CN111819186A - 表达嵌合抗原受体的免疫细胞 - Google Patents

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Abstract

本文描述了产生和利用包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的方法，所述嵌合抗原受体包含两个或更多个细胞外结构域，所述细胞外结构域各自包含肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体例如增殖诱导配体(APRIL)的细胞外结构域的一部分。本文所述的CAR能够靶向例如B细胞成熟抗原(BCMA)和/或跨膜激活剂和CAML相互作用分子(TACI)。另外，本发明的CAR T细胞克服了对抗BCMA靶向疗法的抗性，并且利用二聚化和三聚化跨膜结构域实现最佳功能。此外，本发明涉及治疗癌症(例如，多发性骨髓瘤(MM))、浆细胞疾病或障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥的方法。

Description

表达嵌合抗原受体的免疫细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月10日提交的国际专利申请号PCT/US2018/013221、以及2018年2月12日提交的美国临时申请号62/629,558、2018年11月27日提交的美国临时申请号62/771,998和2018年11月29日提交的美国临时申请号62/773,001的权益，将上述申请的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本文所述的技术涉及免疫疗法。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。2018年1月10日创建的所述ASCII副本被命名为51295-012WO4_Sequence_Listing_1.10.19_ST25并且大小为83,402字节。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)提供了一种将细胞毒性T细胞反应引导至表达所选靶抗原(最常见的是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原)的靶细胞的方式。CAR是T细胞受体(TCR)的适应物，其中抗原结合结构域例如被与衍生的靶抗原特异性地结合的抗体的抗原结合结构域替代。在T细胞(“CAR T细胞”)上表达的CA对在靶细胞表面上的靶抗原的接合促进对靶细胞的杀伤。
多发性骨髓瘤占所有血液学恶性肿瘤的约13％，并且是骨髓中浆细胞的单克隆扩增的结果，导致副蛋白的产生。患者最常出现疼痛的骨病变、贫血、高钙血症和肾功能不全。目前，全身治疗的护理标准包括化学疗法、免疫调节药物(IMiD)、蛋白酶体抑制剂和自体干细胞移植。尽管近年来在治疗上取得了进步，但随着疾病难治性渐增，复发仍很常见。因此，存在对多发性骨髓瘤的改进治疗的未满足的需求。
发明内容
CAR T细胞是在治疗癌症方面显示出巨大希望的一种最前沿治疗剂。已经证明，此类治疗剂对多种非实体癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)特别有效。创建针对给定疾病或障碍的CAR T细胞的最大挑战之一是克服来自脱靶和全身效应(诸如细胞因子释放综合征)的不良反应。虽然细胞因子释放综合征通常是可治疗的，但是人们担心这种并发症的治疗可能会限制CART细胞治疗的功效和/或长期持续的效果。
CAR T治疗设计中遇到的另一个问题是通过由CAR识别的靶向抗原或肿瘤相关因子的丢失使肿瘤逃逸。当肿瘤下调或以其他方式丧失靶向抗原或因子的细胞表面表达时，其将不再被设计用于靶向该抗原或因子的CAR T细胞高效地攻击。例如在靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR T疗法中已经观察到了这一点，所述B细胞成熟抗原例如在B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中表达。
本文描述了CAR设计的改进，其避免了脱靶效应并减少了由于靶抗原丢失而导致的肿瘤逃逸的可能性。
因此，本文所述的发明的一个方面涉及一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含：一个或多个细胞外结构域，所述细胞外结构域包含肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体的一部分；铰链和跨膜结构域；共刺激结构域；和细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本文描述了一种方法，其使用BCMA相关蛋白作为示例性肿瘤相关靶标得到证明，所述方法使用结合两种不同肿瘤相关抗原或因子的单一配体。在一些实施方案中，基本上如本领域已知的CAR，将单一配体融合至跨膜结构域和T细胞受体细胞内效应子结构域，任选地和共刺激结构域。具有结合两种不同肿瘤相关抗原或因子而不是单一抗原的配体，意味着如果一种或另一种抗原或因子被肿瘤细胞下调，则CAR将不会丧失有效性。本文使用APRIL(增殖诱导配体)多肽的一部分作为配体说明了这一点，APRIL多肽的所述部分以高亲和力结合至BCMA和TACI(另一种肿瘤相关抗原或因子)两者。在本文所述的任何方面的一些实施方案中，配体例如通过自身寡聚化而寡聚化(例如，二聚化或三聚化)。例如，在一些实施方案中，配体是TNF超家族受体配体的一部分。在一些方面，CAR设计包括超过一种配体(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种配体)。
因此，本文所述的发明的一个方面涉及一种CAR多肽，其包含位于内源性切割位点N末端的包含TNF超家族受体配体的一部分的细胞外结构域、铰链和跨膜域、共刺激结构域以及细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，TNF超家族受体配体是APRIL。在其他实施方案中，TNF超家族受体配体是TNF-α、淋巴毒素β、OX40L、CD154、FasL、LIGHT、TL1A、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、BAFF、CAMLG、LIGHT、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体、TL1A或EDA-A2。
因此，本文所述的发明的一个方面涉及一种CAR多肽，其包含位于内源性切割位点N末端的包含APRIL的一部分的细胞外结构域、铰链和跨膜域、共刺激结构域以及细胞内信号传导结构域。
在任何方面的一个实施方案中，CAR多肽还包含CD8前导序列。在一个实施方案中，CD8前导序列包含选自SEQ ID NO:20、26或32的序列，或由包含选自SEQ ID NO:2、8、9或14的序列的核酸编码。
在一个实施方案中，APRIL的所述部分包含选自SEQ ID NO:21、27或33的序列，或由包含选自SEQ ID NO:3、9或15的序列的核酸编码。在任何方面的一个实施方案中，APRIL的所述部分不包含APRIL的富赖氨酸区域。
在任何方面的一个实施方案中，铰链和跨膜结构域包含CD8或4-1BB的铰链和跨膜结构域。在一个实施方案中，CD8铰链和跨膜结构域序列包含SEQ ID NO:22的序列，或由包含SEQ ID NO:4的序列的核酸编码。在一个实施方案中，4-1BB铰链和跨膜结构域序列选自SEQ ID NO:28或34，或由包含SEQ ID NO:10或16的序列的核酸编码。
在任何方面的一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ、CD3η或CD3θ的信号传导结构域。在一个实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域序列选自SEQ ID NO:24或30，或由包含SEQ ID NO:6或12的序列的核酸编码。在一个实施方案中，CD3θ细胞内信号传导结构域序列包含SEQ ID NO:36的序列，或由包含SEQ ID NO:18的序列的核酸编码。
在任何方面的一个实施方案中，共刺激结构域是4-1BB细胞内结构域(ICD)、CD28ICD、CD27 ICD、ICOS ICD或OX40 ICD。在一个实施方案中，共刺激结构域是4-1BB ICD。在一个实施方案中，4-1BB ICD序列包含选自SEQ ID NO:23、29或35的序列，或由包含SEQ IDNO:5、11或17的序列的核酸编码。
在任何方面的一个实施方案中，CAR多肽包含两个或更多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或十个或更多个)细胞外结构域，所述细胞外结构域包含TNF超家族受体配体的一部分。在一个实施方案中，CAR多肽包含三个细胞外结构域，所述细胞外结构域包含TNF超家族受体配体的一部分。
本文所述的发明的另一个方面涉及一种CAR多肽，其与选自SEQ ID NO:19、25或31的序列具有至少95％同一性，或者由与选自SEQ ID NO:1、7或13的序列具有至少95％同一性的序列编码。
本文所述的发明的另一个方面涉及一种CAR多肽，其包含选自SEQ ID NO:19、25或31的序列，或者由选自SEQ ID NO:1、7或13的序列编码。
本文所述的发明的另一个方面涉及一种CAR多肽，其包含与选自SEQ ID NO:19、25或31的序列相对应的序列，或者由选自SEQ ID NO:1、7或13的序列编码。
本文所述的发明的另一个方面涉及一种多肽复合物，其包含两种或更多种(例如，两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、或十种或更多种)本文所述的任何CAR多肽。在一个实施方案中，多肽复合物包含三种本文所述的任何CAR多肽。
本文所述的发明的另一个方面涉及一种哺乳动物细胞，其包含：本文所述的任何CAR多肽；编码本文所述的任何CAR多肽的核酸；或本文所述的任何多肽复合物。
在任何方面的一个实施方案中，细胞是T细胞。在一个实施方案中，细胞是人细胞。在一个实施方案中，细胞从患有或被诊断为患有癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病的个体获得。
本文所述的发明的另一个方面涉及一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、淀粉样变性或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：将T细胞工程化以在T细胞表面上包含本文所述的任何CAR多肽；向所述受试者给予所述工程化T细胞。
本文所述的发明的另一个方面涉及一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括给予细胞，所述细胞包含本文所述的任何CAR多肽或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸。
在任何方面的一个实施方案中，癌症是BAFF+、BCMA+和/或TACI+。在一个实施方案中，其中癌症是多发性骨髓瘤或郁积型骨髓瘤。
在任何方面的一个实施方案中，还向受试者给予抗BCMA疗法。在一个实施方案中，受试者对抗BCMA疗法有抗性。
在任何方面的一个实施方案中，自身免疫性疾病选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。
本文所述的技术的另一个方面涉及一种被配制用于治疗癌症的组合物，其包含如本文所述的CAR多肽。在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。
本文所述的技术的另一个方面涉及一种被配制用于治疗癌症的组合物，其包含如本文所述的蛋白质复合物。在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。
