였다. SP6 CAR은 이전에 보고되었고, CD8α 힌지 및 TM 영역, CD28의 세포질 부분 및 CD3ζ 분자의 신호발송 도메인을 포함한다[카펜터(Carpenter) 등의 문헌 "Clin. Caner Res., 19(8): 2048-2060(2013)"]. SP6-CD828Z CAR은 뮤린 또는 인간 단백질을 인식하지 않고, 이를 음성 대조군으로서 사용하였다.

모든 CAR 서열을 인코딩하는 DNA를 코돈 최적화하고(co), 인비트로겐[진아트(GeneArt)]에 의해 적절한 제한 자리를 갖도록 합성하였다. CAR 서열을 pRRLSIN.cPPT.MSCV.coDMF5.oPRE로 지정된 렌티바이러스 벡터 플라스미드에 결찰시켰다[양(Yang) 등의 문헌 "J. Immunother., 33(6): 648-658(2010)"]. 이러한 벡터의 coDMF5 부분을 표준 제한 효소 및 결찰 방법에 의해 CAR 서열로 대체하였다.

렌티바이러스 상청액 생산

이전에 공개된 프로토콜을 약간 수정함으로써, 각각의 CAR을 인코딩하는 렌티바이러스를 포함하는 상청액을 생산하였다[양(Yang) 등의 문헌 "J. Immunother., 33(6): 648-658(2010)"]. 상청액을 생산하기 위해, 293T-17 세포(ATCC)를 이전에 상세화된 바와 같이 하기 플라스미드로 형질감염시켰다: pMD2.G(수포성 구내염 바이러스 외피를 인코딩함), pMDLg/pRRE(gag 및 pol을 인코딩함), pRSV-Rev(Rev를 인코딩함), 및 적절한 CAR-인코딩 플라스미드[양(Yang) 등의 문헌 "J. Immunother., 33(6): 648-658(2010)"]. 형질감염 이후, 형질감염된 293T-17 세포를 약 40 시간 동안 배양하였다. 이어서 배양 상청액을 수집하고 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 이어서 메르크 밀리포어 리미티드(Merk Millipore Ltd.)(미국 매사추세츠주 빌레리카)로부터의 아미콘(AMICON) 울트라(Ultra)-15 한외여과기 유닛을 사용하여 상청액을 한외여과하였다.

T-세포 형질도입

T-세포를 이전에 기재된 것과 유사한 방식으로 배양하였다[코헨데르퍼(Kochenderfer) 등의 문헌 "J. Immunother., 32(7): 689-702 (2009)"]. 간단히, 5% 인간 AB 혈청[밸리 바이오메디칼(Valley Biomedical), 미국 버지니아주 윈체스터] 및 300 국제 단위(IU: international unit)/mL의 인터류킨(interleukin)-2[IL-2, 키 론(Chiron), 미국 캘리포니아주 에메리빌]가 함유된 AIM V 배지(인비트로겐)에서 항-CD3 단일클론성 항체 OKT3[오르토(Ortho), 미국 뉴욕주 로체스터]에 의해 PBMC를 자극시켰다. 배양한지 22 내지 26 시간 후, 활성화된 PBMC를 계수하고 원심분리하였다. 세포를 원심분리한 후, 배양 배지를 펠릿화된 세포로부터 제거하고 저장하였다. 세포를 배양이 개시된 동일한 배지에서 재현탁시켰고(1 x 1O⁶개의 세포/mL), 렌티바이러스 벡터를 프로타민황산염(protamine sulfate)과 함께 배지에 첨가하였다. 세포를 6-웰 조직 배양 플레이트[코닝(Corning), 미국 뉴욕주 코닝]에서 4 x 10⁶개의 T-세포/웰로 배양하였다. 이어서 세포를 약 48 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서 세포를 원심분리하고, 따라 붓고, 배양을 위해 5% 인간 AB 혈청 + 300 IU/mL의 IL-2가 보충된 신선한 AIM V 배지에 0.5 x 10⁶/mL로 재현탁시켰다. 세포 농도를 2 내지 3 일 마다 0.5 x 1O⁶개의 T-세포/mL로 조정하였다.

단백질 L 염색에 의한 형질도입된 T-세포상에서의 CAR 검출

세포를 세척하고 형광-활성화된 세포 분류(FACs: fluorescence-activated cell sorting) 완충액[인산염-완충된 염수(PBS: phosphate-buffered saline) + 0.1% 아지드화 나트륨 및 0.4% 소 혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin)]에 현탁시켰다. 비오틴-표지화된 단백질 L[진스크립트(GenScript), 미국 뉴저지주 피스카타웨이]을 첨가하여 세포 표면 CAR scFv를 검출하였다. 세포를 4℃에서 30 분 동안 항온처리하고 2회 세척하였다. 세포를 FACs 완충액에 현탁시키고 정상적 마우스 IgG(인비트로겐)로 차단하였다. 이어서 세포를 파이코에리트린(PE: phycoerythrin)-표지화된 스트렙타비딘(streptavidin)[비디 파르민겐(BD Pharmingen), 미국 캘리포니아주 산 호세], 항-CD4[이바이오사이언스(eBioscience), 미국 캘리포니아주 샌 디에고], 항-CD8(이바이오사이언스), 항-CD30(비디 파르민겐) 및 항-CD3(이바이오사이언스)으로 염색시켰다. LSR II 유세포분석기[비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스]에 의해 유세포분석 수집을 수행하였고, 플로우조(FLOWJO) 소프트웨어[트리스타 인코포레이티드(Treestar, Inc.), 미국 오레곤주 애쉬랜드]에 의해 분석을 수행하였다. 단백질 L로 염색된 CAR-형질도입된 배양액중 T-세포의 백분율로부터, 각각의 실험에서 단백질 L로 염색된 동일한 공여체로부터의 동일하게-배양된 형질도입되지 않은 T-세포의 백분율을 뺀 값으로서 CAR-발현(CAR⁺) T-세포의 백분율을 계산하였다. 비디 바이오사이언시즈로부터의 항-CD30 항체에 의해 표준 방법을 사용하여 CD30을 위해 T-세포를 염색시켰다.

인터페론(Interferon)-γELISA

CD30⁺ 또는 CD30-음성 표적 세포를 5% 인간 혈청이 보충된 AIM-V 배지중 96-웰 환저 플레이트의 2중 웰에서 CAR-형질도입된 T-세포와 합하였다. 플레이트를 37℃에서 18 내지 20 시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, IFNγ를 위한 ELISA를 표준 방법에 의해 수행하였다[피어스(Pierce), 미국 매사추세츠주 왈탐].

