CN103965361B - 一种t细胞信号的嵌合分子转换器及其用途 - Google Patents
一种t细胞信号的嵌合分子转换器及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及一种T细胞信号的嵌合分子转换器及其用途。具体地，其由高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的多肽，通过铰链结构与源于高亲和受体的跨膜区和共刺激信号分子胞内肽段连接构成。膜外多肽接收肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面免疫抑制分子信号并传递到胞内，通过共刺激信号分子胞内肽段，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间，从而克服肿瘤免疫抑制微环境对肿瘤过继细胞治疗效应细胞的副作用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及一种T细胞信号的嵌合分子转换器（Signal Chimeric Convertor，SCC）及其用途。
背景技术
肿瘤过继细胞治疗（adoptive cell therapy,ACT）是将经处理的自体或异体免疫细胞（主要是自体细胞）回输给肿瘤患者，以增强患者免疫功能，达到治疗目的的方法。当前肿瘤ACT进展迅速，在多种类型恶性肿瘤的临床治疗中取得了非常好的疗效（Nature.2011;480:480-9；J Clin Oncol.2011;29:4828-36）。
免疫系统的稳定至关重要，反应过低可造严重感染，反应过强则发生过敏反应。因而，人体免疫系统进化出一套精细、复杂的双向免疫调节机制，对免疫应答进行正负双向调节。在排除外来抗原异物时，激活并加强免疫应答反应；外来抗原物质排除后，可使免疫应答减弱以至终止。例如肿瘤ACT效应T细胞，其正向调节分子包括CD3/TCR复合物、CD28、CD134（又称OX40）、CD137（又称4-1BB），其负向调节分子包括PD-1（又称PDCD1，CD279）、CD152（又称CTLA4）、CD223（又称LAG3），TIM3（又称HAVCR2）。
然而，在肿瘤微环境内，存在许多能负向调节T细胞免疫应答的因素，使肿瘤细胞逃脱机体免疫系统的监控与清除，使得肿瘤细胞不断恶性增殖、侵袭与转移。
肿瘤微环境由肿瘤细胞和肿瘤基质细胞、细胞因子、趋化因子等组成，其中基质细胞包括成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、调节性T细胞（Treg）、未分化的骨髓细胞、内皮细胞、周细胞和血小板、内皮细胞等；细胞因子如TNF、VEGF、IL-1等；趋化因子如CXCL12、CCL27、CCL21等。
一方面，肿瘤细胞或肿瘤基质细胞可通过其表面的抑制分子直接发挥作用。例如，肿瘤细胞可以过量表达PD-1的配体PDL1/PDL2，与其受体PD-1相互作用，导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，使肿瘤细胞逃脱机体免疫监控（J Immunol.2011;187:1113-9）；某些肿瘤细胞可以高表达FasL，通过结合免疫细胞表面的Fas分子，激活免疫细胞的凋亡信号途径（MolBiotechnol.2003;25:19-30）；某些肿瘤细胞表面表达非经典MHC I类分子（HLA-G），抑制免疫活性细胞发挥效应功能（Cancer Res.2007;67:6433-41）；某些肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞可以表达B7-H4，作用于T细胞相关受体，抑制Ｔ细胞功能（Immunity.2003;18:849-61）；某些肿瘤和成纤维细胞样网状细胞（FRC）表达Crry，一种膜相关补体调控蛋白，它通过抑制C3/C5转化酶活性保护肿瘤细胞逃逸补体系统（J Immunol.2000;164:4533-42）。
另一方面，肿瘤细胞或肿瘤基质细胞可通过分泌免疫抑制分子间接发挥作用。例如，天然来源的调节性T细胞和肿瘤细胞分泌TGF-β1，抑制T细胞功能，并将原态T细胞转化成诱导性调节T（iTreg）细胞；肿瘤细胞可大量分泌VEGF，抑制DC的分化与成熟，抑制机体的抗肿瘤T细胞免疫应答而逃避免疫监视；肿瘤细胞可分泌CCL21，通过将外层组织转化为淋巴样组织，从而创造出一种耐受性间质微环境，来促进免疫系统逃逸；肿瘤和骨髓来源未成熟树突状细胞表达IDO-色氨酸代谢中的限速酶。IDO通过去除色氨酸，提高促凋亡、色氨酸分解产物N-甲酰犬尿氨酸的局部浓度，从而抑制T细胞功能；CD11b+Gr-1+髓系抑制细胞（MDSCs）通过分泌抑制免疫反应的细胞因子（如IL-4、IL-10）、上调NO、产生活性氧族以及增强L精氨酸酶的活性而抑制免疫反应，引起肿瘤的免疫逃逸。
因而，为进一步提高肿瘤ACT的疗效，亟需解决使到达病灶部位后的效应细胞能适应肿瘤部位的免疫抑制微环境，有效存活并发挥治疗作用这一技术难题。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，建立一种T细胞信号的嵌合分子转换器（Signal Chimeric Convertor，SCC），可将肿瘤微环境内免疫抑制信号转换为免疫激活信号。具体地说，该T细胞信号分子转换器由高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面免疫抑制分子的多肽，通过铰链结构与源于高亲和受体的跨膜区和共刺激信号分子胞内肽段连接构成。膜外多肽接收肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面免疫抑制分子信号并传递到胞内，通过共刺激信号分子胞内肽段，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间，从而克服肿瘤免疫抑制微环境对肿瘤过继细胞治疗效应细胞的副作用。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种分离的融合蛋白，包括：
