CN116997654A - 编码抗乙酰胆碱受体自身抗体的嵌合受体的基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了嵌合多肽受体，其中包含能够被抗人烟碱性乙酰胆碱受体α1亚基(nAChRα1)抗体结合的抗原区域的细胞外区域、跨膜区域和包含细胞内信号传导结构域的细胞内结构域以出现的顺序从N‑末端向C‑末端排列，其中所述抗原区域的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或通过取代、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸衍生自如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸序列，编码所述嵌合多肽受体多肽的多核苷酸，表达所述嵌合多肽受体的细胞，等，其用于治疗重症肌无力。

Description

编码抗乙酰胆碱受体自身抗体的嵌合受体的基因
技术领域
本发明涉及特异性识别结合烟碱性乙酰胆碱受体的自身抗体的嵌合受体多肽、编码所述多肽的多核苷酸、用所述多核苷酸转染的细胞、用于使用所述细胞治疗自身免疫病(特别是重症肌无力)的医用组合物、治疗方法、测试方法、其用途等。
背景技术
众所周知，使用表达识别癌细胞特异性抗原的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(CAR-T细胞)以特异性破坏表达所述抗原的癌细胞的细胞治疗对于癌症治疗是有效的。还已尝试了类似的方法以通过使用表达特异性识别自身抗体的嵌合自身抗体受体(CAAR)的T细胞(CAAR-T细胞)以靶向表达自身抗体的致病性B细胞来治疗自身免疫病(专利文献1：WO2016/070061)。
广义上讲，嵌合受体是包含三个区域的分子，即，包含与靶分子的结合区域的细胞外区域、跨膜区域和将刺激转导到细胞内的细胞内区域。表达嵌合受体的基因工程T细胞通过嵌合受体与靶分子的结合以及激活刺激至T细胞的转导而对表达靶分子的细胞发挥毒性活性(非专利文献1：Stoiber等人,Cells.2019年5月17日；8(5):472)。
为了获得发挥这种活性的T细胞，设计在T细胞表面上以足够量表达(非专利文献2：Fujiwara等人,Cells 2020,9(5),1182)并且具有适合于发挥毒性活性的构象和在细胞表面上的分布(非专利文献1：Stoiber等人,Cells.2019年5月17日；8(5):472)的嵌合受体是必要的。使用单克隆抗体用于治疗癌症和自身免疫病也是众所周知的。单克隆抗体是基于细胞产生的天然抗体设计的，并且已经确立了其在细胞中的表达方法。由于是分泌性蛋白，所以即使其在细胞内以低水平表达，也可以通过大规模生产来获得治疗用抗体。另一方面，嵌合受体是完全人工设计的分子。由于嵌合受体在细胞膜内表达，所以诸如其在细胞内的表达水平和在细胞表面上的分布的因素对于其效力来说是重要的。因此，理论上看来似乎只要确定了靶分子，就可以容易地制备表达所期望的嵌合受体的基因工程细胞。然而，实践中，这种功能细胞的制备伴随着巨大的困难，且需要对于每种个别嵌合受体的大量的反复试错以及非凡的独创性和独出心裁。
已报道了在由针对人Dsg3的自身抗体引起的寻常型天疱疮(一种自身免疫病)的治疗中的CAAR-T细胞治疗(非专利文献3：Ellebrecht等人,Science 2016年7月8日:第353卷,第6295期,第179-184页)。根据所述报道，在患有寻常型天疱疮的患者血清中检测到识别Dsg3细胞外结构域EC1、EC2、EC3、EC4和EC5的自身抗体。分别基于靶抗原区域EC1-EC3、EC1-EC4和EC1-EC5设计了三种类型的CAARs；包含EC1-EC3或EC1-EC4结构域的CAARs在细胞表面上良好表达，并表现出适当的活性；另一方面，以EC1-EC5作为抗原区域的CAAR在细胞表面上的表达呈现不同，且所述CAAR也具有不足的活性。
已知结合烟碱性乙酰胆碱受体α1亚基(在下文中，称为“nAChRα1”或“AChRα”)的自身抗体降低存在于神经肌肉接头的突触后膜中的相应乙酰胆碱受体分子的水平，从而诱导特征在于肌肉虚弱、增加的疲劳易感性或呼吸问题的重症肌无力(MG)(非专利文献4：Luo等人,J Mol Neurosci.2010年1月；40(1-2):217-20；和非专利文献5：Luo等人,JNeurosci.2009年11月4日；29(44):13898-908)。特别地，来源于患有MG的患者的所有自身抗体的不止一半结合被称为“主要免疫原性区域”的nAChRα1的区域。结合主要免疫原性区域的自身抗体的量也与疾病严重程度相关。此外，抗主要免疫原性区域抗体在转移至大鼠时在大鼠中诱导MG(Makino等人,PLoS One.2017年10月17日；12(10):e0185976)。治疗MG的一种方法涉及使用治疗用类固醇或其他免疫抑制药物诱导缓和。然而，不仅当使用这种药物时的完全缓解率低至15％或更低，而且这些药物也引起各种不利反应并显著抑制生活质量。基于静脉注射免疫球蛋白(IVIg)或清血法的疗法在类固醇抗性的难治病例中或在严重病例中显示一定功效，然而，效果短暂，且这种方法给医疗服务提供者和患者带来沉重负担。近年来，抗补体C5抗体(依库珠单抗(Eculizumab))已被批准用于难以由上述治疗方法控制的病例。然而，其与诸如增加的发展脑膜炎球菌感染的风险的并发症有关，从而限制了其使用(非专利文献6：Sanders等人,Neurology.(2016)87(4),419-425)。在这些情况下，仍然存在提供治疗重症肌无力的有效方法的需要。
引用列表
专利文献
专利文献1：WO2016/070061
非专利文献
非专利文献1：Stoiber等人,Cells.2019年5月17日；8(5):472
非专利文献2：Fujiwara等人,Cells 2020,9(5),1182
非专利文献3：Ellebrecht等人,Science 2016年7月8日:第353卷,第6295期,第179-184页
非专利文献4：Luo等人,J Mol Neurosci.2010年1月；40(1-2):217-20
非专利文献5：Luo等人,J Neurosci.2009年11月4日；29(44):13898-908。
非专利文献6：Sanders等人,Neurology.(2016)87(4),419-425
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供用嵌合受体基因转染的基因工程T细胞，其中所述基因工程T细胞在用于治疗由特异性识别烟碱性乙酰胆碱受体α亚基并引起自体组织(self-tissue)的破坏的致病性抗体(自身抗体)引起的自身免疫病例如重症肌无力的细胞治疗的方法中是有效的。人工改造的T细胞的主要作用是去除产生致病性自身抗体的B细胞和浆细胞。为了获得发挥这种功能的T细胞，设计转基因是必要的，其使得嵌合受体能够在T细胞表面上以足够量表达，同时保持用于发挥活性的细胞膜中适当的构象。
功能性嵌合受体的抗原区域期望呈现与天然对应物相似的构象，这是因为与自身免疫病有关的自身抗体识别处于其天然构象的抗原。为了在细胞上表达一定量的期望的蛋白，可以基于相应的天然基因序列表达以单体形式存在的具有衍生自天然蛋白的细胞外结构域的嵌合受体。然而，如果要表达的嵌合受体仅仅具有多亚基分子如乙酰胆碱受体的一个亚基，则很难维持天然分子构象。为了获得功能性嵌合受体，使用反复试错以从头合成众多受体并测试其每一种以评估其功能是必要的。此外，为了CAAR-T细胞表现出需要的活性，在细胞表面上必须有一定水平的嵌合受体的表达。尽管可以实现分泌性蛋白的大规模生产，但控制细胞膜中蛋白的表达水平是非常困难的。
即使感兴趣的受体在细胞表面上以足够的量表达，为了在受体与靶分子结合后向CAAR-T中的适当信号转导以及后来的针对靶细胞的毒性，必须保持不仅特异性结合靶分子的受体的结合结构域的适当构象，而且保持整个受体的构象。与通常包含scFv的用于靶向癌细胞的CARs的结合结构域不同，CAARs的结合结构域的结构高度可变且取决于要靶向的B细胞受体(BCR)/自身抗体。因此，在不参考其他CAARs的情况下根据期望的靶从头进行CAARs的合成。
问题的解决方案
本发明人已进行了勤奋的研究以实现所述目的且因此发现：对应于具有在其中引入的氨基酸突变的nAChRα1的细胞外区域的氨基酸序列作为嵌合受体的结合区是合适的，借此嵌合受体表达在细胞膜中；且包含与各种接头和细胞内结构域组合的这种结合区的嵌合受体在细胞膜中适当表达并发挥细胞毒活性。本发明人已进一步进行了研究，从而导致完成了本发明。
本发明提供以下发明。
[1]嵌合多肽受体，其中包含能够被抗人烟碱性乙酰胆碱受体α1亚基(nAChRα1)抗体结合的抗原区域的细胞外区域、跨膜区域和包含细胞内信号传导结构域的细胞内区域以出现的顺序从N-末端向C-末端排列，其中所述抗原区域包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或通过取代、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸衍生自如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
[2]根据[1]所述的多肽受体，其中所述抗原区域是由通过SEQ ID NO：3中的至少一个Xaa所代表的氨基酸的取代以及任选地作为一个或多个额外的突变通过在SEQ ID NO：3中除Xaa所代表的氨基酸之外的位置处缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸而衍生自如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的氨基酸序列组成的区域。
[3]根据[2]所述的多肽受体，其中所述一个或多个额外的突变包含SEQ ID NO：2中1至5个N-末端和/或C-末端氨基酸的缺失或添加。
[4]根据[2]或[3]所述的多肽受体，其中在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中，由Xaa代表的氨基酸如下：
Xaa8是疏水性氨基酸或酸性氨基酸，
Xaa14是酸性氨基酸或疏水性氨基酸，
Xaa70是酸性氨基酸、具有包含酰胺基的侧链的氨基酸或疏水性氨基酸，
Xaa72是疏水性氨基酸，
Xaa112是疏水性氨基酸，
Xaa149是亲水性氨基酸或疏水性氨基酸，
Xaa155是疏水性氨基酸或亲水性氨基酸，
氨基酸Xaa146至Xaa148、Xaa150至Xaa154和Xaa156至Xaa159各自独立地是碱性氨基酸或疏水性氨基酸，并且
Xaa192和Xaa193各自独立地是Cys或Gly，
其中所述疏水性氨基酸是Val、Ala、Leu、Ile、Gly、Trp、Tyr、Phe、Met或Pro，所述亲水性氨基酸是Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln或Ser，所述酸性氨基酸是Asp或Glu，所述碱性氨基酸为Arg或Lys，且具有包含酰胺基的侧链的氨基酸为Asn或Gln。
[5]根据[4]所述的多肽受体，其中在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中，由Xaa代表的氨基酸如下：
Xaa8是Val或Glu，
Xaa14是Asp、Ala或Gly，
Xaa70是Asp、Asn或Ala，
Xaa72是Tyr或Phe，
Xaa112是Tyr或Phe，
Xaa149是Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro，
Xaa155是Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro，氨基酸Xaa146至Xaa148、Xaa150至Xaa154和Xaa156至Xaa159各自独立地是SEQ ID NO：2中相应位点的氨基酸或Lys，且
Xaa192和Xaa193各自独立地是Cys或Gly。
[6]根据[5]所述的多肽受体，其中在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中，Xaa149是Trp、Lys、Arg或Pro，且Xaa155是Val、Ala、Gly、Lys、Arg、Pro、Met、Asp、Asn、Glu、Gln或Ser。
[7]根据[6]所述的多肽，其中在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中，Xaa149和Xaa155各自独立地是Lys或Arg。
[8]根据[1]所述的多肽受体，其中所述抗原区域是选自下面的组的任一成员：
抗原区域：AChRα211、AChRα211/V8E、AChRα211/W149R、AChRα211/W149K、AChRα211/W149P、AChRα211/V155A、AChRα211/V155K、AChRα211/V155M、AChRα211/V155D、AChRα211/V155P、AChRα211/C192G、AChRα211/C193G、AChRα211/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149R、AChRα211/V8E/W149K、AChRα211/V8E/W149P、AChRα211/V8E/V155A、AChRα211/V8E/V155K、AChRα211/V8E/V155M、AChRα211/V8E/V155D、AChRα211/V8E/V155P、AChRα211/V8E/C192G、AChRα211/V8E/C193G、AChRα211/V8E/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/V155K、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/W149R/V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/W149R/C192G、AChRα211/W149R/C193G、AChRα211/W149R/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/V155K、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/W149K/V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/W149K/C192G、AChRα211/W149K/C193G、AChRα211/W149K/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155A、AChRα211/W149P/V155K、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/W149P/V155D、AChRα211/W149P/V155P、AChRα211/W149P/C192G、AChRα211/W149P/C193G、AChRα211/W149P/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149R/V155A、AChRα211/V8E/W149R/V155K、AChRα211/V8E/W149R/V155M、AChRα211/V8E/W149R/V155D、AChRα211/V8E/W149R/V155P、AChRα211/V8E/W149R/C192G、AChRα211/V8E/W149R/C193G、AChRα211/V8E/W149R/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149K/V155A、AChRα211/V8E/W149K/V155K、AChRα211/V8E/W149K/V155M、AChRα211/V8E/W149K/V155D、AChRα211/V8E/W149K/V155P、AChRα211/V8E/W149K/C192G、AChRα211/V8E/W149K/C193G、AChRα211/V8E/W149K/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149P/V155A、AChRα211/V8E/W149P/V155K、AChRα211/V8E/W149P/V155M、AChRα211/V8E/W149P/V155D、AChRα211/V8E/W149P/V155P、AChRα211/V8E/W149P/C192G、AChRα211/V8E/W149P/C193G、AChRα211/V8E/W149P/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155A/C192G、AChRα211/W149R/V155K/C192G、AChRα211/W149R/V155M/C192G、AChRα211/W149R/V155D/C192G、AChRα211/W149R/V155P/C192G、AChRα211/W149K/V155A/C192G、AChRα211/W149K/V155K/C192G、AChRα211/W149K/V155M、/C192G、AChRα211/W149K/V155D/C192G、AChRα211/W149K/V155P/C192G、AChRα211/W149P/V155A/C192G、AChRα211/W149P/V155K/C192G、AChRα211/W149P/V155M、/C192G、AChRα211/W149P/V155D/C192G、AChRα211/W149P/V155P/C192GAChRα211/W149R/V155A/C193G、AChRα211/W149R/V155K/C193G、AChRα211/W149R/V155M/C193G、AChRα211/W149R/V155D/C193G、AChRα211/W149R/V155P/C193G、AChRα211/W149K/V155A/C193G、AChRα211/W149K/V155K/C193G、AChRα211/W149K/V155M/C193G、AChRα211/W149K/V155D/C193G、AChRα211/W149K/V155P/C193G、AChRα211/W149P/V155A/C193G、AChRα211/W149P/V155K/C193G、AChRα211/W149P/V155M/C193G、AChRα211/W149P/V155D/C193G、AChRα211/W149P/V155P/C193G、AChRα211/W149R/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155K/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155P/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155K/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155P/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155K/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155P/C192G/C193G、AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/D14G/W149R/V155A、AChRα211/D14G/W149R/V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/D14G/W149R/V155P、AChRα211/D14G/W149R/V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/D14G/W149K/V155A、AChRα211/D14G/W149K/V155M、AChRα211/D14G/W149K/V155D、AChRα211/D14G/W149K/V155P、AChRα211/D14G/W149K/V155G、AChRα211/D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/W149P/V155A、AChRα211/D14G/W149P/V155M、AChRα211/D14G/W149P/V155D、AChRα211/D14G/W149P/V155P、AChRα211/D14G/W149P/V155G、AChRα211/D14A/W149R/V155K、AChRα211/D14A/W149R/V155A、AChRα211/D14A/W149R/V155M、AChRα211/D14A/W149R/V155D、AChRα211/D14A/W149R/V155P、AChRα211/D14A/W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/W149K/V155A、AChRα211/D14A/W149K/V155M、AChRα211/D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/W149K/V155P、AChRα211/D14A/W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/W149P/V155A、AChRα211/D14A/W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/W149P/V155P或AChRα211/D14A/W149P/V155G
其中AChRα211是如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列，AChRα211的每一个提及的取代的位置指由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列中的相应位置，且在每个取代中，取代氨基酸在位置后显示。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的多肽受体，其中所述细胞内信号传导结构域是衍生自CD3ζ或CD3δ的细胞内结构域的氨基酸序列。
[10]根据[1]至[8]中任一项所述的多肽受体，其中所述跨膜区域是衍生自选自nAChRα1、T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154和GITR的任意一种分子的跨膜结构域的氨基酸序列。
[11]根据[1]至[10]中任一项所述的多肽受体，其中所述细胞内区域在所述细胞内信号传导结构域的N-末端进一步包含1至3个共刺激结构域。
[12]根据[11]所述的多肽受体，其中所述共刺激结构域是衍生自选自CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137(4-1BB)、ICOS、CD154、CITR、TNFR2、DR3、CD30、HVEM、CD27和OX40的1-3种分子的细胞内区域的序列。
[13]根据[1]至[12]中任一项所述的多肽受体，其进一步包含在所述抗原区域和所述跨膜区域之间的由100个或更少的氨基酸组成的接头区域。
[14]根据[13]所述的多肽受体，其中所述接头区域是如SEQ ID NO：5、39、40或41所述的氨基酸序列的部分或全部。
[15]根据[1]所述的多肽受体，其中
所述抗原区域为AChRα211/W149R/V155K、AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/W149R/V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/W149R/V155G、AChRα211/W149K/V155K、AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/W149K/V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/W149K/V155G、AChRα211/W149P/V155K、AChRα211/W149P/V155A、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/W149P/V155D、AChRα211/W149P/V155P或AChRα211/W149P/V155G、AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/D14G/W149R/V155A、AChRα211/D14G/W149R/V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/D14G/W149R/V155P、AChRα211/D14G/W149R/V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/D14G/W149K/V155A、AChRα211/D14G/W149K/V155M、AChRα211/D14G/W149K/V155D、AChRα211/D14G/W149K/V155P、AChRα211/D14G/W149K/V155G、AChRα211/D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/W149P/V155A、AChRα211/D14G/W149P/V155M、AChRα211/D14G/W149P/V155D、AChRα211/D14G/W149P/V155P、AChRα211/D14G/W149P/V155G、AChRα211/D14A/W149R/V155K、AChRα211/D14A/W149R/V155A、AChRα211/D14A/W149R/V155M、AChRα211/D14A/W149R/V155D、AChRα211/D14A/W149R/V155P、AChRα211/D14A/W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/W149K/V155A、AChRα211/D14A/W149K/V155M、AChRα211/D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/W149K/V155P、AChRα211/D14A/W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/W149P/V155A、AChRα211/D14A/W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/W149P/V155P或AChRα211/D14A/W149P/V155G；
其中AChRα211是如SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列，AChRα211的每一个提及的取代的位置指由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列中的相应位置，且在每个取代中，取代氨基酸在位置后显示，所述接头区域是CD8α铰链序列(SEQ ID NO：39)、CD28铰链序列(SEQ IDNO：40)或人工接头序列(SEQ ID NO：41)的部分或全部，
所述跨膜区域是CD8α跨膜结构域(SEQ ID NO：6)、CD28跨膜结构域(SEQ ID NO：37)或AChRα跨膜结构域(SEQ ID NO：38)，
所述共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO：7)、CD28共刺激结构域(SEQID NO：25)、GITR共刺激结构域(SEQ ID NO：26)、TNFR2共刺激结构域(SEQ ID NO：27)、DR3共刺激结构域(SEQ ID NO：28)、CD30共刺激结构域(SEQ ID NO：29)、HVEM共刺激结构域(SEQ ID NO：30)、CD27共刺激结构域(SEQ ID NO：31)或OX40共刺激结构域(SEQ ID NO：32)，且
所述细胞内信号传导结构域是CD3ζ细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：8)。
[16]根据[15]所述的多肽，其中
所述抗原区域是AChRα211/W149R/V155K(其是其中Xaa14是Asp、Xaa149是Arg并且Xaa155是Lys的SEQ ID NO：42的氨基酸序列)、AChRα211/W149R/V155A(其是其中Xaa14是Asp、Xaa149是Arg并且Xaa155是Ala的SEQ ID NO：42的氨基酸序列)、AChRα211/D14G/W149R/V155K(其是其中Xaa14是Gly、Xaa149是Arg并且Xaa155是Lys的SEQ ID NO：42的氨基酸序列)或AChRα211/D14G/W149R/V155A(其是其中Xaa14是Gly、Xaa149是Arg并且Xaa155是Ala的SEQ ID NO：42的氨基酸序列)，
所述接头区域是CD8α铰链序列(SEQ ID NO：39)、从其C-末端起14个连续氨基酸(其是由SEQ ID NO：39的位置32至45的氨基酸组成的氨基酸序列)、人工接头序列(SEQ IDNO：41)或从其C-末端起的4个连续氨基酸(其是由SEQ ID NO：41的位置11至14的氨基酸组成的氨基酸序列)，
所述跨膜区域是CD8α跨膜结构域(SEQ ID NO：6)，
所述共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO：7)或OX40共刺激结构域(SEQ ID NO：32)，并且
所述细胞内信号传导结构域是CD3ζ细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：8)。
[17]由氨基酸序列组成的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含用于使得所述多肽能够在细胞表面上的表达的信号肽的氨基酸序列，且进一步包含与SEQ ID NO：43至47中任一个的氨基酸序列表现出80％或更高序列同一性的嵌合受体的氨基酸序列的氨基酸序列。
[18]根据[17]所述的多肽，其中所述嵌合受体的氨基酸序列是SEQ ID NO：43至47中任一个的氨基酸序列。
[19]多核苷酸，其编码根据[1]至[18]中任一项所述的多肽。
[20]载体，其包含根据[19]所述的多核苷酸。
[21]根据[20]所述的载体，其中所述载体是选自质粒载体、反转录病毒载体和慢病毒载体的任一载体。
[22]根据[20]或[21]所述的载体，其中所述载体被进行设计以使得能够表达根据[1]至[18]中任一项所述的多肽。
[23]根据[20]或[21]所述的载体，其中所述载体是被进行设计以能够产生其中封入编码根据[1]至[18]中任一项所述的多肽的多核苷酸的病毒载体的质粒载体。
[24]用根据[19]所述的多核苷酸转染的细胞。
[25]根据[24]所述的细胞，其中所述细胞在细胞表面上表达根据[1]至[18]中任一项所述的多肽。
[26]根据[24]或[25]所述的细胞，其中所述细胞是选自T细胞、PBMC、iPS细胞和ES细胞中的任一细胞。
[27]用于治疗与结合乙酰胆碱受体α亚基的自身抗体的产生有关的疾病的药物，所述药物包含根据[24]至[26]中任一项所述的细胞作为活性成分。
[28]根据[27]所述的药物，其中所述疾病是重症肌无力。
[29]用于治疗重症肌无力的方法，其包括向待治疗的主体施用治疗有效量的根据[24]至[26]中任一项所述的细胞的步骤。
[30]根据[24]至[26]中任一项所述的细胞在生产用于治疗重症肌无力的药物中的用途。
本发明的有利效果
表达本发明嵌合受体的T细胞对患有重症肌无力的患者体内表达针对nAChRα1的自身抗体的致病性B细胞显示出体内细胞毒活性，且因此对患有重症肌无力的患者具有治疗作用。
附图说明
[图1]图1A)是AChRα-CAAR的示意图：抗原区域(AChRα)、接头区域(接头)、跨膜结构域(TM，跨膜)、细胞内共刺激结构域和细胞内信号结构域相连。图1B)显示了AChRα-CAAR的实例的全长氨基酸序列：显示了AChRα211/W149R/V155K的序列。