CD107a 검정

시험된 각각의 T-세포 배양을 위하여, 2개의 시험관을 제조하였다. 하나의 시험관은 CD30⁺ 표적 세포를 함유하였고, 나머지 시험관은 CD30-음성 표적 세포를 함유하였다. 시험관 둘 다 CAR-형질도입된 T-세포, 5% 인간 AB 혈청이 보충된 1 mL의 AIM-V 배지, 적정된 농도의 항-CD107a 항체(이바이오사이언스, 클론 eBioH4A3), 및 1 μL의 골기스탑(GOLGISTOP) 단백질 수송 저해제[모네신(monesin), 비디 바이오사이언시즈]를 함유하였다. 모든 시험관을 37℃에서 4 시간 동안 항온처리하고, 이어서 CD3, CD4, 및 CD8에 대해 염색시켰다.

증식 검정

배양액을 24-웰 플레이트에 제공하였다. 배양액에 포함된 표적 세포는 0.5 x 10⁶개의 방사선조사된 CD30⁺ 세포 또는 0.5 x 10⁶개의 방사선조사된 CD30-음성 세포였다. 배양액은 또한 항-CD30 CAR을 발현하는 배양액으로부터의 0.75 x 10⁶개의 T-세포를 포함하였다. T-세포를 이전에 기재된 바와 같이[매너링(Mannering) 등의 문헌 "J. Immunol. Methods, 283(1-2): 173-183(2003)], 카복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFSE, 인비트로겐)로 표지화하였다. 배양액에 사용된 배지는 5% 인간 AB 혈청이 보충된 AIM V였다. IL-2를 배지에 첨가하지 않았다. 개시후 4 일째, 죽은 세포를 배제하기 위해 각각의 배양액중 살아있는 세포를 트립판 블루(trypan blue)에 의해 계수하고, "단백질 L 염색에 의한 형질도입된 T-세포상에서의 CAR 검출"하에 기재된 바와 같이 유세포분석을 수행하였다.

세포독성 검정

세포독성 검정을 이전에 기재된 바와 같이 실행하였다[코헨데르퍼(Kochenderfer) 등의 문헌 "J. Jmmunother., 32(7): 689-702(2009)"]. 음성-대조군 CCRF-CEM 세포의 생존에 대하여 CD30⁺ HH 림프종 세포의 생존을 비교함으로써 세포독성을 측정하였다. 이들 세포 유형 둘 다를 동일한 시험관에서 CAR-형질도입된 T-세포와 합하였다. CCRF-CEM 음성 대조군 세포를 형광 염료 5-(및-6)-(((4-클로로메틸)벤조일)아미노)테트라메틸로다민(CMTMR)(인비트로겐)으로 표지화하고, CD30⁺ HH 림프종 표적 세포를 CFSE로 표지화하였다. T-세포 + 표적 세포 배양액을 다수의 T-세포 대 표적 세포 비로 2중으로 멸균성 5 mL 시험관(BD)에 제공하였다. 시험관에 함유된 표적 세포는 50,000개의 CCRF-CEM 음성-대조군 세포와 함께의 50,000개의 CD30⁺ HH 세포였다. 배양액을 4 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리후 즉시, 7AAD(7-아미노-액티노마이신 D)(BD)를 첨가하고 유세포분석 수집을 수행하였다. 각각의 T-세포 + 표적-세포 배양액에 대하여, 살아있는 HH 세포의 퍼센트를 살아있는 CCRF-CEM 음성 대조군 세포의 퍼센트로 나눔으로써 CD30⁺ HH 표적 세포의 생존율을 결정하였다. 각각의 T-세포 + 표적 세포 배양액중 HH 표적 세포의 생존율을 효과자 T-세포의 부재하에 HH 표적 세포 및 CCRF-CEM 세포만을 함유하는 시험관에서의 살아있는 CCRF-CEM 음성-대조군 세포의 퍼센트로 나눠줌으로써 HH 표적 세포의 보정된 생존율을 계산하였다. 이러한 보정은 출발된 세포 수에서의 다양성 및 자발적 표적 세포 사멸을 해명하기 위해 필수적이다. 세포독성을 다음과 같이 계산하였다: CD30⁺ HH 표적 세포의 세포독성률 = 100 - CD30⁺ HH 표적 세포의 보정된 생존율.

실시예 1

본 실시예는 CD30 RNA가 정상적 인간 조직에서 존재하지 않거나 매우 낮은 수준으로 발현되었음을 입증한다.

CD30 발현에 대한 분석을 48개의 정상적 인간 조직의 RNA로부터 제조된 cDNA 샘플의 패널(panel)상에서 qPCR에 의해 수행하였다(도 1A 및 1B). 결과는 CD30이 정상적 인간 조직에서 존재하지 않거나 매우 낮은 수준으로 발현되었음을 보여준다. 이들 qPCR 결과는 다른 연구자들에 의해 수행된 광범위한 이전의 면역조직화학 연구와 일치하였다[슈바르팅(Schwarting) 등의 문헌 "Blood, 74(5): 1678-1689(1989)"; 이토(Ito) 등의 문헌 "American J. Pathol, 145(2): 276-280(1994)"; 팔리니(Falini) 등의 문헌 "Blood, 85(1): 1-14(1995)"]. 주목할만하게, qPCR에 의해 검출된 CD30 RNA 발현을 낮은 수준으로 갖는 소수의 기관은 다른 연구자들에 의해 수행된 실험에서 면역조직화학에 의해서는 CD30에 대해 음성이었다[슈바르팅(Schwarting) 등의 문헌 "Blood, 74(5): 1678-1689(1989)"; 이토(Ito) 등의 문헌 "American J. Pathol, 145(2): 276-280(1994)"; 팔리니(Falini) 등의 문헌 "Blood, 85(1): 1-14(1995)"]. 이러한 이전의 면역조직화학 연구는 임신한 자궁의 탈락막 세포를 제외한 대다수의 인간 기관의 세포상에서 CD30이 발현되지 않았음을 보여주었다[이토(Ito) 등의 문헌 "American J. Pathol, 145(2): 276-280(1994)"].

