CN105153315B - 免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体及其应用，嵌合受体包括免疫抑制因子受体和肿瘤抗原受体，其中肿瘤抗原受体识别肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原来产生和传递T细胞活化的第一信号，决定T细胞杀伤特异性；免疫抑制因子受体通过与免疫抑制因子结合，避免抑制因子诱导免疫细胞的失活甚至凋亡使肿瘤细胞产生免疫逃逸，从而提升CAR修饰的T细胞的肿瘤杀伤作用，因此能够用于临床预防或/和治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病。

Description

免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体及其应用

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，具体涉及免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，还涉及嵌合受体在制备治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病的药物中的应用。

背景技术

针对肿瘤和慢性感染的过继性T细胞治疗(adoptive cell therapy，ACT)是一个新兴的并且展现出巨大潜力的领域。这种疗法以合成生物学作为基础对T淋巴细胞进行修饰使其表达高亲和性的抗原受体从而克服免疫耐受机制，对靶细胞进行高效杀伤，进而达到治疗的目的。当前对于肿瘤的过继性T细胞治疗进展迅速，其中用靶向CD-19抗原的CAR修饰的T细胞治疗化疗耐受性急性淋巴细胞白血病取得了良好的临床效果(Sci Transl Med5,177ra38(2013))。通常T细胞的活化需要两个信号的刺激，其中，T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞的杀伤特异性；T细胞表面的共刺激分子(如CD28)与相应配体(如B7)结合，提供T细胞活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。但由于肿瘤细胞存在HLA下调的免疫逃逸机制和抗原加工途径改变的免疫逃逸机制，导致在生理条件下无法有效提供T细胞活化相关的信号，从而激活T细胞免疫反应。为了解决这个问题，人们采用嵌合抗原受体CAR的方式对T细胞进行修饰，从而绕开上述限制杀伤肿瘤细胞。

嵌合抗原受体CAR由一个scFv单链抗体(由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经Linker连接而成)，通过铰链结构与源于TCR复合体或者IgE高亲和受体的跨膜和胞内信号结构连接构成。表达CAR的T细胞可通过非MHC限制性途径与抗原反应。经过多年的发展，CAR受体已由最初的第一代受体发展为第三代受体。第一代CAR受体，包含胞外特异识别肿瘤抗原的scFv片段，胞内激活信号由CD3ζ或FcεRIγ的ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代CAR受体在第一代CAR的基础上增加了一个共刺激信号分子的胞内结构域，提供T细胞活化的两种信号，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specific protein tyrosine kinase(LCK)，inducible T-cell co-stimulator(ICOS)以及DNAX-activation protein10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(activation induced cell death，AICD)。第三代CAR受体，在第二代CAR的基础上，增加了另外一种共刺激信号分子的胞内结构域，如在共刺激结构CD28和ITAM信号链的之间再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。

虽然第二第三代的CAR受体能够在很大程度上提高对T细胞激活、增殖及杀伤能力，但是由于肿瘤细胞会表达免疫抑制因子如PD-1、CTLA-4、TGF-β、VEGF、IL-10等，当免疫细胞上的相关受体与这些抑制因子结合后会迅速诱导该免疫细胞的失活甚至凋亡从而使肿瘤细胞产生免疫逃逸免于受到攻击。这使得CAR修饰的T细胞的肿瘤杀伤作用大大降低。

基于上述原因，我们希望寻求一种能够稳定提升CAR修饰的T细胞的杀伤效能的方法从而获得良好的临床疗效。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，本发明的目的之二在于提供嵌合受体在制备治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病的药物中的应用。

为实现上述发明目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，包括免疫抑制因子受体和肿瘤抗原受体，所述免疫抑制因子受体依次由信号肽Ⅰ、至少一个结合肿瘤免疫抑制因子受体、跨膜区Ⅰ和胞内共刺激信号分子胞内结构域组成；所述肿瘤抗原受体依次由信号肽Ⅱ、至少一个肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原、跨膜区Ⅱ、胞内免疫受体酪氨酸活化基序组成。