[图2-1]图2显示了如通过流式细胞术所分析的人T细胞中各种AChRα-CAAR的膜表达。在图2-1(A)中，通过使用共同的信号肽(CD8α)、抗原区域(AChRα236)、共刺激结构域(4-1BB)和信号结构域(CD3ζ)并使用衍生自AChRα或CD8α的接头区域和跨膜区域构建并表达AChRα-CAARs。CAAR与FLAG标签肽连接，且蓝色荧光蛋白(BFP)用作基因转移的报道基因。图2-1A提供了散点图，其中X轴描绘BFP的表达，且Y轴描绘FLAG标签的表达。将四等分线(quartering line)并入散点图中以将BFP-阴性细胞与BFP-阳性细胞区分开，如用辅助线所划出的。BFP-阳性/CAAR(FLAG)-阳性细胞部分以粗线划出。图2-1(B)提供了显示当通过使用共同的抗原区域(AChRα236)、接头区域(CD8α)、跨膜结构域(CD8α)、共刺激结构域(4-1BB)和信号结构域(CD3ζ)并使用衍生自CD8α、AChRα或IgE的信号肽构建并表达AChRα-CAARs时的AChRα-阳性细胞的柱状图。
[图2-2]图2-2(C)提供了显示当与图2-1(B)相同的AChRα-CAARs与其他AChR亚基(AChRβ、AChRδ和AChRε)共表达时的AChRα-阳性细胞的柱状图。圆圈描绘非转染的T细胞；三角形描绘携带AChRα236-CAAR的T细胞；正方形描绘携带AChRβ、AChRδ和AChRε的T细胞；且菱形描绘携带AChRα236-CAAR、AChRβ、AChRδ和AChRε的T细胞。图2-2(D)提供了与图2-1(A)中的那些类似的散点图，且描绘了当通过使用主要免疫原性区域作为抗原区域并包括信号肽(CD8α)、接头区域(CD8α)、跨膜结构域(CD8α)、共刺激结构域(4-1BB)和信号结构域(CD3ζ)构建并表达AChRα-CAAR时CAAR的表达。图2-2(E)提供了与图2-1(A)中的那些类似的散点图，且描绘了当通过使用AChRα236/V8E/W174R/V180A(左图)或AChRα236/Δ59-83/V8E/W174R/V180A(AChRα211/V8E/W149R/V155；右图)作为抗原区域并包括信号肽(CD8α)、接头区域(CD8α)、跨膜结构域(CD8α)、共刺激结构域(4-1BB)和信号结构域(CDζ)构建并表达AChRα-CAAR时CAAR的表达。
[图3]图3提供了显示在人T细胞中在AChRα211或AChRα236中具有引入的对应于V8E、W149R和V155A的突变的AChRα-CAARs的表达的散点图。所述表达基于可归因于抗-FLAG抗体反应的荧光强度进行评价。BFP用作基因转移的报道基因。将基于BFP-阴性细胞的四等分线作为辅助线并入。X轴和Y轴的参数以及相应的CAAR-T细胞示于图中。
[图4]通过流式细胞术分析了在人T细胞中在AChRα211或AChRα236中具有引入的V8E、W149R和/或V155A突变的AChRα-CAARs的表达。(A)BFP用作基因转移的报道基因。显示了散点图，其中基于BFP-阴性细胞并入四等分线作为辅助线，并且BFP-阳性和CAAR-阳性细胞部分通过粗线划出。X轴描绘BFP的荧光强度，且Y轴描绘mAb35抗体反应。(B)从(A)中显示的每种类型的转染的T细胞门控BFP-阳性细胞，并通过平均荧光强度(MFI)指示mAb35抗体反应性。
[图5]通过流式细胞术分析了在人T细胞中使用在AChRα211中具有引入的G147K、W149K、Y151K、G153K、V155K、A157K或N159K突变的抗原区域的AChRα-CAAR的表达。(A)BFP用作基因转移的报道基因。显示了并入基于BFP-阴性细胞的四等分线作为辅助线的散点图，并且BFP-阳性和CAAR-阳性细胞部分通过粗线划出。X轴描绘BFP的荧光强度，且Y轴描绘抗-FLAG抗体反应。(B)从(A)中显示的每种类型的转染的T细胞门控BFP-阳性细胞，并通过MFI指示抗-FLAG抗体反应性。
[图6]通过流式细胞术分析了在人T细胞中使用在AChRα211中具有引入的W149A、W149K、W149D、W149S、W149G、W149N、W149I、W149F、W149M、W149P、W149R、V155R、V155K、V155D、V155S、V155G、V155N、V155I、V155F、V155M、V155P或V155A突变的抗原区域的AChRα-CAARs的表达。(A)BFP用作基因转移的报道基因。显示了并入基于BFP-阴性细胞的四等分线作为辅助线的散点图，并且BFP-阳性和CAAR-阳性细胞部分通过粗线划出。X轴描绘BFP的荧光强度，且Y轴描绘抗-FLAG抗体反应。(B)从(A)中显示的每种类型的转染的T细胞门控BFP-阳性细胞，并通过MFI指示抗-FLAG抗体反应性。
[图7]通过流式细胞术分析了在人T细胞中使用在AChRα211中具有引入的W149R、V155K、W149R/V155K或V8E/W149R/V155A突变的抗原区域的AChRα-CAARs的表达。(A)BFP用作基因转移的报道基因。显示了并入基于BFP-阴性细胞的四等分线作为辅助线的散点图，并且BFP-阳性和CAAR-阳性细胞部分通过粗线划出。X轴描绘BFP的荧光强度，且Y轴描绘抗-FLAG抗体反应。(B)从(A)中显示的每种类型的转染的T细胞门控BFP-阳性细胞，并通过MFI指示抗-FLAG抗体反应性。
[图8]图8(A)是显示图7中制备的CAAR-T细胞针对杂交瘤的杀细胞活性的线图：X轴描绘效应物(CAAR-T细胞)-靶(杂交瘤)混合细胞计数(E/T比)，且Y轴描绘了作为杂交瘤细胞总数目的百分比的杂交瘤细胞存活，其中基于未添加CAAR-T细胞的情况下的杂交瘤的细胞计数确定100％的基准。图8(B)是显示(A)的杀细胞测试中提及的每种类型的CAAR-T细胞的增殖的条状图：Y轴描绘了增殖，其中基于反应开始时的细胞计数确定100％的基准。在图中，2、1、0.5、0.25和0.125代表E/T比。
[图9]在人T细胞中表达包含在AChRα211/W149R/V155K中具有引入的D14A、D14G、D70N、D70A、Y72F或Y112F突变的抗原区域的AChRα-CAARs，并评价其针对膜型mAb35-scFv-表达细胞的杀细胞活性。左侧的条状图显示在没有额外的mAb35抗体的情况下获得的数据，且右侧的条状图显示在有额外的mAb35抗体的情况下获得的数据。在图中，2、1和0.1代表E/T(效应物/靶)比。Y轴描绘了存活，其中基于未添加CAAR-T细胞的情况下靶细胞的细胞计数确定100％的基准。
[图10]在人T细胞中表达使用AChRα211/W149R/V155K作为抗原区域并包括CD8α-衍生的接头(A)或柔性接头(B&C)的AChRα-CAAR，并评价其针对膜型mAb35-scFv-表达细胞的杀细胞活性。在条状图表中，2、1和0.1代表E/T(效应物/靶)比。Y轴描绘了存活，其中基于未添加CAAR-T细胞的情况下靶细胞的细胞计数确定100％的基准。
[图11]衍生自多个供体的T细胞用编码使用作为抗原区域的AChRα211/W149R/V155K、作为接头区域的CD8α-衍生的四个氨基酸(含有CS突变的FACD或FASD)和CD28、GITR、TNFR2、DR3、CD30、HVEM、CD27、4-1BB或OX40作为共刺激结构域构建的AChRα-CAAR的基因转染。针对表达膜型mAb35的RAJI细胞的杀细胞活性作为箱须图(box-and-whisker plot)表示。Y轴描绘了存活，其中基于未添加CAAR-T细胞的情况下靶细胞的细胞计数确定100％的基准。
[图12]将CD28-或CD8α-衍生的接头的氨基酸不同地缺失或突变，并作为接头区域在包括AChRα211/W149R/V155K作为抗原区域和HVEM作为共刺激结构域的AChRα-CAAR中提供。衍生自多个供体的T细胞被用相关的编码AChRα-CAAR的基因转染，以构建CAAR-T细胞。针对表达膜型mAb35的RAJI细胞的杀细胞活性以箱须图表示。X轴描绘了每个AChRα-CAAR中接头区域的起源和相关的突变，括号内的数字代表接头的长度，而±代表半胱氨酸被丝氨酸取代的位点和数目(表6)。Y轴描绘了存活，其中基于未添加CAAR-T细胞的情况下靶细胞的细胞计数确定100％的基准。
[图13]图13显示了箱须图，其中用使用NOG小鼠获得的异种移植模型评价了包含AChRα211/W149R/V155K作为抗原区域的CAAR-T细胞针对表达膜型mAb35-scFv的RAJI细胞的杀细胞活性。所述图显示了CAAR-T细胞施用后14天，40μL血液(左)、全脾(中)、股骨和胫骨的骨髓(右)中表达膜型mAb35-scFv的RAJI细胞的细胞计数。对照T代表非转染的T细胞。
[图14]图14显示了根据实施例12的表达AChRα-CAAR的CAAR-T细胞针对从用AChRα蛋白免疫的小鼠的脾获得的产生抗-AChRα抗体的B细胞的杀细胞活性。Y轴描绘了MFI，其代表培养物上清液中所含的抗-AChRα抗体的量。对照T代表非转染的T细胞。“4aa/4-1BB”和“14aa/OX40”对应于分别表达AChRα-CAARsAChRα/W149R/V155K>4aa>4-1BB和AChRα/W149R/V155K>14aa>OX40的T细胞。
[图15]图15显示本发明的两种嵌合受体的全长氨基酸序列。
[图16]图16显示本发明的进一步的两种嵌合受体的全长氨基酸序列。
具体实施方式
在下文中，将对本发明进行详细描述。
<术语>
在本说明书中，术语“多肽”是其中两个或更多个氨基酸通过肽键以预定序列连接的分子。其氨基酸序列包含具有特定特征或功能的氨基酸区域、结构域、肽或蛋白的氨基酸序列。如本所用的术语“多肽”具有与诸如“蛋白”、“肽”和“寡肽”的术语相同的含义。如本所用的术语“分离的多肽”或“分离的蛋白”将多肽或蛋白与体内存在的蛋白区分开。分离的多肽或分离的蛋白不必定需要作为蛋白进行物理分离或纯化，并且也包括存在于细胞培养物上清液或组织样品中的蛋白。分离的多肽或分离的蛋白意指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学制剂的多肽。
在本说明书中，术语“嵌合受体”意指起用于自身免疫病领域中的嵌合自身抗体受体的作用的蛋白，且其也称为CAAR。CAAR是具有带有三个区域的结构的蛋白，即，包含能够被结合自身抗原(自身抗体)且导致自身免疫病的抗体结合的抗原区域的细胞外区域、跨膜区域以及包含细胞内信号传导结构域的细胞内区域，其中所述三个区域以那样的顺序从N-末端向C-末端排列。信号肽可以进一步连接至抗原区域的N-末端。在细胞外区域中，接头区域可以存在于抗原区域和跨膜结构域之间。在细胞内区域中，细胞内共刺激结构域可以存在于细胞内信号传导结构域的N-末端。CAAR中包含的各个区域可以经由由0至10个氨基酸组成的任意间隔区附着。
在本说明书中，细胞外区域通常是这样的区域，当嵌合受体在细胞中表达时其大部分存在于细胞外。不是所述区域中包含的所有氨基酸都必须存在于细胞外。取决于细胞外区域的序列以及任何邻近的氨基酸序列，细胞外结构域的排列可以是这样的，从而使得对应于C-末端的细胞外区域的序列的部分埋入细胞膜中。
在本说明书中，跨膜区域通常是这样的结构域，当嵌合受体在细胞中表达时其大部分存在于细胞膜中。不是所述区域中包含的所有氨基酸都必须存在于细胞膜中。取决于跨膜区域的序列以及任何邻近的氨基酸序列，跨膜区域的排列可以是这样的，从而使得对应于N-末端的跨膜区域的序列的部分可以存在于细胞外和/或C-末端的序列的部分抗原存在于细胞内。
在本说明书中，细胞内区域通常是这样的结构域，当嵌合受体在细胞中表达时其大部分存在于细胞内。不是所述结构域中包含的所有氨基酸都必须存在于细胞内。取决于细胞内区域的序列以及任何邻近的氨基酸序列，细胞内区域的排列可以是这样的，从而使得对应于N-末端的细胞内区域的序列的部分埋入细胞膜中。
癌症治疗领域中适用于嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的各种众所周知的技术可以容易地应用于本发明的嵌合受体。关于涉及CAR-T细胞制备的文献，参见，例如，Uckun等人,2011,Brit.J.Hematol.,153:15-23；US 2012/0141505；和美国专利Nos.5,484,892、5,573,924、6,379,668、7,744,877、8,362,211、9,023,999、8,822,647、9,328,156和9,034,324。
嵌合受体的抗原区域具有模拟导致靶向的自身免疫病的自身抗原(在本发明中为nAChRα1)的至少一部分的结构，并且具有与产生靶向的自身抗体的致病性B细胞和/或浆细胞上表达的BCR特异性结合并将结合信号转导至细胞内信号传导结构域的功能。
在本说明书中，术语“nAChRα1”意指人烟碱性乙酰胆碱受体α1亚基或其细胞外区域。除非另有说明，否则所述术语可用作包括下文描述的突变型nAChRα1的通称，或者其可用于意指天然nAChRα1。术语“AchRα236”用于将由236个氨基酸组成的天然nAChRα1细胞外区域(SEQ ID NO：1)与以后提及的缺失型nAChRα1区分开。
在本说明书中，术语“缺失型nAChRα1”或“AchRα211”意指具有如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的nAChRα1，其中从AchRα236的氨基酸序列缺失了自N-末端起的位置59至84的区域。SEQ ID NO：3代表其中缺失型nAChRα1中的可能取代位点以Xaa表示的氨基酸序列。SEQ ID NO：4代表AChRα236且包括由对应于SEQ ID NO：3中的那些的Xaa代表的可能取代位点(突变型AChRα236)。
在本说明书中，术语“致病性B细胞”意指产生识别自身抗原且导致自身免疫病的自身抗体的B细胞、浆细胞和/或成浆细胞。产生的自身抗体与这种致病性B细胞的细胞表面结合，或者在其细胞表面上表达具有与自身抗体相同的抗原结合特异性的B细胞受体。为了治疗自身免疫病，患者体内的致病性B细胞的量被减少，且这本身又导致体内相应自身抗体的水平也被降低。
在本说明书中，术语“氨基酸”包括每一种天然氨基酸和修饰的氨基酸。术语“保守氨基酸变异”是在不损害蛋白的期望的功能或特征的情况下一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。氨基酸可以彼此保守地取代，只要它们的侧链具有相似的科学和/或空间特征。氨基酸的这种性质已在生物化学或分子生物学领域得到充分分析且众所周知。
在本说明书中，术语“疏水性氨基酸”是带有具有低亲水性或高疏水性的侧链的氨基酸，且为作为天然氨基酸的Val、Ala、Leu、Ile、Gly、Trp、Tyr、Phe、Met或Pro。其中，具有有大体积侧链的疏水性氨基酸的实例包括Trp、Tyr和Phe。具有小侧链的疏水性氨基酸的实例包括Val、Ala、Leu、Ile和Gly。
在本说明书中，术语“亲水性氨基酸”是带有具有高亲水性的侧链的氨基酸，且为作为天然氨基酸的Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln或Ser。酸性氨基酸是Asp或Glu。碱性氨基酸是Arg或Lys。在其侧链中具有酰胺基的氨基酸是Asn或Gln。
在本说明书中，术语“多核苷酸”意指其中由天然碱基、糖和糖间(主链)键组成的核苷或核苷酸单体根据预定的核苷酸序列连接的核酸。所述术语还包括包含非天然单体或其部分的修饰或取代的序列。本发明的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)、核糖核酸序列(RNA)或DNA-RNA杂合体，并且含有天然碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶。这些序列还可以含有修饰的碱基。这种修饰的碱基的实例包括氮杂和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶以及黄嘌呤和次黄嘌呤。
在本说明书中，术语“分离的核酸”意指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学制剂的核酸。分离的核酸也基本上不含在相应的天然形式中侧接分离的核酸由其衍生的核酸的序列(即，位于所述核酸的5'和3'端的序列)。术语“核酸”包括DNA和RNA，其可以是双链或单链，并且对应于有义链或反义链。术语“核酸”进一步包括互补核酸序列，例如，cDNA。
在本说明书中，术语“细胞”意指具有限定的功能的细胞或包含这种细胞的细胞群体。细胞可以是从其天然位置分离的含有细胞的样品，或可以是作为不同细胞的混合物的细胞群体，只要所述群体包括保持限定的功能的细胞。细胞可以取决于寻求的特定特征在可能已经历或可能尚未经历分离或浓缩的样品中提供。细胞的实例包括，但不限于，从活体收集的细胞(组织细胞、血液细胞、淋巴细胞、骨髓细胞等)，确立的细胞系，通过转染进行基因工程改造的细胞，成体干细胞例如间充质干细胞和造血干细胞，多潜能干细胞例如ES细胞和iPS细胞，以及通过成体干细胞或多潜能干细胞的人工诱导或分化而获得的细胞。
在本说明书中，术语“基因工程细胞”意指用编码嵌合受体的多核苷酸转染的细胞。转染方法没有特别限制，并且可以应用生物遗传学(biogenetic)或分子生物学领域中通常使用的各种方法。待人工改造的细胞没有特别限制。当待人工改造的细胞是T细胞时，基因工程细胞也称为“CAAR-T细胞”或“CAAR-T”。
本发明的基因工程细胞一般施用或移植至患有自身免疫病的患者。在自体细胞治疗中，使用衍生自待治疗的患者的细胞用于施用或移植。在同种异体细胞治疗中，待施用或移植的细胞的来源不受限制，只要细胞不易受免疫排斥的影响并且可以用于同种异体疗法即可。细胞可以是单一细胞，或可以是作为不同细胞类型的混合物的细胞群体。
在本说明书中，术语“T细胞”意指具有所述技术领域中允许其分类为T细胞的生物学、分子生物学、形态学或遗传特征的细胞，或包含这种细胞的细胞群体。T细胞的这种特征的例子包括表面标志物的表达，例如T细胞抗原受体(TCR)/CD3复合物。表达T细胞标志物以及对应于个别T细胞群体的其他标志物(例如，CD4、CD8和TCR亚型)并且具有与其他个别T细胞群体类似的功能的细胞群体可以用作T细胞。
T细胞可以作为已被分离或浓缩以获得对于T细胞标志物阳性的T细胞的细胞群体提供，或者T细胞可以作为尚未基于任何T细胞标志物经受分离或浓缩的含有T细胞的生物样品(一般是血液或其加工的材料)中的细胞群体提供。这种细胞群体的实例包括血液细胞、血细胞和外周血单核细胞(PBMCs)。通过诱导成体干细胞(造血干细胞)或多潜能干细胞分化为T细胞而获得的细胞群体也作为T细胞包括在内。
在本说明书中，术语“基因工程T细胞”意指被转染的上文限定的基因工程细胞，其可以是T细胞或包含T细胞的细胞群体。本发明的基因工程T细胞包括具有特定功能的细胞，例如已使用T细胞标志物以及个别T细胞群体的其他标志物(例如，CD4和CD8)通过分离或浓缩获得的个别类型的T细胞。
在本说明书中，术语“治疗”是针对疾病或症状获得有益的或期望的与健康相关的临床结果的方法。有益的或期望的临床结果可以包括，但不限于，一种或多种症状或病理状况的减轻或改善、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定化(即，不恶化)、疾病扩散的预防、疾病进展的延迟或减慢、疾病状况的改善或减轻以及缓和(部分或完全)，无论上述特征可检测还是不可检测。“治疗”还可以意指与没有治疗的情况下的预期存活时间段相比存活时间段的延长。术语“减轻”疾病或病症意指与不治疗病症的情况相比，病症或疾病状况的程度和/或不期望的临床表现被减轻和/或进展的时间进程被减慢或延长。
在本说明书中，术语“衍生自分子或区域的氨基酸序列的氨基酸序列或区域”意指由基于原始分子或区域的序列的氨基酸序列组成的序列，任选地包括一个或多个氨基酸的突变，其中所述突变的序列保持原始分子或区域的功能或活性高于一定水平。氨基酸突变的形式不受限制，且只要突变是本领域技术人员基于原始分子或区域的类型、功能和序列通过通常的反复试错过程而做出的并且所述突变被合理地预测维持其功能或活性，所述突变就被接受。这种突变的实例包括，但不限于，保守氨基酸取代，用具有相似功能或物理化学性质的氨基酸取代，在对功能或活性具有低贡献的区域中取代、缺失、插入或添加氨基酸，以及在所述区域的N-末端或C-末端的几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加。待突变的氨基酸数目通常为15个或更少，优选为0个或更少，更优选为7个或更少，进一步优选为5个、4个、3个、2个或1个。
<嵌合受体和多肽>
本发明的多肽具有包含能够被抗-nAChRα1抗体结合的抗原区域的细胞外区域，并且所述多肽能够起嵌合受体的作用。抗原区域是包含由211个氨基酸组成的缺失型nAChRα1细胞外区域(SEQ ID NO：2：AChRα211)的区域，其中从由236个氨基酸组成的天然nAChRα1细胞外区域(SEQ ID NO：1：AChRα236)的N-末端起位置59至83的区域已被缺失，或包含通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加(也统称为“突变”)而衍生自如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的氨基酸序列的区域。
SEQ ID NO：2中待取代的氨基酸的实例可以包括由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：42中的Xaa所代表的氨基酸。然而，待突变的位点不限于此，只要保持嵌合受体的功能即可。
在本说明书中，氨基酸取代突变由SEQ ID NO：2中感兴趣的氨基酸位置前面的原始氨基酸的指示和感兴趣的氨基酸位置后面的取代氨基酸的指示表示。这些氨基酸各自通过单字母密码表示。如果包括的话，多个氨基酸突变由通过“/”定界的各个突变代表。例如，SEQ ID NO：2的位置8的Val被Glu取代、位置149的Trp被Arg取代以及位置155的Val被Ala取代的抗原区域可以由“AChRα211/V8E/W149R/V155A”代表。
当SEQ ID NO：3的氨基酸Xaa8是Val或Glu时，已证实所得到的多肽起CAAR的作用。因此，它由多种多样的氨基酸取代是被接受的。取代优选为由疏水性氨基酸或酸性氨基酸，更优选为由具有小侧链的疏水性氨基酸或酸性氨基酸，进一步优选为由Val或Glu的，最优选为由Val。
当SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：42的氨基酸Xaa14是Asp、Ala或Gly时，已证实所得到的多肽起CAAR的作用。因此，它由多种多样的氨基酸取代是被接受的。取代优选为由酸性氨基酸或疏水性氨基酸，更优选为由酸性氨基酸或具有小侧链的疏水性氨基酸，进一步优选为由Asp、Ala或Gly。
当SEQ ID NO：3的氨基酸Xaa70是Asp、Asn或Ala时，所得到的多肽起CAAR的作用。因此，它由多种多样的氨基酸取代是被接受的。取代优选为由酸性氨基酸、具有包含酰胺基的侧链的氨基酸或疏水性氨基酸，更优选为由Asp、Asn或Ala。
当SEQ ID NO：3的氨基酸Xaa72是Tyr或Phe时，已证实所得到的多肽起CAAR的作用。因此，它由多种多样的氨基酸取代是被接受的。取代优选为由疏水性氨基酸，更优选为由具有大体积侧链的疏水性氨基酸，且进一步优选为由Tyr或Phe。
当SEQ ID NO：3的氨基酸Xaa112是Tyr或Phe时，已证实所得到的多肽起CAAR的作用。因此，它由多种多样的氨基酸取代是被接受的。取代优选为由疏水性氨基酸，更优选为由具有大体积侧链的疏水性氨基酸，进一步优选为由Tyr或Phe。
当SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：42的氨基酸Xaa149是Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro时，已证实所得到的多肽起CAAR的作用。因此，它由多种多样的氨基酸取代是被接受的。取代优选为由亲水性氨基酸或疏水性氨基酸，更优选为由Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro，且进一步优选为由Trp、Arg、Lys或Pro。
当SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：42的氨基酸Xaa155为Val、Arg、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro时，已证实所得到的多肽起CAAR的作用。因此，它由多种多样的氨基酸取代是被接受的。取代优选为由疏水性氨基酸或亲水性氨基酸，更优选为由Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro，且进一步优选为由Val、Lys、Ala、Met、Asp、Pro或Gly。
对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置146至159的区域是富含疏水性氨基酸的区域。即使当所述区域的各个氨基酸适当地由Lys取代时，具有所得到的序列的多肽也已被证实起CAAR的作用。因此，在对应于SEQ ID NO：3的Xaa146至Xaa159的区域中，除Xaa149和Xaa155以外的氨基酸被多种多样的氨基酸取代是可能的。取代优选为由碱性氨基酸或疏水性氨基酸，更优选为由SEQ ID NO：2中相应位点的氨基酸或Lys。从SEQ ID NO：3的Xaa146至Xaa159的区域的氨基酸序列的具体实例包括如SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：23所述的序列。
即使当SEQ ID NO：3的Xaa192和Xaa193(原始序列中的Cys)的每一个都由Gly取代，所得到的序列也已被证实起CAAR的作用。因此，其由多种多样的氨基酸取代是可能的。每个氨基酸可以独立地保持为Cys或由Gly取代，优选地至少一个氨基酸保持为Cys，而另一个氨基酸由Gly取代，且进一步优选地两者均由Gly取代。
本发明的嵌合受体的抗原区域的一种形式是包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的区域，其中Xaa14是Asp、Ala或Gly，Xaa149是Trp、Arg、Lys或Pro，且Xaa155是Lys、Ala、Met、Asp、Pro或Gly。
在所述情况中，其他氨基酸Xaa选自上述氨基酸，且优选尽可能类似于天然nAChRα1的序列的那些以结合致病性B细胞。因此，SEQ ID NO：3中除Xaa14、Xaa149和Xaa155之外取代的氨基酸Xaa的数目优选为10个或更少，更优选为5个或更少，进一步优选为3个、2个或1个，最优选为0个(即，除Xaa14、Xaa149和Xaa155之外的氨基酸Xaa为SEQ ID NO：2中的相应氨基酸，从而使得抗原区域的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：42)。当取代时，SEQ ID NO：3中除Xaa149和Xaa155之外的Xaa优选选自Xaa8、Xaa70、Xaa72、Xaa192和Xaa193，更优选选自Xaa8、Xaa192和Xaa193。
本发明的嵌合受体中含有的抗原区域的具体实例可以包括AChRα211、AChRα211/V8E、AChRα211/W149R、AChRα211/W149K、AChRα211/W149P、AChRα211/V155A、AChRα211/V155K、AChRα211/V155M、AChRα211/V155D、AChRα211/V155P、AChRα211/C192G、AChRα211/C193G、AChRα211/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149R、AChRα211/V8E/W149K、AChRα211/V8E/W149P、AChRα211/V8E/V155A、AChRα211/V8E/V155K、AChRα211/V8E/V155M、AChRα211/V8E/V155D、AChRα211/V8E/V155P、AChRα211/V8E/C192G、AChRα211/V8E/C193G、AChRα211/V8E/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/V155K、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/W149R/V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/W149R/C192G、AChRα211/W149R/C193G、AChRα211/W149R/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/V155K、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/W149K/V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/W149K/C192G、AChRα211/W149K/C193G、AChRα211/W149K/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155A、AChRα211/W149P/V155K、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/W149P/V155D、AChRα211/W149P/V155P、AChRα211/W149P/C192G、AChRα211/W149P/C193G、AChRα211/W149P/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149R/V155A、AChRα211/V8E/W149R/V155K、AChRα211/V8E/W149R/V155M、AChRα211/V8E/W149R/V155D、AChRα211/V8E/W149R/V155P、AChRα211/V8E/W149R/C192G、AChRα211/V8E/W149R/C193G、AChRα211/V8E/W149R/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149K/V155A、AChRα211/V8E/W149K/V155K、AChRα211/V8E/W149K/V155M、AChRα211/V8E/W149K/V155D、AChRα211/V8E/W149K/V155P、AChRα211/V8E/W149K/C192G、AChRα211/V8E/W149K/C193G、AChRα211/V8E/W149K/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149P/V155A、AChRα211/V8E/W149P/V155K、AChRα211/V8E/W149P/V155M、AChRα211/V8E/W149P/V155D、AChRα211/V8E/W149P/V155P、AChRα211/V8E/W149P/C192G、AChRα211/V8E/W149P/C193G、AChRα211/V8E/W149P/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155A/C192G、AChRα211/W149R/V155K/C192G、AChRα211/W149R/V155M/C192G、AChRα211/W149R/V155D/C192G、AChRα211/W149R/V155P/C192G、AChRα211/W149K/V155A/C192G、AChRα211/W149K/V155K/C192G、AChRα211/W149K/V155M、/C192G、AChRα211/W149K/V155D/C192G、AChRα211/W149K/V155P/C192G、AChRα211/W149P/V155A/C192G、AChRα211/W149P/V155K/C192G、AChRα211/W149P/V155M、/C192G、AChRα211/W149P/V155D/C192G、AChRα211/W149P/V155P/C192GAChRα211/W149R/V155A/C193G、AChRα211/W149R/V155K/C193G、AChRα211/W149R/V155M/C193G、AChRα211/W149R/V155D/C193G、AChRα211/W149R/V155P/C193G、AChRα211/W149K/V155A/C193G、AChRα211/W149K/V155K/C193G、AChRα211/W149K/V155M/C193G、AChRα211/W149K/V155D/C193G、AChRα211/W149K/V155P/C193G、AChRα211/W149P/V155A/C193G、AChRα211/W149P/V155K/C193G、AChRα211/W149P/V155M/C193G、AChRα211/W149P/V155D/C193G、AChRα211/W149P/V155P/C193G、AChRα211/W149R/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155K/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155P/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155K/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155P/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155K/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155P/C192G/C193G、AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/D14G/W149R/V155A、AChRα211/D14G/W149R/V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/D14G/W149R/V155P、AChRα211/D14G/W149R/V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/D14G/W149K/V155A、AChRα211/D14G/W149K/V155M、AChRα211/D14G/W149K/V155D、AChRα211/D14G/W149K/V155P、AChRα211/D14G/W149K/V155G、AChRα211/D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/W149P/V155A、AChRα211/D14G/W149P/V155M、AChRα211/D14G/W149P/V155D、AChRα211/D14G/W149P/V155P、AChRα211/D14G/W149P/V155G、AChRα211/D14A/W149R/V155K、AChRα211/D14A/W149R/V155A、AChRα211/D14A/W149R/V155M、AChRα211/D14A/W149R/V155D、AChRα211/D14A/W149R/V155P、AChRα211/D14A/W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/W149K/V155A、AChRα211/D14A/W149K/V155M、AChRα211/D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/W149K/V155P、AChRα211/D14A/W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/W149P/V155A、AChRα211/D14A/W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/W149P/V155P和AChRα211/D14A/W149P/V155G。