（1）高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段、
（2）跨膜区，以及
（3）共刺激信号分子胞内结构域肽段。
不拘于理论的限制，本发明的融合蛋白通过具有高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面免疫抑制分子的多肽来传递T细胞活化的第二信号，使经过融合蛋白修饰的T细胞在接触肿瘤细胞或肿瘤基质细胞表面起免疫抑制作用的分子后，起免疫激活作用，增强T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间，从而克服肿瘤免疫抑制微环境对肿瘤过继细胞治疗效应细胞的副作用。
本发明的融合蛋白是一种T细胞信号的嵌合分子转换器。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面免疫抑制分子选自膜蛋白：PDL1/PDL2（PD-1配体）、FasL（Fas配体）、B7-H4（免疫共刺激蛋白B7-H4，又称VTCN1）、Crry（膜相关补体调控蛋白，又称Cr1l）和HLA-G（非经典MHCI类分子）中的一种或多种。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面免疫抑制分子选自分泌蛋白：TGFβ（转化生长因子-β）、IL-4（白介素4）、IL-10（白介素10）、CCL21（趋化因子21）和IDO（吲哚胺2,3-双加氧酶）中的一种或多种。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段为相应免疫抑制分子配体/受体的天然肽段或单链抗体肽段。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段为包含SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的肽段；具体地，所述高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段为单拷贝或多拷贝；具体地，为双拷贝。
不拘于理论的限制，多拷贝可以增强对靶标的亲和力，但如果拷贝数太多，可能本领域对融合蛋白空间构象的正确折叠，从而影响其功能；具体地，为2个拷贝。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述跨膜区肽段选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的任意一种。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述共刺激信号分子胞内结构域肽段选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS和DAP10的胞内结构域肽段中的一种或多种。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述共刺激信号分子胞内结构域肽段为包含SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的肽段；具体地，所述共刺激信号分子胞内肽段为单拷贝或多拷贝；具体地，为双拷贝。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其还包含信号肽；优选地，所述信号肽包含SEQ ID NO：11所示的序列。
不拘于理论的限制，信号肽可以提高融合蛋白分泌的效果，在信号肽与融合蛋白其它氨基酸序列一起被表达后，最终要被蛋白酶切除。蛋白酶具有一定的识别序列，而信号肽与其后面的肽段融合后构成新的氨基酸序列，所以如果选择的信号肽不当，可能会导致蛋白酶的误切，导致融合蛋白失活。因此，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域肽段以及可选的信号肽之间为直接连接和/或通过一个或多个相同或不同的Linker连接；优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：13（Linker1）、SEQ ID NO：15（Linker2）或SEQ ID NO：17（Linker3）所示。
融合蛋白是通过DNA重组技术将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一基因表达框所得的具有多种功能的蛋白质产物。不拘于理论的限制，在构建融合蛋白时，一个关键的问题是两个甚至多个不同来源蛋白间的接头序列(Linker)，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白（肽段）高级结构的折叠，从而相互干扰，使其中一个甚至多个来源蛋白失去活性；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原，而且随着融合蛋白氨基酸序列的延长，其表达难度会随之增加，其整体折叠可能会出现新的问题。因而，具体涉及到每种蛋白时，由于其各自构象的不同，如何使其融合在一起，而不影响每个部分的功能，需具体分析。遗憾的是，尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了重大的进步，但是对于序列和结构之间的关系的了解还是很有限，仍无法通过软件准确模拟融合后蛋白的二级结构。这种现状直接导致了目前对于连接肽序列的设计缺乏可靠的选择标准。