本发明中，配体为可以和所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原、免疫抑制因子特异性结合的分子，例如可以为蛋白、多肽或抗体。

优选的，所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1 beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase1)、FR(Flavin reductase)、PSMA(Prostate-specific membrane antigen)、gp100(PMEL premelanosome protein)、CA9(carbonic anhydrase IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称melan-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，cancer/testis antigen 1B)、MAGE(Melanoma-associatedantigen E1)家族蛋白、BAGE(B melanoma antigen family)家族蛋白、GAGE(growthhormone releasing factor)家族蛋白、AFP(alpha-fetoprotein)、MUC1(mucin 1,cellsurface associated)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 1)、PSCA(prostate stem cell antigen)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，kallikrein-related peptidase 3)、HMGA2、fetal acetylcholine receptor(fetal-AChR)、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(mesothelin)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16，mucin 16，cell surface associated)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，vitaminD(1,25-dihydroxyvitamin D3)receptor)，β2-MG(beta-2-microglobulin)、PROGRP(GPR gastrin-releasing peptide)、Freeβ-hCG、SCCA、β2-MG、RORl、间皮素(mesothelin)、c-Met、糖脂F77、GD-2、NY-ESO-1TCR中的至少一种；所述肿瘤免疫抑制因子受体为PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3中的至少一种；所述胞内共刺激信号分子胞内结构域为CD28、CD134/OX40、CD137/41BB、LCK、ICOS或DAP10中的至少一种；所述胞内免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ和FcεRIγ的免疫受体酪氨酸活化基序信号链；所述跨膜区为CD28、CD8、CD3ζ、CD134、CD137、ICOS或DAP10跨膜区。

优选的，所述信号肽Ⅰ和信号肽Ⅱ为相同信号肽或不同信号肽。

优选的，所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为CEA；所述肿瘤免疫抑制因子受体为PD-1；所述胞内共刺激信号分子胞内结构域为CD28和CD137/41BB；所述胞内免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ的免疫受体酪氨酸活化基序信号链；所述跨膜区Ⅰ为CD28，所述跨膜区Ⅱ为CD8。

优选的，所述免疫抑制因子受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述肿瘤抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

更优选的，所述免疫抑制因子受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述肿瘤抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

更优选的，所述免疫抑制因子受体和肿瘤抗原受体由两个载体分别表达或由一个载体融合表达。蛋白质前体加工酶识别序列可以为Furin-2A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6中第1093～1968位所示，当两种嵌合抗原受体表达后，将被剪切成两个独立的蛋白，分别运输至细胞膜。

本发明中所述的载体选自真核表达质粒、重组病毒；所述真核表达质粒例如可以为pSV2、pRSV、pcDNA3.1、pCI和pVAX1、转座子质粒；所述重组病毒例如可以为重组逆病毒、重组慢病毒，本发明的一个实施方案中，所述载体改造至第三代自身失活型面病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE。

更优选的，所述融合表达的融合序列为由蛋白质前体加工酶识别序列连接免疫抑制因子受体和肿瘤抗原受体的序列。

本发明中可以将嵌合受体与包装为病毒，将表达肿瘤抗原受体和免疫抑制因子受体的表达载体整合到宿主细胞基因组中使其稳定表达两种嵌合受体的重组病毒。

优选的，所述的病毒包括慢病毒，腺病毒和逆转录病毒，更优选为第三代自身失活型慢病毒。

本发明中，包装需要借助包装细胞系，包括PT67，NIH3T3，PG13，293T优选的，所述包装细胞系为293T。

本发明中，包装为病毒包装即是将包装质粒、包膜质粒、载体质粒导入到包装细胞系中使其表达，然后在细胞外组装成高滴度慢病毒。

本发明中，通过将慢病毒导入免疫反应细胞，使嵌合抗原受体得以表达，来对细胞进行遗传修饰。所以免疫反应细胞选自T细胞、单核细胞(monocyte)、自然杀伤细胞(NK细胞)、中性粒细胞；其中所述T细胞例如可以为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、辅助T细胞、或抑制/调节性T细胞。