待在本发明的嵌合受体中包括的抗原区域除在SEQ ID NO：3中由Xaa代表的氨基酸的取代之外，还可以具有一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加(在下文中，称为“额外的突变”)，只要所述嵌合受体在细胞膜中表达且具有被抗-nAChRα1抗体识别的功能即可。这种额外的突变可以在SEQ ID NO：2的任何位置进行，且优选在从N-末端和/或C-末端起的10个氨基酸内的区域中进行，更优选从那里起的5个、4个、3个、2个或1个氨基酸内的位点。待突变的氨基酸的数目为10个或更少，优选5个、4个、3个、2个或1个。抗原区域的额外的突变的形式优选为SEQ ID NO：2的10个或更少的N-末端和/或C-末端氨基酸的缺失或添加，更优选为5个、4个、3个、2个或1个C-末端氨基酸的缺失或添加，进一步优选为5个、4个、3个、2个或1个C-末端氨基酸的添加。
包含本发明的抗原区域的CAAR结合抗人nAChRα1抗体的能力可以通过根据本领域已知的方法通过测试来证实，且抗-nAChRα1抗体与用编码CAAR的多核苷酸转染的细胞的结合可通过下面提及的方法来证实。这种方法的实例可以包括FACS和使用抗-nAChRα1抗体的免疫染色。使用的抗体可以是可商购获得的抗-nAChRα1抗体，或者可以使用包含这种抗体的抗原结合部位的重组蛋白。这种重组蛋白可以参考作为抗-nAChRα1抗体已知的mAb35抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO：33：膜型mAb35，SEQ ID NO：35：mAb35 hIgG1，SEQ ID NO：36：mAb35 hIgGκ)适当地制备。例如，可以使用含有抗体的样品，例如患有MG的患者的血液样品或从所述样品分离或浓缩的抗体组分的样品。已报道从患有MG的患者的血液获得的抗-nAChRα1抗体与mAb35竞争与nAChRα1的结合(非专利文献5：Luo等人，JNeurosci.2009年11月4日；29(44):13898-908)。mAb35被认为识别与患者的自身抗体识别的表位相似的表位。因此，具有能够被mAb35结合的抗原区域的CAAR被认为与致病性B细胞结合。
本发明的嵌合受体可以包含用于使得能够在细胞膜中表达的信号肽。许多分泌性蛋白和膜蛋白的N-末端包含信号肽，其具有，但不限于，大约15至30个氨基酸的长度。这种信号肽不受连接形式或序列类型的限制，只要信号肽不抑制嵌合受体的功能并且其是允许在细胞膜中的表达的形式即可。信号肽的优选的连接点在嵌合受体的N-末端。信号肽的具体实例可以包括CD8α-衍生的信号肽(SEQ ID NO：9)、nAChRα1-衍生的信号肽(SEQ ID NO：10)和人免疫球蛋白衍生的信号肽(SEQ ID NO：11)。可以采用包含上述序列的部分或全部序列的氨基酸序列作为信号肽。
本发明的嵌合受体中的细胞外区域可以具有由大约300个或更少的氨基酸组成并且起将抗原区域连接到跨膜区域的作用的接头区域。各种序列都可以用于接头区域，只要抗原区域与靶致病性B细胞的特异性结合不被显著抑制。所述序列可以是衍生自来源于天然蛋白的接头或铰链区域的序列(例如，CD8、CD28等的铰链区域，衍生自各IgG的铰链区域，以及由4至8个氨基酸组成的铰链区域(短铰链)描述于本领域已知的文献中，例如非专利文献1)，或者所述接头可以是人工设计的序列。接头区域的氨基酸长度为例如300个氨基酸或更少、100个氨基酸或更少或约50个氨基酸或更少。如下面提及的实施例8和实施例10中所示的，即使当本发明的嵌合受体的接头区域以不同方式突变，以便提供接头序列，例如通过在衍生自CD8α(SEQ ID NO：39)或CD28(SEQ ID NO：40)的铰链区域的序列或SEQ ID NO：41的人工设计的接头序列的N-末端缺失氨基酸残基而获得的包含两个或更多个氨基酸的不同长度的序列、或通过将有助于二硫键的Cys取代为Ser而衍生自这种接头序列的序列，或提供不含接头区域的嵌合受体时，细胞膜上的嵌合受体也维持了与抗-nAChRα1抗体结合的能力。因此，已经证实接头区域不受特定序列或长度的限制并且各种氨基酸序列都是可能的。
接头区域优选地促进抗原区域与致病性B细胞上的自身抗体或BCR的结合，并且具有增强信号转导至细胞的序列。预期促进结合的氨基酸的实例包括Cys、荷电氨基酸以及具有潜在糖基化位点内的Ser和Thr。这些氨基酸可以用作构成接头区域的氨基酸。
在本发明的一个方面，嵌合受体中含有的接头区域是衍生自CD8α(NCBI RefSeq：NP_001759.3)的氨基酸位置118至178即CD8α铰链区域、CD8β(GenBank：AAA35664.1)的氨基酸位置135至195、CD4(NCBI RefSeq：NP_000607.1)的氨基酸位置315至396、CD28(NCBIRefSeq：NP_006130.1)的氨基酸位置114至152或其至少部分的氨基酸序列。接头区域的序列优选为包含如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：39所述的CD8α铰链区域中包含的四个或更多个连续氨基酸的序列的氨基酸序列(更优选为对应于氨基酸位置42至45、氨基酸位置38至45、氨基酸位置36至45、氨基酸位置32至45、氨基酸位置27至45、氨基酸位置21至45或氨基酸位置1至45的氨基酸序列)，或包含如SEQ ID NO：40所述的CD28铰链区域中包含的四个或更多个连续氨基酸的氨基酸序列(更优选氨基酸位置36至39、氨基酸位置30至39、氨基酸位置20至39或氨基酸位置1至39)，或如SEQ ID NO：41所述的柔性接头中的区域中包含的四个或更多个连续氨基酸的序列(优选对应于氨基酸位置11至14、氨基酸位置8至14、氨基酸位置4至14或氨基酸位置1至14的氨基酸序列)。
本发明的嵌合受体中所含的跨膜区域没有特别限制，只要所述跨膜区域跨过细胞膜存在即可。跨膜区域可以衍生自天然膜结合的蛋白或者可以是人工设计的。本发明的嵌合受体中可以包括的跨膜区域的实例包括，但不限于，衍生自nAChRα1、T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD27、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR等的跨膜结构域的氨基酸序列。优选CD8α跨膜结构域(SEQID NO：6)、CD28跨膜结构域(SEQ ID NO：37)或nAChRα1跨膜结构域(SEQ ID NO：38)。人工设计的跨膜区域一般具有包含疏水性氨基酸的氨基酸序列。例如，在合成的跨膜区域的每一端都可以发现Phe、Trp和Val的三联体。
在另一个方面，当本发明的嵌合受体包括至少包含天然膜型蛋白的铰链区域的C-末端的区域的接头区域时，所述接头区域和所述嵌合受体中要包括的跨膜区域可以衍生自相同的蛋白(例如，CD8α的铰链区域和跨膜结构域的组合，或CD28的铰链区域和跨膜结构域的组合)。结果，细胞外区域的细胞膜附近的结构可以是与天然蛋白的结构类似的结构。
本发明的嵌合受体可以被进行设计以形成多聚体，特别地，二聚体。例如，可以将Cys插入接头区域和/或跨膜区域，以通过二硫键多聚化(二聚化)嵌合受体。在下面提及的实施例10中，使用CD8α和CD28-衍生的铰链区域作为接头区域，并且证实即使当铰链区中所含的Cys被Ser取代时(SEQ ID NO：39的Xaa27和Xaa44或SEQ ID NO：40的Xaa28)，也维持了CAAR的功能。
本发明的嵌合受体的细胞内区域具有用于将自身抗体与抗原区域的结合产生的信号转导至细胞内并激活表达所述嵌合受体的T细胞的细胞毒活性的细胞内信号传导结构域。所述结构域没有特别限制，并且可以对其应用衍生自CAR-T技术领域中一般使用的结构域的任何序列。起源结构域的代表性实例可以包括CD3ζ泛细胞内信号传导结构域(SEQ IDNO：8)和CD3δ细胞内信号传导结构域。
本发明的嵌合受体中的细胞内区域除了细胞内信号传导结构域之外，还可以具有细胞内共刺激结构域用于进一步增强信号。所述区域没有特别限制，且可以对其应用衍生自CAR-T技术领域中一般使用的分子或在T细胞表面表达且已知增强T细胞的激活的分子的细胞内结构域或共刺激结构域的任何序列。细胞内共刺激结构域的实例包括衍生自CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137(4-1BB)、ICOS、GITR、TNFR2、DR3、CD30、HVEM、CD27、OX40和CD154的细胞内结构域，其包含信号传导基序的末端截短的片段，以及其共刺激结构域的序列。上文提及的共刺激结构域的具体实例包括对应于CD2(NCBI RefSeq：NP_001758.2)的氨基酸位置236至351、CD4(NCBI RefSeq：NP_000607.1)的氨基酸位置421至458、CD5(NCBI RefSeq：NP_055022.2)的氨基酸位置402至495、CD8α(NCBI RefSeq：NP_001759.3)的氨基酸位置207至235、CD8β(GenBank：AAA35664.1)的氨基酸位置196至210、CD28(NCBI RefSeq：NP_006130.1)的氨基酸位置180至220、CD137(4-1BB，NCBI RefSeq：NP_001552.2)的氨基酸位置214至255、CD134(OX40，NCBI RefSeq：NP_003318.1)的氨基酸位置241至277以及ICOS(NCBI RefSeq:NP_036224.1)的氨基酸位置166至199的序列。其其他具体实例可包括4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO：7)、CD28共刺激结构域(SEQ ID NO：25)、GITR共刺激结构域(SEQ ID NO：26)、TNFR2共刺激结构域(SEQ ID NO：27)、DR3共刺激结构域(SEQ ID NO：28)、CD30共刺激结构域(SEQ ID NO：29)、HVEM共刺激结构域(SEQ ID NO：30)、CD27共刺激结构域(SEQ ID NO：31)和OX40共刺激结构域(SEQ ID NO：32)。
当在本发明的嵌合受体中包括共刺激结构域时，可以包括衍生自上述任何一种分子的一种或多种(例如，两种或三种)序列。当包括不止一种序列时，可以任意组合所述序列。这种组合的例子包括CAR-T领域中已知的衍生自CD28和4-1BB的共刺激结构域的组合。
已证实本发明的嵌合受体无论共刺激结构域的类型如何都起作用，这是因为在下面提及的实施例9中证实了包括衍生自各种膜蛋白的共刺激结构域的CAARs都适当地起作用。衍生本发明的共刺激结构域的分子优选是4-1BB、CD28、GITR、TNFR2、DR3、CD30、HVEM、CD27或OX40。
本发明的嵌合受体可以除抗原区域之外还包括CAR-T技术领域或其他生物技术领域中已知的进一步的区域或序列。对应于进一步的区域的本说明书中描述的每种序列是所述区域的代表序列，并且一些代表序列具有一个或几个氨基酸的突变。术语“衍生自”这种本领域已知的序列“的序列”意指与本领域已知的序列相同的序列，或者通过一个或几个氨基酸的突变的引入衍生自本领域已知的序列同时保持相关区域的功能的序列。当这种衍生自本领域已知的区域的序列含有氨基酸突变时，突变的位置不受特别限制，只要保持所述区域的功能。突变优选涉及位于所述区域的功能中心外面的氨基酸。
在本发明的嵌合受体中，可以将由一个或多个连接氨基酸组成的间隔序列插入到各个区域之间。例如，可以使用长度为2至10个氨基酸的间隔序列。特别地，可以使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的间隔序列。
本发明的嵌合受体是，例如，从N-末端到C-末端包含以下区域的多肽：包含由SEQID NO：2的AChRα211或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：42的突变型AChRα211(其中未取代的Xaa是SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸)所代表的序列的抗原区域；由衍生自选自nAChRα1、T细胞受体α链、T细胞受体β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154和GITR的任一结构域的跨膜结构域的序列组成的跨膜区域；和包含衍生自CD3ζ或CD3δ的细胞内信号传导结构域的序列的细胞内区域，优选从N-末端到C-末端包含下述的多肽：选自AChRα211/W149R/V155K、AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/W149R/V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/W149R/V155G、AChRα211/W149K/V155K、AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/W149K/V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/W149K/V155G、AChRα211/W149P/V155K、AChRα211/W149P/V155A、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/W149P/V155D、AChRα211/W149P/V155P、AChRα211/W149P/V155G、AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/D14G/W149R/V155A、AChRα211/D14G/W149R/V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/D14G/W149R/V155P、AChRα211/D14G/W149R/V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/D14G/W149K/V155A、AChRα211/D14G/W149K/V155M、AChRα211/D14G/W149K/V155D、AChRα211/D14G/W149K/V155P、AChRα211/D14G/W149K/V155G、AChRα211/D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/W149P/V155A、AChRα211/D14G/W149P/V155M、AChRα211/D14G/W149P/V155D、AChRα211/D14G/W149P/V155P、AChRα211/D14G/W149P/V155G、AChRα211/D14A/W149R/V155K、AChRα211/D14A/W149R/V155A、AChRα211/D14A/W149R/V155M、AChRα211/D14A/W149R/V155D、AChRα211/D14A/W149R/V155P、AChRα211/D14A/W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/W149K/V155A、AChRα211/D14A/W149K/V155M、AChRα211/D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/W149K/V155P、AChRα211/D14A/W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/W149P/V155A、AChRα211/D14A/W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/W149P/V155P和AChRα211/D14A/W149P/V155G的抗原区域；选自CD8α跨膜结构域(SEQ ID NO：6)、CD28跨膜结构域(SEQ ID NO：37)和AChRα跨膜结构域(SEQ ID NO：38)的任意一种跨膜区域；选自4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO：7)、CD28共刺激结构域(SEQ ID NO：25)、GITR共刺激结构域(SEQ ID NO：26)、TNFR2共刺激结构域(SEQ ID NO：27)、DR3共刺激结构域(SEQ ID NO：28)、CD30共刺激结构域(SEQ ID NO：29)、HVEM共刺激结构域(SEQ ID NO：30)、CD27共刺激结构域(SEQ ID NO：31)和OX40共刺激结构域(SEQ ID NO：32)的任意一种共刺激结构域；和细胞内信号传导结构域，其为CD3ζ细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：8)；并且任选地包含抗原区域和跨膜区域之间的接头区域(其为CD8α铰链序列(SEQ ID NO：39)、CD28铰链序列(SEQ ID NO：40)或人工接头序列(SEQ ID NO：41)的部分或完整序列)。
在一个方面，本发明的嵌合受体可以是包含与SEQ ID NOs：43至47中任一个的氨基酸序列具有80％或更高(优选85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高)的序列同一性的氨基酸序列并且保持作为根据本发明的CAAR的功能的多肽。这种多肽可以在其N-末端包含用于使得能够在细胞表面上表达的信号肽，并且用于确认在细胞表面上表达的标签肽等可以进一步直接或经由间隔区间接连接至SEQ ID NOs：43至47中任一个的氨基酸序列的N-末端。嵌合受体可以是由通过并入几个(20个或更少，优选15个或更少、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加从上述氨基酸序列衍生的氨基酸序列组成的多肽。在多肽的氨基酸序列中，优选SEQ ID NOs：43至47中的位置1至160(优选位置1至170，更优选位置1至180，位置1至190，位置1至200，或位置1至211)的氨基酸被维持，并且其他位置中的氨基酸可以在一定的序列同一性水平上改变。这种嵌合受体的氨基酸序列最优选为SEQ ID NOs：43至47中的任意一种氨基酸序列。
<基因>
本发明提供了包含编码上述嵌合受体多肽的区域的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是包含所述区域的核苷酸片段、mRNA等，并且可以是适合于基因转移并使得嵌合受体能够在细胞膜中表达的形式，例如质粒、载体或病毒。
本发明的多核苷酸可以是具有天然结构的DNA或RNA，或者可以是具有化学修饰的结构的修饰的核酸。例如，当本发明的多核苷酸以mRNA的形式提供给细胞时，使用修饰的核酸以使得mRNA对被RNA酶降解具有抗性。优选地，修饰mRNA的碱基部分。例如，优选在5-位置具有取代的嘧啶核苷酸或在1-位置具有取代的假尿苷。其具体实例可包括5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷和1-烷基假尿苷。1-烷基假尿苷可以是1-(C1-C6烷基)假尿苷，且优选是1-甲基假尿苷或1-乙基假尿苷。
编码本发明的嵌合受体的多核苷酸可以通过常规方法由公开的氨基酸序列容易地制备。编码氨基酸序列的核苷酸序列可以基于如序列表中所述的氨基酸序列获得。核苷酸序列可以从上文对应于每个区域的氨基酸序列提及的NCBI RefSeqID编号或GenBank检索号获得，并且本发明的多核苷酸可以使用标准分子生物学和/或化学程序来制备。例如，可以基于核苷酸序列合成核酸，并且可以通过组合通过聚合酶链反应(PCR)从cDNA文库获得的DNA片段来制备本发明的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以与另一种核酸连接，以便在优选的启动子的控制下表达。启动子的实例包括连续促进基因或可操作地连接的构建体表达的组成型启动子，以及通过药物等(例如，四环素或阿霉素)的作用诱导基因或可操作地连接的构建体表达的诱导型启动子。本公开内容的多核苷酸还可以连接至其他调节元件，例如，增强子序列或终止子序列，其与启动子或转录起始位点配合，以获得核酸的有效转录。本发明的多核苷酸可以与能够充当用于确认多核苷酸表达的标志物(例如，抗药性基因、编码报道酶的基因或编码荧光蛋白例如GFP或BFP的基因)、标签序列(FLAG、His标签等)的基因结合。
本发明的多核苷酸可以具有用于在特定宿主细胞中表达的密码子优化的核苷酸序列。如此优化的核苷酸序列可以通过应用本领域已知的算法或软件从感兴趣的氨基酸序列获得。
本发明提供了包含有效量的本发明的多核苷酸以及药学上可接受的赋形剂的组合物。优选的药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员众所周知的。药学上可接受的赋形剂的实例包括磷酸缓冲盐水(例如，0.01M磷酸盐，0.138M NaCl，0.0027M KCl，pH 7.4)，含有无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐的水溶液，盐水，乙二醇或乙醇的溶液，以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。可以使用辅药例如润湿剂或乳化剂以及pH缓冲剂。Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)(其引入本文作为参考)中描述的赋形剂可以适当地用作药学上可接受的赋形剂。本公开内容的组合物可以配制成优选用于肠胃外施用的已知形式，例如，注射或输注。进一步地，本公开内容的组合物可以含有制剂添加剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂，以及用于延长保存期间功效的防腐剂。所述组合物可以是干燥形式，用于在使用前用适当的无菌液体重构。对于通过细颗粒介导的施用，可以用DNA包被诸如微观尺寸的金颗粒的颗粒。
在将本发明的多核苷酸先体外后体内转移至细胞的情况下，除了上述赋形剂之外，本发明的多核苷酸还可以与促进其转移至细胞的物质组合，例如用于核酸转移的试剂，例如脂质体或阳离子脂质。另一方面，如下面所提及的，包含本发明的多核苷酸的载体也是有用的。
可以施用含有本发明的多核苷酸作为活性成分的组合物用于治疗由针对nAChRα1的自身抗体引起的自身免疫病(特别地，重症肌无力)。包含本发明的多核苷酸作为活性成分的组合物可以通过肠胃外施用，例如，通过注射或输注，皮内地、肌内地、皮下地、腹膜内地、鼻内地、动脉内地、静脉内地、肿瘤内地或进入输入淋巴管施用，或可以适当配制用于这种施用，尽管施用途径没有特别限制。
包含本发明的多核苷酸的载体没有特别限制，只要所述载体通常用于生物遗传学领域即可。可以使用质粒载体、病毒载体、非病毒载体等。本发明提供了包含本发明的多核苷酸的这种载体。
例如，病毒载体例如反转录病毒载体(包括致癌反转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体、EB病毒(EBV)载体或HSV载体可以用作本发明中的病毒载体。例如，可以使用缺乏复制能力从而不在感染的细胞中自我复制的病毒载体。
作为进一步的例子，脂质体或包含阳离子脂质等的细颗粒可以用作非病毒载体，如WO96/10038、WO97/18185、WO97/25329、WO97/30170和WO97/31934中所述的(其引入本文作为参考)。作为额外的例子，由通过辐射破坏病毒颗粒的内部部分获得的外壳已用于如Jin等人，EMBO Mol Med.2016年7月；8(7):702-711中描述的用于转移用于支架/基质附着区的表达的附加型载体的方法中，且可以用于本发明中；也可以使用Mol Ther MethodsClin Dev.2017年12月22日；8:131-140中描述的基于转座子的转移方法例如PiggyBac方法中采用。
为了制备病毒载体，设计包含编码本发明嵌合受体的序列和对于封入病毒中所必需的序列(例如，LTR序列)的质粒，以使得本发明的多肽能够在用病毒感染的细胞中适当表达，并将所述质粒转移到适当的细胞(特别地，包装细胞)中。收集并浓缩病毒级分用于生产病毒载体。本发明提供了供生产病毒载体之用的这种质粒。
用于生产病毒载体的质粒可以使用可商购获得的试剂盒根据所附的规程来制备。作为这种试剂盒，适合病毒类型的各种试剂盒都是可商购获得的。质粒制备试剂盒的实例包括用于慢病毒的pLVSIN EF1αpur(Takara Bio Inc.,6186)、用于反转录病毒的pQCXIX(Takara Bio Inc.,Z1515N)和用于腺伴随病毒的pAAV-CMV(Takara Bio Inc.,6651)。
在一个方面，封入了本发明的多核苷酸的病毒可以通过将上述用于病毒制备的质粒转移到携带病毒颗粒形成所必需的组分基因的包装细胞中并收集培养的细胞的溶液来制备。可以使用的包装细胞的例子包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12(美国专利No.5,278,056)和Psi-Crip[Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America，第85卷，第6460-6464页(1988)]。
在另一个方面，封入了本发明的多核苷酸的病毒可以通过将上述用于病毒制备的质粒与病毒颗粒形成所必需的组分基因一起转移至细胞并回收培养的细胞的溶液来制备。包装信号序列转移试剂可以取决于病毒的类型或根据制备试剂盒的规程适当选择。对于慢病毒，例如，可以使用慢病毒高滴度包装混合物(Lentiviral High Titer Packaging Mix)(Takara Bio Inc.,6194)。作为进一步的例子，可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞(具体地，Lenti-X 293T细胞系(Takara Bio Inc.,632180))。可以在转移质粒时添加辅助转移试剂(例如，Opti-MEM I减少血清培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.,31985070))。
本发明的病毒载体可以作为携带上述质粒的培养的细胞的上清液提供，或者可以将所述病毒载体浓缩以供使用。对于病毒载体的浓缩，可以取决于病毒载体的类型使用适当的试剂盒(例如，Lenti-X浓缩器(Takara Bio Inc.,631232))。
本发明的质粒通常以保持在适当细胞中的形式贮藏，并且可以在期望的时间通过培养含有所述质粒的细胞以使得能够增殖且然后对其施加刺激用于诱导病毒产生来用于产生病毒载体。病毒载体可以通过从培养液分离或浓缩病毒组分而获得。这种用于贮藏的含有质粒的细胞没有特别限制，并且可以使用本领域中已知的技术中使用的细胞类型。
为了生产病毒载体，将慢病毒质粒、慢病毒高滴度包装混合物(Takara Bio Inc.,6194)和TransIT-293转染试剂(Takara Bio Inc.,MIR2704)与Opti-MEM I减少血清培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.,31985070)混合，温育15分钟，且然后添加至已预先培养从而使得细胞半汇合的Lenti-X 293T细胞系(Takara Bio Inc.,632180)。在添加后24至48小时收集培养物上清液。根据制造商的规程使用Lenti-X浓缩器(Takara Bio Inc.,631232)浓缩培养物上清液中含有的病毒载体。
<细胞和用于生产所述细胞的方法>
本发明提供了含有编码上述嵌合受体的多核苷酸的宿主细胞。
衍生自哺乳动物的细胞例如人细胞，或衍生自非人哺乳动物例如猴、小鼠、大鼠、猪、马或狗的细胞可用于本发明中。优选人细胞。
本公开内容中使用的细胞不受其类型的特别限制，并且可以使用任何类型的细胞。例如，可以使用从体液、组织或器官例如血液(外周血、脐带血等)或骨髓收集、分离或纯化的细胞，或多潜能干细胞，例如iPS或ES细胞，其分化为上文提及的细胞(参见例如，Themeli等人，2013)。可以使用外周血单核细胞(PBMC)、免疫细胞(包括，例如，T细胞、树突细胞、B细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞或造血细胞(嗜中性粒细胞或嗜碱性粒细胞))、脐带血单核细胞、成纤维细胞、前体脂肪细胞、肝细胞、皮肤角质形成细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、各种癌细胞系或神经干细胞。例如，可以使用NK细胞或T细胞、T细胞的前体细胞(造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等)或含有这些细胞的细胞群体。T细胞的实例包括CD8-阳性T细胞、CD4-阳性T细胞、调节T细胞、细胞毒性T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。含有T细胞和T细胞的前体细胞的细胞群体包括PBMCs。这些细胞可以从活体收集，可以通过从活体收集的细胞的扩充培养获得，或者可以确立为细胞系。如果期望将制备的CAAR-表达细胞或通过制备的CAAR-表达细胞的分化获得的细胞移植到活体中，则可以用本发明的多核苷酸转染从活体本身或相同物种的另一个活体收集的细胞。
在一个方面，本发明的基因工程细胞是在细胞膜中表达上述嵌合受体的细胞。这种细胞具有经由嵌合受体的抗原区域与特定致病性B细胞结合并将结合信号转导至细胞内信号传导结构域从而使得所述细胞被激活的性质。表达本发明的嵌合受体的细胞的激活取决于宿主细胞的类型和嵌合受体中包含的细胞内结构域而不同，并且可以基于参数来确定，例如细胞因子释放、细胞增殖率的改善或细胞表面分子的变化。
当本发明的基因工程细胞的宿主细胞是T细胞时，这种细胞也称为CAAR-T细胞。当宿主细胞是T细胞时，通过上述信号转导激活的细胞释放细胞毒性细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)并对靶细胞发挥杀细胞活性或细胞毒性。此外，细胞因子释放或细胞表面分子的变化刺激其他免疫细胞，例如，B细胞、树突细胞、NK细胞和巨噬细胞。因此，可以从身体减少或消除产生针对nAchRα1的自身抗体的细胞，并且可以治疗由自身抗体引起的疾病或症状。