실시예 2

본 실시예는 세포주, 1차 인간 CDD34⁺ 세포, 및 1차 인간 말초 혈액 단핵 세포의 표면상에서의 CD30 발현의 존재 또는 부재를 입증한다.

다른 연구자들은 호지킨 림프종, 역형성 큰 세포 림프종, 일부 B-세포 림프종, 및 몇몇 유형의 T-세포 림프종을 비롯한 몇몇 상이한 유형의 림프종의 표면상에서 CD30을 검출하였다[스타인(Stein) 등의 문헌 "Blood, 66(4): 848-858(1985)"; 슈바르팅(Schwarting) 등의 문헌 "Blood, 74(5): 1678-1689(1989)"; 팔리니(Falini) 등의 문헌 "Blood, 85(1): 1-14(1995)"]. CD30 발현을 유세포분석에 의한 일련의 세포주의 표면상에서 검정하였다. 일부 세포주, 예컨대 HH 림프종 세포주가 높은 수준으로 CD30을 발현한 것으로 밝혀졌다. 몇몇 다른 세포주, 예컨대 COLO205 세포주는 CD30을 발현하지 않았다. ngfr-bv173 세포주는 CD30을 발현하지 않았다. CD30-bv173 세포주(이는 CD30을 발현하도록 형질도입됨)는 CD30을 발현하였다. CD30 발현을 또한 1차 인간 CDD34⁺ 세포, 및 1차 인간 말초 혈액 단핵 세포에 대하여 평가하였고; CD34⁺ 세포와 PBMC는 둘 다 CD30을 발현하지 않았다.

실시예 3

본 실시예는 CAR의 T-세포 표면 발현을 입증하고, 각각의 CAR은 5F11, AC10, 및 XmAb2513 항체로부터 유래된 scFv중 하나를 혼입한다.

각각의 4가지 상이한 항-CD30 단일-쇄 가변성 단편(scFv)중 하나를 혼입하는 CAR을 생성하였다. 이들 scFv는 4가지 상이한 단일클론성 항체, 17G1, 5F11, AC10, 및 XmAb2513으로부터 유래되었다. 17G1-유래된 scFv를 혼입하는 CAR은 T-세포상에서 높은 수준으로 발현되지 않았고, 광범위하게 연구되지 않았다. 각각의 5F11, AC10, 및 XmAb2513 항체중 하나로부터 유래된 scFv를 혼입하는 CAR을 시험관내에서 광범위하게 연구하였다. 상이한 scFv를 평가하기 위해, CD28 보조자극 분자 및 CD3ζ T-세포 활성화 분자로부터의 힌지, TM 및 세포질 영역을 C-말단에서 갖는 CAR 고안물을 사용하였다.

우선, 각각의 5F11, AC10, 및 XmAb2513 항체중 하나로부터 유래된 scFv를 혼입한 CAR의 T-세포 표면 발현을 유세포분석에 의해 비교하였다. 인간 T-세포를 0 일째 항-CD3 항체 OKT3으로 자극하였다. 1 일째, 5F11-28Z, AC10-28Z, 또는 XmAb2513-28Z를 인코딩하는 렌티바이러스를 T-세포에 형질도입하였다. 대조군으로서, 일부 T-세포를 형질도입하지 않은 채로 두었다. T-세포를 IL-2-함유 배지에서 증식시켰다. 7 일째, 세포를 단백질 L, CD3, CD4, CD8, 및 CD30으로 염색시키고, 유세포분석에 의해 분석하였다. 3가지 CAR 모두가 높은 수준으로 T-세포상에서 발현되었고, 3가지 상이한 CAR의 표면 발현 수준은 거의 동일하였다. CD8 및 CAR을 발현하는 세포의 백분율은 표 A에 제시된다. 도표는 살아있는 CD3⁺ 림프구에 대하여 제한되었다. 유사한 결과가 2명의 상이한 환자로부터의 세포에 의해 수득되었다.

[표 A]

실시예 4

본 실시예는 5F11-28Z CAR을 발현하는 T-세포가 AC10-28Z CAR 또는 XmAb2513 CAR을 발현하는 T-세포에 비해 기능적으로 더 우수함을 입증한다.

활성화된 T-세포가 CD30을 발현하고[호리에(Horie) 등의 문헌 "Seminars in immunology, 10(6): 457-470(1998)"], 이에 따라 CD30⁺ T-세포의 제거가 항-CD30-CAR-발현 T-세포의 배양물에서 일어나는 것이 가능하므로, CD30을 발현하는 전체 T-세포의 백분율을 평가하였다. CD30을 발현하는 전체 T-세포의 백분율은 실시예 3에서 CAR 발현을 평가하기 위해 사용된 것과 동일한 T-세포 배양액으로 평가하였다.

CD30⁺ T-세포는 AC10-28Z-형질도입된 T-세포, XmAb2513-28Z-형질도입된 T-세포, 및 형질도입되지 않은 T-세포의 배양액과 비교하여 5F11-28Z-형질도입된 T-세포의 배양물에서 크게 감소한 것으로 밝혀졌다. CD8 및 CD30을 발현하는 세포의 백분율은 표 B에 제시된다. 도표는 살아있는 CD3⁺ 림프구에 대하여 제한되었다. 표 B는, 형질도입되지 않은 T-세포, 또는 AC10-28Z 또는 XmAb-28Z를 인코딩하는 유전자가 형질도입된 T-세포와 비교하여 5F11-28Z를 위한 유전자가 형질도입된 T-세포에서 CD30을 발현하는 세포의 백분율이 훨씬 더 낮았음을 보여준다. 유사한 결과가 6개의 실험에서 수득되었다. 이들 결과로부터, 5F11-28Z-형질도입된 T-세포는 배양액으로부터 CD30⁺ T-세포를 제거하는데 있어서 AC10-28Z-형질도입된 T-세포 또는 XmAb2513-28Z-형질도입된 T-세포에 비해 더욱 효과적임을 알 수 있었다.

[표 B]

실시예 2의 실험 및 표 A에서 평가된 동일한 배양액으로부터의 세포를 탈과립화(degranulation)에 대해 평가하였다. T-세포를 CD30⁺ 표적 세포 SUDHL-1과 함께 4 시간 동안 배양하였다. CD107a 분자는 T-세포 탈과립화의 표지이다. 탈과립화를 검출하기 위해 배양액에 CD107a에 대한 항체를 포함시켰다. 세포를 또한 CD3 및 CD8에 대해 염색시켰다. 도표는 살아있는 CD3⁺ 림프구에 대하여 제한되었다.