2、所述免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体在制备预防和/或治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病的药物中的应用。

优选的，所述恶性肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；所述病毒为艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、乳头瘤病毒、疱疹病毒或巨细胞病毒。

发明详述

本发明中术语“嵌合抗原受体”是人工改造受体，能够将识别肿瘤抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。

本发明中术语“T细胞活化相关信号”是指与T细胞活化所需要两个信号，即T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞的杀伤特异性；T细胞表面的共刺激分子(如CD28)与相应配体(如B7)结合，提供T细胞活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。

本发明中术语“免疫受体酪氨酸活化基序”(immunoreceptor tyrosine-baseactivation motifs，ITAM)是指免疫细胞活化相关受体(如BCR/Igα/Igβ，TCR/CD3、FcαR和FcRγ等)胞浆区所共有的以酪氨酸残基(tyrosine,Y)为基础的氨基酸序列基序，其特征为:两个酪氨酸残基被大约13外其它氨酸残基隔开(…YXX[L/V]X 7-11YXX[L/V]…)，其中酪氨酸是蛋白激酶磷酸化位点，被磷酸化后能够与信号转导途径下游的信号分子结合，导致细胞的活化。

本发明中术语“共刺激信号分子”(Co-stimulating molecule)是指免疫细胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通过与其配体结合，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。

发明中术语“肿瘤特异性抗原”(tumor specific antigen,TSA)是肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原。

发明中术语“肿瘤相关抗原”(tumor-associated antigen,TAA)是指非肿瘤细胞所特有的、正常细胞和其他组织上也存在的抗原，只是其含量在细胞癌变时明显增高的抗原。

发明中术语“免疫抑制因子(Immunosuppressive factor)”是指肿瘤细胞表面表达的一系列通过抑制各种免疫细胞在瘤组织中的浸润，增殖，分化，活化，或诱导免疫细胞凋亡，或抑制瘤细胞表面靶细胞识别抗原的表达，或封闭由细胞因子启动的信号传导通路等方式使肿瘤细胞免于受到免疫细胞的攻击的因子

发明中术语“单链抗体”(single-chain antibody variable region fragment,scFv)是指由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经Linker连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。

发明中术语“程序性死亡蛋白1”(Programmed cell death protein 1，PD-1)作为B7-CD28家族的重要负性共刺激信号途径，已证实能够通过抑制T细胞的活化增殖及细胞因子的产生来负调控免疫应答，参与免疫耐受及自身免疫性疾病、慢性感染、肿瘤等慢性疾病。

本发明中，所述肿瘤抗原受体与CD3共同组成一个嵌合抗原受体负责产生并传递T细胞活化的第一信号，所述免疫抑制因子受体与CD28、CD137/4-1BB等功刺激信号共同组成一个嵌合抗原受体负责产生并传递T细胞活化的第二信号，两个嵌合抗原受体各自独立与各自的配体结合，并分别将结合后产生的信号转导入细胞内。