用于制备本发明的基因工程细胞的方法包括用本发明的多核苷酸转染细胞的步骤。所述步骤先体外后体内或体外进行。例如，可以使用包含本发明的多核苷酸的病毒载体或非病毒载体根据常规方法先体外后体内或体外转染细胞，以便获得表达本发明的嵌合受体的细胞。
用本发明的多核苷酸转染细胞的合适方法是本领域已知的。标准的生物遗传学和分子生物学方法一般应用于制备CAR-T细胞的方法。可以通过使用本领域众所周知的各种转染技术等将本发明的多核苷酸转移至感兴趣的细胞。在另一个方面，本发明的多核苷酸可以例如通过使用CRISPR/Cas9或锌指核酸酶的基因组编辑技术转移至感兴趣的细胞的基因组中(例如，美国专利No.8,956,828)。
在一个方面，患者衍生的抗体或mAb35抗体能够结合在本发明的基因工程T细胞的细胞表面上表达的嵌合受体。
在一个方面，本发明的基因工程T细胞表现出针对产生mAb35的杂交瘤的细胞毒活性。
在一个方面，本发明提供了用于制备基因工程细胞的方法，包括用本发明的多核苷酸或载体转染细胞。
当本发明的方法应用于自体细胞治疗时，可以采用包括以下步骤的方法：
a)从待治疗的个体收集待人工改造的细胞；
b)用包含本发明的多核苷酸的载体转染所述收集的细胞；和
c)扩充培养包含嵌合受体表达细胞的细胞群体。
在一个方面，在转染之前用可溶性或膜结合的抗-CD3抗体(例如，OKT3或mOKT3)和/或APC(例如，人工APC(aAPC)或表达膜型抗-CD3单克隆抗体的APC)刺激收集的待人工改造的细胞(优选包含T细胞的细胞群体，更优选PBMCs或CD3-阳性细胞级分)。
在另一个方面，将待人工改造供转染之用的细胞以给定的细胞密度悬浮(例如，0.1至2×106个细胞/mL)并添加至病毒结合的平板。病毒结合的平板可以通过将上述病毒浓缩物添加到用5至10ng/mL抗-CD3抗体(克隆名称：OKT3)和20至100μg/mL RetroNectin包被的平板中来制备。
例如，可以使用补加有血清或血清替代物(serum replacement)和细胞因子如IL-2的培养基(例如，AIM-V培养基(Thermo Fisher ScientificInc.,12055083))作为用于转染的培养基。可以对补加有细胞的病毒结合的平板进行离心。
转染步骤b)可以重复多次。例如，可以进行转导步骤直到达到足够的表达水平为止。作为进一步的例子，转导步骤可以进行2至10次，优选2、3、4或5次。
在一个方面，在转染步骤中，细胞可以连续培养连续两天或更多天，例如，连续两天、连续三天或连续四天。在使用病毒结合的平板的情况下，每2至3天将培养基用新鲜培养基置换，并且细胞可以培养连续5至20天。
在一个方面，用抗-nAChRα1抗体或表达识别nAChRα1的BCR的照射的细胞刺激本发明的基因工程细胞。例如，用照射的细胞以100:1、75:1、50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50或1:100的效应物:靶比刺激本发明的基因工程T细胞。
当本发明的基因工程细胞用于同种异体细胞治疗时，可以通过通常的转染方法或基因编辑方法将本发明的多核苷酸转移至细胞(例如，多潜能干细胞如ES细胞或iPS细胞、通过诱导这些细胞的分化获得的血细胞或已进行处理以便避免免疫排斥的体细胞或血细胞)。通过基因组编辑技术将本发明的多核苷酸例如转移至多潜能干细胞例如ES细胞或iPS细胞的基因组中，以确立具有适当整合的多核苷酸的多潜能干细胞。由于多潜能干细胞能够增殖，所以本发明的基因工程细胞可以通过在需要的时间诱导必需量的增殖并诱导分化为T细胞而用于同种异体细胞治疗。
<药物组合物和治疗方法>
本发明的基因工程细胞可以用于由针对nAchRα1的自身抗体引起的主体中的自身免疫病的治疗。使用本发明的基因工程细胞的治疗是通过减少所述主体中表达抗-nAChRα1自身抗体的致病性B细胞的数目来实现的。本发明提供例如含有这种基因工程细胞作为活性成分的自身免疫病的治疗药物，以及通过施用所述细胞来治疗自身免疫病的方法。自身免疫病的典型例子包括重症肌无力(MG)。
如本说明书中所提及的CAAR-T细胞的有效量意指在不导致对人患者的毒性的情况下导致期望的治疗终点(例如，症状的减轻、改善或去除，或者人患者的自身抗体或同种抗体的减少或去除)的量。仅作为实例，待施用于人患者的CAAR-T细胞的有效量可以意指约104至约109个CAAR-T细胞(例如，约105至约106个CAAR-T细胞)/kg人患者的体重。
含有本发明的细胞作为活性成分的治疗药物可以通过肠胃外施用，例如，通过注射或输注，皮内地、肌内地、皮下地、腹膜内地、鼻内地、动脉内地、静脉内地、肿瘤内地或进入输入淋巴管施用，尽管施用途径没有限制。优选静脉内施用。
待用本发明的细胞治疗的患者可以经受CAR-T细胞领域中已知的各种预处理。
患者体内的抗-nAChRα1自身抗体与本发明的细胞的结合可能降低其药理作用，这是因为被自身抗体识别的细胞经历通过体内的巨噬细胞的消除。因此，可以对待用本发明的细胞治疗的患者进行预处理，以便在施用前暂时达到具有血液中减少量的抗-nAChRα1自身抗体或血液中增加量的IgG的状态，并且本发明的细胞可以在本发明的细胞可以结合致病性B细胞的环境中施用。作为这种预处理的实例，本发明的细胞可以在透析后施用于患者。患者经历透析，以便除去血液中的血浆成分，以逐渐降低血液中的抗-AChRα1抗体的水平。
进一步地，在特定部分中描述的定义和实施方案意图适用于本文中描述的它们适合的其他实施方案，如本领域技术人员将理解的。例如，在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面都可以与任何其他一个或多个方面组合，除非清楚地相反地表明。特别地，被指示为优选或有利的任何特征都可以与被指示为优选或有利的任何其他一种或多种特征组合。
以上公开内容概括地描述了本申请。通过参考下面给出的实施例可以获得更完整的理解。描述这些实施例仅仅是为了举例说明起见，且不意图限制本申请的范围。当情况可能提示或使得便利时，还可以预期形式的改变和等同方案的替代。尽管在本说明书中使用了特定术语，但是这种术语意图是在描述性意义上而不是用于限制目的。
实施例
以下提供的实施例中使用的AchRα211突变体(SEQ ID NO：3)的标记中，SEQ IDNO：3中Xaa代表的氨基酸指与SEQ ID NO：2的原始序列中的相应位点相同的氨基酸，除非详细说明了特定氨基酸(例如，Xaa8是V、Xaa14是D、Xaa70是D、Xaa72是Y、Xaa112是Y、Xaa192是C和Xaa193是C)。在AchRα236突变体(SEQ ID NO：4)的标记中，SEQ ID NO：3中Xaa代表的氨基酸指与SEQ ID NO：1的原始序列中的相应位点相同的氨基酸，除非详细说明了特定氨基酸。
在下面提供的实施例中包含每个AchRα的细胞外区域作为抗原区域的嵌合受体(AchRα-CAAR)的描述中，使用人衍生的序列，并且使用CD8α-衍生的接头区域(SEQ ID NO：5)作为接头区域，CD8α-衍生的跨膜结构域(SEQ ID NO：6)作为跨膜区域，4-1BB-衍生的共刺激结构域(SEQ ID NO：7)作为细胞内共刺激结构域，以及CD3ζ-衍生的细胞内信号结构域(SEQ ID NO：8)作为细胞内信号结构域，除非另有详细说明。同样，使用CD8α信号肽(SEQ IDNO：9)作为信号肽。为了确认CAAR表达，经由3-氨基酸间隔区(GSG)将FLAG标签序列放置在AchRα-CAAR的N-末端。为了确认基因转移，自切割肽T2A和荧光蛋白BFP经由3-氨基酸间隔区(GSG)放置在AchRα-CAAR的C-末端。
在下面提供的实施例中，采用以下方法作为各自的实验方法。
[用于CAAR表达的病毒载体的构建]
构建用于表达AchRα-CAAR的慢病毒载体(图1)，其中从N-末端以那样的顺序排列有抗原区域、接头区域、跨膜区域、细胞内共刺激结构域和细胞内信号区域。同样，信号肽被放置在AchRα-CAAR的N-末端。为了确认表达等，在AchRα-CAAR的N-末端放置FLAG标签序列和3-氨基酸间隔区(GSG)，而在其C-末端放置自切割肽T2A和荧光蛋白BFP。将对应于如上所述排列的核苷酸序列插入pLVSIN EF1αpur(Takara Bio Inc.,6186)的多克隆位点，以制备用于插入慢病毒的质粒载体以表达AchRα-CAAR。
[AchRαCAAR-T细胞的制备]
根据pLVSIN EF1αpur的规程，将慢病毒的质粒载体、慢病毒高滴度包装混合物(Takara Bio Inc.,6194)和TransIT-293转染试剂(Takara Bio Inc.,MIR2704)与Opti-MEMI减少血清培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.,31985070)混合，温育15分钟，且然后添加到Lenti-X293T细胞系(Takara Bio Inc.,632180)。Lenti-X293T细胞系的细胞之前已培养直至它们半汇合为止。第二天，将培养基用新鲜培养基置换，且将细胞进一步培养24小时，继之以回收上清液。根据制造商的规程，使用Lenti-X浓缩器(Takara Bio Inc.,631232)浓缩培养物上清液中含有的病毒。根据制造商的规程(Takara Bio Inc.,T100B)，将病毒浓缩物添加至用5至10ng/mL抗-CD3抗体(克隆名称：OKT3)和20至100μg/mLRetroNectin包被的平板中，以制备病毒结合的平板。接着，以0.1-2x106个细胞/mL的浓度将人衍生的外周血单核细胞悬浮于通过将100U/mL IL-2添加至含有5％胎牛血清(FBS)的AIM-V培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.,12055083)(在下文中，称为基础培养基)获得的培养基(在下文中，称为生长培养基)中。将悬浮液添加至病毒结合的平板，以1000g离心30至60分钟，且然后转移至培养箱中并培养。每2至3天将培养基用新鲜的生长培养基置换，并将细胞培养7至14天以制备表达AchRα-CAAR的T细胞(AchRαCAAR-T)。如有必要，使用CELLBANKER 1(Takara Bio Inc.,CB011)深低温保藏回收的细胞。当用于实验中时，在解冻后使用冷冻的细胞，且然后在培养基中温育1天。
[用于确认细胞中CAAR的表达的方法]
将抗-AchRα抗体(mAb35，由来自ATCC的杂交瘤(TIB-175)制备)在FACS缓冲液(含有0.5％BSA、2mM EDTA和0.09％叠氮化物的磷酸缓冲盐水)中悬浮至1-10μg/mL，然后添加到细胞中，并于4℃反应10至20分钟，且用FACS缓冲液洗涤细胞。将APC抗人IgG Fc抗体(BioLegend,Inc.,409306)用FACS缓冲液稀释20至100-倍，然后添加到细胞中，并于4℃反应10至20分钟，且用FACS缓冲液洗涤细胞。取决于测试，将APC抗-FLAG标签抗体(BioLegend,Inc.,637308)用FACS缓冲液稀释20至100-倍，然后添加到细胞中，并于4℃反应10至20分钟，且用FACS缓冲液洗涤细胞。将抗体染色的细胞悬浮于含有1至10μg/mL 7-氨基放线菌素D的FACS缓冲液中，并通过使用流式细胞术(MACSQUANT Analyzer 10)进行测量。在作为FCS文件输出后，使用FLOW JO软件在FSC/SSC图中选择细胞级分，以选择对7-氨基放线菌素D染色阴性的活细胞。接着，活细胞用X轴上的BFP针对Y轴上的APC进行门控，并使用作为阴性对照的BFP-阴性细胞中APC的荧光，通过四等分线表示。如有必要，将活细胞分级分离为BFP-阳性细胞或BFP-阴性细胞，并将这些组用在X轴上的APC覆盖和门控。
<实施例1：关于能够在细胞膜中作为CAAR表达的抗原区域的研究>
为了发现具有用于治疗重症肌无力的适合的结构的CAAR(图1)，通过使用下面给出的序列作为信号肽、抗原区域、接头区域和跨膜结构域制备了用于CAAR表达的病毒载体；并评价了CAAR在细胞膜中的表达。在所述实验中，4-1BB用作细胞内信号结构域(SEQ IDNO：7)，且CD3ζ(SEQ ID NO：8)用作细胞内信号结构域。
(1)使用包含排列的天然AchRα细胞外区域(SEQ ID NO：1)作为抗原区域、CD8α-衍生的接头区域(SEQ ID NO：5)和CD8α-衍生的跨膜结构域(SEQ ID NO：6)的CAAR的载体制备的慢病毒，所述CAAR与CD8α-衍生的信号肽(SEQ ID NO：9)连接(图2A)。
(2)使用包含排列的天然AchRα细胞外区域(SEQ ID NO：1)作为抗原区域、CD8α-衍生的接头区域(SEQ ID NO：5)和AchRα-衍生的跨膜结构域(SEQ ID NO：38)的CAAR的载体制备的慢病毒，所述CAAR与CD8α-衍生的信号肽(SEQ ID NO：9)连接(图2A)。
(3)使用包含排列的天然AchRα细胞外区域(SEQ ID NO：1)作为抗原区域、CD8α-衍生的接头区域(SEQ ID NO：5)和CD8α-衍生的跨膜结构域(SEQ ID NO：6)的CAAR的载体制备的慢病毒，所述CAAR与AchRα-衍生的信号肽(SEQ ID NO：10)连接(图2B)。
(4)使用包含排列的天然AchRα细胞外区域(SEQ ID NO：1)作为抗原区域、CD8α-衍生的接头区域(SEQ ID NO：5)和CD8α-衍生的跨膜结构域(SEQ ID NO：6)的CAAR的载体制备的慢病毒，所述CAAR与免疫球蛋白衍生的信号肽(SEQ ID NO：11)连接(图2B)。
(5)通过(1)、(3)或(4)中描述的载体与表达下述组分的复合物的载体的共表达制备的慢病毒：全长AchRβ(SEQ ID NO：12)、全长AchRδ(SEQ ID NO：13)、全长AchRε(SEQ IDNO：14)和通过T2A连接的GFP(图2C)。通常，如果多聚体中包含的每种组分单独表达，则由于组分之间暴露的结合面而难以获得稳定的膜表达。由于天然AchR作为五聚体表达，所以已报道，特别地，胎儿AchR(α、α、β、δ和ε)在细胞系中具有高表达水平(Lozier等人,Am J ClinPathol.2015年2月；143(2):186-92；提问(quiz)305)。
(6)使用包含排列的主要免疫原性区(SEQ ID NO：15)作为抗原区域、CD8α-衍生的接头区域(SEQ ID NO：5)和CD8α-衍生的跨膜结构域(SEQ ID NO：6)的用于开发重症肌无力的疾病模型的CAAR的载体制备的慢病毒，所述CAAR与CD8α-衍生的信号肽(SEQ ID NO：9)连接(图2D)。
(7)在AchRα-mAb35抗体-银环蛇毒素(α-Btx)复合物的结构分析中，为了使从酵母制备的蛋白结晶起见，公开了AchRα的细胞外结构域(236个氨基酸)中的四个突变(Noridomi等人,Elife.2017年4月25日；6:e23043)(Δ59-83、V8E、W174R和V180A)。使用包含排列的含有这些突变中的三个(V8E/W174R/V180A)的序列作为抗原区域、CD8α-衍生的接头区域(SEQ ID NO：5)和CD8α-衍生的跨膜结构域(SEQ ID NO：6)的CAAR的载体制备的慢病毒，所述CAAR与CD8α-衍生的信号肽(SEQ ID NO：9)连接(图2E)。
(8)使用包含排列的含有上述四个突变(Δ59-83、V8E、W174R和V180A)的序列作为抗原区域、CD8α-衍生的接头区域(SEQ ID NO：5)和CD8α-衍生的跨膜结构域(SEQ ID NO：6)的CAAR的载体制备的慢病毒，所述CAAR与CD8α-衍生的信号肽(SEQ ID NO：9)连接(图2E)。
[结果]
对于(1)至(5)和(7)，与BFP-阴性细胞相比，在BFP-阳性细胞中未确认CAAR的细胞膜表达。对于(6)，CAAR在细胞膜中表达。然而，所述CAAR缺乏mAb35抗体反应性。仅在引入四个突变的(8)的情况中，与BFP-阴性细胞相比，在BFP-阳性细胞中确认了连同mAb35抗体反应性一起的CAAR的膜表达。讨论(7)中提及的AchRα的晶体结构的论文检查了使用酵母的蛋白表达，并且既没有检查使用动物细胞在细胞膜中的表达，也没有检查作为单体的AchRα的表达。在所述论文中，通过添加与AchRα结合的α-Btx，成功实现了高分辨率结晶。然而，从安全性的观点来看，在CAAR-T疗法中使用α-Btx，即，蛇毒素，是不可接受的。综上所述，对于(8)的载体证实的AchRα-CAAR的膜表达是令人惊讶的。
[讨论]
对于(1)至(5)和(7)，与BFP-阴性细胞相比，在BFP-阳性细胞中不能确认CAAR的细胞膜表达，从而提示天然AchRα的细胞外区域未能经历作为嵌合受体的膜表达。在关于(6)的结果中，BFP-阳性细胞与抗-FLAG抗体反应，但不与mAb35抗体反应。这提示mAb35抗体不识别至少线性的主要免疫原性区域。因此，发现所述抗体不能用于去除致病性B细胞。
在关于AchRα细胞外区域的突变形式的下面给出的实施例中，细胞外区域的全长序列(236个氨基酸)被称为AchRα236，并且在AchRα236的序列中具有Δ59-83缺失的突变体被称为AchRα211。氨基酸的取代突变由被“/”定界的各个原始和取代氨基酸代表。等于位置84或在其之后的氨基酸位置由AchRα211的序列中相应的氨基酸位置代表(AchRα236的W174和V180分别对应于AchRα211的W149和V155)。具体而言，具有(8)中采用的四个突变的突变体由AchRα211/V8E/W149R/V155A代表。
<实施例2：关于待应用于CAAR的AchRα突变体的研究-1>
为了进一步提高CAAR在细胞膜中的表达水平，除了实施例1中(8)的载体中提供的四个突变(AchRα211/V8E/W149R/V155A)之外，还研究了进一步的突变。如在前述文献中使用以获得AchRα-mAb35抗体-α-Btx的晶体结构的α-Btx与AchRα211的C192和C193结合并稳定复合物的结构，从而提示在实施例1中的载体(8)中，AchRα211的C192和C193处于游离形式，其可以导致AchRα211在细胞膜中表达时不稳定。因此，构建了包含作为抗原区域的其中C192和C193突变为甘氨酸的AchRα211/V8E/W149R/V155A/C192G/C193G的AchRα-CAAR的表达载体(抗原区域：SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中Xaa8是E，Xaa149是R，Xaa155是A，Xaa192和Xaa193是GG，且其他氨基酸Xaa是SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸)并评价了在细胞膜上的表达(图3)。
[结果]
证实包含额外的C192G/C193G突变的AchRα-CAAR表现出与AchRα211/V8E/W149R/V155A相同水平的膜表达。
<实施例3：关于待应用于CAAR的AchRα突变体的研究-2>
含有四个突变的AchRα-CAAR在细胞膜中表达。为了评价各氨基酸突变对膜表达的贡献，构建了用于表达含有下表中所示的四个突变的各种组合的突变型AchRα-CAAR的载体(抗原区域：下表中所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中Xaa8、Xaa149和Xaa155是下表中定义的氨基酸，并且其他氨基酸Xaa是SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸；以及SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其中Xaa8、Xaa174和Xaa180是下表中定义的氨基酸，并且其他氨基酸Xaa是SEQ ID NO：1中相应位置的氨基酸)并评价了在细胞膜中的表达(图4)。
[表1]
[结果]
发现Δ59-83突变是AchRα-CAAR在细胞膜中表达所必需的。出乎意料的是，V8E突变减少了膜表达，而发现W149R和V155A突变显著增加了膜表达的水平。
<实施例4：关于待应用于CAAR的AchRα突变体的研究-3>
AchRα211中的W149和V155突变对于增加膜表达也有效。在这些位点取代的氨基酸具有相对于天然疏水性氨基酸的增强的亲水性，从而提示用赖氨酸取代这些天然氨基酸及其邻近位点的天然氨基酸对于膜表达是有效的。因此，确定了通过用赖氨酸取代作为富含疏水性氨基酸的区域的AchRα211的146-159区域中的氨基酸是否可以获得类似的效果。构建了AchRα-CAAR的表达载体，其中AchRα211的146-159区域中的氨基酸147、149、151、153、155、157和159中的每一个都作为代表性氨基酸用赖氨酸取代(抗原区域：SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中Xaa146至Xaa159为下表2中所示的序列，且其他氨基酸Xaa为SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸)，并评价了在细胞膜中的表达(图5)。
[表2]
名称 Xaa146-159
AchRα211/G147K LKTWTYDGSWAIN(SEQ ID NO：16)
AchRα211/W149K LGTKTYDGSVVAI N(SEQ I D NO：17)
AchRα211/Y151K LGTWTKDGSVVAIN(SEQ ID NO：18)
AchRα211/G153K LGTWTYDKSVVAIN(SEQ ID NO：19)
AchRα211/V/155K LGTWTYDGSKVAIN(SEQ ID NO：20)
AchRα211/A157K LGTWTYDGSVVKIN(SEQ ID NO：21)
AchRα211/N159K LGTWTYDGSVVAIK(SEQ ID NO：22)
[结果]
证实了所有上述AchRα-CAAR突变体都在细胞膜中表达。特别地，氨基酸G147、W149、V155、A157或N159的取代增加了表达的水平。
<实施例5：待用于AchRα-CAAR的AchRα突变体的研究-4>
为了最优化AchRα211中的W149和V155的氨基酸取代，构建了下表3中所示的突变型AchRα-CAAR表达载体(抗原区域：SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中Xaa149和Xaa155是下表中所示的序列，并且其他氨基酸Xaa是SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸)并评价了在细胞膜中的表达(图6和7)。
[表3]
名称 Xaa149 Xaa155
AchRα211 W V
AchRα211/W149A A V
AchRα211/W149K K V
AchRα211/W149D D V
AchRα211/W149S S V
AchRα211/W149G G V
AchRα211/W149N N V
AchRα211/W149I I V
AchRα211/W149F F V
AchRα211/W149M M V
AchRα211/W149P P V
AchRα211/W149R R V
AchRα211/V155R W R
AchRα211/V155K W K
AchRα211/V155D W D
AchRα211/V155S W S
AchRα211/V155G W G
AchRα211/V155N W N
AchRα211/V155I W I
AchRα211/V155F W F
AchRα211/V155M W M
AchRα211/V155P W P
AchRα211/V155A W A
AchRα211/W149R/V155K R K
[结果]
证实了所有上述AchRα-CAAR突变体都在细胞膜中表达。特别地，W149由氨基酸R、K或P的取代以及V155由氨基酸K、A、M、D、P或G的取代增加了表达的水平。发现与每一种单一突变相比，双重突变W149R和V155K的并入将表达水平增加到约10倍。
<实施例6：AchRα-CAAR-T细胞针对产生抗-AchRα抗体的杂交瘤的杀细胞活性的评价>
研究了表达AchRα-CAAR的CAAR-T细胞以评估其针对充当靶细胞的产生抗-AchRα抗体的杂交瘤的杀细胞活性和反应过程中的增殖性能，在所述AchRα-CAAR中，在上述实施例中确认在细胞膜中表达的突变型AchRα被作为抗原区域提供(图8)。
(1)细胞的制备
根据上述各实施例制备具有AchRα211、AchRα211/V8E/W149R/V155A、AchRα211/W149R、AchRα211/V155K或AchRα211/W149R/V155K作为抗原区域的CAAR-T细胞，并悬浮在基础培养基中。使用的靶细胞是产生抗-AchRα抗体mAb35的杂交瘤(ATCC，TIB-175)。为了检测靶细胞的生存力，通过类似于CAAR转染的方法制备具有GFP基因的插入片段的慢病毒，并允许其感染产生mAb35的杂交瘤，其然后通过有限稀释法亚克隆以确立携带GFP基因的杂交瘤细胞系。ClonaCell-HY MediumE(STEMCELL Technologies Inc.,3805)用于杂交瘤培养。
(2)杀细胞活性的评价
通过流式细胞术测定BFP-阳性细胞计数(CAAR-T细胞)。将每种类型的CAAR-T细胞以0.25×103至2×104个细胞/孔的浓度添加至96-孔平板，同时将GFP-阳性杂交瘤以1×104个细胞/孔的浓度添加至其中。培养中使用基础培养基和ClonaCell-HY Medium E的半培养基(half medium)。3天后，将细胞悬浮于含有1至10μg/mL 7-氨基放线菌素D的FACS缓冲液中，并使用流式细胞术进行分析。在作为FCS文件输出后，使用FLOW JO软件在FSC/SSC图中选择细胞级分，以选择对7-氨基放线菌素D染色阴性的活细胞。接着，活细胞用X轴上的BFP针对Y轴上的GFP进行门控。选择BFP-阳性细胞作为CAAR-T细胞，而选择GFP-阳性细胞作为靶细胞。测定活的BFP-阳性细胞和GFP-阳性细胞的数目。通过测定活的靶细胞的量评估杀细胞活性。未添加CAAR-T细胞的情况下孔中的靶细胞计数定义为100％。还评估了CAAR-T细胞的增殖，且反应开始前的靶细胞计数定义为100％。
[结果]
与阴性对照T细胞的杀细胞活性相比，所有突变型CAAR-T细胞均表现出增加的杀细胞活性。所有突变体的CAAR-T细胞计数在反应完成时均维持。特别地，具有AChRα211/V155K或AChRα211/V149R/V155K的CAAR-T细胞具有高增殖性能。
<实施例7：通过CAAR的结构人工改造的杀细胞活性的改进>
作为实施例1-6中的研究的结果，将AChRα211/W149R/V155K设置为代表性抗原区域。已报道包含scFv的CAR结构对在靶细胞上表达的抗原的亲和力影响CAR-T细胞在癌症治疗领域中的功效(Benmebarek等人，Int J Mol Sci.2019年3月；20(6):1283)。根据使用mAb35抗体和AChRα的结构分析(Noridomi等人，Elife.2017年4月25日；6:e23043)，AChRα211的氨基酸D14、D70、Y72和Y112对于AChRα与mAb35抗体的相互作用是需要的。为了通过降低抗原区域AChRα对抗-mAb35抗体的亲和力来增强CAAR-T的杀细胞活性，最优化了AChRα和抗-mAb35抗体之间的距离。构建了用于使得能够表达具有在与AChRα211/W149R/V155K的抗体结合有关的位点引入的突变的CAAR的病毒载体(抗原区域：SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中Xaa14、Xaa70、Xaa72和Xaa112为下表中所示的氨基酸，Xaa146至Xaa159为SEQ ID NO：23的氨基酸序列，且其他氨基酸Xaa为SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸)，且制备CAAR-T细胞并评价其杀细胞活性(图9)。杀细胞活性评价通过以下给出的方法进行。
[表4]
名称 Xaa14 Xaa70 Xaa72 Xaa112
AChRα211/W149R/V155K D D Y Y
AChRα211/D14A/W149R/V155K A D Y Y
AChRα211/D14G/W149R/V155K G D Y Y
AChRα211/D70N/W149R/V155K D N Y Y
AChRα211/D70A/W149R/V155K D A Y Y
AChRα211/Y72F/W149R/V155K D D F Y
AChRα211/Y112F/W149R/V155K D D Y F
(1)靶细胞(表达膜型mAb35-scFv的RAJI细胞)的确立
将编码与CD8α-衍生的信号分泌序列、接头区域和跨膜区域连接的mAb35-衍生的scFv的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)的基因插入pLVSIN EF1αIRES-ZsGreen1(Takara BioInc.，6192)中。使用所述载体，通过与CAAR转染相似的方法制备具有所述基因的插入片段的慢病毒，并允许其感染K562细胞(ATCC，CCL-243)和RAJI细胞(ATCC，CCL-86)，其然后通过有限稀释法亚克隆以确立表达膜型mAb35抗体的各细胞系。在确立的细胞系的培养中使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.，61870-036)。
(2)杀细胞活性的评价
在重症肌无力患者体内的血液中存在致病性抗-AChRα抗体。为了施用的CAAR-T细胞呈现药理作用，AChRα-CAAR需要与致病性B细胞等上表达的BCR结合。血液中的抗-AChRα抗体可能与CAAR结合，并从而竞争性抑制与BCRs的结合。已知将持续刺激递送至CAR结构的基底信号(tonic signaling)是造成施用的细胞的耗尽的原因(非专利文献：Long等人，NatMed.2015年6月；21(6)：581-90.doi：10.1038/nm.3838.)。因此，在有或没有mAb35抗体(一种抗-AChRα抗体)的情况下评价杀细胞活性。
通过使用流式细胞术测量制备的CAAR-T细胞的FLAG-阳性比率(CAAR表达比率)，并测定CAAR-T细胞计数。将CAAR-T细胞和表达膜型mAb35-scFv的K562细胞以7×105个细胞/孔的浓度悬浮于生长培养基中，并接种到6-孔平板，并培养7天。每2至3天将培养基用新鲜基础培养基置换。对培养液进行取样，并经受流式细胞术以确认作为ZsGreen1-阳性细胞检测的表达膜型mAb35-scFv的K562细胞是否不再存活。然后，进行FLAG-阳性细胞计数以测定CAAR-T细胞的数目。接着，使用含有10％FBS的RPMI1640培养基，将表达膜型mAb35-scFv的RAJI细胞以1x104个细胞/孔的浓度接种至96-孔平板中，而CAAR-T细胞以1x103、1x104或2x104个细胞/孔的浓度接种至其中。将mAb35抗体(ATCC，TIB-175-衍生的)以10μg/mL(终浓度)添加至平板的一些孔中。第二天，等量向其添加含有1至10μg/mL7-氨基放线菌素D的FACS缓冲液，继之以使用流式细胞术的分析。在作为FCS文件输出后，使用FLOWJO软件在FSC/SSC图中选择细胞级分，以选择对7-氨基放线菌素D染色阴性的活细胞。接着，活细胞用X轴上的BFP针对Y轴上的ZsGreen1进行门控。选择BFP-阳性细胞作为CAAR-T细胞，而选择ZsGreen1-阳性细胞作为靶细胞。测定活的BFP-阳性细胞和GFP-阳性细胞的数目。通过确定活的靶细胞的数目评估杀细胞活性。未添加CAAR-T细胞的情况下孔中的靶细胞计数定义为100％。
[结果]
发现具有突变型AChRα-CAAR的所有CAAR-T细胞都具有杀细胞活性，无论是否存在mAb35抗体。
<实施例8：通过CAAR的结构的调整的杀细胞活性的改进-1>
已知接头区域在癌症领域中以scFv作为结合结构域的CAR-T细胞的活性中发挥着重要作用。因此，构建了AChRα-CAARs的病毒载体，所述AChRα-CAARs使用AChRα211/W149R/V155K作为抗原区域并使用CD8α-衍生的接头区域(SEQ ID NO：5)或人工设计的柔性接头(SEQ ID NO：41)的N-末端截短的接头区域(抗原区域：AChRα211/W149R/V155K(SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中Xaa146至Xaa159是SEQ ID NO：23的氨基酸序列，并且其他氨基酸Xaa为SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸)，接头区域：下表中所示序列))，且制备CAAR-T细胞，并通过实施例7的方法评价其杀细胞活性(图10)。
[表5]
[结果]
证实具有突变型AChRα-CAAR的所有CAAR-T细胞都具有杀细胞活性，无论mAb35抗体是否存在。所述结果提示了接头的存在对于包含全长细胞外区域作为抗原区域的AChRα-CAAR来说不重要。
<实施例9：适合于AChRα-CAAR的共刺激结构域的研究>