표 C는 CD8 및 CD107a를 발현하는 세포의 백분율을 제시한다. 표 C에 제시된 바와 같이, AC10-28Z 또는 XmAb2513-28Z-형질도입된 세포와 비교하여 5F1l-28Z-형질도입된 T-세포에 의해 더 큰 CD30-특이적 탈과립화가 나타났다. 유사한 결과가 2개의 상이한 공여체로부터의 세포에 의해 수득되었다.

[표 C]

표적 세포와의 공-배양시의 CD30-특이적 인터페론-감마(IFNγ) 방출을 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA: enzyme-linked immunosorbant assay)에서 측정하였다. 5F11-28Z-형질도입된 T-세포는 AC10-28Z 또는 XmAb2513-28Z-형질도입된 세포와 비교하여 더 큰 CD30-특이적 IFNγ 방출을 나타내었다(표 D-1). 표 D-1에서 SUDHL-1, HH, 및 CD30-bv173은 CD30⁺ 세포주이다. 표 D-1에서 NGFR-bv173 및 CCRF-CEM은 CD30-음성 세포주이다. 표 D-1에서의 값은 배양 기간의 종결시 방출된 IFNγ의 pg/mL이다. CAR-형질도입된 T-세포 및 형질도입되지 않은 T-세포를 단백질 L로 염색시키고 각각의 CAR-형질도입된 T-세포 집단의 단백질 L 염색률(%)로부터 형질도입되지 않은 T-세포의 단백질 L 염색률(%)을 차감함으로써 각각의 CAR을 발현하는 T-세포의 백분율(표 D-2)을 결정하였다.

이들 결과로부터 5F11-28Z를 발현하는 T-세포가 AC10-28Z 또는 XmAb2513을 발현하는 T-세포에 비해 기능적으로 더 우수한 것으로 확인되었다.

[표 D-1]

[표 D-2]

실시예 5

본 실시예는 5F11-28Z 및 5F11-CD828Z CAR의 CD30-특이적 작용을 입증한다.

5F11 scFv를 포함하는 T-세포가 기능적으로 더 우수하기 때문에, 추가의 실험을 이러한 CAR에 의해 실행하였다. 5F11 scFv를 포함한 3개의 CAR을 고안하였다(도 2A 내지 2C). 5F11-28Z 및 5F11-CD828Z의 CD30-특이적 작용을 IFNγ ELISA 검정에서 확인하였다(표 E-1). CAR을 발현하는 T-세포를 표 E-1에서의 표적 세포와 함께 하룻밤 배양하고, 이어서 IFNγ ELISA를 수행하였다. 표 E-1에서 SUDHL-1 및 HDLM-2는 CD30⁺ 세포주이다. 표 E-1에서 NGFR-bv173, CCRF-CEM, 및 293GP는 CD30-음성 세포주이다. 표 E-1에서의 값은 배양 기간의 종결시 방출된 IFNγ의 pg/mL이다. CAR-형질도입된 T-세포 및 형질도입되지 않은 T-세포를 단백질 L로 염색시키고 각각의 CAR-형질도입된 T-세포 집단의 단백질 L 염색률(%)로부터 형질도입되지 않은 T-세포의 단백질 L 염색률(%)을 차감함으로써 각각의 CAR을 발현하는 T-세포의 백분율을 결정하였다(표 E-2).

[표 E-1]

[표 E-2]

실시예 6

본 실시예는 5F11-28Z 및 5F11-CD828Z CAR이 5F11-CD8BBZ CAR과 비교할 경우 더 우수한 CD30-특이적 활성을 제공함을 입증한다.

T-세포를 3가지 상이한 CAR, 5F11-28Z, 5F11- CD828Z, 또는 5F11-CD8BBZ중 하나로 형질도입하였다. CAR-형질도입된 T-세포를 CD30⁺ 표적 세포 CD30-bv173 또는 CD30-음성 세포주 ngfr-bv173과 함께 4 시간 동안 배양하였다. 탈과립화를 검출하기 위해 배양액에 CD107a에 대한 항체를 포함시켰다. 세포를 또한 CD3 및 CD8에 대해 염색시켰다. 도표는 살아있는 CD3⁺ 림프구에 대하여 제한되었다.

4-1BB-함유 CAR 5F11-CD8BBZ와 비교하여, CD28-함유 CAR 5F11-28Z 및 5F11-CD828Z는 CD30⁺ 표적 세포에 대하여 더욱 큰 정도로 탈과립화시켰고; 더욱이, 5F11-CD8BBZ와 비교하여, CD28-함유 CAR은 CD30-음성 표적에 대하여서는 배경 탈과립화가 더 적었다(표 F-1 및 F-2). 표 F-1은 CD30⁺ 표적 세포 CD30-bv173과의 공-배양시 CD8 및 CD107a를 발현하는 세포의 백분율을 제시한다. 표 F-2는 CD30-음성 세포주 ngfr-bv173과의 공-배양시 CD8 및 CD107a를 발현하는 세포의 백분율을 제시한다. 유사한 결과가 2개의 상이한 공여체에서 보여졌다. 본 실험에서 사용된 T-세포의 세포 표면 CAR 발현은: 5F11-28Z의 경우 95.8%; 5F11-CD828Z의 경우 96.0%; 5F11-CD8BBZ의 경우 93.2%였다.

[표 F-1]

CD30-bv173 표적

[표 F-2]

Ngfr-bv173 표적

유사하게, 항원-특이적 IFNγ 생산을 평가하였고, 5F11-28Z CAR을 발현하는 T-세포는 CD30⁺ 표적 세포와 함께 배양되는 경우 가장 많은 IFNγ를 생산하였다. 4-1BB 작용기(moiety)를 포함하는 CAR을 발현하는 T-세포와 비교할 경우, 5F11-28Z 또는 5F11-CD828Z를 발현하는 T-세포는 CD30-음성 표적에 대하여 더 적은 배경 IFNγ를 생산하였다(표 G). 표 G에서 HH는 CD30⁺ 림프종 세포주이다. 표 G에서 A549, TC71, So18, Panc10.05, 및 MDA231은 CD30-음성 세포주이다. 1차 CD34+ 조혈 모세포를 또한 포함시켰다(표 G). 유세포분석으로 측정할 경우 표 G에서 95.8%의 5F11-28Z T-세포가 CAR을 발현시켰다.