不拘于理论的限制，本发明人通过选择合适的信号肽和Linker，增大了融合蛋白的表达量，有利于得到空间构象更佳的融合蛋白，从而提高了融合蛋白的活性。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白为针对PDL1/PDL2的T细胞信号的分子转换器pSCC1，其包含信号肽、PD1-IGV、CD28跨膜区和CD28胞内区。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白为针对PDL1/PDL2的T细胞信号的分子转换器pSCC2，其包含信号肽、PD1-IGV、CD28跨膜区和4-1BB胞内区。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白为针对PDL1/PDL2的T细胞信号的分子转换器pSCC3，其包含信号肽、PD1-IGV、CD28跨膜区、CD28胞内区和4-1BB胞内区。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白为针对EGFR及PDL1/PDL2的T细胞信号的分子转换器epSCC，其包含信号肽、HERIN、PD1-IGV、CD28跨膜区、CD28胞内区和4-1BB胞内区。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白为针对PDL1/PDL2及EGFR的T细胞信号的分子转换器peSCC，其包含信号肽、PD1-IGV、HERIN、CD28跨膜区、CD28胞内区和4-1BB胞内区。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其氨基酸序列包含或者为SEQ ID NO：19、SEQID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及一种多核苷酸，其编码本发明中任一项所述的融合蛋白。
根据本发明任一项所述的多核苷酸，其包含或者为SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列或其简并性序列。
本发明的再一方面涉及一种重组载体，其包含本发明任一项所述的多核苷酸；具体地，所述重组载体为重组真核表达载体或重组病毒载体；更具体地，所述重组真核表达载体为重组pMXs-IRES-GFP载体；所述重组病毒载体为重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体；进一步具体地，所述重组逆转录病毒载体为重组pMXs-SCC-IRES-GFP病毒载体。
本发明的再一方面涉及一种重组细胞，其包含本发明任一项的重组载体；具体地，所述重组细胞为重组肿瘤浸润T淋巴细胞。
本发明的再一方面涉及一种重组T细胞，其表达本发明中任一项所述的融合蛋白。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的融合蛋白或本发明任一项所述的多核苷酸或本发明任一项所述的重组载体遗传修饰的T细胞；具体地，所述T细胞为肿瘤浸润T淋巴细胞；具体地，所述遗传修饰为基因枪法、转染、电转、或病毒转导。
在本发明的一个实施方案中，应用pSCC1、pSCC2、pSCC3、epSCC、peSCC分别修饰肝癌组织中分离培养的肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL）。
在本发明的一个实施方案中，应用pSCC1、pSCC2、pSCC3、epSCC、peSCC修饰后的TIL细胞体外杀伤SMMC-7721肝癌细胞。
本发明的再一方面涉及一种组合物，其包含一种或多种的本发明中任一项所述的融合蛋白或本发明任一项所述的多核苷酸或本发明任一项所述的重组载体或本发明任一项所述的重组细胞或本发明任一项所述的T细胞；可选地，其还包含药学上可接受的载体或辅料。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的融合蛋白或本发明任一项所述的多核苷酸或本发明任一项所述的重组载体或本发明任一项所述的重组细胞或本发明任一项所述的T细胞在制备治疗和/预防和/辅助治疗肿瘤的药物中的用途；具体地，所述肿瘤为选自肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌和前列腺癌中的一种或多种。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/预防和/辅助治疗肿瘤的方法，包括给予受试者有效量的本发明中任一项所述的融合蛋白或本发明任一项所述的多核苷酸或本发明任一项所述的重组载体或本发明任一项所述的重组细胞或本发明任一项所述的T细胞的步骤；；具体地，所述肿瘤为选自肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌和前列腺癌中的一种或多种。
给药剂量取决于许多因素，例如所治疗病况的严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。
在本发明中：
术语“肿瘤基质细胞”是指肿瘤微环境内一些支撑肿瘤细胞的恶性增殖、抗凋亡、侵袭、转移，逃脱免疫监控等生命活动的细胞，主要包括成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、调节性T细胞（Treg）、未分化的骨髓细胞、内皮细胞、周细胞和血小板、内皮细胞等。