已知共刺激结构域在发挥CAR-T的功能中发挥着重要作用。因此，通过以下给出的方法研究了各种共刺激结构域对AChRα-CAAR的影响。
(1)CAAR-T细胞的制备
构建了AChRα-CAAR的病毒载体，所述AChRα-CAAR包含AChRα211/W149R/V155K作为抗原区域和FACD(SEQ ID NO：5的42至45)或FASD(SEQ ID NO：39的42至45，Xaa44＝S)作为接头区域并进一步包含基于本领域已知的用于CAR-T的各种序列或称为与T细胞寿命相关的TNF受体超家族的各种序列中的任何一种的共刺激结构域(抗原区域：AChRα211/W149R/V155K(SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中Xaa146至Xaa159为SEQ ID NO：23的氨基酸序列，且其他氨基酸Xaa为SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸)，共刺激结构域：衍生自4-1BB(SEQ IDNO：7)、CD28(SEQ ID NO：25)、GITR(SEQ ID NO：26)、TNFR2(SEQ ID NO：27)、DR3(SEQ IDNO：28)、CD30(SEQ ID NO：29)、HVEM(SEQ ID NO：30)、CD27(SEQ ID NO：31)或OX40(SEQ IDNO：32))的序列。将衍生自多个供体的人外周血单核细胞用使得能够进行AChRα-CAAR表达的每种病毒载体感染以制备CAAR-T细胞，其然后通过下面给出的方法评价其杀细胞活性(图11)。
(2)靶细胞(表达膜型mAb35的RAJI细胞)的确立
将编码氨基酸序列(SEQ ID NO：33)的基因插入pLVSIN EF1αIRES-ZsGreen1中，所述氨基酸序列对应于恒定区被膜型人IgG1恒定区置换的mAb35抗体(大鼠衍生的)H链的肽和恒定区被人Igκ恒定区置换的mAb35L链的肽，其中H链和L链经由T2A连接。由于CD79a和CD79b的共表达对于膜型抗体的稳定表达是必要的，所以将编码经由T2A连接的全长CD79a和全长CD79b的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)的基因插入pLVSIN EF1αpur中。使用这些载体，通过与CAAR转染相似的方法制备具有这些基因的每一种的插入片段的慢病毒，并允许其感染RAJI细胞(ATCC，CCL-86)，其然后通过有限稀释法亚克隆以确立表达膜型mAb35抗体和CD79a/CD79b的细胞系。在确立的细胞系的培养中使用含有10％FBS的RPMI1640培养基。将细胞系通过预先用基础培养基置换进行适应，并用于活性评价。
(3)杀细胞活性的评价
对于如上所述制备的每种类型的CAAR-T细胞，通过使用流式细胞术测定BFP-阳性细胞计数(CAAR-T细胞)。将CAAR-T细胞以1×103个细胞/孔的浓度接种至96-孔平板，而将靶细胞以1×104个细胞/孔的浓度接种至其中。使用的培养基是生长培养基。两天后，以1x105个细胞/孔的浓度接种额外的靶细胞，并进一步培养4天。等量向其添加含有1至10μg/mL7-氨基放线菌素D的FACS缓冲液，继之以使用流式细胞术的分析。在作为FCS文件输出后，使用FLOWJO软件在FSC/SSC图中选择细胞级分，以选择对7-氨基放线菌素D染色阴性的活细胞。接着，活细胞用X轴上的BFP针对Y轴上的ZsGreen1进行门控。选择BFP-阳性细胞作为CAAR-T细胞，而选择ZsGreen1-阳性细胞作为靶细胞。测定活的BFP-阳性细胞和GFP-阳性细胞的数目。通过活的靶细胞的数目评估杀细胞活性。未添加CAAR-T细胞的情况下孔中的靶细胞计数定义为100％。
[结果]
具有每一种上述共刺激结构域的AChRα-CAARs的杀细胞活性在供体中是一致的，并且AChRα-CAAR具有比对照T细胞显著更高的杀细胞活性(Dunnett氏-检验，p<0.01)。因此证实，本发明的AChRα-CAAR可以包含多种多样的序列作为共刺激结构域，例如一般用于CAR-T领域中的各种共刺激结构域，以及衍生自属于TNF受体超家族的各种受体的细胞内结构域的序列。
<实施例10：通过CAAR结构的调整的杀细胞活性的改进-2>
为了对共刺激分子和接头区域/跨膜区域进行进一步的研究，进行了以下研究。构建了每种AChRα-CAAR的病毒载体，所述AChRα-CAAR包含AChRα211/W149R/V155K(SEQ IDNO：3)作为抗原区域和HVEM作为共刺激结构域，并进一步包含下表中所示的接头区域(抗原区域：AChRα211/W149R/V155K(SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中Xaa146至Xaa159为SEQ IDNO：23的氨基酸序列，且其他氨基酸Xaa为SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸)，接头区域：下表中所示的序列，跨膜区域：下表中所示的序列，共刺激结构域：HVEM(SEQ ID NO：30))，并制备CAAR-T细胞且使用表达膜型mAb35-scFv的RAJI细胞，通过实施例9的方法评价其杀细胞活性(图12)。
[表6]
[结果]
具有每一种上述接头区域/跨膜结构域的AChRα-CAAR都具有在供体中一致的显著杀细胞活性(Dunnett氏-检验，p<0.01)。根据这些结果，证实在本发明的CAAR中，接头区域的存在或不存在不影响活性，并且不管接头区域的序列或长度怎样本发明的CAAR都起CAAR的作用。
<实施例11：CAAR-T细胞的体内杀细胞活性评价>
为了评价CAAR-T细胞的体内杀细胞活性，使用免疫缺陷的NOG小鼠(NOD/Shi-scid,IL-2Rγ<null>)进行药理学实验。重症肌无力患者体内存在致病性抗-AChRα抗体，且推测抗-AChRα抗体与所施用的CAAR-T细胞的AChRα-CAAR结合，其本身又经历通过抗体依赖性细胞毒活性从体内的消除。尽管具有低的NK细胞活性，但由于巨噬细胞的存在，在NOG小鼠中也有可能发生类似的消除。为了控制所述消除，用诸如静脉注射免疫球蛋白(IVIg)的试剂的治疗可能是必要的。因为IVIg衍生自人，所以认为人衍生的抗-AChRα抗体(mAb35抗体)的恒定区反映了其发挥抑制效果的真实临床情形。因此，在所述测试中，使用人源化mAb35抗体(mAb35-hIgG1)进行以下的实验。
通过制备恒定区被人IgG1恒定区置换的mAb35抗体H链的多肽(SEQ ID NO：35)的表达质粒和恒定区被Igκ恒定区置换的mAb35抗体L链的多肽(SEQ ID NO：36)的表达质粒，用其转染HEK293细胞，并用A蛋白纯化回收的培养物上清液，来获得mAb35-hIgG1。构建用于表达N-末端具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列作为信号肽和标签肽并包含AChRα211/W149R/V155K作为抗原区域的AChRα-CAAR(SEQ ID NO：43)的病毒载体，并制备CAAR-T细胞。
在试验开始前一天，向尾静脉施用10mg/头的IVIg(Baxter，4987456506071，GAMMAGARD静脉注射用，2.5g)和20μg/头的mAb35-hIgG1。将实施例7中制备的表达膜型mAb35-scFv的RAJI细胞以5×105个细胞/头施用至尾静脉。四小时后，将上述CAAR-T细胞以6×106个细胞/头施用至尾静脉。十四天后，将小鼠实施安死术，并收集血液、脾和骨髓(一侧股骨和胫骨)且机械分散。
使用RBC裂解缓冲液(Thermo Fisher Scientific Inc.,00-4333-57)溶血收集的每种组织。然后，将APC抗-DYKDDDDK标签抗体(抗-FLAG抗体，BioLegend,Inc.,637308)和PE抗人CD3(BioLegend,Inc.,317308)用FACS缓冲液稀释100-倍，然后添加至细胞中，于4℃反应15分钟，并用FACS缓冲液洗涤细胞。将抗体染色的细胞悬浮于含有1μg/mL7-氨基放线菌素D的FACS缓冲液中，并通过使用流式细胞术进行测量。在作为FCS文件输出后，使用FLOWJO软件在FSC/SSC图中选择细胞级分，以选择对7-氨基放线菌素D染色阴性的活细胞。接着，活细胞用X轴上的ZsGreen1针对Y轴上的SSC进行门控，并且测定对应于表达膜型mAb35-scFv的RAJI细胞的ZsGreen1阳性细胞的数目(图13)。
[结果]
与对照T细胞施用组相比，AChRα-CAAR-T施用组中的血液、脾和骨髓中表达膜型mAb35-scFv的RAJI细胞计数显著减少(T-检验，p<0.01)。
<实施例12：AChRα-CAAR-T细胞针对衍生自用AChRα敏化的小鼠的产生抗-AChRα抗体的B细胞的杀细胞活性的评价>
为了治疗由抗-AChRα抗体产生引起的重症肌无力，有必要去除导致自身抗体产生的致病性B细胞。因此，将用AchRα蛋白敏化的小鼠脾中包含的包括与抗-AChRα抗体产生相关的B细胞的脾细胞制备为靶细胞，其反映真实的临床情形，并使用培养物上清液中所含的抗-AChRα抗体的量作为杀细胞活性的指标研究了AChRα-CAAR-T细胞的杀细胞活性。
(1)CAAR-T细胞的制备
使得能够表达两种类型的AChRα-CAAR(AChRα/W149R/V155K>4aa>4-1BB：SEQ IDNO:44，AChRα/W149R/V155K>14aa>OX40：SEQ ID NO:47)且在N-末端具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列作为信号肽和标签肽的慢病毒载体。允许上述用于AChRα-CAAR表达的病毒载体感染人外周血单核细胞，以获得CAAR-T细胞。
(2)脾细胞(产生抗-AChRα抗体的B细胞)的制备
为了制备作为靶细胞的产生抗-AChRα抗体的细胞，将100μL含有以1:1的比例与铝胶(Alhydrogel)(R)佐剂2％(InvivoGen,vac-alu-250)混合的5至10μg重组AChRα蛋白的溶液皮下接种至C57BL/6J小鼠中。14天后，以与上述相同的方式向其皮下接种5至10μg重组AChRα蛋白作为加强剂量。进一步的7天后，对所述小鼠实施安死术，然后收获脾。将脾切碎，在40μm细胞渗滤器上研磨，并悬浮在基础培养基中以制备含有产生抗-AChRα抗体的B细胞的脾细胞悬浮液。
(3)杀细胞活性的评价
对于如上所述制备的每种类型的CAAR-T细胞，使用APC抗-DYKDDDDK抗体和流式细胞术测定FLAG-阳性细胞计数(CAAR-T细胞)。将CAAR-T细胞以1×105个细胞/孔的浓度接种至96-孔平板，而将脾细胞以1×105个细胞/孔的浓度接种至其中。使用的培养基是补加了0.001％1-硫甘油(Sigma-Aldrich Co.,LLC,M6145)的生长培养基。于1μM(终浓度)添加TLR9配体K3(Ajinomoto Bio-Pharma,CN-65003)以促进抗体产生。培养8天后，回收培养物上清液。为了测量回收的培养物上清液中的抗-AChRα抗体的量，将表达AChRα的Jurkat细胞以4×104个细胞/孔的浓度接种到96-孔平板中，并将40μL的培养物上清液添加到其中并于4℃反应10至20分钟，并用FACS缓冲液洗涤细胞。将APC抗小鼠IgG抗体(BioLegend,Inc.,405308)用FACS缓冲液稀释100-倍，然后添加到细胞中，并于4℃反应10至20分钟，并用FACS缓冲液洗涤细胞。等量向其添加含有2μg/mL7-氨基放线菌素D的FACS缓冲液，继之以使用流式细胞术的分析。在作为FCS文件输出后，使用FLOWJO软件在FSC/SSC图中选择细胞级分，以选择对7-氨基放线菌素D染色阴性的活细胞。接着，活细胞用X轴上的APC针对Y轴上的细胞计数进行门控。MFI被测量以测定培养物上清液中所含的抗-AChRα抗体的量，并间接评估AChRα-CAAR-T细胞针对产生抗-AChRα抗体的B细胞的杀细胞活性。结果示于图14中。
[结果]
与对照T细胞施用组相比，AChRα-CAAR(4aa/4-1BB和14aa/OX40)-T细胞施用组中培养物上清液中所含的抗-AChRα抗体的量减少。这些结果提示本发明的AChRα-CAAR-T细胞可以靶向并杀死产生抗-AChRα抗体的B细胞。
序列表的自由文本
SEQ ID NO：1：AChRα236(人天然AChRα亚基细胞外区域)
SEQ ID NO：2：AChRα211(Δ59-74人AChRα亚基细胞外区域)
SEQ ID NO：3：AChRα211突变体(Xaa：8、14、70、72、192、193)
SEQ ID NO：4：AChRα236突变体(Xaa：8、171-184)
SEQ ID NO：5：CD8a接头区域
SEQ ID NO：6：CD8a跨膜结构域
SEQ ID NO：7：4-1BB共刺激结构域
SEQ ID NO：8：CD3ζ细胞内信号结构域
SEQ ID NO：9：CD8α信号肽
SEQ ID NO：10：人AChRα信号肽
SEQ ID NO：11：人免疫球蛋白信号肽
SEQ ID NO：12：AChRβ
SEQ ID NO：13：AChRδ
SEQ ID NO：14：AChRε
SEQ ID NO：15：主要免疫原性区域
SEQ ID NO：16：疏水区(146-159)，G147K突变
SEQ ID NO：17：疏水区(146-159)，W149K突变
SEQ ID NO：18：疏水区(146-159)，Y151K突变
SEQ ID NO：19：疏水区(146-159)，G153K突变
SEQ ID NO：20：疏水区(146-159)，V155K突变
SEQ ID NO：21：疏水区(146-159)，A157K突变
SEQ ID NO：22：疏水区(146-159)，N159K突变
SEQ ID NO：23：疏水区(146-159)，V155K突变
SEQ ID NO：24：膜型mAb35-scFv
SEQ ID NO：25：CD28共刺激结构域
SEQ ID NO：26：GITR共刺激结构域
SEQ ID NO：27：TNFR2共刺激结构域
SEQ ID NO：28：DR3共刺激结构域
SEQ ID NO：29：CD30共刺激结构域
SEQ ID NO：30：HVEM共刺激结构域
SEQ ID NO：31：CD27共刺激结构域
SEQ ID NO：32：OX40共刺激结构域
SEQ ID NO：33：人源化膜型mAb35
SEQ ID NO：34：CD79a/CD79b
SEQ ID NO：35：mAb35-hIgG1
SEQ ID NO：36：mAb35-hIgGκ
SEQ ID NO：37：CD28跨膜结构域
SEQ ID NO：38：AChR跨膜结构域
SEQ ID NO：39：CD8α接头区域(Xaa27、44＝C或S)
SEQ ID NO：40：CD28接头区域(Xaa28＝C或S)
SEQ ID NO：42：AChRα/W149X/V155X
SEQ ID NO：43至47：AChRα-CAAR全长序列
SEQ ID NO：48：信号-FLAG-肽
序列表
<110> 第一三共株式会社（DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED）
<120> 编码抗乙酰胆碱受体自身抗体的嵌合受体的基因
<130> FP2137
<150> JP2021-043269
<151> 2021-03-17
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 236
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Lys Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val Val Glu Val Thr
20 25 30
Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu Val Asn Gln
35 40 45
Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gly Asp Met Val Asp Leu
50 55 60
Pro Arg Pro Ser Cys Val Thr Leu Gly Val Pro Leu Phe Ser His Leu
65 70 75 80
Gln Asn Glu Gln Trp Val Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp
85 90 95
Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Ile Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg
100 105 110
Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val
115 120 125
Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Tyr Thr Gly His Ile Thr Trp Thr
130 135 140
Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys Glu Ile Ile Val Thr His Phe
145 150 155 160
Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser Met Lys Leu Gly Thr Trp Thr Tyr
165 170 175
Asp Gly Ser Val Val Ala Ile Asn Pro Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu
180 185 190
Ser Asn Phe Met Glu Ser Gly Glu Trp Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly
195 200 205
Trp Lys His Ser Val Thr Tyr Ser Cys Cys Pro Asp Thr Pro Tyr Leu
210 215 220
Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln Arg Leu Pro
225 230 235
<210> 2
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 天然类型AChRa211
<400> 2
Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Lys Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val Val Glu Val Thr
20 25 30
Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu Val Asn Gln
35 40 45
Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gln Trp Val Asp Tyr Asn
50 55 60
Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Ile
65 70 75 80
Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala
85 90 95
Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Tyr
100 105 110
Thr Gly His Ile Thr Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys
115 120 125
Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser Met
130 135 140
Lys Leu Gly Thr Trp Thr Tyr Asp Gly Ser Val Val Ala Ile Asn Pro
145 150 155 160
Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu Ser Asn Phe Met Glu Ser Gly Glu Trp
165 170 175
Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly Trp Lys His Ser Val Thr Tyr Ser Cys
180 185 190
Cys Pro Asp Thr Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln
195 200 205
Arg Leu Pro
210
<210> 3
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有在Xaa8、14、70、72、112 146-159、192、193的突变的AChRa211
<220>
<221> 于V8突变
<222> (8)..(8)
<223> Xaa8可以是任何氨基酸。
<220>
<221> 于D14突变
<222> (14)..(14)
<223> Xaa14可以是任何氨基酸。
<220>
<221> 于D70突变
<222> (70)..(70)
<223> Xaa70可以是任何氨基酸。
<220>
<221> 于Y72突变
<222> (72)..(72)
<223> Xaa72可以是任何氨基酸。
<220>
<221> 于Y112突变
<222> (112)..(112)
<223> Xaa112可以是任何氨基酸。
<220>
<221> 于位置146至159mutation
<222> (146)..(159)
<223> Xaa146至Xaa159可以是任何氨基酸。
<220>
<221> misc_feature
<222> (192)..(193)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 3
Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Xaa Ala Lys Leu Phe Lys Xaa Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val Val Glu Val Thr
20 25 30
Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu Val Asn Gln
35 40 45
Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gln Trp Val Asp Tyr Asn
50 55 60
Leu Lys Trp Asn Pro Xaa Asp Xaa Gly Gly Val Lys Lys Ile His Ile
65 70 75 80
Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala
85 90 95
Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Xaa
100 105 110
Thr Gly His Ile Thr Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys
115 120 125
Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser Met
130 135 140
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro
145 150 155 160
Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu Ser Asn Phe Met Glu Ser Gly Glu Trp
165 170 175
Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly Trp Lys His Ser Val Thr Tyr Ser Xaa
180 185 190
Xaa Pro Asp Thr Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln
195 200 205
Arg Leu Pro
210
<210> 4
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有在位置8、14、70、72、112、171-184的Xaa的突变的AChRa236
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (171)..(184)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 4
Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Xaa Ala Lys Leu Phe Lys Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val Val Glu Val Thr
20 25 30
Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu Val Asn Gln
35 40 45
Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gly Asp Met Val Asp Leu
50 55 60
Pro Arg Pro Ser Cys Val Thr Leu Gly Val Pro Leu Phe Ser His Leu
65 70 75 80
Gln Asn Glu Gln Trp Val Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp
85 90 95
Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Ile Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg
100 105 110
Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val
115 120 125
Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Tyr Thr Gly His Ile Thr Trp Thr
130 135 140
Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys Glu Ile Ile Val Thr His Phe
145 150 155 160
Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser Met Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
165 170 175
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu
180 185 190
Ser Asn Phe Met Glu Ser Gly Glu Trp Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly
195 200 205
Trp Lys His Ser Val Thr Tyr Ser Cys Cys Pro Asp Thr Pro Tyr Leu
210 215 220
Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln Arg Leu Pro
225 230 235
<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a的接头序列
<400> 5
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a的跨膜序列
<400> 6
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 7
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB的共刺激区域
<400> 7
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3z的细胞内信号传导区域
<400> 8
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a的信号肽序列
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AChRa的信号肽序列
<400> 10
Met Glu Pro Trp Pro Leu Leu Leu Leu Phe Ser Leu Cys Ser Ala Gly
1 5 10 15
Leu Val Leu Gly
20
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人免疫球蛋白的信号肽序列
<400> 11
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser
<210> 12
<211> 501
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Met Thr Pro Gly Ala Leu Leu Met Leu Leu Gly Ala Leu Gly Ala Pro
1 5 10 15
Leu Ala Pro Gly Val Arg Gly Ser Glu Ala Glu Gly Arg Leu Arg Glu
20 25 30
Lys Leu Phe Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Val Arg Pro Ala Arg Glu Val
35 40 45
Gly Asp Arg Val Arg Val Ser Val Gly Leu Ile Leu Ala Gln Leu Ile
50 55 60
Ser Leu Asn Glu Lys Asp Glu Glu Met Ser Thr Lys Val Tyr Leu Asp
65 70 75 80
Leu Glu Trp Thr Asp Tyr Arg Leu Ser Trp Asp Pro Ala Glu His Asp
85 90 95
Gly Ile Asp Ser Leu Arg Ile Thr Ala Glu Ser Val Trp Leu Pro Asp
100 105 110
Val Val Leu Leu Asn Asn Asn Asp Gly Asn Phe Asp Val Ala Leu Asp
115 120 125
Ile Ser Val Val Val Ser Ser Asp Gly Ser Val Arg Trp Gln Pro Pro
130 135 140
Gly Ile Tyr Arg Ser Ser Cys Ser Ile Gln Val Thr Tyr Phe Pro Phe
145 150 155 160
Asp Trp Gln Asn Cys Thr Met Val Phe Ser Ser Tyr Ser Tyr Asp Ser
165 170 175
Ser Glu Val Ser Leu Gln Thr Gly Leu Gly Pro Asp Gly Gln Gly His
180 185 190
Gln Glu Ile His Ile His Glu Gly Thr Phe Ile Glu Asn Gly Gln Trp
195 200 205
Glu Ile Ile His Lys Pro Ser Arg Leu Ile Gln Pro Pro Gly Asp Pro
210 215 220
Arg Gly Gly Arg Glu Gly Gln Arg Gln Glu Val Ile Phe Tyr Leu Ile
225 230 235 240
Ile Arg Arg Lys Pro Leu Phe Tyr Leu Val Asn Val Ile Ala Pro Cys
245 250 255
Ile Leu Ile Thr Leu Leu Ala Ile Phe Val Phe Tyr Leu Pro Pro Asp
260 265 270