本文所述的技术的另一个方面涉及一种被配制用于治疗癌症的组合物，其包含如本文所述的CAR T细胞。在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。
在仍其他方面，本发明的特征在于一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包括：a)两个或更多个细胞外结构域，所述细胞外结构域各自包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体的一部分；b)铰链和跨膜结构域；c)共刺激结构域；和d)细胞内信号传导结构域。
在另一个方面，本发明的特征在于一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包括：a)两个或更多个细胞外结构域，所述细胞外结构域各自包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体或其一部分；b)跨膜结构域；和c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR多肽还包括一个或多个共刺激结构域。
在一些实施方案中，TNF超家族受体配体是增殖诱导配体(APRIL)。在另外的实施方案中，TNF超家族受体配体是TNF-α、淋巴毒素β、OX40配体(OX40L)、CD154、Fas配体(FasL)、LIGHT、TNF样配体1A(TL1A)、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体(4-1BBL)、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、核因子κB受体激活剂配体(RANKL)、TNF相关弱凋亡诱导剂(TWEAK)、B细胞激活因子(BAFF)、钙调节配体(CAMLG或CAML)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3(NT-3)、神经营养蛋白4(NT-4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(TNFR)相关蛋白(GITR)配体或外异蛋白(ectodysplasin)A2(EDA-A2)。
在一些实施方案中，所述两个或更多个细胞外结构域各自包括相同TNF超家族受体配体的一部分。在又其他实施方案中，细胞外结构域中的至少两个各自包括不同TNF超家族受体配体的一部分。
在另外的实施方案中，所述两个或更多个细胞外结构域通过一个或多个接头序列彼此连接，所述接头序列例如为包括与SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的接头序列、或包括SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列的接头序列。
在一些实施方案中，CAR多肽还包括前导序列，例如CD8前导序列。在特定实施方案中，CD8前导序列包括与SEQ ID NO:20、26或32的序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列，或包括SEQID NO:20、26或32的序列。
在一些实施方案中，APRIL的所述部分不包括APRIL的富赖氨酸区域(例如，SEQ IDNO:38的富赖氨酸序列)。在又另外的实施方案中，APRIL的所述部分不包括弗林蛋白酶切割位点(例如，SEQ ID NO:66或67的弗林蛋白酶切割位点)。在特定实施方案中，APRIL的所述部分包括与SEQ ID NO:21、27、33或40的序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列，或包括SEQ ID NO:21、27、33或40的序列。
在另外的实施方案中，铰链和跨膜结构域包括CD28、CD8或4-1BB的铰链和跨膜结构域。在特定实施方案中，CD8铰链和跨膜结构域包括与SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列。在其他实施方案中，4-1BB铰链和跨膜结构域包括与SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ、CD3ε或CD3θ的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域包括与SEQ ID NO:24、30或44的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:24、30或44的氨基酸序列。在其他实施方案中，CD3θ细胞内信号传导结构域包括与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，共刺激结构域包括4-1BB、CD28、CD27、ICOS或OX40的细胞内结构域。在特定实施方案中，共刺激结构域是4-1BB的细胞内结构域，例如，其中4-1BB的细胞内结构域包括与SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列。
在特定实施方案中，CAR多肽包括三个细胞外结构域，所述细胞外结构域各自包括TNF超家族受体配体的一部分(例如，三个APRIL结构域，在本文中也称为TriPRIL)。
在另一个方面，本发明的特征在于一种CAR多肽，其与SEQ ID NO:39、57、64或65的序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，或者由与SEQ ID NO:45的序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。
在另一个方面，本发明的特征在于一种CAR多肽，其包括SEQ ID NO:39、57、64或65的序列，或者由SEQ ID NO:45的序列编码。
在另一个方面，本发明的特征在于一种CAR多肽，其包括与SEQ ID NO:39、57、64或65的序列相对应的序列，或者由SEQ ID NO:45的序列编码。
在另一个方面，本发明的特征在于一种多肽复合物，其包括前述方面中任一个的两种或更多种CAR多肽。在一些实施方案中，多肽复合物包括前述方面中任一个的三种CAR多肽。
在另一个方面，本发明的特征在于一种哺乳动物细胞，其包括：a)前述方面中任一个的CAR多肽；b)编码前述方面中任一个的CAR多肽的核酸；或c)包括前述方面中任一个的两种或更多种(例如，三种)CAR多肽的多肽复合物。
在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，诸如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞从患有或被诊断为患有癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病或障碍的个体获得。
在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、淀粉样变性、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥的方法，所述方法包括：a)将T或NK细胞工程化以在T或NK细胞表面上包括前述方面中任一个的CAR；以及b)向所述受试者给予所述工程化T或NK细胞。
在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予前述方面中任一个的细胞。在一些实施方案中，受试者患有癌症、浆细胞障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥。
在一些实施方案中，癌症是BAFF+、B细胞成熟抗原(BCMA)+和/或跨膜激活剂和CAML相互作用分子(TACI)+。在一些实施方案中，还向受试者给予抗BCMA疗法。在另外的实施方案中，受试者对抗BCMA疗法有抗性。
在特定实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤、郁积型骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulenemia)。
在又其他实施方案中，自身免疫性疾病选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。
在另外的实施方案中，受试者具有高水平的抗人白细胞抗原(HLA)抗体。
在另一个方面，本发明的特征在于一种被配制用于治疗癌症的组合物，其包括前述方面中任一个的CAR多肽、多肽复合物或细胞。在一些实施方案中，组合物还包括药学上可接受的载体。
在其他方面，本发明的特征在于一种治疗对抗BCMA疗法有抗性的受试者的癌症、浆细胞障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包括CAR和/或编码CAR的多核苷酸，其中所述CAR包括细胞外靶标结合结构域，所述细胞外靶标结合结构域包括两个或更多个APRIL结构域。
在一些实施方案中，癌症包括表达BCMA和/或TACI的细胞。在一些实施方案中，癌症包括具有降低的BCMA表达的细胞。在一些实施方案中，癌症是骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤或郁积型骨髓瘤)或华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)。
在其他实施方案中，浆细胞障碍是淀粉样变性。
在一些实施方案中，自身免疫性疾病或障碍选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。
在另外的实施方案中，受试者具有高水平的抗HLA抗体。
在一些实施方案中，CAR包括跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在另外的实施方案中，CAR还包括一个或多个共刺激结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。在一些实施方案中，铰链/跨膜结构域包括免疫球蛋白样蛋白(例如，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、CD28、CD8或4-1BB的铰链/跨膜结构域。在具体实施方案中，铰链/跨膜结构域包括CD8的铰链/跨膜结构域，其任选地包括与SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列、或包括SEQ IDNO:22或42的氨基酸序列。在其他实施方案中，铰链/跨膜结构域包括4-1BB的铰链/跨膜结构域，其任选地包括与SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列、或包括SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，细胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3δ、CD3ε、CD3η、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞内信号传导结构域，其任选地包括与SEQID NO:24、30或44的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列、或包括SEQ ID NO:24、30或44的氨基酸序列。在其他实施方案中，细胞内信号传导结构域包括CD3θ的细胞内信号传导结构域，其任选地包括与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列、或包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在一些实施方案中，共刺激结构域包括4-1BB、CD27、CD28或OX40的共刺激结构域。在具体实施方案中，共刺激结构域包括4-1BB的共刺激结构域，其任选地包括与SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列、或包括SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列。