本发明中，所述Linker是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。

本发明中，所述多肽通常是指长度在1-100个氨基酸的肽链分子；蛋白通常是指长度大于100个氨基酸的肽链分子。

在本发明中所述“选自”是指选自所列项目中的一种或数种。

本发明的有益效果在于：本发明公开了免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，以T细胞作为CAR修饰的对象，将第一信号和第二信号从单一的CAR中分开，构建双信号独立的嵌合抗原受体，其中肿瘤抗原受体与CD3等组成一个CAR，识别肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原来产生和传递T细胞活化的第一信号，决定T细胞杀伤特异性；而免疫抑制因子受体与CD28、CD137/4-1BB等共同组成一个CAR负责产生并传递T细胞活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。这样经过CAR修饰的T细胞表面会形成两个针对同一个免疫抑制因子的受体，但是这两个受体在与免疫抑制因子结合后所产生的效果却完全相反，T细胞原有的免疫抑制因子受体在与配体结合后会诱导T细胞的失活或者凋亡，而CAR修饰的免疫抑制因子受体在与配体结合后会产生并传递T细胞活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活，这样两个免疫抑制因子受体就会竞争结合肿瘤细胞表面的免疫抑制因子，虽然仍有一部分CAR修饰的T细胞在与免疫抑制因子结合后会失活或凋亡，但另一部分CAR修饰的T细胞在与免疫抑制因子结合后会促进T细胞活化、增殖与存活，这样即可大幅提高CAR修饰的T细胞对肿瘤细胞的杀伤效能。

除T细胞外，本发明同样适用于其它免疫反应细胞，例如单核细胞、NK细胞、中性粒细胞。

同时，本发明中的免疫抑制因子受体可以是多种免疫抑制因子受体的组合因而适用于各种恶性肿瘤以及同种类型的恶性肿瘤细胞由于异质性而表达不同免疫抑制因子的情况，进而达到增加CAR修饰的免疫细胞的杀伤效能的作用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为靶向CEA抗原的嵌合抗原受体的结构图(A：靶向CEA抗原的嵌合抗原受体与靶向PD-1配体的嵌合受体联合示意图；B：CAR1CEA，CAR2PD1，CAR1CEACAR2PD1，CAR3CEA序列组成示意图)。

图2为表达不同CAR的T细胞体外培养时的增殖情况。

图3为表达CAR1CEA、CAR3CEA和CAR1CAR2PD1的T细胞靶向CEA抗原的CAR的表达检测及PD1分子的检测。

图4为表达CAR1CEA、CAR2PD1、CAR3CEA和CAR1CAR2PD1的T细胞对靶细胞作用后IFN-γ的释放水平检测。

图5表达CAR1CEA、CAR2PD1、CAR3CEA和CAR1CAR2PD1的T细胞对靶细胞杀伤能力的检测。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、CAR表达框的合成与表达载体的构建

设计一个免疫抑制因子受体和一个肿瘤抗原受体在内的双信号嵌合抗原受体，分别为CAR1CEA、CAR2PD-1和CAR1CEACAR2PD-1，结构如图1所示。

其中CAR1CEA依次由信号肽1、VLCEA、Linker1、VHCEA、CD8a higle、CD8TM和CD3ζ融合构建成嵌合抗原受体，命名为信号肽1-VLCEA-Linker1-VHCEA-CD8a higle-CD8TM-CD3ζ融合构成，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示，编码的基因序列如SEQ ID NO.2所示。SEQ ID NO.2中第1-54位为信号肽1，第55-372位为VLCEA(简称VL)，第373-426位为Linker1，第427-798位为VHCEA(简称VH)，第799-963位为CD8a higle(简称CD8a)，第964-1047位为CD8TM(简称TM)，第1048-1383位为CD3ζ(简称CD3)。

CAR2PD-1依次由信号肽2、PD-1、CD28和CD137/41BB融合构建成嵌合抗原受体，命名为2-PD-1-CD28-CD137/41BB，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO.3所示，编码的基因序列如SEQ ID NO.4所示。SEQ ID NO.4中第1-465位为PD-1胞外结构域(简称PD-1，由于PD-1胞外结构域能够定位于细胞膜，因此也相当于信号肽2)，第466-705位为CD28跨膜及胞内结构域(简称CD28)，第706-834位为CD137胞内结构域(简称CD137/41BB)。

CAR1CEA CAR2PD-1由CAR1CEA与CAR2PD-1经Furin-2A(SEQ ID NO.6核苷酸序列第1384～1449位所示)连接构成，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO.5所示，编码的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