Ala Gly Glu Lys Met Gly Leu Ser Ile Phe Ala Leu Leu Thr Leu Thr
275 280 285
Val Phe Leu Leu Leu Leu Ala Asp Lys Val Pro Glu Thr Ser Leu Ser
290 295 300
Val Pro Ile Ile Ile Lys Tyr Leu Met Phe Thr Met Val Leu Val Thr
305 310 315 320
Phe Ser Val Ile Leu Ser Val Val Val Leu Asn Leu His His Arg Ser
325 330 335
Pro His Thr His Gln Met Pro Leu Trp Val Arg Gln Ile Phe Ile His
340 345 350
Lys Leu Pro Leu Tyr Leu Arg Leu Lys Arg Pro Lys Pro Glu Arg Asp
355 360 365
Leu Met Pro Glu Pro Pro His Cys Ser Ser Pro Gly Ser Gly Trp Gly
370 375 380
Arg Gly Thr Asp Glu Tyr Phe Ile Arg Lys Pro Pro Ser Asp Phe Leu
385 390 395 400
Phe Pro Lys Pro Asn Arg Phe Gln Pro Glu Leu Ser Ala Pro Asp Leu
405 410 415
Arg Arg Phe Ile Asp Gly Pro Asn Arg Ala Val Ala Leu Leu Pro Glu
420 425 430
Leu Arg Glu Val Val Ser Ser Ile Ser Tyr Ile Ala Arg Gln Leu Gln
435 440 445
Glu Gln Glu Asp His Asp Ala Leu Lys Glu Asp Trp Gln Phe Val Ala
450 455 460
Met Val Val Asp Arg Leu Phe Leu Trp Thr Phe Ile Ile Phe Thr Ser
465 470 475 480
Val Gly Thr Leu Val Ile Phe Leu Asp Ala Thr Tyr His Leu Pro Pro
485 490 495
Pro Asp Pro Phe Pro
500
<210> 13
<211> 517
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Met Glu Gly Pro Val Leu Thr Leu Gly Leu Leu Ala Ala Leu Ala Val
1 5 10 15
Cys Gly Ser Trp Gly Leu Asn Glu Glu Glu Arg Leu Ile Arg His Leu
20 25 30
Phe Gln Glu Lys Gly Tyr Asn Lys Glu Leu Arg Pro Val Ala His Lys
35 40 45
Glu Glu Ser Val Asp Val Ala Leu Ala Leu Thr Leu Ser Asn Leu Ile
50 55 60
Ser Leu Lys Glu Val Glu Glu Thr Leu Thr Thr Asn Val Trp Ile Glu
65 70 75 80
His Gly Trp Thr Asp Asn Arg Leu Lys Trp Asn Ala Glu Glu Phe Gly
85 90 95
Asn Ile Ser Val Leu Arg Leu Pro Pro Asp Met Val Trp Leu Pro Glu
100 105 110
Ile Val Leu Glu Asn Asn Asn Asp Gly Ser Phe Gln Ile Ser Tyr Ser
115 120 125
Cys Asn Val Leu Val Tyr His Tyr Gly Phe Val Tyr Trp Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Ile Phe Arg Ser Ser Cys Pro Ile Ser Val Thr Tyr Phe Pro Phe
145 150 155 160
Asp Trp Gln Asn Cys Ser Leu Lys Phe Ser Ser Leu Lys Tyr Thr Ala
165 170 175
Lys Glu Ile Thr Leu Ser Leu Lys Gln Asp Ala Lys Glu Asn Arg Thr
180 185 190
Tyr Pro Val Glu Trp Ile Ile Ile Asp Pro Glu Gly Phe Thr Glu Asn
195 200 205
Gly Glu Trp Glu Ile Val His Arg Pro Ala Arg Val Asn Val Asp Pro
210 215 220
Arg Ala Pro Leu Asp Ser Pro Ser Arg Gln Asp Ile Thr Phe Tyr Leu
225 230 235 240
Ile Ile Arg Arg Lys Pro Leu Phe Tyr Ile Ile Asn Ile Leu Val Pro
245 250 255
Cys Val Leu Ile Ser Phe Met Val Asn Leu Val Phe Tyr Leu Pro Ala
260 265 270
Asp Ser Gly Glu Lys Thr Ser Val Ala Ile Ser Val Leu Leu Ala Gln
275 280 285
Ser Val Phe Leu Leu Leu Ile Ser Lys Arg Leu Pro Ala Thr Ser Met
290 295 300
Ala Ile Pro Leu Ile Gly Lys Phe Leu Leu Phe Gly Met Val Leu Val
305 310 315 320
Thr Met Val Val Val Ile Cys Val Ile Val Leu Asn Ile His Phe Arg
325 330 335
Thr Pro Ser Thr His Val Leu Ser Glu Gly Val Lys Lys Leu Phe Leu
340 345 350
Glu Thr Leu Pro Glu Leu Leu His Met Ser Arg Pro Ala Glu Asp Gly
355 360 365
Pro Ser Pro Gly Ala Leu Val Arg Arg Ser Ser Ser Leu Gly Tyr Ile
370 375 380
Ser Lys Ala Glu Glu Tyr Phe Leu Leu Lys Ser Arg Ser Asp Leu Met
385 390 395 400
Phe Glu Lys Gln Ser Glu Arg His Gly Leu Ala Arg Arg Leu Thr Thr
405 410 415
Ala Arg Arg Pro Pro Ala Ser Ser Glu Gln Ala Gln Gln Glu Leu Phe
420 425 430
Asn Glu Leu Lys Pro Ala Val Asp Gly Ala Asn Phe Ile Val Asn His
435 440 445
Met Arg Asp Gln Asn Asn Tyr Asn Glu Glu Lys Asp Ser Trp Asn Arg
450 455 460
Val Ala Arg Thr Val Asp Arg Leu Cys Leu Phe Val Val Thr Pro Val
465 470 475 480
Met Val Val Gly Thr Ala Trp Ile Phe Leu Gln Gly Val Tyr Asn Gln
485 490 495
Pro Pro Pro Gln Pro Phe Pro Gly Asp Pro Tyr Ser Tyr Asn Val Gln
500 505 510
Asp Lys Arg Phe Ile
515
<210> 14
<211> 516
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Met His Gly Gly Gln Gly Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val
1 5 10 15
Cys Leu Gly Ala Gln Gly Arg Asn Gln Glu Glu Arg Leu Leu Ala Asp
20 25 30
Leu Met Gln Asn Tyr Asp Pro Asn Leu Arg Pro Ala Glu Arg Asp Ser
35 40 45
Asp Val Val Asn Val Ser Leu Lys Leu Thr Leu Thr Asn Leu Ile Ser
50 55 60
Leu Asn Glu Arg Glu Glu Ala Leu Thr Thr Asn Val Trp Ile Glu Met
65 70 75 80
Gln Trp Cys Asp Tyr Arg Leu Arg Trp Asp Pro Arg Asp Tyr Glu Gly
85 90 95
Leu Trp Val Leu Arg Val Pro Ser Thr Met Val Trp Arg Pro Asp Ile
100 105 110
Val Leu Glu Asn Asn Val Asp Gly Val Phe Glu Val Ala Leu Tyr Cys
115 120 125
Asn Val Leu Val Ser Pro Asp Gly Cys Ile Tyr Trp Leu Pro Pro Ala
130 135 140
Ile Phe Arg Ser Ala Cys Ser Ile Ser Val Thr Tyr Phe Pro Phe Asp
145 150 155 160
Trp Gln Asn Cys Ser Leu Ile Phe Gln Ser Gln Thr Tyr Ser Thr Asn
165 170 175
Glu Ile Asp Leu Gln Leu Ser Gln Glu Asp Gly Gln Thr Ile Glu Trp
180 185 190
Ile Phe Ile Asp Pro Glu Ala Phe Thr Glu Asn Gly Glu Trp Ala Ile
195 200 205
Gln His Arg Pro Ala Lys Met Leu Leu Asp Pro Ala Ala Pro Ala Gln
210 215 220
Glu Ala Gly His Gln Lys Val Val Phe Tyr Leu Leu Ile Gln Arg Lys
225 230 235 240
Pro Leu Phe Tyr Val Ile Asn Ile Ile Ala Pro Cys Val Leu Ile Ser
245 250 255
Ser Val Ala Ile Leu Ile His Phe Leu Pro Ala Lys Ala Gly Gly Gln
260 265 270
Lys Cys Thr Val Ala Ile Asn Val Leu Leu Ala Gln Thr Val Phe Leu
275 280 285
Phe Leu Val Ala Lys Lys Val Pro Glu Thr Ser Gln Ala Val Pro Leu
290 295 300
Ile Ser Lys Tyr Leu Thr Phe Leu Leu Val Val Thr Ile Leu Ile Val
305 310 315 320
Val Asn Ala Val Val Val Leu Asn Val Ser Leu Arg Ser Pro His Thr
325 330 335
His Ser Met Ala Arg Gly Val Arg Lys Val Phe Leu Arg Leu Leu Pro
340 345 350
Gln Leu Leu Arg Met His Val Arg Pro Leu Ala Pro Ala Ala Val Gln
355 360 365
Asp Thr Gln Ser Arg Leu Gln Asn Gly Ser Ser Gly Trp Ser Ile Thr
370 375 380
Thr Gly Glu Glu Val Ala Leu Cys Leu Pro Arg Ser Glu Leu Leu Phe
385 390 395 400
Gln Gln Trp Gln Arg Gln Gly Leu Val Ala Ala Ala Leu Glu Lys Leu
405 410 415
Glu Lys Gly Pro Glu Leu Gly Leu Ser Gln Phe Cys Gly Ser Leu Lys
420 425 430
Gln Ala Ala Pro Ala Ile Gln Ala Cys Val Glu Ala Cys Asn Leu Ile
435 440 445
Ala Cys Ala Arg His Gln Gln Ser His Phe Asp Asn Gly Asn Glu Glu
450 455 460
Trp Phe Leu Val Gly Arg Val Leu Asp Arg Val Cys Phe Leu Ala Met
465 470 475 480
Leu Ser Leu Phe Ile Cys Gly Thr Ala Gly Ile Phe Leu Met Ala His
485 490 495
Tyr Asn Arg Val Pro Ala Leu Pro Phe Pro Gly Asp Pro Arg Pro Tyr
500 505 510
Leu Pro Ser Pro
515
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 主要免疫原性区域
<400> 15
Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Asp Tyr
1 5 10 15
Thr Gly His Ile
20
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变G147K的AChRa211疏水区146-159
<400> 16
Leu Lys Thr Trp Thr Tyr Asp Gly Ser Val Val Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变W149K的AChRa211疏水区146-159
<400> 17
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Asp Gly Ser Val Val Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变Y151K的AChRa211疏水区146-159
<400> 18
Leu Gly Thr Trp Thr Lys Asp Gly Ser Val Val Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变G153K的AChRa211疏水区146-159
<400> 19
Leu Gly Thr Trp Thr Tyr Asp Lys Ser Val Val Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变V155K的AChRa211疏水区146-159
<400> 20
Leu Gly Thr Trp Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Val Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变A157K的AChRa211疏水区146-159
<400> 21
Leu Gly Thr Trp Thr Tyr Asp Gly Ser Val Val Lys Ile Asn
1 5 10
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变N159K的AChRa211疏水区146-159
<400> 22
Leu Gly Thr Trp Thr Tyr Asp Gly Ser Val Val Ala Ile Lys
1 5 10
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变W149R、V155K的AChRa211疏水区146-159
<400> 23
Leu Gly Thr Arg Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Val Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 24
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb35
<400> 24
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Gly Ser
35 40 45
Gln Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu His Ser Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln
100 105 110
Tyr Ile Asn Gly Tyr Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Glu
145 150 155 160
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
165 170 175
Ser Val Ser Trp Leu Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met
180 185 190
Gly Arg Met Trp Asp Asp Gly Gly Thr Val Tyr Asn Ser Gly Leu Lys
195 200 205
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
210 215 220
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr
225 230 235 240
Arg Asp Glu Arg Ile Arg Ala Ile Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
275 280 285
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
290 295 300
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
305 310 315 320
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
325 330 335
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
340 345 350
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
355 360 365
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
370 375 380
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
385 390 395 400
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
405 410 415
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
420 425 430
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
435 440 445
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
450 455 460
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
465 470 475 480
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
485 490 495
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
500 505 510
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
515 520 525
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
530 535 540
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
545 550 555 560
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
565 570 575
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
580 585 590
Gly Lys
<210> 25
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28共刺激区域
<400> 25
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 26
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR共刺激区域
<400> 26
Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro
1 5 10 15
Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala
20 25 30
Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu
35 40 45
Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
50 55
<210> 27
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFR2共刺激区域
<400> 27
Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro
1 5 10 15
Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala
20 25 30
Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu
35 40 45
Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
50 55
<210> 28
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR3共刺激区域
<400> 28
Thr Tyr Thr Tyr Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala
1 5 10 15
Asp Glu Ala Gly Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Asp Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser
35 40 45
Glu Lys Ile Cys Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly
50 55 60
Tyr Pro Glu Thr Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp
65 70 75 80
Asp Gln Leu Pro Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu
85 90 95
Ser Pro Glu Ser Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly
100 105 110
Pro Gln Leu Tyr Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys
115 120 125
Glu Phe Val Arg Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Val
130 135 140
Glu Val Glu Ile Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys
145 150 155 160
Arg Trp Arg Gln Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala
165 170 175
Leu Glu Arg Met Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg
180 185 190
Leu Gln Arg Gly Pro
195
<210> 29
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD30共刺激区域
<400> 29
Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu
1 5 10 15
Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser
20 25 30
Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr
35 40 45
Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu
50 55 60
Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln
65 70 75 80
Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu
85 90 95
Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr
100 105 110
Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu
115 120 125
Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu
130 135 140
Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu
145 150 155 160
Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu
165 170 175
Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
180 185
<210> 30
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVEM共刺激区域
<400> 30
Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile
20 25 30
Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu
35 40 45
Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
50 55 60
<210> 31
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD27共刺激区域
<400> 31
Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala
1 5 10 15
Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile
20 25 30
Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 32
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ox40共刺激区域
<400> 32
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
20 25 30
Thr Leu Ala Lys Ile
35
<210> 33
<211> 791
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二价mAb35
<400> 33
Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ala Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Ser Tyr Ser Val Ser Trp Leu Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Glu Trp Met Gly Arg Met Trp Asp Asp Gly Gly Thr Val Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Gly Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Gly Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Thr Arg Asp Glu Arg Ile Arg Ala Ile Asn Trp Phe Ala Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp
465 470 475 480
Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu
485 490 495
Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe Phe Lys Val
500 505 510
Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Ile Pro
515 520 525
Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala Gly Ser Gly Glu Gly Arg
530 535 540
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
545 550 555 560
Ala Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Ala Met
565 570 575
Arg Cys Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser
580 585 590
Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asp
595 600 605
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu
610 615 620
Leu Ile Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe
625 630 635 640
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
645 650 655
His Ser Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Ile Asn Gly
660 665 670
Tyr Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala
675 680 685
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
690 695 700
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
705 710 715 720
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
725 730 735
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
740 745 750
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
755 760 765
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
770 775 780
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
785 790
<210> 34
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD79a/CD79b
<400> 34
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val
85 90 95
Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn
100 105 110
Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro
115 120 125
Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile
130 135 140
Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly
145 150 155 160
Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu
165 170 175
Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly
195 200 205
Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu
210 215 220
Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
225 230 235 240
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Arg Leu Ala Leu Ser Pro Val
245 250 255
Pro Ser His Trp Met Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Glu Pro
260 265 270
Val Pro Ala Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser
275 280 285
Ala Cys Ser Arg Ile Trp Gln Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg
290 295 300
Gly Phe Thr Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn
305 310 315 320
Val Ser Trp Leu Trp Lys Gln Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu
325 330 335
Lys Leu Glu Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala
340 345 350
Thr Leu Thr Ile Gln Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe
355 360 365
Cys Gln Gln Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly
370 375 380
Thr Glu Leu Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln
385 390 395 400
Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly Ile Ile Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile
405 410 415
Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro Ile Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp
420 425 430
Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His Thr Tyr Glu Gly Leu Asp Ile
435 440 445
Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu
450 455 460
Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro Gly Gln Glu
465 470 475
<210> 35
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb35 hIgG1
<400> 35
Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ala Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Ser Tyr Ser Val Ser Trp Leu Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Glu Trp Met Gly Arg Met Trp Asp Asp Gly Gly Thr Val Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Gly Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Gly Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Thr Arg Asp Glu Arg Ile Arg Ala Ile Asn Trp Phe Ala Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 36
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb35 hIgGk
<400> 36
Met Ala Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Ala
1 5 10 15
Met Arg Cys Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile
35 40 45
Asp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu His Ser Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Ile Asn
100 105 110
Gly Tyr Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 37
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜区域
<400> 37
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 38
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AChRa跨膜区域
<400> 38
Leu Tyr Phe Ile Val Asn Val Ile Ile Pro Cys Leu Leu Phe Ser Phe
1 5 10 15
Leu Thr Gly Leu Val Phe Tyr Leu
20
<210> 39
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 任选具有在Xaa27和/或Xaa44的突变的CD8a接头
<220>
<221> mutation
<222> (27)..(27)
<223> Xaa27是 Cys或Ser
<220>
<221> mutation
<222> (44)..(44)
<223> Xaa44是 Cys或Ser
<400> 39
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Xaa Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Xaa Asp
35 40 45
<210> 40
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 任选具有在Xaa28的突变的CD28接头
<220>
<221> mutation
<222> (28)..(28)
<223> Xaa28是 Cys或Ser
<400> 40
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Xaa Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工柔性接头序列
<400> 41
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10
<210> 42
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 其中D14、W149和或V155可被突变的AChRa211。
<220>
<221> Xaa14突变
<222> (14)..(14)
<223> Xaa14可以是任何氨基酸，优选Asp、Ala或Gly。
<220>
<221> Xaa149_mutation
<222> (149)..(149)
<223> Xaa149可以是任何氨基酸，优选Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro。
<220>
<221> Xaa155_mutation
<222> (155)..(155)
<223> Xaa155可以是任何氨基酸，优选Val、Arg、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro。
<400> 42
Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Lys Xaa Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val Val Glu Val Thr
20 25 30
Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu Val Asn Gln
35 40 45
Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gln Trp Val Asp Tyr Asn
50 55 60
Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Ile
65 70 75 80
Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala
85 90 95
Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Tyr
100 105 110
Thr Gly His Ile Thr Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys
115 120 125
Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser Met
130 135 140
Lys Leu Gly Thr Xaa Thr Tyr Asp Gly Ser Xaa Val Ala Ile Asn Pro
145 150 155 160
Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu Ser Asn Phe Met Glu Ser Gly Glu Trp
165 170 175
Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly Trp Lys His Ser Val Thr Tyr Ser Cys
180 185 190
Cys Pro Asp Thr Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln
195 200 205
Arg Leu Pro
210
<210> 43
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AChRa211/W149R/V155K>45aa>4-1BB
<400> 43
Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Lys Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val Val Glu Val Thr
20 25 30
Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu Val Asn Gln
35 40 45
Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gln Trp Val Asp Tyr Asn
50 55 60
Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Ile
65 70 75 80
Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala
85 90 95
Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Tyr
100 105 110
Thr Gly His Ile Thr Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys
115 120 125
Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser Met
130 135 140
Lys Leu Gly Thr Arg Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Val Ala Ile Asn Pro
145 150 155 160
Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu Ser Asn Phe Met Glu Ser Gly Glu Trp
165 170 175
Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly Trp Lys His Ser Val Thr Tyr Ser Cys
180 185 190
Cys Pro Asp Thr Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln
195 200 205
Arg Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
210 215 220
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
245 250 255
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
260 265 270
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
275 280 285
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
290 295 300
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
305 310 315 320
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
325 330 335
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
340 345 350
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
355 360 365
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
370 375 380
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
385 390 395 400
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
405 410 415
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
420 425 430
Pro Arg
<210> 44
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AChRa211/W149R/V155K>4aa>4-1BB
<400> 44
Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Lys Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val Val Glu Val Thr
20 25 30
Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu Val Asn Gln
35 40 45
Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gln Trp Val Asp Tyr Asn
50 55 60
Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Ile
65 70 75 80
Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala
85 90 95
Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Tyr
100 105 110
Thr Gly His Ile Thr Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys
115 120 125
Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser Met
130 135 140
Lys Leu Gly Thr Arg Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Val Ala Ile Asn Pro
145 150 155 160
Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu Ser Asn Phe Met Glu Ser Gly Glu Trp
165 170 175
Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly Trp Lys His Ser Val Thr Tyr Ser Cys
180 185 190
Cys Pro Asp Thr Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln
195 200 205
Arg Leu Pro Gly Ser Ser Gly Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
210 215 220
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
225 230 235 240
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
245 250 255
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
260 265 270
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
275 280 285
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
290 295 300
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
305 310 315 320
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
325 330 335
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
340 345 350
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
355 360 365
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
370 375 380
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
385 390
<210> 45
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AChRa211/D14G/W149R/V155K>45aa> 4-1BB
<400> 45
Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Lys Gly Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val Val Glu Val Thr
20 25 30
Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu Val Asn Gln
35 40 45
Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gln Trp Val Asp Tyr Asn
50 55 60
Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Ile
65 70 75 80
Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala
85 90 95
Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Tyr
100 105 110
Thr Gly His Ile Thr Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys
115 120 125
Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser Met
130 135 140
Lys Leu Gly Thr Arg Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Val Ala Ile Asn Pro
145 150 155 160
Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu Ser Asn Phe Met Glu Ser Gly Glu Trp
165 170 175
Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly Trp Lys His Ser Val Thr Tyr Ser Cys
180 185 190
Cys Pro Asp Thr Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln
195 200 205
Arg Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
210 215 220
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
245 250 255
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
260 265 270
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
275 280 285
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
290 295 300
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
305 310 315 320
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
325 330 335
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
340 345 350
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
355 360 365
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
370 375 380
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
385 390 395 400
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
405 410 415
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
420 425 430
Pro Arg
<210> 46
<211> 429
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AChRa211/W149R/V155K >45aa>OX40
<400> 46
Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Lys Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val Val Glu Val Thr
20 25 30
Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu Val Asn Gln
35 40 45
Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gln Trp Val Asp Tyr Asn
50 55 60
Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Ile
65 70 75 80
Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala
85 90 95
Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Tyr
100 105 110
Thr Gly His Ile Thr Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys
115 120 125
Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser Met
130 135 140
Lys Leu Gly Thr Arg Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Val Ala Ile Asn Pro
145 150 155 160
Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu Ser Asn Phe Met Glu Ser Gly Glu Trp
165 170 175
Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly Trp Lys His Ser Val Thr Tyr Ser Cys
180 185 190
Cys Pro Asp Thr Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln
195 200 205
Arg Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
210 215 220
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
245 250 255
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
260 265 270
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro
275 280 285
Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln
290 295 300
Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys
305 310 315 320
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
325 330 335
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
340 345 350
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
355 360 365
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
370 375 380
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
385 390 395 400
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
405 410 415
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420 425
<210> 47
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AChRa211/W149R/V155K >14aa>OX40