术语“免疫抑制分子”是指由肿瘤细胞或肿瘤基质细胞产生，起抑制免疫作用，使肿瘤细胞逃脱机体免疫监控，诱导免疫耐受的分子。例如肿瘤细胞或肿瘤基质细胞膜蛋白PDL1/PDL2（PD-1配体）、FasL（Fas配体）、B7-H4（免疫共刺激蛋白B7-H4，又称VTCN1）、Crry（膜相关补体调控蛋白，又称Cr1l）、HLA-G（非经典MHC I类分子），以及肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌型蛋白TGFβ（转化生长因子-β）、IL-4（白介素4）、IL-10（白介素10）、CCL21（趋化因子21）、IDO（吲哚胺2,3-双加氧酶）、VEGF（血管内皮生长因子）等。
术语“共刺激信号分子”（Co-stimulating molecule）是指免疫细胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通过与其配体结合，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。
术语“胞外区”是指膜蛋白位于细胞外的区段。
术语“结构域”是指蛋白质生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，常见结构域的氨基酸残基数在100～400个之间，最小的结构域只有40～50个氨基酸残基，大的结构域可超过400个氨基酸残基。
术语“单链抗体”（single-chain antibody variable region fragment,scFv）是指由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经Linker连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。
术语“PD-1”是指人类程序性死亡因子1(programmed cell death1)，NCBI基因库的官方ID号为5133，对应蛋白序列编号有NP_005009.1，是T细胞天然免疫抑制分子，其胞外区免疫球蛋白样结构域（PD1-IGv）具有高效结合其配体为PDL1/PDL2的特性。
术语“Herin”或“HERIN”是指人类Her2的第8个内含子中编码Herstatin的C末端79个氨基酸的DNA序列，具有高效结合EGFR家族除HER3外其它3个成员的特性。
术语“免疫球蛋白样结构域”是指该结构域可形成类似于免疫球蛋白的空间结构。
术语“同源串联重复”是指以一个氨基酸残基多肽为单元重复1次以上。
术语“间隔串联重复”是指一种氨基酸残基多肽后连接另一种氨基酸残基多肽，或以此为单元重复1次以上。
术语“Linker”是指一段多肽，其作用是使两段相邻的肽段序列在空间结构上互不干扰。
术语“简并性”是指，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象。
本文所用的术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。
术语“组合物”，其还可以是指药物组合物，可用于在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、小鼠、狗、猴、牛、马等。
术语“天然受体/配体”是指生物体内存在相互结合作用的组合，例如细胞外的VEGF蛋白为配体，血管内皮细胞表面的FLT-1，KDR为VEGF的天然受体等；T细胞表面的膜蛋白PD-1为配体，肿瘤细胞或巨噬细胞表面的PDL1/PDL2为其天然配体。
本文所述的“高效结合”是指亲和力常数Kd小于9.9×10-7mol/L。
发明的有益效果
本发明创造性地将具有高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面免疫抑制分子的多肽、跨膜区肽段、共刺激信号分子胞内肽段经蛋白Linker相连，构成具有T信号分子转换器功能的融合蛋白，经该融合蛋白修饰后的T细胞在接触肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面起免疫抑制作用的分子后，不受免疫抑制分子的负面影响，反而起免疫活化作用，增强T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间，从而克服肿瘤免疫抑制微环境对肿瘤过继细胞治疗效应细胞的副作用。
本发明所提供T细胞信号分子转换器的胞外区还可以融合识别并结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，例如CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、gp100、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、TAG-72、h5T4、fetal acetylcholine receptor、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、TSGF、SF、POA、β2-MG和PROGRP的单链抗体或天然肽段（如本发明实施实例中，epSCC与peSSC融合了结合EGFR家族的肽段HERIN），使表达该分子转换器的T细胞接触肿瘤细胞后，进一步增强免疫活化作用。
附图说明
图1：pSCC1、pSCC2、pSCC3、epSCC、peSCC的结构示意图。SP表示信号肽；L1，L2，L3分别表示Linker1，Linker2，Linker3。CD28TM，CD28跨膜区；CD28IR，CD28胞内区；PD1-IGV，PD1胞外IG样结构域肽段。
图2：经SCC修饰前后肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor InfiltratingLymphocyte，TIL）接触SMMC-7721后的增殖情况。