在一些实施方案中，每个APRIL结构域包括与SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，APRIL结构域通过一个或多个接头序列彼此连接。在一些实施方案中，接头序列包括与SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列。
在特定实施方案中，细胞外靶标结合结构域包括三个APRIL结构域。在一些实施方案中，细胞外靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR包括与SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸还包括自杀基因。在另外的实施方案中，编码CAR的多核苷酸还包括编码信号序列的序列。
在另外的实施方案中，免疫细胞是T或NK细胞，例如人细胞。
在另一个方面，本发明的特征在于一种CAR，其包括包含三个APRIL结构域的细胞外靶标结合结构域。
在一些实施方案中，CAR包括跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在另外的实施方案中，CAR还包括一个或多个共刺激结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。在一些实施方案中，铰链/跨膜结构域包括免疫球蛋白样蛋白(例如，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、CD28、CD8或4-1BB的铰链/跨膜结构域。在具体实施方案中，铰链/跨膜结构域包括CD8的铰链/跨膜结构域，其任选地包括与SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列、或包括SEQ IDNO:22或42的氨基酸序列。在其他实施方案中，铰链/跨膜结构域包括4-1BB的铰链/跨膜结构域，其任选地包括与SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列、或包括SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，细胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3δ、CD3ε、CD3η、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞内信号传导结构域，其任选地包括与SEQID NO:24、30或44的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列、或包括SEQ ID NO:24、30或44的氨基酸序列。在其他实施方案中，细胞内信号传导结构域包括CD3θ的细胞内信号传导结构域，其任选地包括与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列、或包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在一些实施方案中，共刺激结构域包括4-1BB、CD27、CD28或OX40的共刺激结构域。在具体实施方案中，共刺激结构域包括4-1BB的共刺激结构域，其任选地包括与SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列、或包括SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列。
在一些实施方案中，每个APRIL结构域包括与SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，APRIL结构域通过一个或多个接头序列彼此连接。在一些实施方案中，接头序列包括与SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列。
在特定实施方案中，细胞外靶标结合结构域包括三个APRIL结构域。在一些实施方案中，细胞外靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列。
在特定实施方案中，CAR包括与SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征在于一种CAR，其包括与SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征在于一种CAR，其包括SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征在于一种多核苷酸，其编码前述方面中任一个的CAR。在一些实施方案中，多核苷酸还包括自杀基因。在另外的实施方案中，多核苷酸还包括编码信号序列的序列。
在另一个方面，本发明的特征在于一种免疫细胞，其包括前述方面中任一个的CAR和/或多核苷酸。
在一些实施方案中，免疫细胞是T或NK细胞，例如人细胞。
在另一个方面，本发明的特征在于一种药物组合物，其包括前述方面中任一个的CAR、多核苷酸和/或免疫细胞。
在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥的方法，所述方法包括向所述受试者给予前述方面的免疫细胞和/或药物组合物。
在一些实施方案中，癌症包括表达BCMA和/或TACI的细胞。在一些实施方案中，癌症包括具有降低的BCMA表达的细胞。在另外的实施方案中，受试者对抗BCMA疗法有抗性。在特定实施方案中，癌症是骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤或郁积型骨髓瘤)或华氏巨球蛋白血症。
在其他实施方案中，浆细胞障碍是淀粉样变性。在一些实施方案中，自身免疫性疾病或障碍选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。在另外的实施方案中，受试者具有高水平的抗HLA抗体。
定义
为了方便起见，下面提供了在说明书、实施例和所附权利要求书中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或从上下文中隐含，否则以下术语和短语包括下面提供的含义。提供所述定义以帮助描述特定实施方案，并且不旨在限制所要求保护的技术，因为本技术的范围仅由权利要求限定。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。如果术语在本领域中的用法与其在本文中所提供的定义之间存在明显的差异，则应当以本说明书内提供的定义为准。
在免疫学和分子生物学中的常用术语的定义可以在以下文献中找到：The MerckManual of Diagnosis and Therapy,第19版,由Merck Sharp&Dohme Corp.出版,2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编辑),The Encyclopedia ofMolecular Cell Biology and Molecular Medicine,由Blackwell Science Ltd.出版,1999-2012(ISBN 9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)；Werner Luttmann的Immunology,由Elsevier出版,2006；Janeway's Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编辑),Taylor&FrancisLimited,2014(ISBN 0815345305,9780815345305)；Lewin's Genes XI,由Jones&BartlettPublishers出版,2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and JosephSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,NewYork,USA(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA,JonLorsch(编辑)Elsevier,2013(ISBN 0124199542)；Current Protocols in MolecularBiology(CPMB),Frederick M.Ausubel(编辑),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X,9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),JohnE.Coligan(编辑),John Wiley and Sons,Inc.,2005；以及Current Protocols inImmunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan MShevach,Warren Strobe,(编辑)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN 0471142735,9780471142737)，将所述文献的内容全部通过引用以其整体并入本文。
术语“TNF超家族受体配体”是指与肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体结合的配体。TNF超家族受体配体作为非共价寡聚体(例如，三聚体)可以是有活性的。在一些实施方案中，TNF超家族受体配体作为同寡聚体(例如，同三聚体)是有活性的。然而，一些TNF超家族受体配体作为异寡聚体(例如，异三聚体)可以是有活性的，包括BAFF(其可以与APRIL形成异寡聚体)。在一些实施方案中，TNF超家族受体配体是在Aggarwal,Nat.Rev.Immunol.3:745-756,2003或Croft等人Nat.Rev.Immunol.9(4):271-285,2009中描述的TNF超家族受体配体。在一些实施方案中，TNF超家族受体配体是TNF-α、淋巴毒素β、OX40配体(OX40L)、CD154、Fas配体(FasL)、LIGHT、TNF样配体1A(TL1A)、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体(4-1BBL)、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、核因子κB受体激活剂配体(RANKL)、TNF相关弱凋亡诱导剂(TWEAK)、B细胞激活因子(BAFF)、钙调节配体(CAMLG或CAML)、LIGHT、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3(NT-3)、神经营养蛋白4(NT-4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(TNFR)相关蛋白(GITR)配体、TL1A或外异蛋白A2(EDA-A2)。在一些实施方案中，TNF超家族受体配体与在Aggarwal,同上或Croft等人,同上中描述的TNF超家族受体结合，所述TNF超家族受体包括例如肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)、CD95、诱骗受体3(DCR3)、死亡受体3(DR3)、死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)、诱骗受体1(DCR1)、诱骗受体2(DCR2)、死亡受体6(DR6)、外异蛋白A受体(EDAR)、神经生长因子受体(NGFR)、骨保护素(OPG)、核因子κB受体激活剂(RANK)、淋巴毒素β受体(LTbetaR)、成纤维细胞生长因子诱导分子14(FN14)、疱疹病毒侵入介体(HVEM)、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40、GITR、B细胞成熟抗原(BCMA)、跨膜激活剂和CAML相互作用分子(TACI)、BAFF受体(BAFFR)、X连锁的外异蛋白A2受体(XEDAR)、TROY或在淋巴组织中表达的受体(RELT)。