[표 G]

CD28-함유 CAR의 CD30-특이적 활성이 4-1BB-함유 CAR의 CD30-특이적 활성에 비해 더 우수하므로, 5F11-28Z 및 5F11-CD828Z는 추가의 개발을 위해 가장 유망한 CAR인 것으로 결론지어졌다. 모든 실험을 분석하였을 때, 5F11-CD828Z 또는 5F11-CD8BBZ를 발현하는 T-세포와 비교하여, 5F11-28Z CAR을 발현하는 T-세포는 CD30⁺ 표적 세포의 가장 강력한 인식을 나타내었다(표 D-1, D-2, E-1, E-2, 및 G).

실시예 7

본 실시예는 5F11-28Z CAR을 발현하는 T-세포가 CD30-특이적 방식으로 시험관내에서 증식함을 입증한다.

5F11-28Z를 발현하는 T-세포를 형광 염료 CFSE로 표지화하였고, 이는 세포가 증식함에 따라 희석되었다. 도 3에서, 5F11-28Z T-세포를 CD30-bv173 세포와 함께 배양한 경우(CD30⁺, 충전된 흑색 히스토그램), 5F11-28Z-형질도입된 T-세포를 음성 대조군 NGFR-bv173 세포와 함께 배양한 경우(CD30-음성, 비어 있는 히스토그램)에 비해 CFSE는 더 큰 정도로 희석되었다. 따라서, 5F11-28Z CAR을 발현하는 T-세포는 CD30-특이적 방식으로 시험관내에서 증식하였다(도 3). 도표는 살아있는 CD3⁺, CAR-발현 림프구에 대해 제한되었다. 유사한 결과가 4개의 상이한 실험에서 수득되었다.

실시예 8

본 실시예는 배양액에서 항-CD30-CAR-형질도입된 T-세포의 수가 임상적 입양 세포 이식을 위해 충분한 세포를 수득하기에 충분하도록 확장됨을 입증한다.

활성화된 T-세포는 CD30을 발현하고, 항-CD30 CAR을 발현하는 T-세포를 함유한 T-세포 배양액은 형질도입되지 않은 T-세포의 배양액과 비교하여 CD30⁺ T-세포의 수가 감소하였다. 항-CD30-CAR-형질도입된 T-세포 배양액에서 CD30⁺ T-세포의 이러한 감소된 수는 CAR-발현 T-세포에 의한 CD30⁺ T-세포의 제거에 기인하는 것으로 보였다. 항-CD30-CAR-형질도입된 T-세포가 CAR T-세포 치료법의 임상적 실험에서 정상적으로 투여될 경우 10⁸ 내지 10⁹개의 T-세포를 생성하기에 충분히 증식하고 생존할 수 있는지의 여부를 결정하고자 하였다.

0 일째 T-세포 배양을 OKT3 자극에 의해 개시하였다. 배양 1 일째 T-세포를 형질도입하지 않은 채로 두거나 5F11-28Z, AC10-28Z, 또는 XmAb2513-28z로 형질도입하고, IL-2-함유 배지에서 시험관내 증식시켰다. 살아있는 전체 세포를 트립판 블루에 의한 광 현미경에 의해 계수하였다. 모든 3가지 CAR에 있어서, 단백질 L 염색에 의해 검출될 경우 각각의 CAR로 형질도입된 T-세포의 90% 이상은 T-세포 표면상에서 CAR을 발현하였다. 2개의 상이한 공여체로부터의 세포에 의한 결과가 각각 도 4A 및 4B에 제시된다. AC10-28Z 및 XmAb2513-28Z CAR T-세포 배양액을 배양 9 일째 의도적으로 종결시켰고, 5F1l-28Z-형질도입된 배양액 및 형질도입되지 않은 배양액을 11 일째 의도적으로 종결시켰다.

별도의 실험에서, 0 일째 T-세포 배양을 OKT3 자극에 의해 개시하였다. T-세포를 형질도입하지 않은 채로 두거나 5F11-CD8-28Z, 5F11-CD8-BBZ, 또는 5F11-28Z로 형질도입하고, IL-2-함유 배지에서 시험관내 증식시켰다. 살아있는 전체 세포를 트립판 블루에 의한 광 현미경에 의해 계수하였다. 모든 3가지 CAR에 있어서, 단백질 L 염색에 의해 검출될 경우 각각의 CAR로 형질도입된 T-세포의 90% 이상이 T-세포 표면상에서 CAR을 발현하였다. 2개의 상이한 공여체로부터의 결과가 각각 도 5A 및 5B에 제시된다.

반복된 실험에서, 배양액중 항-CD30-CAR-형질도입된 T-세포의 수는 임상적 입양 세포 이식을 위해 충분한 세포를 수득하기에 충분하도록 확장되는 것으로 보여졌다(도 4A, 4B, 5A 및 5B).

실시예 9

본 실시예는 5F11-28Z-형질도입된 T-세포가 CD30⁺ HH 림프종 세포를 시험관내에서 사멸시킬 수 있음을 입증한다.

5F11-28Z-발현 T-세포가 CD30⁺ HH 림프종 세포주 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있음을 보여주는 시험관내 유세포분석 세포독성 검정을 수행하였다. 검정은 4-시간의 항온처리 기간을 가졌다. 도 6에 제시된 바와 같이, 5F11-28Z-형질도입된 T-세포는 CD30⁺ HH 림프종 세포를 시험관내에서 사멸시킬 수 있음이 확립되었다.

실시예 10

본 실시예는 5F11-28Z 및 5F11-CD828Z를 발현하여 종양을 생체내에서 근절하는 T-세포의 능력을 입증한다. 본 실시예는 또한 5F11-28Z 및 5F11-CD828Z를 발현하는 T-세포로 치료된 종양-함유 마우스가 종양의 재발 없이 장기간 생존함을 입증한다.