图3：经SCC修饰前后TIL细胞对SMMC-7721的杀伤作用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：融合蛋白表达框的合成与表达载体的构建
根据构成融合蛋白各组分的氨基酸序列与编码序列，拼接成整个融合的氨基酸序列与编码DNA表达框，具体如下：
PD1-IGV的氨基酸残基序列为：
GDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGA(SEQ IDNO:1)
PD1-IGV的编码序列为：
GGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCC(SEQ ID NO:2)
CD28跨膜区（CD28TM）氨基酸残基序列为:
PFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRS(SEQ ID NO：3)。
CD28跨膜区（CD28TM）的编码序列为:
CCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGT(SEQ ID NO：4)。
CD28胞内区（CD28IR）氨基酸残基序列为:
KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：5)。
CD28胞内区（CD28IR）的编码序列为:
AAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQID NO：6)。
4-1BB共刺激信号域肽段（41BB）的氨基酸残基序列为:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：7)。
4-1BB共刺激信号域肽段（41BB）的编码序列为:
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO：8)。
HERIN的氨基酸残基序列为：
GTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEG(SEQ IDNO：9)。
HERIN的编码序列为：
GGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGC(SEQ ID NO：10)。
信号肽的氨基酸残基序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO：11)。
信号肽编码序列为：
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO：12)。
Linker1的氨基酸残基序列为:
EPKSCDKTHTCPPCPAPE(SEQ ID NO：13)。
Linker1的编码序列为:
GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA(SEQ ID NO：14)。
Linker2的氨基酸残基序列为:
GGGGGGGGG(SEQ ID NO：15)。
Linker2的编码序列为:
GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGT(SEQ ID NO：16)。
Linker3的氨基酸残基序列为：
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：17)。
Linker3的编码序列为：
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCG(SEQ ID NO：18)。
pSCC1依次由信号肽-PD1IGV-Linker1-CD28TM-CD28IR融合构成（见图1），其氨基酸序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQCGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SE Q ID NO：19)。
pSCC1的编码序列为:
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO：20)。
pSCC2依次由信号肽-PD1IGV-Linker1-CD28TM-Linker2-41BB融合构成（见图1），其氨基酸序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQCGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：21)。
pSCC2的编码序列为:
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO：22)。
pSCC3依次由信号肽-PD1IGV-Linker1-CD28TM-CD28IR-Linker2-41BB融合构成（见图1），其氨基酸序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQCGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：23)。
pSCC3的编码序列为:
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO：24)。
epSCC依次由信号肽-HERIN-Linker3-PD1IGV-Linker1-CD28TM-CD28IR融合构成（见图1），其氨基酸序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：25)。