术语“部分”是指多肽(例如，TNF超家族受体配体(例如，APRIL))的一部分。在一些实施方案中，TNF超家族受体配体的一部分位于内源性切割位点的N末端，并且至少包含TNF样结构域。在一些实施方案中，TNF超家族受体配体的一部分能够寡聚化(例如，二聚化或三聚化)。寡聚化可以是同寡聚化或异寡聚化。在特定实施方案中，TNF超家族受体配体的所述部分是APRIL的一部分，诸如截短的APRIL。示例性截短的APRIL示于SEQ ID NO:21、27、33和40中。
如本文所用，术语“APRIL结构域”是指被掺入CAR多肽中的APRIL的全长序列或其一部分。“APRIL结构域”还是指相对于APRIL的全长序列或其一部分具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代或缺失、或者相对于SEQ IDNO:21、27、33、40或60的序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代或缺失的氨基酸序列。“APRIL结构域”还包括与APRIL的全长序列或其一部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性、或者与SEQ ID NO:21、27、33、40或60的APRIL序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列。
术语“减少”、“降低”(“reduced”、“reduction”)或“抑制”在本文中全部用于意指减少了统计学上显著的量。在一些实施方案中，“降低”(“reduce”、“reduction”)或“减少”或“抑制”通常意指与参考水平(例如，在不存在给定治疗或药剂的情况下)相比减少了至少10％，并且可以包括例如减少了至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“降低”或“抑制”不涵盖与参考水平相比完全的抑制或降低。“完全抑制”是与参考水平相比100％抑制。在适用时，减少可以优选地下降至如在没有给定障碍的个体的正常范围内可接受的水平。
术语“增加”(“increased”、“increase”)、“增强”或“激活”在本文中全部用于意指增加了统计学上显著的量。在一些实施方案中，术语“增加”(“increased”、“increase”)、“增强”或“激活”可以意指与参考水平相比至少10％的增加，例如与参考水平相比至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的增加、或高达并包括100％增加或在10％-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加、或在2倍与10倍之间的任何增加或更多。在标记或症状的背景下，“增加”是这种水平的统计学上显著的增加。
如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常，动物是脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括例如黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(例如，恒河猴)。啮齿动物包括例如小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括例如牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(例如，家猫)、犬科物种(例如，狗、狐狸、狼)、禽类物种(例如，鸡、鸸鹋、鸵鸟)以及鱼类(例如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些例子。可以将除人以外的哺乳动物有利地用作代表疾病(例如，癌症)的动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。
受试者可以是先前已被诊断出或被鉴定为罹患或患有需要治疗的病症(例如，白血病或另一种类型的癌症等)或与这样的病症有关的一种或多种并发症，并且任选地，已经经历了针对所述病症或与所述病症有关的一种或多种并发症的治疗的受试者。可替代地，受试者也可以是先前未被诊断为患有这种病症或相关并发症的受试者。例如，受试者可以是展现出所述病症或与所述病症有关的一种或多种并发症的一种或多种危险因素的受试者，或者是不展现危险因素的受试者。
“需要针对特定病症的治疗的受试者”可以是患有所述病症、被诊断为患有所述病症或有患上所述病症的风险的受试者。
“疾病”是动物(例如，人)的一种健康状态，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有得到改善，则动物的健康继续恶化。相比之下，动物的“障碍”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但是其中动物的健康状态比不存在所述障碍的情况下更为不利。如果不进行治疗，障碍不一定会导致动物的健康状态进一步下降。
如本文所用，术语“肿瘤抗原”和“癌症抗原”可互换使用以指由癌细胞差异表达并且由此可以被利用以便靶向癌细胞的抗原。癌症抗原是可能潜在地刺激明显的肿瘤特异性免疫反应的抗原。这些抗原中的一些是由正常细胞编码的，但是不一定被表达。这些抗原可以被表征为在正常细胞中通常是沉默的(即，不表达的)那些、仅在某些分化阶段表达的那些以及暂时表达的那些(诸如胚胎和胎儿抗原)。其他癌症抗原由突变细胞基因编码，所述突变细胞基因诸如为癌基因(例如，激活的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变p53)和由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白。仍其他癌症抗原也可以由病毒基因(诸如在RNA和DNA肿瘤病毒上携带的那些)编码。已经依据多种实体瘤定义了许多肿瘤抗原：由免疫定义的MAGE 1、2和3；MART-1/Melan-A、gp100、癌胚抗原(CEA)、HER2、粘蛋白(即，MUC-1)、前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。另外，已经证明病毒蛋白(诸如一些由乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)和人乳头瘤病毒(HPV)编码的病毒蛋白)分别在肝细胞癌、淋巴瘤和宫颈癌的发展中具有重要作用。
如本文所用，术语“嵌合的”是指至少两个或更多个不同多核苷酸分子的部分的融合产物。在一个实施方案中，术语“嵌合的”是指通过操纵已知元件或其他多核苷酸分子产生的基因表达元件。
在一些实施方案中，“激活”可以是指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞状态。在一些实施方案中，激活可以是指诱导的细胞因子产生。在其他实施方案中，激活可以是指可检测的效应子功能。至少，如本文所用的“激活的T细胞”是增殖性T细胞。
如本文所用，术语“特异性结合”和“特异性地结合”是指在两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的物理相互作用，其中第一实体以比其与作为非靶标的第三实体的结合更大的特异性和亲和力结合第二靶标实体。在一些实施方案中，特异性结合可以是指第一实体对第二靶标实体的亲和力，其比第一实体在相同条件下对第三非靶标实体的亲和力大至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多。对给定靶标具特异性的试剂是在所利用的测定条件下对所述靶标展现出特异性结合的试剂。非限制性例子包括识别和结合同源结合配偶体(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白的抗体或配体。
如本文所用，“刺激配体”是指这样的配体，其当存在于抗原呈递细胞(APC，例如巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、人工APC等)上时可以与T细胞上的同源结合配偶体(本文中称为“刺激分子”或“共刺激分子”)特异性地结合，由此介导T细胞的初级反应(包括但不限于增殖、激活、启动免疫反应等)。刺激配体是本领域熟知的，并且尤其涵盖装载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。
如本文所用的术语“刺激分子”意指T细胞上的与抗原呈递细胞上存在的同源刺激配体特异性地结合的分子。
如本文所用的术语“共刺激配体”包括APC上的与T细胞上的同源共刺激分子特异性地结合、由此提供信号的分子，所述信号加上通过例如TCR/CD3复合物与装载有肽的MHC分子的结合提供的初级信号介导T细胞反应，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于4-1BBL、OX40L、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll样受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性地结合的配体。共刺激配体还可以包括但不限于与T细胞上存在的共刺激分子特异性地结合的抗体，所述共刺激分子诸如为但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3；以及与CD83特异性地结合的配体。
4-1BBL是属于TNFR/TNF配体超家族的2型跨膜糖蛋白。4-1BBL是与T细胞上表达的受体4-1BB(CD137)结合的共刺激配体。4-1BBL在专门的APC(包括树突状细胞、巨噬细胞和激活的B细胞)上表达。已知许多物种的4-1BBL序列，例如人4-1BBL，也称为TNFSF9(NCBI基因ID：8744)多肽(例如，NCBI Ref Seq NP_003802.1)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq NM_003811.3)。4-1BBL可以是指人4-1BBL，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，4-1BBL可以是指例如狗、猫、牛、马、猪等的4-1BBL。本领域技术人员针对此类物种容易地鉴定人4-1BBL的同系物和/或直系同源物，例如使用NCBI直系同源物搜索功能或在给定物种的可用序列数据中搜索与参考4-1BBL序列类似的序列。
“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性地结合，由此介导T细胞的共刺激反应，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA、Toll样受体、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和CD83。
在一个实施方案中，如本文所用的术语“工程化”及其语法等效物可以是指核酸(例如，生物体基因组内的核酸)的一种或多种人为设计的改变。在另一个实施方案中，工程化可以是指基因的改变、添加和/或缺失。“工程化细胞”可以是指具有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。如本文所用的术语“细胞”或“工程化细胞”及其语法等效物可以是指人或非人动物源的细胞。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指与第二可转录多核苷酸分子(诸如目的基因)连接的第一多核苷酸分子(诸如启动子)，其中多核苷酸分子的排列使得第一多核苷酸分子影响第二多核苷酸分子的功能。所述两个多核苷酸分子可以是或可以不是单个连续多核苷酸分子的一部分，并且可以是或可以不是相邻的。例如，如果启动子调节或介导目的基因在细胞中的转录，则所述启动子与所述目的基因可操作地连接。