5F11-28Z 및 5F11-CD828Z를 발현하여 종양을 생체내에서 근절하는 T-세포의 능력을 평가하였다. CD30⁺ HH 림프종 세포의 피하 종양을 면역시스템이 손상된 NOD/SCID 공통 감마 쇄-결핍(NSG) 마우스에서 확립하였다. 4 일후, 5F11-28Z 또는 5F11-CD828Z 또는 SP6-CD828Z가 형질도입된 동일한 공여체로부터의 8 x 10⁶개 T-세포의 단일 정맥내 주입에 의해 마우스를 치료하였다. 마우스의 4번째 그룹을 치료하지 않은 채로 두었다. SP6-CD828Z는 인간 또는 뮤린 단백질을 인식하지 않는 CAR이다. SP6-CD828Z를 음성 대조군으로서 사용하였다. 각각의 그룹은, 9 마리의 마우스를 함유한 치료되지 않은 그룹을 제외하고 10 마리의 마우스를 포함하였다. 각각의 실험은 상이한 정상적 공여체로부터의 T-세포를 사용하였다.

결과는 도 7A 및 7B에 제시된다. 종양은 5F11-28Z 또는 5F11-CD828Z를 발현하는 T-세포를 수여받은 마우스에서 완전히 근절되었고; 대조적으로, SP6-CD828Z-형질도입된 T-세포를 수여받은 마우스 및 치료되지 않은 마우스에서는 종양 성장이 진행되었다(도 7A). 유사하게, 5F11-28Z 또는 5F11-CD828Z가 형질도입된 T-세포를 수여받은 마우스는 모두 종양이 재발되지 않고 장기간 생존하였고; 대조적으로, 치료되지 않은 마우스 및 SP6-CD828Z-형질도입된 T-세포를 수여받은 마우스는 진행성 종양에 의해 사망하였다(도 7B). 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법에 의해 생존율을 계산하였다.

실시예 11

본 실시예는 항-CD30 CAR이 가용성 CD30의 존재에도 불구하고 종양을 근절시키는데 효과적임을 입증한다.

CD30은 CD30⁺ 림프종을 앓는 일부 환자에서 CD30⁺ 악성 세포에 의해 쉐딩(shedding)된다[비스코(Visco) 등의 문헌 "European J. Haematol., 77(5): 387-394(2006); 피졸로(Pizzolo) 등의 문헌 "British J. Haematol, 75(2): 282-284(1990)"]. 따라서, 표적 세포를 인식하는 항-CD30 CAR의 능력에 대한 가용성 CD30의 영향을 평가하였다. 5F11-28Z CAR을 발현하는 형질도입된 T-세포 또는 형질도입되지 않은 T-세포를 표 H에 지시된 표적 세포와 함께 하룻밤 배양하고, 이어서 표준 IFNγ ELISA를 수행하였다. 표 H에서 HH 세포는 CD30⁺ 세포주이다. μg/mL가 수반되는 표 H에서의 수(표 H의 가장 왼쪽 칼럼)는 T-세포 및 표적 세포가 함께 배양되는 전체 시간 동안 배지에 첨가되는 인간 CD30 단백질의 농도를 지칭한다. 표 H에서 U251 및 Colo-205는 CD30-음성 세포주이다. 표 H의 가장 오른쪽 2개의 칼럼에서 수는 배양 기간의 종료시 방출되는 IFNγ의 pg/mL 수이다. 유세포분석에 의해 측정할 경우 표 H에서 5F11-28Z T-세포의 94.8%가 CAR을 발현하였다.

[표 H]

표 H는, 고농도의 가용성 CD30 단백질을 표적 세포 및 5F11-28Z-발현 T-세포가 함유된 배지에 첨가하는 것이 CD30⁺ 표적 세포를 인식하는 CAR T-세포의 능력을 차단하지 않았음을 제시한다. 혈청 및 림프종 덩어리에서의 CD30 단백질의 농도에 대한 이전의 추정값은 표 H의 배양액에 첨가할 CD30 단백질의 농도의 선택을 안내한다[나가타(Nagata) 등의 문헌 "PNAS, 102(22): 7946-7951(2005)"]. 항-CD30 CAR이 가용성 CD30의 존재에도 불구하고 종양을 근절하는데 효과적일 수 있다는 추가의 증거는 실시예 10의 뮤린 실험에 의해 제공된다. CD30은 ELISA에 의해 4 HH 종양-함유 마우스의 혈청에서 77 유닛/mL의 평균 농도로 검출되었고, 이는 약 11 ng/mL에 상응한다. HH 세포에 의한 CD30의 쉐딩에도 불구하고, HH 종양은 도 7A에 도시된 바와 같이 마우스에서 근절되었다.

실시예 12

본 실시예는 5F11-CD28Z가 형질도입된 세포의 투약량-적정을 나타낸다.

면역시스템이 손상된 NSG 마우스에게 고형 덩어리가 형성되는 방식으로 4 x 10⁶개 HH 세포를 이식시켰다. 이어서 마우스를 6 x 10⁶개의 형질도입되지 않은 T-세포의 단일 주입 또는 5F11-CD28Z가 형질도입된 0.67 x 10⁶, 2 x 10⁶, 또는 6 x 10⁶개의 T-세포의 단일 주입에 의해 치료하였다. 5F11-CD28Z를 발현하는 T-세포는 2 x 10⁶ 또는 6 x 10⁶개의 항-CD30 CAR T-세포의 주입물을 수여받은 마우스에서 종양을 제거할 수 있었지만, 형질도입되지 않은 T-세포 또는 0.67 x 10⁶개의 항-CD30 CAR T-세포의 주입물은 종양을 제거할 수 없었다. 5F11-CD28Z-발현 T-세포를 수여받은 마우스는 CAR T-세포-중재된 독성의 어떠한 징후도 나타내지 않았다. 마우스는 털이 헝클어지거나 활성이 감소되지 않았고, 마우스는 실험의 종료시 희생되거나 큰 종양이 발달된 후 희생된 경우에만 사망하였다.

본원에 인용된 출판물, 특허 출원, 및 특허를 비롯한 모든 참고문헌은, 각각의 참고문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참고로 인용되고 그의 전체가 본원에 제시되는 것과 동일한 정도로, 본원에 참고로 인용되어 있다.

본 발명을 기재함에 있어서(특별히 하기 특허청구범위와 관련하여) 단수형 용어 및 유사한 언급은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "포함하는", "갖는", "포함되는" 및 "함유하는"이라는 용어는, 달리 주지되지 않는 한, 확장가능한 용어(즉, "제한되지 않고 포함함"을 의미함)인 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 값들의 범위에 대한 언급은, 달리 본원에 지시되지 않는 한, 단지 그 범위내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 작용하고자 할 뿐이고, 각각의 별도의 값은 이것이 개별적으로 본원에 언급되는 것과 마찬가지로 본 명세서에 혼입되는 것이다. 본원에 기재된 모든 방법은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 표현(예를 들어, "예컨대")의 사용은, 단지 본 발명을 좀 더 잘 설명하려는 것이고, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범주에 제한을 두는 것이 아니다. 본 명세서에서 어떠한 표현도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실행에 필수적임을 지시하는 것으로 이해되어서는 안된다.