epSCC的编码序列为:
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ IDNO：26)。
peSCC依次由信号肽-PD1IGV-Linker3-HERIN-Linker1-CD28TM-CD28IR融合构成（见图1），其氨基酸序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQCGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAGGGGSGGGGSGGGGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：27)。
peSCC的编码序列为：
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ IDNO：28)。
分别按pSCC1的DNA编码序列(SEQ ID NO：20)、pSCC2的DNA编码序列(SEQ ID NO：22)、pSCC3的DNA编码序列(SEQ IDNO：24)，epSCC的DNA编码序列(SEQ ID NO：26)，peSCC的DNA编码序列(SEQ ID NO：28)，委托生物工程（上海）有限公司合成其整个表达框，插入逆转录病毒包装载体pMXs-IRES-GFP（购自CellBioLabs）EcoRI-XhoI位点中，分别构建pMXs-pSCC1-IRES-GFP、pMXs-pSCC2-IRES-GFP、pMXs-pSCC3-IRES-GFP、pMXs-epSCC-IRES-GFP、pMXs-peSCC-IRES-GFP载体，转化到E.coli（DH5α），经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。
实施例2：肝癌组织来源TIL细胞的分离培养
收集新切除的肝癌标本，立即在无菌条件下进行处理。具体方法如下：去除肝癌标本周围的正常组织和坏死区域，从标本的不同区域取下大小为1-2mm3的小组织块，24孔板的每一孔放置一块。每孔加2mL完全培养基（含10%FBS的GT-T551培养基）和3000IU/mL的IL-2。将24孔板置于37℃，5%CO2培养箱中培养。培养起始后的第5-6天为所有孔进行半量换液。之后，根据TIL生长情况，每隔1-2天进行一次半量换液。一旦孔内TIL长满，且所有贴壁细胞已除去，就将各个长满孔内的TIL收集起来。
随后，1×106TIL重悬于含150mL完全培养基、30ng/mL抗CD3抗体、不少于200倍于TIL的照射过的饲养细胞（来自3个不同健康人的PBMC）和6000IU/mL IL-2的T175培养瓶中，将培养瓶竖直培养。培养至第5天，瓶内65%液体换为新的完全培养基和IL-2。培养至第7天，2个T175培养瓶内的细胞悬液转移至细胞培养袋内，加入300mL完全培养基和IL-2。从第6天开始，每隔1天进行一次台盼蓝染色计数，通过加入新的完全培养基和IL-2控制细胞密度至0.5-2×106/mL。扩增的第14天，收集细胞。
实施例3：TIL的遗传修饰
于175-cm2flasks中培养包装细胞Amphotropic（购自CellBioLabs，细胞数约为1–2×107），利用Lipofectamine2000（Invitrogen）将纯化后的高品质pMXs-pSCC1-IRES-GFP、pMXs-pSCC2-IRES-GFP、pMXs-pSCC3-IRES-GFP、pMXs-epSCC-IRES-GFP、pMXs-peSCC-IRES-GFP质粒转染到细胞中。3天后，收集含有病毒颗粒的细胞培养基，以4000g离心10min，收集上清液，并用0.45μm滤器过滤，滤过的液体置于40mL超速离心管中，4℃，25000r/min离心20分钟，使用500ul冰PBS液重悬病毒沉淀，分别获得携带pSCC1、pSCC2、pSCC3、epSCC、peSCC表达框的重组逆转录病毒。随后，分两次（每次100μL）将病毒悬液与2×106的TIL细胞共培养，分别收集感染后的TIL细胞TILpSCC1、TILpSCC2、TILpSCC3、TILepSCC、TILpeSCC。
实施例4：遗传修饰后TIL细胞的增殖情况测定
将TILpSCC1、TILpSCC2、TILpSCC3、TILepSCC、TILpeSCC以及未修饰的TIL细胞（5×105/孔，GT-T551培养基基，含3000U/ml IL-2），分别加入预铺经放射处理的SMMC-7721（购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所）的6孔板（5×105/孔）中，分别在第3天、第7天，对悬浮的TIL细胞进行计数。结果表明，修饰后的TILpSCC1、TILpSCC2、TILpSCC3、TILepSCC、TILpeSCC接触SMMC-7721细胞后能大量增殖，而未修饰的TIL细胞则基本不增殖（见图2）。
可见，不受免疫抑制分子的负面影响，克服肿瘤免疫抑制微环境对肿瘤过继细胞治疗效应细胞的副作用。
实施例5：遗传修饰后TIL细胞的体外杀伤作用测定