在本文所述的各种实施方案中，进一步考虑所描述的任何特定多肽的变体(天然存在的或另外的)、等位基因、同源物、经保守修饰的变体和/或保守取代变体涵盖在内。关于氨基酸序列，普通技术人员将认识到，改变编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的单独取代、缺失或添加是“经保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代并保留了多肽的所需活性。此类经保守修饰的变体是符合本公开文本的多态性变体、种间同系物和等位基因的补充，并且不排除所述多态性变体、种间同系物和等位基因。
给定的氨基酸可以被具有相似的生理化学特征的残基替代，例如，将一个脂肪族残基取代为另一个脂肪族残基(诸如将Ile、Val、Leu或Ala取代为另一个脂肪族残基)，或将一个极性残基取代为另一个极性残基(诸如在Lys与Arg之间；在Glu与Asp之间；或在Gln与Asn之间)。其他此类保守取代(例如，对具有相似疏水性特征的整个区域的取代)是熟知的。可以在本文所述的任何一种测定中测试包含保守氨基酸取代的多肽，以确认保留了所需活性，例如天然或参考多肽的配体介导的受体活性和特异性。
可以根据其侧链特性的相似性对氨基酸进行分组(在A.L.Lehninger,Biochemistry,第二版,第73-75页,Worth Publishers,New York(1975))：(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电的极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。可替代地，可以基于共同的侧链特性将天然存在的残基分成几组：(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一个类别。特定的保守取代包括例如：将Ala取代为Gly或取代为Ser；将Arg取代为Lys；将Asn取代为Gln或取代为His；将Asp取代为Glu；将Cys取代为Ser；将Gln取代为Asn；将Glu取代为Asp；将Gly取代为Ala或取代为Pro；将His取代为Asn或取代为Gln；将Ile取代为Leu或取代为Val；将Leu取代为Ile或取代为Val；将Lys取代为Arg、取代为Gln或取代为Glu；将Met取代为Leu、取代为Tyr或取代为Ile；将Phe取代为Met、取代为Leu或取代为Tyr；将Ser取代为Thr；将Thr取代为Ser；将Trp取代为Tyr；将Tyr取代为Trp；和/或将Phe取代为Val、取代为Ile或取代为Leu。
在一些实施方案中，本文所述的多肽(或编码这种多肽的核酸)可以是本文所述的氨基酸序列之一的功能片段。如本文所用，“功能片段”是根据本领域已知或本文下面所描述的测定保留了至少50％的野生型参考多肽活性的肽片段或区段。功能片段可以包含本文所公开序列的保守取代。
在一些实施方案中，本文所述的多肽可以是如本文所述的多肽或分子的变体。在一些实施方案中，变体是经保守修饰的变体。保守取代变体可以通过例如对天然核苷酸序列的突变获得。如本文所指，“变体”是与天然或参考多肽基本上同源，但是由于一个或多个缺失、插入或取代而具有与天然或参考多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列的多肽。编码变体多肽的DNA序列涵盖这样的序列，所述序列当与天然或参考DNA序列相比时包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代，但是编码保留了非变体多肽活性的变体蛋白或其片段。各种各样的基于PCR的位点特异性诱变方法是本领域已知的，并且可以被普通技术人员所应用。
变体氨基酸或DNA序列可以与天然或参考序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多相同。在天然序列与突变序列之间的同源性程度(同一性百分比)可以例如通过使用万维网上通常用于此目的的可免费获得的计算机程序(例如具有默认设置的BLASTp或BLASTn)比较所述两个序列来确定。
天然氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的许多技术中的任何一种来完成。例如，可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸在特定的基因座处引入突变，所述突变序列的侧翼是允许连接至天然序列片段的限制性位点。连接后，所得的重新构建的序列编码具有所需的氨基酸插入、取代或缺失的类似物。可替代地，可以采用寡核苷酸定向位点特异性诱变程序，以提供具有根据所需要的取代、缺失或插入而改变的特定密码子的改变的核苷酸序列。进行此类改变的技术已经得到确认，并且包括例如以下文献所公开的那些：Walder等人(Gene 42:133,1986)；Bauer等人(Gene 37:73,1985)；Craik(BioTechniques,1985年1月,12-19)；Smith等人(Genetic Engineering:Principles and Methods,PlenumPress,1981)；以及美国专利号4,518,584和4,737,462，将所述文献通过引用以其整体并入本文。任何不参与维持多肽的适当构象的半胱氨酸残基通常可以被丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加至多肽以改善其稳定性或促进寡聚化。
如本文所用，术语“DNA”被定义为脱氧核糖核酸。术语“多核苷酸”在本文中可与“核酸”互换使用，以表示核苷聚合物。通常，多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的在DNA或RNA中天然发现的核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)构成。然而，所述术语涵盖包含核苷或含有经化学或生物修饰的碱基、经修饰的骨架等的核苷类似物的分子(无论是否发现于天然存在的核酸中)，并且此类分子对于某些应用可能是优选的。在本申请涉及多核苷酸的情况下，应理解提供了DNA、RNA两者、以及在每种情况下单链和双链两种形式(以及每个单链分子的互补序列)。如本文所用的“多核苷酸序列”可以是指多核苷酸材料本身和/或是指在生物化学上表征特定核酸的序列信息(即，用作碱基缩写的字母的连续)。除非另外指明，否则本文呈现的多核苷酸序列以5'至3'方向呈现。
如本文所用的术语“多肽”是指氨基酸聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是相对较短的多肽，长度通常在约2个与60个氨基酸之间。本文所用的多肽通常含有氨基酸，诸如蛋白质中最常见的20种L-氨基酸。然而，可以使用本领域已知的其他氨基酸和/或氨基酸类似物。可以例如通过添加化学实体(诸如碳水化合物基团、磷酸基团、脂肪酸基团、用于缀合、官能化的接头等)来修饰多肽中的一个或多个氨基酸。具有与之共价或非共价缔合的非多肽部分的“多肽”仍被认为是“多肽”。示例性修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化、使用重组DNA技术产生或通过化学手段(诸如常规固相肽合成等)合成。如本文所用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以是指多肽材料本身和/或是指在生物化学上表征多肽的序列信息(即，用作氨基酸名称的缩写的字母或三字母代码的连续)。除非另外指明，否则本文呈现的多肽序列以N末端至C末端的方向呈现。
在一些实施方案中，载体包含编码如本文所述的多肽(例如，CAR多肽)的核酸。在本文所述的一些方面，将编码如本文所述的给定多肽的核酸序列或其任何模块可操作地连接至载体。如本文所用，术语“载体”是指被设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”涵盖当与适当的控制元件缔合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。载体可以包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒体等。
如本文所用，术语“表达载体”是指引导从与载体上的转录调节序列连接的序列表达RNA或多肽的载体。所表达的序列将与细胞通常但不一定是异源的。表达载体可以包含另外的元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其在两种生物体中得以维持，例如在人细胞中进行表达并在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指参与产生RNA和蛋白质以及(在适当时)分泌蛋白质的细胞过程，包括(在适用时)但不限于例如转录、转录物加工、翻译以及蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过翻译从基因转录的mRNA获得的多肽。术语“基因”意指当可操作地连接至适当的调节序列时，在体外或在体内被转录(DNA)为RNA的核酸序列。基因可以包括或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如5'非翻译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾随”序列、以及在单独的编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文所用，“信号肽”或“信号序列”是指在新合成蛋白质的N末端的用于将新生蛋白质引导到内质网中的肽。在一些实施方案中，信号肽是CD8信号肽。
如本文所用，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，其包括至少一种病毒源的元件并且具有被包装到病毒载体颗粒中的能力。病毒载体可以含有代替非必需病毒基因的编码如本文所述的多肽的核酸。可以将载体和/或颗粒用于在体外或在体内将核酸转移到细胞中的目的。许多形式的病毒载体是本领域已知的。
“重组载体”意指包括能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应当理解，在一些实施方案中，可以将本文所述的载体与其他合适的组合物和疗法组合。在一些实施方案中，载体是附加型的。合适的附加型载体的使用提供了一种以高拷贝数的染色体外DNA在受试者中维持目的核苷酸的手段，由此消除了染色体整合的潜在影响。
如本文所用，术语“治疗”(“treat”、“treatment”、“treating”)或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减慢或停止与疾病或障碍(例如急性成淋巴细胞性白血病或其他癌症、疾病或障碍)相关的病症的进展或严重性。术语“治疗”包括减少或减轻病症、疾病或障碍的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标记减少，则治疗通常是“有效的”。可替代地，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标记的改善，还包括与在没有治疗的情况下预期的症状的进展或恶化相比症状的进展或恶化停止或至少减慢了。有益或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态稳定(即，不恶化)、疾病进展延迟或减慢、疾病状态改善或缓和、缓解(无论是部分还是全部)和/或死亡率降低(无论是可检测的还是不可检测的)。术语疾病的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的解除(包括姑息治疗)。
如本文所用，术语“药物组合物”是指与药学上可接受的载体(例如，制药工业中通常使用的载体)组合的活性药剂。短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断的范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在任何方面的一些实施方案中，药学上可接受的载体可以是除水以外的载体。在任何方面的一些实施方案中，药学上可接受的载体可以是乳膏、乳剂、凝胶、脂质体、纳米颗粒和/或软膏。在任何方面的一些实施方案中，药学上可接受的载体可以是人工或工程化载体，例如其中发现活性成分并非天然存在的载体。