본 발명의 바람직한 실시태양, 예컨대 본 발명을 실행하기 위해 발명자들에게 공지된 최적의 방식이 본원에 기재되어 있다. 이들 바람직한 실시태양의 변경은 전술된 기재내용을 살펴볼 경우 당분야의 숙련가에게 분명할 수 있다. 본 발명자들은 숙련가라면 이러한 변경을 적절히 이용할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실행될 수 있음을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용될 경우 본원에 첨부된 특허청구범위에 인용된 주제 내용의 모든 변형 및 대등물을 포함한다. 게다가, 이의 모든 가능한 변경에서 상기 기재된 요소들의 임의의 조합은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 본 발명에 의해 내포된다.

SEQUENCE LISTING <110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES <120> ANTI-CD30 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS <130> 726313 <140> PCT/US2016/056262 <141> 2016-10-10 <150> US 62/241,896 <151> 2015-10-15 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Thr Ala Tyr 1 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile Thr 1 5 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu 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Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln 115 120 125 Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr Tyr Trp Ser 145 150 155 160 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile 165 170 175 Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val 180 185 190 Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn 195 200 205 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Thr 210 215 220 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro 225 230 235 240 Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 290 295 300 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn 305 310 315 320 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 325 330 335 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 340 345 350 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 355 360 365 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 370 375 380 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 385 390 395 400 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 405 410 415 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 420 425 430 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 435 440 445 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 450 455 460 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Arg Phe Val Ser Ser 1 5 <210> 20 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 gccaccatgg ccctgcctgt gacagctctg ctgctgcctc tggccctgct gctgcatgcc 60 gccagacccg atatccagat gacccagagc cccaccagcc tgtctgccag cgtgggcgac 120 agagtgacca tcacctgtag agccagccag ggcatcagca gctggctgac ctggtatcag 180 cagaagcccg agaaggcccc caagagcctg atctacgccg ccagctctct gcagtctggc 240 gtgcccagca gattttccgg cagcggctct ggcaccgact tcaccctgac aatcagcagc 300 ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac tgccagcagt acgacagcta ccccatcacc 360 ttcggccagg gcacccggct ggaaatcaag ggcagcacat ctggcagcgg caagcctgga 420 tctggcgagg gctctacaaa gggccaggtg cagctgcagc agtggggagc cggactgctg 480 aagcctagcg agacactgag cctgacctgc gccgtgtacg gcggcagctt cagcgcctac 540 tattggagct ggatccggca gcctcctggc aagggcctgg aatggatcgg cgacatcaat 600 cacggcggag gcaccaacta caaccccagc ctgaagtccc gcgtgaccat ctccgtggac 660 accagcaaga accagttctc cctgaagctg aacagcgtga cagccgccga cacagccgtg 720 tactactgtg ccagcctgac cgcctattgg ggccagggat ctctcgtgac cgtgtccagc 780 ttcgtgcccg tgttcctgcc tgccaagcct accacaaccc ctgcccctag acctcctacc 840 ccagccccta caatcgccag ccagcctctg tctctgaggc ccgaggcttg tagacctgct 900 gcaggcggag ccgtgcacac cagaggactg gatttcgcct gcgacatcta catctgggcc 960 cctctggccg gcacatgtgg cgtgctgctg ctgagcctcg tgatcaccct gtactgcaac 1020 caccggaaca agcggggcag aaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgcgg 1080 cccgtgcaga ccacccagga agaggacggc tgctcctgca gattccccga ggaagaagaa 1140 ggcggctgcg agctgagagt gaagttcagc agatccgccg acgcccctgc ctaccagcag 1200 ggacagaacc agctgtacaa cgagctgaac ctgggcagac gggaagagta cgacgtgctg 1260 gacaagcgga gaggccggga ccccgagatg ggcggaaagc ccagacggaa gaacccccag 1320 gaaggcctgt ataacgaact gcagaaagac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc 1380 atgaagggcg agcggaggcg cggcaagggc cacgatggcc tgtaccaggg cctgagcacc 1440 gccaccaagg acacctacga cgccctgcac atgcaggccc tgccccccag a 1491 <210> 21 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 gccaccatgg ccctgcctgt gacagctctg ctgctgcctc tggccctgct gctgcatgcc 60 gccagacccg atatccagat gacccagagc cccaccagcc tgtctgccag cgtgggcgac 120 agagtgacca tcacctgtag agccagccag ggcatcagca gctggctgac ctggtatcag 180 cagaagcccg agaaggcccc caagagcctg atctacgccg ccagctctct gcagtctggc 240 gtgcccagca gattttccgg cagcggctct ggcaccgact tcaccctgac aatcagcagc 300 ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac tgccagcagt acgacagcta ccccatcacc 360 ttcggccagg gcacccggct ggaaatcaag ggcagcacat ctggcagcgg caagcctgga 420 tctggcgagg gctctacaaa gggccaggtg cagctgcagc agtggggagc cggactgctg 480 aagcctagcg agacactgag cctgacctgc gccgtgtacg gcggcagctt cagcgcctac 540 tattggagct ggatccggca gcctcctggc aagggcctgg aatggatcgg cgacatcaat 600 cacggcggag gcaccaacta caaccccagc ctgaagtcca gagtgaccat cagcgtggac 660 accagcaaga accagttctc cctgaagctg aacagcgtga cagccgccga caccgccgtg 720 tactactgtg ccagcctgac agcctattgg ggccagggct ctctcgtgac cgtgtccagc 780 atcgaagtga tgtacccccc tccctacctg gacaacgaga agtccaacgg caccatcatc 840 cacgtgaagg gcaagcacct gtgccccagc cctctgtttc ctggccctag caagcccttc 900 tgggtgctgg tggtcgtggg cggagtgctg gcctgttaca gcctgctcgt gacagtggcc 960 ttcatcatct tttgggtgcg cagcaagcgg agccggctgc tgcacagcga ctacatgaac 1020 atgaccccca gacggccagg ccccaccaga aagcactacc agccttacgc ccctcccaga 1080 gacttcgccg cctaccgcag cagagtgaag ttcagcagaa gcgccgacgc ccctgcctat 1140 cagcagggcc agaaccagct gtacaacgag ctgaacctgg gcagacggga agagtacgac 1200 gtgctggaca agcggagagg cagggaccct gagatgggcg gcaagcccag aagaaagaac 1260 ccccaggaag gcctgtataa cgaactgcag aaagacaaga tggccgaggc ctacagcgag 1320 atcggcatga agggcgagcg gagaagaggc aagggacacg acggcctgta ccagggactg 1380 agcaccgcca ccaaggacac ctacgacgcc ctgcacatgc aggccctgcc ccccaga 1437 <210> 22 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 gccaccatgg ccctgcctgt gacagctctg ctgctgcctc tggccctgct gctgcatgcc 60 gccagacccg atatccagat gacccagagc cccaccagcc tgtctgccag cgtgggcgac 120 agagtgacca tcacctgtag agccagccag ggcatcagca gctggctgac ctggtatcag 180 cagaagcccg agaaggcccc caagagcctg atctacgccg ccagctctct gcagtctggc 240 gtgcccagca gattttccgg cagcggctct ggcaccgact tcaccctgac aatcagcagc 300 ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac tgccagcagt acgacagcta ccccatcacc 360 ttcggccagg gcacccggct ggaaatcaag ggcagcacat ctggcagcgg caagcctgga 420 tctggcgagg gctctacaaa gggccaggtg cagctgcagc agtggggagc cggactgctg 480 aagcctagcg agacactgag cctgacctgc gccgtgtacg gcggcagctt cagcgcctac 540 tattggagct ggatccggca gcctcctggc aagggcctgg aatggatcgg cgacatcaat 600 cacggcggag gcaccaacta caaccccagc ctgaagtccc gcgtgaccat ctccgtggac 660 accagcaaga accagttctc cctgaagctg aacagcgtga cagccgccga cacagccgtg 720 tactactgtg ccagcctgac cgcctattgg ggccagggat ctctcgtgac cgtgtccagc 780 ttcgtgcccg tgttcctgcc tgccaagcct accacaaccc ctgcccctag acctcctacc 840 ccagccccta caatcgccag ccagcctctg tctctgaggc ccgaggcttg tagacctgct 900 gcaggcggag ccgtgcacac cagaggactg gatttcgcct gcgacatcta catctgggcc 960 cctctggccg gcacatgtgg cgtgctgctg ctgagcctcg tgatcaccct gtactgcaac 1020 caccggaaca gaagcaagcg gagccggctg ctgcacagcg actacatgaa catgacccca 1080 agacggcctg gccccacccg gaagcactac cagccttacg cccctcccag agacttcgcc 1140 gcctaccggt ccagagtgaa gttcagcaga tccgccgacg cccctgccta ccagcaggga 1200 cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg ggcagacggg aagagtacga cgtgctggac 1260 aagcggagag gccgggaccc cgagatgggc ggaaagccca gacggaagaa cccccaggaa 1320 ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag atggccgagg cctacagcga gatcggcatg 1380 aagggcgagc ggaggcgcgg caagggccac gatggcctgt accagggcct gagcaccgcc 1440 accaaggaca cctacgacgc cctgcacatg caggccctgc cccccaga 1488 <210> 23 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln 115 120 125 Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr Tyr Trp Ser 145 150 155 160 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile 165 170 175 Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val 180 185 190 Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn 195 200 205 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Thr 210 215 220 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235