按不同的效靶比（50:1，25:1，5:1，1:1），将TILpSCC1、TILpSCC2、TILpSCC3、TILepSCC、TILpeSCC以及未修饰的TIL细胞与SMMC-7721共培养，应用LDH乳酸脱氢酶-细胞毒性检测分析试剂盒（LDH-Cytotoxicity Assay Kit，Biovision）检测遗传修饰前后的TIL细胞对SMMC-7721细胞的体外杀伤能力。方法如下：靶细胞铺96孔板（5×103/孔），设培养基背景、体积校正、靶细胞自发LDH释放、靶细胞最大LDH释放、效应细胞自发LDH释放对照孔，治疗组孔，每组重复3孔，每个孔的终体积相同且不少于100μL。250g离心4min，在37℃，5%CO2孵育至少4h。在离心前45min，向靶细胞最大释放孔加入10×裂解液，体积校正孔加入等量的裂解液。再次离心，从每孔转移50μL上清至新的96孔板中，再加入50μL底物溶液，室温避光孵育30min。每孔加入50μL终止液，1h内测定D490。细胞毒性（%）=[（D实验孔-D培养基背景孔）-（D效应细胞自发LDH释放孔-D培养基背景孔）-（D靶细胞自发LDH释放孔-D培养基背景孔）]/[（D靶细胞最大LDH释放孔-D体积校正孔）-（D靶细胞自发LDH释放孔-D培养基背景孔）]×100%。
结果表明，经遗传修饰的TILpSCC1、TILpSCC2、TILpSCC3、TILepSCC、TILpeSCC能有效杀伤SMMC-7721肿瘤细胞，杀伤作用显著高于未经修饰的TIL细胞（见图3）。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (23)
1.一种分离的融合蛋白，其组成如下：
1)高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段，
2)跨膜区，
3)共刺激信号分子胞内结构域肽段；以及
4)可选的信号肽；
其中，所述高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段选自SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽段；
其中，
所述跨膜区为CD28跨膜区；
所述共刺激信号分子胞内结构域肽段选自CD28和CD137/4-1BB中的一种或多种；
所述高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域肽段以及可选的信号肽之间为直接连接和/或通过一个或多个相同或不同的linker连接。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于如下的(1)-(4)中的任一项或者多项：
(1)所述高效结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段为单拷贝或双拷贝；
(2)所述共刺激信号分子胞内结构域肽段为SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的肽段；
(3)所述共刺激信号分子胞内结构域肽段为单拷贝或双拷贝；和
(4)所述融合蛋白还包含信号肽。
3.一种分离的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述信号肽为SEQ ID NO：11所示的序列。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示。
6.一种多核苷酸，其编码权利要求1至5中任一权利要求所述的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其为SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列或其简并性序列。
8.一种重组载体，其包含权利要求6或7所述的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其中，所述重组载体为重组真核表达载体或重组病毒载体。
10.根据权利要求9所述的重组载体，其中，所述重组真核表达载体为重组pMXs-IRES-GFP载体；所述重组病毒载体为重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体。
11.根据权利要求10所述的重组载体，其中，所述重组逆转录病毒载体为重组pMXs-SCC-IRES-GFP病毒载体。
12.一种重组细胞，其包含权利要求8至11中任一权利要求所述的重组载体。
13.根据权利要求12所述的重组细胞，其中，所述重组细胞为重组肿瘤浸润T淋巴细胞。
14.一种重组T细胞，其表达权利要求1至5中任一权利要求所述的融合蛋白。
15.由权利要求1至5中任一权利要求所述的融合蛋白或权利要求6或7所述的多核苷酸或权利要求8至11中任一权利要求所述的重组载体遗传修饰的T细胞。
16.根据权利要求15所述的T细胞，其中，所述T细胞为肿瘤浸润T淋巴细胞。
17.根据权利要求15所述的T细胞，其中，所述遗传修饰为基因枪法、转染、电转或病毒转导。
18.一种药物组合物，其包含一种或多种权利要求1至5中任一权利要求所述的融合蛋白或权利要求6或7所述的多核苷酸或权利要求8至11中任一权利要求所述的重组载体或权利要求12或13所述的重组细胞或权利要求14至17中任一权利要求所述的T细胞。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体或辅料。
20.权利要求1至5中任一权利要求所述的融合蛋白或权利要求6或7所述的多核苷酸或权利要求8至11中任一权利要求所述的重组载体或权利要求12或13所述的重组细胞或权利要求14至17中任一权利要求所述的T细胞在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述肿瘤为选自肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌和前列腺癌中的一种或多种。
22.根据权利要求20所述的用途，其中，所述治疗为辅助治疗。
23.根据权利要求21所述的用途，其中，所述治疗为辅助治疗。
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