同时设计对照CAR3CEA，依次由信号肽1、VLCEA、Linker1、VHCEA、CD8a higle、CD8TM、CD28、CD137/41BB和CD3ζ融合构建成嵌合抗原受体信号肽1-VLCEA-Linker1-VHCEA-CD8a higle-CD8TM-CD28-CD137-CD3ζ，结构如图1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码的基因序列如SEQ ID NO.8所示。SEQ ID NO.8中，第1-54位为信号肽1，第55-372位为VLCEA(简称VL)，第373-462位为Linker1，第463-798位为VHCEA(简称VH)，第799-963位为CD8 a higle(简称CD8)，第964-1048位为CD8 TM(简称TM)，第1049-1170位为CD28胞内结构域(简称CD28)，第1171-1300位为CD137胞内结构域(简称CD137)，第1301-1635位为CD3ζ胞内机构域(简称CD3ζ)。

此外信号肽1和信号肽2序列可以为相同的信号肽，也可以为不同的信号肽；本发明中使用不同的信号肽，信号肽1为SEQ ID NO.2中第1-54位核苷酸序列；信号肽2为PD-1胞外结构域。

根据CAR1CEA、CAR2PD-1、CAR1CEACAR2PD-1和CAR3CEA的基因编码序列，委托生工生物工程(上海)有限公司合成，然后将合成的序列插入pRRLSIN.cPPT.EF1a-GFP.WPRE载体(Trono实验室)的NheI与SalI多克隆位点之间，然后将重组载体转化到E.coli Stable3，筛选阳性克隆，并送测序公司测序，经测序验证正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。

实施例2、表达CAR序列的慢病毒制备

将实施例1中构建并纯化获得高品质慢病毒质粒，利用磷酸钙将其与慢病毒包装质粒pMD2.G、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev转染至293T细胞，48h后收集上清，并通过PEG600离心纯化，分别获得表达CAR1CEA、CAR2PD-1、CAR1CEACAR2PD-1或CAR3CEA的慢病毒。

实施例3、稳定表达人源PD1配体1(B7H1)的肿瘤细胞系的构建

B7H1基因CDS序列购于义翘神州公司(货号HG10084-M)，然后用引物5’-agagctagcatgaggatatttgctgtc-3’(SEQ ID NO.9)和5’-attgtcgacttacgtctcctccaaatg-3’(SEQ ID NO.10)进行PCR扩增，扩增获得的片段用限制性内切酶NheI和SalI进行双酶切，并将酶切产物连接至pRRLSIN.cPPT.EF1a-GFP.WPRE载体的NheI和SalI酶切位点处，连接产物转化到E.coli Stable3，筛选阳性克隆，获得pRRLSIN.cPPT.EF1a-B7H1.WPRE，经测序验证后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。再按照实施例2中的方法利用磷酸钙将其与慢病毒包装质粒pMD2.G、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev转染至293T细胞，48h后收集上清，并通过PEG600离心纯化获得表达B7H1基因的慢病毒载体。

将pRRLSIN.cPPT.EF1a-B7H1.WPRE病毒载体于24孔板中感染Lovo、SW480、HT29细胞(均购自ATCC，1×10⁵/孔)，利用流式细胞技术筛选稳定表达B7H1的细胞系。

实施例4、遗传修饰外周血来源T细胞细胞表型及增殖情况测定

将人外周血来源的单个核细胞PBMC培养在含10％FBS(体积分数)的RPMI 1640完全培养基中，通过抗CD3单克隆抗体活化2天后，加入20MOI的慢病毒载体，24h后更换含有500IU/ml的重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基中继续培养12天。通过细胞计数方式记录细胞感染病毒后的第1、5、6、7、9、12天的细胞数，绘制细胞生长曲线，结果如图2所示。结果显示表达CAR1CEACAR2PD1的CAR-T细胞增殖能力与传统的表达CAR3CEA的CAR-T细胞无显著差异，较表达CAR1CEA的CART细胞更具有增殖优势，但细胞增殖能力低于CAR2PD1T。