如本文所用，术语“给予”是指通过导致将药剂至少部分递送到所需部位的方法或途径将如本文所公开的治疗或药物组合物置于受试者体内。可以通过导致受试者的有效治疗的任何适当途径给予包含如本文所公开的药剂的药物组合物。
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且通常意指两个标准偏差(2SD)或更大的差异。
除了在操作实施例中以外或者在另外指明的情况下，本文所用的表达成分的量或反应条件的所有数字应当理解为在所有情形下均被术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可以意指±1％。
如本文所用，术语“包含”意指除了所呈现的定义要素以外还可能存在其他要素。“包含”的使用表示包含而非限制。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其相应组分，其不包括在实施方案的所述描述中未列举的任何要素。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。所述术语允许存在不实质上影响技术的所述实施方案的一种或多种基本和新颖或功能特征的另外的要素。
除非上下文另外明确指明，否则单数术语“一种/一个”(“a”、“an”)和“所述”(“the”)包括复数种/个指示物。类似地，除非上下文另外明确指明，否则词语“或”旨在包括“和”。尽管与本文所述的方法和材料类似或等效的那些方法和材料可以用于本公开文本的实践或测试，但下面描述了合适的方法和材料。缩写“例如”(“e.g.”)源自拉丁语例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性例子。因此，缩写“例如”(“e.g.”)与术语“例如”(“for example”)同义。
在任何方面的一些实施方案中，本文所述的公开文本不涉及克隆人类的过程、修改人类的种系遗传同一性的过程、使用人胚胎用于工业或商业目的、或修改动物的遗传同一性的过程(所述过程有可能导致人或动物遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医学益处)、以及由此类过程产生的动物。
在对下文的技术的各个方面和实施方案的描述内定义了其他术语。
本文所述的方法和构建体提供了若干优点。例如，包括TriPRIL CAR在内的全人CAR的免疫原性和对CAR T细胞输注的排斥的发生率降低。此外，TriPRIL CAR T细胞在小鼠中扩增的速度较慢，这可能导致与CAR T细胞快速扩增相关的细胞因子释放综合征的发生率降低。TriPRIL CAR构建体还维持TNF超家族成员的三聚体结构，但是具有CAR骨架的规范稳定构型。
本发明的其他特征和优点将根据以下对其优选实施方案的描述以及根据权利要求书变得清楚。
附图说明
图1示出了基于scFv的抗BCMA CAR与APRIL抗BCMA/TACI CAR的示意性比较。
图2示出了本文所述的CAR的某些实施方案的示意图。预期使用4-1BB跨膜结构域更有可能促进三聚化。
图3示出了指定的细胞类型中的靶标表面表达。
图4示出了表达APRIL或BCMA CAR的细胞的生长曲线。
图5A示出了APRIL CAR的CAR-T细胞转导效率。图5B描绘了BCMA CAR的CAR-T细胞转导效率。x轴为mCherry，y轴为侧向散射。在活的CD3+T细胞上对细胞进行门控。
图6示出了比较APRIL和BCMA CAR的杀伤测定的结果。
图7示出了比较APRIL和BCMA CAR的激活测定的结果。在表达NFAT启动子后的萤光素酶的Jurkat细胞系(JNL)中测试了CAR介导的T细胞激活。如所指示用CAR对JNL细胞进行慢病毒转导，并且使其暴露于在x轴上指定的靶标数小时。测量光发射(相对光单位，y轴)。
图8示出了BCMA和TACI在指定的多发性骨髓瘤细胞系中的表达水平。
图9示出了BCMA和TACI在工程化细胞系中的表达。
图10示出了几种APRIL和BCMA CAR的示意图及其转导效率。
图11示出了证明在用RPMI8226BCMA反复刺激后BCMA和APRIL CAR扩增的图。
图12示出了表达BCMA和TACI的细胞系的APRIL-CAR杀伤的图。
图13示出了APRIL-CAR的特异性激活。
图14显示响应于用RPMI8226亲本刺激，BCMA和APRIL CAR脱粒。
图15示出了APRIL-CART细胞的细胞因子谱。
图16示出了示例性TriPRIL构建体的示意图。
图17示出了TriPRIL CAR的CAR-T细胞转导效率。x轴显示mCherry信号，并且y轴为侧向散射。上图示出了对照未经转导的(UTD)细胞，并且下图示出了用TriPRIL CAR转导的细胞。
图18示出了使用TriPRIL CAR T细胞的细胞杀伤测定的结果。
图19示出了从多发性骨髓瘤患者(n＝25)获得的浆细胞上的BCMA和TACI表达。
图20示出了基于APRIL的CAR在原代人T细胞中的转导效率(MOI＝5，n＝3)。
图21示出了在靶细胞系RPMI8226、MM.1S、K562-BCMA和K562-TACI上的BCMA和TACI表达。
图22A和22B示出了用BCMA、APRIL和TriPRIL CAR T细胞进行的体外CD69激活测定的结果。图22A示出了门控策略。图22B示出了在与靶细胞共培养12小时之后基于CD69表达百分比的激活。
图23示出了用BCMA CAR、APRIL-CD8 CAR和APRIL-4-1BB CAR进行的体外杀伤测定的结果。
图24示出了用BCMA-CAR、APRIL-CD8 CAR和TriPRIL CAR进行的体外杀伤测定的结果。
图25A示出了在NOD scidγ(NSG)小鼠中用MM.1S细胞进行的体内实验的实验设计。
图25B示出了在指定的时间点NSG小鼠中的肿瘤负荷的生物发光成像。
图25C示出了在指定的时间点NSG小鼠中的肿瘤负荷的定量。
图25D示出了在注射CAR T或UTD细胞后6.5天在血液中CD3+/mCherry阳性细胞的绝对数量。
图26A示出了从多发性骨髓瘤患者中获得的浆细胞上的BCMA和TACI表达。
图26B示出了在人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和MM.1S以及被修饰以表达BCMA或TACI的K562细胞上的BCMA(PE)和TACI(APC)的表达水平。
图26C示出了各种CAR的结合的演示。
图26D示出了单独靶向BCMA以及并行靶向BCMA和TACI的第二代CAR的设计。
图27A示出了BCMA scFv、APRIL-4-1BB和TriPRIL CAR对可溶性BCMA(sBCMA)和可溶性TACI(sTACI)的亲和力。
图27B-27E示出了响应于表达BCMA和/或TACI的靶细胞MM.1S(图27B)、RPMI8226(图27C)、K562-BCMA(图27D)和K562-TACI(图27E)的不同CAR构建体的细胞毒性。
图27F和27G示出了响应于表达BCMA和/或TACI的靶细胞的不同CAR构建体的脱粒(图27F)和激活(图27G)。
图27H和27I示出了通过用BCMA(图27H)或TACI(图27I)反复抗原刺激而诱导的不同CAR T细胞的长期增殖。
图27J示出了在与人MM.1S骨髓瘤细胞共培养后不同CAR T细胞的细胞因子产生。
图28A示出了体内测试CAR T细胞的实验设计。
图28B示出了骨髓瘤异种移植物随时间的代表性生物发光成像。
图28C示出了在指定的时间点在四个组中的通量(光子/秒)的定量。
图28D示出了通过流式细胞术在外周血中测量的CAR T细胞的持久性。
图29A示出了用CRISPR介导的BCMA敲除产生的MM.1S骨髓瘤细胞的BCMA和TACI表达。
图29B示出了MM.1S、MM.1S BCMA KO I和MM.1S BCMA KO II细胞系的群体倍增。
图29C示出了UTD和TriPRIL CAR T细胞对MM.1S和MM.1S BCMA敲除细胞的特异性裂解。
图29D示出了BCMA CAR和TriPRIL CAR T细胞在体外对MM.1S和MM.1S BCMA敲除细胞的杀伤。
图29E示出了在NSG小鼠中MM.1S和MM.1S BCMA阴性细胞系随时间的肿瘤生长动力学。
图30A-30C示出了在BCMA阴性多发性骨髓瘤的异种移植模型中评估的CAR T细胞的抗肿瘤功效。图30A示出了实验设计。图30B示出了骨髓瘤异种移植物随时间的代表性生物发光成像。图30C示出了在指定的时间点在三个组中的通量(光子/秒)的定量。
图31A示出了从三个供体平均得到的具有不同CAR构建体的CD4+或CD8+T细胞的多功能性。图31B示出了来自每个单独供体的具有不同CAR构建体的CD4+或CD8+T细胞的多功能性。
图32A示出了从三个供体平均得到的具有不同CAR构建体的CD+或CD8+T细胞的多功能强度指数(PSI)。图32B示出了来自每个单独供体的具有不同CAR构建体的CD+或CD8+T细胞的PSI。
图33A示出了从三个供体平均得到的CD4+或CD8+T细胞的多功能热图。图33B示出了来自每个单独供体的CD4+或CD8+T细胞的多功能热图。
图34A示出了从三个供体平均得到的具有不同CAR构建体的CD4+或CD8+T细胞的蛋白质分泌(％)。图34B-34D示出了来自每个单独供体的具有不同CAR构建体的CD4+或CD8+T细胞的蛋白质分泌(％)。
图35示出了在存在重组人(rh)BCMA、rhTACI和rhAPRIL的情况下TriPRIL CART的细胞毒性。
具体实施方式
本文描述了CAR设计的改进，其避免了脱靶效应并减少了由于靶抗原丢失而导致的肿瘤逃逸的可能性。在一个实施方案中，本文描述了一种方法，其使用结合两种不同肿瘤相关抗原或因子的单一配体。基本上如本领域已知的CAR，将单一配体融合至跨膜结构域和T细胞受体细胞内效应子结构域，任选地和共刺激结构域。如果一种或另一种抗原或因子被靶细胞下调，则具有结合两种不同肿瘤相关抗原或因子的配体的CAR将不会丧失有效性。在一些实施方案中，CAR包括配体，其包括TNF超家族受体配体的一部分。本文使用APRIL多肽的一部分作为配体说明了这一点，APRIL多肽的所述部分以高亲和力结合至多发性骨髓瘤和白血病相关的BCMA多肽和TACI(在多发性骨髓瘤上表达的另一种因子)两者。
本文所述的技术的实施方案涉及以下发现：包含含有TNF超家族受体配体(例如，APRIL)的细胞外部分的CAR多肽的T细胞是治疗癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病的有效治疗剂，而不会引起脱靶效应或不良反应。
因此，本文所述的发明的一个方面涉及一种CAR多肽，其包含a)包含TNF超家族受体配体(例如，APRIL)的一部分的细胞外结构域，所述细胞外结构域位于内源性切割位点的N末端并且至少包含TNF样结构域；b)铰链和跨膜结构域；和c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TNF超家族受体配体是APRIL。在其他实施方案中，TNF超家族受体配体是TNF-α、淋巴毒素β、OX40L、CD154、FasL、LIGHT、TL1A、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、BAFF、CAMLG、LIGHT、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体、TL1A或EDA-A2。
此外，本文所述的发明涉及包含各自包含如本文所述的TNF超家族受体配体(例如，APRIL)的一部分的两个或更多个(例如，三个)细胞外结构域的CAR多肽，以及所述CAR多肽用于治疗对抗BCMA疗法有抗性的受试者的障碍(例如，癌症(例如，多发性骨髓瘤)、浆细胞障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥)的相关方法。
下文描述了制作和使用本技术的这些和其他方面必需的考虑因素。
嵌合抗原受体
本文所述的技术提供了用于在免疫疗法中使用的改进的嵌合抗原受体(CAR)。下文讨论了CAR和各种改进。