<400> 47
Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Lys Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val Val Glu Val Thr
20 25 30
Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu Val Asn Gln
35 40 45
Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gln Trp Val Asp Tyr Asn
50 55 60
Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Ile
65 70 75 80
Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala
85 90 95
Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Tyr
100 105 110
Thr Gly His Ile Thr Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys
115 120 125
Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser Met
130 135 140
Lys Leu Gly Thr Arg Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Val Ala Ile Asn Pro
145 150 155 160
Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu Ser Asn Phe Met Glu Ser Gly Glu Trp
165 170 175
Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly Trp Lys His Ser Val Thr Tyr Ser Cys
180 185 190
Cys Pro Asp Thr Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln
195 200 205
Arg Leu Pro Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
210 215 220
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
225 230 235 240
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro
245 250 255
Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile
260 265 270
Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val
275 280 285
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
290 295 300
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
305 310 315 320
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
325 330 335
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
340 345 350
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
355 360 365
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
370 375 380
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
385 390 395
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有信号肽和FLAG标签肽的氨基酸序列
<400> 48
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly
20 25 30

Claims (31)

1.嵌合多肽受体，其中包含能够被抗人烟碱性乙酰胆碱受体α1亚基(nAChRα1)抗体结合的抗原区域的细胞外区域、跨膜区域和包含细胞内信号传导结构域的细胞内区域以出现的顺序从N-末端向C-末端排列，其中所述抗原区域包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或通过取代、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸衍生自如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽受体，其中所述抗原区域是由通过SEQ ID NO：3中的至少一个Xaa所代表的氨基酸的取代以及任选地作为一个或多个额外的突变通过在SEQ ID NO：3中除Xaa所代表的氨基酸之外的位置处缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸而衍生自如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的氨基酸序列组成的区域。
3.根据权利要求2所述的多肽受体，其中所述一个或多个额外的突变是SEQ ID NO：2中1至5个N-末端和/或C-末端氨基酸的缺失或添加。
4.根据权利要求2或3所述的多肽，其中在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中，由Xaa代表的氨基酸如下：
Xaa8是疏水性氨基酸或酸性氨基酸，
Xaa14是酸性氨基酸或疏水性氨基酸，
Xaa70是酸性氨基酸、具有包含酰胺基的侧链的氨基酸或疏水性氨基酸，
Xaa72是疏水性氨基酸，
Xaa112是疏水性氨基酸，
Xaa149是亲水性氨基酸或疏水性氨基酸，
Xaa155是疏水性氨基酸或亲水性氨基酸，
氨基酸Xaa146至Xaa148、Xaa150至Xaa154和Xaa156至Xaa159各自独立地是碱性氨基酸或疏水性氨基酸，并且
Xaa192和Xaa193各自独立地是Cys或Gly，
其中所述疏水性氨基酸是Val、Ala、Leu、Ile、Gly、Trp、Tyr、Phe、Met或Pro，所述亲水性氨基酸是Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln或Ser，所述酸性氨基酸是Asp或Glu，所述碱性氨基酸为Arg或Lys，且具有包含酰胺基的侧链的氨基酸为Asn或Gln。
5.根据权利要求4所述的多肽受体，其中在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中，由Xaa代表的氨基酸如下：
Xaa8是Val或Glu，
Xaa14是Asp、Ala或Gly，
Xaa70是Asp、Asn或Ala，
Xaa72是Tyr或Phe，
Xaa112是Tyr或Phe，
Xaa149是Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro，
Xaa155是Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro，
氨基酸Xaa146至Xaa148、Xaa150至Xaa154和Xaa156至Xaa159各自独立地是SEQ ID NO：2中相应位点的氨基酸或Lys，且
Xaa192和Xaa193各自独立地是Cys或Gly。
6.根据权利要求5所述的多肽受体，其中在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中，Xaa149是Trp、Lys、Arg或Pro，且Xaa155是Val、Ala、Gly、Lys、Arg、Pro、Met、Asp、Asn、Glu、Gln或Ser。
7.根据权利要求6所述的多肽受体，其中在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中，Xaa149和Xaa155各自独立地是Lys或Arg。
8.根据权利要求1所述的多肽受体，其中所述抗原区域是选自下面的组的任一成员：
抗原区域：AChRα211、AChRα211/V8E、AChRα211/W149R、AChRα211/W149K、AChRα211/W149P、AChRα211/V155A、AChRα211/V155K、AChRα211/V155M、AChRα211/V155D、AChRα211/V155P、AChRα211/C192G、AChRα211/C193G、AChRα211/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149R、AChRα211/V8E/W149K、AChRα211/V8E/W149P、AChRα211/V8E/V155A、AChRα211/V8E/V155K、AChRα211/V8E/V155M、AChRα211/V8E/V155D、AChRα211/V8E/V155P、AChRα211/V8E/C192G、AChRα211/V8E/C193G、AChRα211/V8E/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/V155K、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/W149R/V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/W149R/C192G、AChRα211/W149R/C193G、AChRα211/W149R/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/V155K、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/W149K/V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/W149K/C192G、AChRα211/W149K/C193G、AChRα211/W149K/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155A、AChRα211/W149P/V155K、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/W149P/V155D、AChRα211/W149P/V155P、AChRα211/W149P/C192G、AChRα211/W149P/C193G、AChRα211/W149P/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149R/V155A、AChRα211/V8E/W149R/V155K、AChRα211/V8E/W149R/V155M、AChRα211/V8E/W149R/V155D、AChRα211/V8E/W149R/V155P、AChRα211/V8E/W149R/C192G、AChRα211/V8E/W149R/C193G、AChRα211/V8E/W149R/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149K/V155A、AChRα211/V8E/W149K/V155K、AChRα211/V8E/W149K/V155M、AChRα211/V8E/W149K/V155D、AChRα211/V8E/W149K/V155P、AChRα211/V8E/W149K/C192G、AChRα211/V8E/W149K/C193G、AChRα211/V8E/W149K/C192G/C193G、AChRα211/V8E/W149P/V155A、AChRα211/V8E/W149P/V155K、AChRα211/V8E/W149P/V155M、AChRα211/V8E/W149P/V155D、AChRα211/V8E/W149P/V155P、AChRα211/V8E/W149P/C192G、AChRα211/V8E/W149P/C193G、AChRα211/V8E/W149P/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155A/C192G、AChRα211/W149R/V155K/C192G、AChRα211/W149R/V155M/C192G、AChRα211/W149R/V155D/C192G、AChRα211/W149R/V155P/C192G、AChRα211/W149K/V155A/C192G、AChRα211/W149K/V155K/C192G、AChRα211/W149K/V155M、/C192G、AChRα211/W149K/V155D/C192G、AChRα211/W149K/V155P/C192G、AChRα211/W149P/V155A/C192G、AChRα211/W149P/V155K/C192G、AChRα211/W149P/V155M、/C192G、AChRα211/W149P/V155D/C192G、AChRα211/W149P/V155P/C192G、AChRα211/W149R/V155A/C193G、AChRα211/W149R/V155K/C193G、AChRα211/W149R/V155M/C193G、AChRα211/W149R/V155D/C193G、AChRα211/W149R/V155P/C193G、AChRα211/W149K/V155A/C193G、AChRα211/W149K/V155K/C193G、AChRα211/W149K/V155M/C193G、AChRα211/W149K/V155D/C193G、AChRα211/W149K/V155P/C193G、AChRα211/W149P/V155A/C193G、AChRα211/W149P/V155K/C193G、AChRα211/W149P/V155M/C193G、AChRα211/W149P/V155D/C193G、AChRα211/W149P/V155P/C193G、AChRα211/W149R/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155K/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155P/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155K/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155P/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155K/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155P/C192G/C193G、AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/D14G/W149R/V155A、AChRα211/D14G/W149R/V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/D14G/W149R/V155P、AChRα211/D14G/W149R/V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/D14G/W149K/V155A、AChRα211/D14G/W149K/V155M、AChRα211/D14G/W149K/V155D、AChRα211/D14G/W149K/V155P、AChRα211/D14G/W149K/V155G、AChRα211/D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/W149P/V155A、AChRα211/D14G/W149P/V155M、AChRα211/D14G/W149P/V155D、AChRα211/D14G/W149P/V155P、AChRα211/D14G/W149P/V155G、AChRα211/D14A/W149R/V155K、AChRα211/D14A/W149R/V155A、AChRα211/D14A/W149R/V155M、AChRα211/D14A/W149R/V155D、AChRα211/D14A/W149R/V155P、AChRα211/D14A/W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/W149K/V155A、AChRα211/D14A/W149K/V155M、AChRα211/D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/W149K/V155P、AChRα211/D14A/W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/W149P/V155A、AChRα211/D14A/W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/W149P/V155P或AChRα211/D14A/W149P/V155G
其中AChRα211是如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列，AChRα211的每一个提及的取代的位置指由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列中的相应位置，且在每个取代中，取代氨基酸在位置后显示。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽受体，其中所述细胞内信号传导结构域是衍生自CD3ζ或CD3δ的细胞内结构域的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽受体，其中所述跨膜区域是衍生自选自nAChRα1、T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154和GITR的任意一种分子的跨膜结构域的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽受体，其中所述细胞内区域在所述细胞内信号传导结构域的N-末端进一步包含1至3个共刺激结构域。
12.根据权利要求11所述的多肽受体，其中所述共刺激结构域是衍生自选自CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137(4-1BB)、ICOS、CD154、CITR、TNFR2、DR3、CD30、HVEM、CD27和OX40的1-3种分子的细胞内区域的序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的多肽受体，其进一步包含在所述抗原区域和所述跨膜区域之间的由100个或更少的氨基酸组成的接头区域。
14.根据权利要求13所述的多肽受体，其中所述接头区域是如SEQ ID NO：5、39、40或41所述的氨基酸序列的部分或全部。
15.根据权利要求1所述的多肽，其中
所述抗原区域为AChRα211/W149R/V155K、AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/W149R/V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/W149R/V155G、AChRα211/W149K/V155K、AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/W149K/V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/W149K/V155G、AChRα211/W149P/V155K、AChRα211/W149P/V155A、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/W149P/V155D、AChRα211/W149P/V155P、AChRα211/W149P/V155G、AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/D14G/W149R/V155A、AChRα211/D14G/W149R/V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/D14G/W149R/V155P、AChRα211/D14G/W149R/V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/D14G/W149K/V155A、AChRα211/D14G/W149K/V155M、AChRα211/D14G/W149K/V155D、AChRα211/D14G/W149K/V155P、AChRα211/D14G/W149K/V155G、AChRα211/D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/W149P/V155A、AChRα211/D14G/W149P/V155M、AChRα211/D14G/W149P/V155D、AChRα211/D14G/W149P/V155P、AChRα211/D14G/W149P/V155G、AChRα211/D14A/W149R/V155K、AChRα211/D14A/W149R/V155A、AChRα211/D14A/W149R/V155M、AChRα211/D14A/W149R/V155D、AChRα211/D14A/W149R/V155P、AChRα211/D14A/W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/W149K/V155A、AChRα211/D14A/W149K/V155M、AChRα211/D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/W149K/V155P、AChRα211/D14A/W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/W149P/V155A、AChRα211/D14A/W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/W149P/V155P或AChRα211/D14A/W149P/V155G，
其中AChRα211是如SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列，AChRα211的每一个提及的取代的位置指由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列中的相应位置，且在每个取代中，取代氨基酸在位置后显示，
所述接头区域是CD8α铰链序列(SEQ ID NO：39)、CD28铰链序列(SEQ ID NO：40)或人工接头序列(SEQ ID NO：41)的部分或全部，
所述跨膜区域是CD8α跨膜结构域(SEQ ID NO：6)、CD28跨膜结构域(SEQ ID NO：37)或AChRα跨膜结构域(SEQ ID NO：38)，
所述共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO：7)、CD28共刺激结构域(SEQ IDNO：25)、GITR共刺激结构域(SEQ ID NO：26)、TNFR2共刺激结构域(SEQ ID NO：27)、DR3共刺激结构域(SEQ ID NO：28)、CD30共刺激结构域(SEQ ID NO：29)、HVEM共刺激结构域(SEQ IDNO：30)、CD27共刺激结构域(SEQ ID NO：31)或OX40共刺激结构域(SEQ ID NO：32)，且
所述细胞内信号传导结构域是CD3ζ细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：8)。
16.根据权利要求15所述的多肽受体，其中
所述抗原区域是AChRα211/W149R/V155K(其是其中Xaa14是Asp、Xaa149是Arg并且Xaa155是Lys的SEQ ID NO：42的氨基酸序列)、AChRα211/W149R/V155A(其是其中Xaa14是Asp、Xaa149是Arg并且Xaa155是Ala的SEQ ID NO：42的氨基酸序列)、AChRα211/D14G/W149R/V155K(其是其中Xaa14是Gly、Xaa149是Arg并且Xaa155是Lys的SEQ ID NO：42的氨基酸序列)或AChRα211/D14G/W149R/V155A(其是其中Xaa14是Gly、Xaa149是Arg并且Xaa155是Ala的SEQ ID NO：42的氨基酸序列)，
所述接头区域是CD8α铰链序列(SEQ ID NO：39)、从其C-末端起14个连续氨基酸(其是由SEQ ID NO：39的位置32至45的氨基酸组成的氨基酸序列)、人工接头序列(SEQ ID NO：41)或从其C-末端起的4个连续氨基酸(其是由SEQ ID NO：41的位置11至14的氨基酸组成的氨基酸序列)，
所述跨膜区域是CD8α跨膜结构域(SEQ ID NO：6)，
所述共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO：7)或OX40共刺激结构域(SEQ IDNO：32)，并且
所述细胞内信号传导结构域是CD3ζ细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：8)。
17.由氨基酸序列组成的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含用于使得所述多肽能够在细胞表面上的表达的信号肽的氨基酸序列，且进一步包含与SEQ ID NO：43至47中任一个的氨基酸序列表现出80％或更高序列同一性的嵌合受体的氨基酸序列的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的多肽，其中所述嵌合受体的氨基酸序列由SEQ ID NO：43至47中任一个的氨基酸序列组成。
19.多核苷酸，其编码根据权利要求1至18中任一项所述的多肽。
20.载体，其包含根据权利要求19所述的多核苷酸。
21.根据权利要求20所述的载体，其中所述载体是选自质粒载体、反转录病毒载体和慢病毒载体的任一载体。
22.根据权利要求20或21所述的载体，其中所述载体被进行设计以使得能够表达根据权利要求1至18中任一项所述的多肽。
23.根据权利要求20或21所述的载体，其中所述载体是被进行设计以能够产生其中封入编码根据权利要求1至18中任一项所述的多肽的多核苷酸的病毒载体的质粒载体。
24.用根据权利要求19所述的多核苷酸转染的细胞。
25.根据权利要求24所述的细胞，其中所述细胞在细胞表面上表达根据权利要求1至18中任一项所述的多肽。
26.根据权利要求24或25所述的细胞，其中所述细胞是选自T细胞、PBMC、iPS细胞和ES细胞中的任一成员。
27.用于治疗与结合乙酰胆碱受体α亚基的自身抗体的产生有关的疾病的药物，所述药物包含根据权利要求24至26中任一项所述的细胞作为活性成分。
28.根据权利要求27所述的药物，其中所述疾病是重症肌无力。
29.用于治疗重症肌无力的方法，其包括向待治疗的主体施用治疗有效量的根据权利要求24至26中任一项所述的细胞的步骤。
30.供治疗重症肌无力之用的根据权利要求24至26中任一项所述的细胞。
31.根据权利要求24至26中任一项所述的细胞在生产用于治疗重症肌无力的药物中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5573924A (en) 1992-09-08 1996-11-12 Immunex Corporation CD27 ligand
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
US5484892A (en) 1993-05-21 1996-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies that block ligand binding to the CD22 receptor in mature B cells
US6106834A (en) 1993-06-02 2000-08-22 Research Corporation Technologies, Inc. Use of anti-CD45 leukocyte antigen antibodies for immunomodulation
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
FR2741066B1 (fr) 1995-11-14 1997-12-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
FR2743365A1 (fr) 1996-01-10 1997-07-11 Rhone Poulenc Rorer Sa Derives de 5h,10h-imidazo(1,2-a)indolo(3,2-e)pyrazine-4-one, leur preparation et les medicaments les contenant
DE19605548A1 (de) 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
DE19607686A1 (de) 1996-02-29 1997-09-04 Chemicon Lab Gmbh Neue metabolisierbare Lipopolyamine, deren Darstellung und Anwendung
KR100719020B1 (ko) * 2005-09-28 2007-05-17 광주과학기술원 재조합 아세틸콜린 수용체 폴리펩티드, 폴리펩티드 유도체및 이를 유효성분으로 포함하는 중증근무력증 치료제
AU2009267294B2 (en) 2008-06-30 2014-06-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-CD27 antibody
PL3006459T3 (pl) 2008-08-26 2022-01-17 City Of Hope Sposób i kompozycje dla wzmocnionego działania efektorowego komórek t przeciw guzowi nowotworowemu
PL2406284T3 (pl) 2009-03-10 2017-09-29 Biogen Ma Inc. Przeciwciała anty-bcma
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
US20120141505A1 (en) 2010-11-01 2012-06-07 Fatih M. Uckun Cd19-ligand and use
SG10201510092QA (en) 2010-12-09 2016-01-28 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
CN113604491A (zh) * 2014-05-02 2021-11-05 宾夕法尼亚大学董事会 嵌合自身抗体受体t细胞的组合物和方法
WO2016070061A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for modified t cells
KR20220007675A (ko) * 2019-05-13 2022-01-18 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 아세틸콜린 수용체 키메라 자가항체 수용체 세포의 조성물 및 방법

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