通过流式细胞技术检测第10天的细胞表面CAR分子及PD1分子的表达水平，用浓度为1ng/ml的Pierce^TMRecombinant Protein L(赛默飞生物科技有限公司公司，货号21189)作为一抗与CAR结合，与1×10⁶CART细胞于100μl体积4℃下孵育30min，1000rpm离心5min，收集沉淀用100μl含0.1％BSA的PBS重悬，加入1μl浓度为1ng/ml的647标记的Streptavidin(赛默飞生物科技有限公司公司，货号：21189S)作为二抗于4℃下孵育30min，加入5μl PE-标记的小鼠抗人CD279单克隆抗体(BD Pharmingen公司，货号558694)，1000rpm离心收集沉淀，反复操作两次，最终用200μl含0.1％BSA的PBS重悬，上流式细胞仪(BD FACSAria II)检测，结果如图3所示。结果显示无论CAR1CEA T、CAR3CEA T还是CAR1CEACAR2PD1T均可表达一定比例的CAR分子，但仅CAR1CEACAR2PD1 T约40％的细胞可表达PD1分子，其他2个CART仅5.8％-8.2％的比例细胞表达本底水平PD1分子，说明CAR1CEACAR2PD1 T成功的在T细胞上同时表达CAR1CEA分子和CAR2PD1分子。

实施例5、CAR1CEA CAR2PD1遗传修饰后T细胞株IFNγ分泌量测定

将CAR1CEA、CAR2PD1、CAR3CEA及CAR1CEACAR2PD1修饰的T细胞以及未修饰的T细胞(5×10⁵/孔)在24孔板中与Lovo、SW480、HuH7，HEK293(均购自ATCC，1×10⁵/孔)，Lovo-B7H1，Sw480-B7H1(Lovo、SW480细胞系感染表达人B7H1基因的慢病毒载体)共培养，24小时后收集上清，通过IFNγ的ELISA检测试剂盒(BD Biosciences)检测IFNγ的分泌量，结果如图4所示。结果表明，与CEA与PD1(B7H1)双阳性的LOVO-B7H1细胞共培养后，CAR1CEACAR2PD1修饰的T细胞能大量分泌IFN-γ，分泌量高于CAR1CEAT，CAR2PD1，和CAR3CEA修饰T细胞；与CEA高阳性而B7H1阴性的Lovo细胞共培养后，CAR1CEACAR2PD1修饰T细胞的IFNγ分泌量与CAR1CEA修饰T细胞差异不显著，低于CAR3修饰T细胞；与CEA弱阳性、PD-1阳性的SW48-B7H1细胞共培养后，CAR1CEACAR2PD-1修饰T细胞分泌较高水平的IFNγ，而CAR1CEA和CAR3CEA修饰T细胞分泌IFNγ的能力显著下降；与CEA弱阳性、PD1阴性的SW48细胞共培养后，CAR1CEACAR2PD1，CAR1CEA和CAR3CEA修饰T细胞分泌IFNγ的能力无显著差异；与CEA阴性、PD1阴性的肿瘤细胞HuH7及CEA阴性、PD1阴性的人胚肾细胞HEK293细胞共培养后，CAR1CEACAR2PD1，CAR1CEA和CAR3CEA修饰T细胞几乎不分泌IFNγ。以上结果表明，当两种抗原同时存在(如CEA与PD-1双阳性，代表一般肿瘤组织细胞)，经CAR1CEACAR2PD1修饰的T细胞能大量分泌IFNγ，且分泌量大于传统的CAR1CEA和CAR3CEA；当第一信号存在，第二信号较弱(如CEA阳性、PD-1阴性，代表少数肿瘤细胞)，经CAR1CEACAR2PD1修饰的T细胞也能有效分泌IFNγ，与传统的CAR1CEA和CAR3CEA分泌量差异不大；当第一信号较弱，第二信号不存在(如CEA弱阳、PD-1阴性，代表正常组织细胞)，经CAR1CEACAR2PD1修饰的T细胞基本不分泌IFNγ。