Claims

(a) 인간 중쇄 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region) 1, 인간 중쇄 CDR2, 인간 중쇄 CDR3, 인간 경쇄 CDR1, 인간 경쇄 CDR2 및 인간 경쇄 CDR3을 포함하는 항-CD30 항원 결합 도메인;
(b) 인간 힌지(hinge) 도메인;
(c) 인간 막관통 도메인; 및
(d) (i) 인간 세포내 T-세포 신호발송 도메인, 및 (ii) 인간 T-세포 보조자극 도메인중 하나 또는 둘 다
를 포함하는, CD30에 대하여 항원 특이성을 갖는 키메라성 항원 수용체.
제1항에 있어서,
항원 결합 도메인이 서열번호 1 내지 6 각각의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
항원 결합 도메인이 서열번호 7 및 8 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
힌지 도메인 및 막관통 도메인이 인간 CD8α의 힌지 도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제4항에 있어서,
인간 CD8α의 힌지 도메인 및 막관통 도메인이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
세포내 T-세포 신호발송 도메인이 인간 CD28, 인간 4-1BB 및 인간 CD3ζ중 하나 이상의 세포내 T-세포 신호발송 도메인을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제6항에 있어서,
인간 CD28의 세포내 T-세포 신호발송 도메인이 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 4-1BB의 세포내 T-세포 신호발송 도메인이 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 CD3ζ의 세포내 T-세포 신호발송 도메인이 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 T-세포 신호발송 도메인이 (i) 인간 CD28의 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 T-세포 신호발송 도메인, 및 (ii) 인간 CD3ζ의 세포내 T-세포 신호발송 도메인을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제9항에 있어서,
인간 CD28의 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 T-세포 신호발송 도메인이 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제9항 또는 제10항에 있어서,
인간 CD3ζ의 세포내 T-세포 신호발송 도메인이 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제9항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체.
제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 따른 키메라성 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
제13항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제14항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
2개 이상의 제15항에 따른 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포의 집단.
제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 따른 키메라성 항원 수용체, 제13항에 따른 핵산, 제14항에 따른 재조합 발현 벡터, 제15항에 따른 숙주 세포, 또는 제16항에 따른 숙주 세포의 집단, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
포유동물에서 암의 치료 또는 예방에서의 용도를 위한, 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 따른 키메라성 항원 수용체, 제13항에 따른 핵산, 제14항에 따른 재조합 발현 벡터, 제15항에 따른 숙주 세포, 제16항에 따른 숙주 세포의 집단, 또는 제17항에 따른 약학 조성물.
암이 림프종인 제18항의 용도를 위한, 키메라성 항원 수용체, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 숙주 세포의 집단, 또는 약학 조성물.
제18항 또는 제19항의 용도를 위한, 포유동물에 대해 자가유래성인 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.
제18항 또는 제19항의 용도를 위한, 포유동물에 대해 동종이형성인 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단.