如本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”或“CARs”是指将配体或抗原特异性移植到例如T细胞(例如幼稚T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合)上的工程化T细胞受体。CAR也被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。
CAR将特异性地结合靶标(例如，在将被靶向作出免疫(例如，T细胞反应)的细胞表面上表达的多肽)的嵌合的细胞外靶标结合结构域置于包括跨膜结构域和T细胞受体分子的一个或多个细胞内结构域(包括信号传导结构域)的构建体上。在一个实施方案中，嵌合的细胞外靶标结合结构域包含抗体的一个或多个抗原结合结构域，所述抗体特异性地结合在将被靶向作出免疫(例如，T细胞反应)的细胞上表达的抗原。如本领域已知的和如本文所公开的，CAR的一个或多个细胞内信号传导结构域的特性可以变化，但是当嵌合的靶标/抗原结合结构域结合在靶向的细胞表面上的靶标/抗原时，所述一个或多个嵌合的靶标/抗原结合结构域使受体对信号传导激活敏感。
关于细胞内信号传导结构域，所谓的“第一代”CAR包括在抗原结合后仅提供例如CD3zeta(CD3ζ)信号的那些CAR。所谓的“第二代”CAR包括提供共刺激(例如，CD28或CD137)和激活(CD3ζ)结构域的那些CAR，并且所谓的“第三代”CAR包括提供多种共刺激(例如，CD28和CD137)结构域和激活结构域(例如，CD3ζ)的那些CAR。在各种实施方案中，CAR被选择为对靶标/抗原具有高亲和力或亲合力–例如，抗体衍生的靶标或抗原结合结构域将通常对靶抗原具有比天然存在的T细胞受体情况下更高的亲和力和/或亲合力。这种特性与人们可以针对抗体选择的高特异性组合提供CAR T细胞的高特异性T细胞靶向。
如本文所用，“CAR T细胞”或“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。当在T细胞中表达时，CAR具有利用单克隆抗体的抗原结合特性，以非MHC限制性方式重新定向针对所选靶标的T细胞特异性和反应性的能力。非MHC限制性抗原识别给予表达CAR的T细胞不依赖抗原加工而识别抗原的能力，由此绕过肿瘤逃逸的主要机制。
如本文所用，术语“细胞外靶标结合结构域”是指在细胞外部发现的足以促进与靶标结合的多肽。细胞外靶标结合结构域将特异性地结合其结合配偶体。作为非限制性例子，细胞外靶标结合结构域可以包括抗体或配体(例如，TNF超家族受体配体)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，细胞外靶标结合结构域包含识别并结合同源结合配偶体蛋白的APRIL或者两个或更多个APRIL结构域(例如，三个如本文所述的APRIL结构域(TriPRIL))。在此背景下，配体是与蛋白质和/或受体的一部分特异性地结合的分子。可用于本文所述的方法和组合物中的配体的同源结合配偶体通常可以在细胞表面上发现。配体:同源配偶体的结合可能导致携带配体的受体的改变，或激活生理反应，例如激活信号传导途径或级联。在一个实施方案中，配体对基因组而言可以是非天然的。任选地，配体在至少两个物种之间具有保守功能。
抗体试剂
在各种实施方案中，本文所述的CAR包含抗体试剂或其作为细胞外靶标结合结构域的抗原结合结构域。
如本文所用，术语“抗体试剂”是指包括至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列并且特异性地结合给定抗原的多肽。抗体试剂可以包含抗体或包含抗体的抗原结合结构域的多肽。在任何方面的一些实施方案中，抗体试剂可以包含单克隆抗体或包含单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(在本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(在本文中缩写为VL)。在另一个例子中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv、CDR和结构域抗体(dAb)片段(参见例如de Wildt等人,Eur J.Immunol.1996；26(3):629-39；将其通过引用以其整体并入本文))以及完整抗体。抗体可以具有IgA、IgG、IgE、IgD或IgM(及其亚型和组合)的结构特征。抗体可以来自任何来源，包括小鼠、兔、猪、大鼠和灵长类动物(人和非人灵长类动物)和灵长类动物源化抗体。抗体还包括中间抗体(midibody)、人源化抗体、嵌合抗体等。可以使用本领域普通技术人员已知的方法例如从噬菌体展示文库中选择全人抗体结合结构域。
VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为“互补决定区”(“CDR”)，散布有更保守的区域，称为“框架区”(“FR”)。已经精确定义了框架区和CDR的范围(参见，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242，以及Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；将所述文献通过引用以其整体并入本文)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在一个实施方案中，抗体或抗体试剂不是人抗体或抗体试剂(即，抗体或抗体试剂是小鼠的)，但是已经被人源化。“人源化抗体或抗体试剂”是指已经在蛋白质序列水平上被修饰以增加其与在人体中天然产生的抗体或抗体试剂变体的相似性的非人抗体或抗体试剂。将抗体人源化的一种方法是将鼠类或其他非人CDR移植到人抗体框架上。
在一个实施方案中，CAR的细胞外靶标结合结构域包含经由柔性接头肽将抗体(通常是单克隆抗体)的VH和VL结构域融合而产生的单链Fv(scFv)片段或基本上由其组成。在各种实施方案中，将scFv融合至跨膜结构域和T细胞受体细胞内信号传导结构域(例如，如本文所述的工程化细胞内信号传导结构域)。
抗体结合结构域以及选择和克隆它们的方式是本领域普通技术人员熟知的。
在一个实施方案中，可用于本文所述的技术的CAR在细胞外靶标结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域中包含至少两个抗原特异性靶向区域。在此类实施方案中，所述两个或更多个抗原特异性靶向区域靶向至少两种不同的抗原，并且可以串联排列并被接头序列分开。在另一个实施方案中，CAR是双特异性CAR。双特异性CAR对两种不同的抗原具有特异性。
TNF超家族受体配体
在一个实施方案中，CAR多肽的细胞外结构域包含TNF超家族受体配体的一部分，其中TNF超家族受体配体的所述部分位于内源性切割位点的N末端，并且至少包含TNF样结构域。
例如，在一个实施方案中，CAR多肽的细胞外结构域包含APRIL的一部分，其中APRIL的所述部分位于内源性切割位点的N末端，并且至少包含TNF样结构域(SEQ ID NO:37)。
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFV(SEQ ID NO:37)
在其他实施方案中，CAR多肽包含TNF超家族受体配体或其部分，其中TNF超家族受体配体是TNF-α、淋巴毒素β、OX40配体(OX40L)、CD154、Fas配体(FasL)、LIGHT、TNF样配体1A(TL1A)、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体(4-1BBL)、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、核因子κB受体激活剂配体(RANKL)、TNF相关弱凋亡诱导剂(TWEAK)、B细胞激活因子(BAFF)、钙调节配体(CAMLG或CAML)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3(NT-3)、神经营养蛋白4(NT-4)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)配体或外异蛋白A2(EDA-A2)。在一些实施方案中，TNF超家族受体配体或其部分(例如，TNF-α、淋巴毒素β、OX40L、CD154、FasL、LIGHT、TL1A、CD70、Siva、CD153、4-1BBL、TRAIL、RANKL、TWEAK、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体或EDA-A2)包括SEQ ID NO:37的TNF样结构域。
在一些实施方案中，本文所述的CAR多肽可以包含两个或更多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或十个或更多个)细胞外结构域，所述细胞外结构域各自包含TNF超家族受体配体的一部分。本文所述的CAR多肽的细胞外靶标结合结构域可以包括两个或更多个相同的TNF超家族受体配体或其部分(例如，同寡聚体)，或者可以包括至少一种不同的TNF超家族受体配体或其部分(例如，异寡聚体)。
TriPRIL
在一些实施方案中，CAR的细胞外靶标结合结构域包含BCMA和/或TACI的配体(例如，APRIL)或其一部分。细胞外靶标结合结构域可以包含两个或更多个APRIL结构域。在一个实施方案中，CAR的细胞外靶标结合结构域包含三个APRIL结构域，所述APRIL结构域任选地通过一个或多个接头序列连接。本文所述的示例性接头包括甘氨酸/丝氨酸接头、以及Whitlow接头。这样的包含三个APRIL结构域的多肽在本文中被称为TriPRIL。
APRIL(一种增殖诱导配体)(也称为TNF超家族成员13(TNFSF13))是肿瘤坏死因子配体(TNF)家族的成员，并且充当BCMA的配体。已知许多物种的APRIL序列，例如人APRIL(UniProtKB：O75888；NCBI基因ID：8741)多肽(例如，NCBI Ref Seq：NP_001185551.1)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq：NM_001198622.1)。APRIL可以是指人APRIL(例如，SEQ ID NO:60)，包括其天然存在的变体、截短形式(例如，SEQ ID NO:21、27、33或40)、分子和等位基因。在任何方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，APRIL可以是指例如狗、猫、牛、马、猪等的APRIL。本领域技术人员针对此类物种容易地鉴定人APRIL的同系物和/或直系同源物，例如使用NCBI直系同源物搜索功能或在给定物种的可用序列数据中搜索与参考APRIL序列类似的序列。在一些实施方案中，人APRIL对应于SEQ ID NO:60的序列：
MPASSPFLLAPKGPPGNMGGPVREPALSVALWLSWGAALGAVACAMALLTQQTELQSLRREVSRLQGTGGPSQNGEGYPWQSLPEQSSDALEAWENGERSRKRRAVLTQKQKKQHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(SEQ ID NO:60)
在一个实施方案中，APRIL的所述部分具有与选自SEQ ID NO:3、8、9、15、21、27、33或40的序列相对应的序列；或包含选自SEQ ID NO:3、8、9、15、21、27、33或40的序列；或包含与选自SEQ ID NO 3、8、9、15、21、27、33或40的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中，APRIL的所述部分基本上由选自SEQ ID NO:3、8、9、15、21、27、33或40的序列组成；或基本上由与选自SEQ ID NO 3、8、9、15、21、27、33或40的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列组成。在一个实施方案中，APRIL的所述部分不包含从位于内源性切割位点C末端的APRIL的部分衍生的序列。