实施例6、CAR1CEACAR2PD1遗传修饰后T细胞株的体外杀伤作用测定

按效靶比为5:1，将CAR1CEA、CAR2PD1、CAR3CEA及CAR1CEACAR2PD1修饰T细胞以及未修饰的T细胞分别与表达萤火虫荧光素酶Luciferase的Lovo、Lovo-B7H1、HuH7、HEK293细胞共培养，应用Luciferase表达量检测不同方法遗传修饰后的T细胞对不同类型肿瘤细胞的体外杀伤能力。方法如下：靶细胞铺96孔板(1×10⁴/孔)，效应细胞(1×10⁴/孔)加入靶细胞所在孔中，每组重复3组，细胞杀伤率＝(靶细胞组Lucifersae值-靶细胞消音细胞共培养组Luciferase值)/靶细胞组Lucifersae值×100％，结果如图5所示。结果表明，CAR1CEACAR2PD1修饰的T能有效杀伤CEA与PD1双阳性的Lovo-B7H1肿瘤细胞；对CEA高阳性而PD1阴性的Lovo的杀伤作用与CAR1CEAT和CAR3CEAT相似；对CEA阴性而PD1阴性的HEK293细胞基本不杀伤；对CEA阴性而PD1阳性的HEK293细胞同样不杀伤。以上结果表明，当两种抗原同时存在(如CEA与PD1双阳性，代表一般肿瘤组织细胞)，经CAR1CEACAR2PD1修饰的T细胞能有效杀伤；当第一信号存在，第二信号较弱(如CEA阳性、PD-1阴性，代表少数肿瘤细胞)，经CAR1CEACAR2PD1修饰的T细胞也能有效发挥杀伤作用；当第一信号阴性，第二信号无论是否存在(如CEA阴、PD-1阴/阳，代表正常组织细胞)，经CAR1CEACAR2PD1修饰的T细胞基本不杀伤。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，其特征在于：包括免疫抑制因子受体和肿瘤抗原受体，所述免疫抑制因子受体依次由信号肽Ⅰ、肿瘤免疫抑制因子受体、跨膜区Ⅰ和胞内共刺激信号分子胞内结构域组成；所述肿瘤抗原受体依次由信号肽Ⅱ、肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原受体、铰链区、跨膜区Ⅱ、胞内免疫受体酪氨酸活化基序组成；所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为CEA；所述肿瘤免疫抑制因子受体为PD-1胞外结构域；所述胞内共刺激信号分子胞内结构域为CD28和CD137/41BB；所述胞内免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ的免疫受体酪氨酸活化基序信号链；所述跨膜区Ⅰ为CD28，所述跨膜区Ⅱ为CD8。

2.根据权利要求1所述免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，其特征在于：所述信号肽Ⅰ和信号肽Ⅱ为相同信号肽或不同信号肽。

3.根据权利要求1所述免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，其特征在于：所述免疫抑制因子受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述肿瘤抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

4.根据权利要求1所述免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，其特征在于：所述免疫抑制因子受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述肿瘤抗原受体的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

5.根据权利要求1所述免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，其特征在于：所述免疫抑制因子受体和肿瘤抗原受体由两个载体分别表达或由一个载体融合表达。

6.根据权利要求5所述免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，其特征在于：所述融合表达的融合序列为由蛋白质前体加工酶识别序列连接免疫抑制因子受体和肿瘤抗原受体的序列。

7.权利要求1~6任一项所述免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体在制备治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病的药物中的应用；所述恶性肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；所述病毒为艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB 病毒、乳头瘤病毒、疱疹病毒或巨细胞病毒。