可用于本发明的接头序列的长度可以是例如从2至100个氨基酸、5至50个氨基酸、10至15个氨基酸、15至20个氨基酸或18至20个氨基酸，并且包括本领域已知的任何合适的接头。例如，可用于本发明的接头序列包括但不限于甘氨酸/丝氨酸接头，例如GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:41)和Gly4Ser(G4S)接头(诸如(G4S)3(GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:61))和(G4S)4(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:62)))；如Whitlow等人,ProteinEng.6(8):989-95,1993(将其内容通过引用以其整体并入本文)所描述的GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:58)的接头序列；如Andris-Widhopf等人,Cold SpringHarb.Protoc.2011(9),2011(将其内容通过引用以其整体并入本文)所描述的GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:63)的接头序列；以及如Sblattero等人,Nat.Biotechnol.18(1):75-80,2000(将其内容通过引用以其整体并入本文)所描述的具有增加的功能(例如，表位标签或含有Cre-Lox重组位点的编码序列)的接头序列。
例如，连接两个APRIL结构域的接头序列可以对应于SEQ ID NO:41、58、61、62或63的序列，或包含SEQ ID NO:41、58、61、62或63的序列，或包含与SEQ ID NO:41、58、61、62或63的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列，或包含相对于SEQ ID NO:41、58、61、62或63的序列具有至少1、2、3、4、5、6或7个氨基酸取代或缺失的序列。
在一个例子中，TriPRIL在每个APRIL结构域之间包括甘氨酸/丝氨酸接头。具有甘氨酸/丝氨酸接头的示例性TriPRIL序列如下：
Figure BDA0002667249210000351
其中接头序列以粗体呈现并加下划线。在一些实施方案中，TriPRIL的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:56的序列，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:56的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。
在另外的例子中，TriPRIL可以包括通过Whitlow接头序列连接的三个APRIL结构域，如下所示：
Figure BDA0002667249210000352
Figure BDA0002667249210000361
其中接头序列以粗体呈现并加下划线。在一些实施方案中，TriPRIL的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:59的序列，包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:59的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TriPRIL的每个APRIL结构域对应于SEQ ID NO:21、27、33、40或60的序列；或包含SEQ ID NO:21、27、33、40或60的序列；或包含与SEQ ID NO:21、27、33、40或60的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中，APRIL的所述部分基本上由SEQ ID NO:21、27、33或40的序列组成；或基本上由与SEQ ID NO:21、27、33或40的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列组成。在一个实施方案中，TriPRIL的每个APRIL结构域不包含从位于内源性切割位点C末端的APRIL的部分衍生的序列。
在一个实施方案中，CAR多肽包含TNF超家族受体配体的一部分，所述部分在其编码区内包含一个或多个突变。例如，在一个实施方案中，CAR多肽包含APRIL的一部分，所述部分在其编码区内包含一个或多个突变。示例性氨基酸突变包括对以下氨基酸进行的点突变：SEQ ID NO:21的氨基酸18、61、91、92和/或117；SEQ ID NO:27的氨基酸18、63、91、92和/或117；SEQ ID NO:33的氨基酸18、63、91、92和/或117；SEQ ID NO:40的氨基酸18、61、91、92和/或117；以及SEQ ID NO:40的氨基酸18、63、91、92和/或117。在另一个例子中，APRIL的所述部分可以包括在以下氨基酸处的氨基酸取代或缺失：SEQ ID NO:21的氨基酸18、61、91、92和/或117；SEQ ID NO:27的氨基酸18、63、91、92和/或117；SEQ ID NO:33的氨基酸18、63、91、92和/或117；SEQ ID NO:40的氨基酸18、61、91、92和/或117；以及SEQ ID NO:40的氨基酸18、63、91、92和/或117。本领域技术人员将能够使用标准技术将突变引入基因或基因产物的核酸序列中。例如，可以经由定点的点诱变(一种PCR技术)来引入点突变。定点诱变试剂盒可例如通过New England Biolabs(马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA))商购获得。将点突变引入基因或基因产物的核酸序列的替代方法的非限制性例子包括盒式诱变或全质粒诱变。
任选地，TNF超家族受体配体(例如，APRIL)的所述部分不包含富赖氨酸区域。在一个实施方案中，“富赖氨酸区域”是指包含至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％赖氨酸氨基酸的氨基酸序列区域。如本文所用，“区域”是指至少4个或更多个连续的氨基酸。在一个实施方案中，富赖氨酸序列包含KQKKQH(SEQ ID NO:38)的序列。
此外，在另一个例子中，包含APRIL的一部分的CAR多肽不包含R-X-Y-R(SEQ IDNO:66)的弗林蛋白酶切割位点，其中X是任何氨基酸并且Y是赖氨酸或精氨酸。例如，APRIL的所述部分不包含具有R-K-R-R(SEQ ID NO:67)的序列的弗林蛋白酶切割位点。可以缺失或突变如本文所述的人APRIL的弗林蛋白酶切割位点。
在任何方面的一个实施方案中，CAR多肽包含两个或更多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或十个或更多个)细胞外结构域，所述细胞外结构域包含TNF超家族受体配体(例如，APRIL)的一部分。在一个实施方案中，CAR多肽包含三个细胞外结构域，所述细胞外结构域包含TNF超家族受体配体(例如，APRIL)的一部分。例如，CAR多肽包含各自包含APRIL的一部分的三个细胞外结构域，即如图16所示的TriPRIL。例如，在一些实施方案中，CAR多肽可以包括两个或更多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或十个或更多个)TNF超家族受体配体(例如APRIL，如图16所示，其中APRIL作为三重复序列提供)的重复。在一些实施方案中，TNF超家族受体配体是相同的。在其他实施方案中，TNF超家族受体配体可以是不同的(例如，CAR可以包括APRIL的一个或多个部分以及第二TNF超家族受体配体(例如，BAFF)的一个或多个部分)。
在任何方面的一个实施方案中，TNF超家族受体配体(例如，APRIL)与另一种TNF超家族受体配体(例如，APRIL)寡聚化(例如，二聚化或三聚化)。寡聚化可以是分子内的或分子间的。寡聚体可以是同寡聚体或异寡聚体。
靶标/抗原
CAR可以靶向任何细胞表面部分。最通常地，靶标将是在人们希望靶向作出T细胞反应的细胞上差异或优先表达的细胞表面多肽。在这方面，肿瘤抗原或肿瘤相关抗原提供了有吸引力的靶标，从而提供靶向肿瘤细胞同时避免或至少限制对非肿瘤细胞或组织的附带损害的手段。肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的非限制性例子包括CEA、未成熟的层粘连蛋白受体、TAG-72、HPV E6和E7、BING-4、钙激活的氯离子通道2、细胞周期蛋白B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、间皮素(Mesotheliun)、SAP-1、存活素、BAGE家族、CAGE家族、GAGE家族、MAGE家族、SAGE家族、XAGE家族、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、Gp100/pmel17、酪氨酸酶、TRP-1/-2、MC1R、BRCA1/2、CDK4、MART-2、p53、Ras、MUC1和TGF-βRII。在一个方面，细胞表面部分可以是TNF超家族受体，例如TNFR1、TNFR2、CD95、DCR3、DR3、DR4、DR5、DCR1、DCR2、DR6、EDAR、NGFR、OPG、RANK、LTbetaR、FN14、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40、GITR、BCMA、TACI、BAFFR、XEDAR、TROY或RELT。在一些实施方案中，TNF超家族受体是BCMA或TACI。
在一些实施方案中，如本文所述的CAR多肽的靶标/抗原是BCMA和/或TACI。
B细胞成熟抗原(BCMA)是一种小的III型跨膜蛋白，并且是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。BCMA以低亲和力结合BAFF并以高亲和力结合APRIL，并且BCMA信号传导保护骨髓瘤细胞免于凋亡。BCMA具有两个紧密的家族成员：TACI和BAFF受体。
已知许多物种的BCMA序列，例如人BCMA(NCBI基因ID：608)多肽(例如，NCBI RefSeq：NP_001183.2)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq：NM_001192.2)。BCMA可以是指人BCMA，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，BCMA可以是指例如狗、猫、牛、马、猪等的BCMA。本领域技术人员针对此类物种容易地鉴定人BCMA的同系物和/或直系同源物，例如使用NCBI直系同源物搜索功能或在给定物种的可用序列数据中搜索与参考BCMA序列类似的序列。
跨膜激活剂和CAML相互作用分子(TACI)是识别APRIL、BAFF和CAML的受体。TACI是TNF受体超家族的成员，并且在与BCMA相似的细胞发育水平和阶段表达。BCMA和TACI的细胞内结构域均与TRAF相互作用，并且可能在促进浆细胞存活方面具有多余的功能。已知许多物种的TACI序列，例如人TACI(NCBI基因ID：23495)多肽(例如，NCBI Ref Seq：NP_036584.1)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq：NM_012452.2)。TACI可以是指人TACI，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，TACI可以是指例如狗、猫、牛、马、猪等的TACI。本领域技术人员针对此类物种容易地鉴定人TACI的同系物和/或直系同源物，例如使用NCBI直系同源物搜索功能或在给定物种的可用序列数据中搜索与参考TACI序列类似的序列。
在一些实施方案中，APRIL或其一部分经由全长APRIL(SEQ ID NO:60)的残基206与TACI结合。在一些实施方案中，APRIL或其一部分经由全长APRIL(SEQ ID NO:60)的残基132与BCMA结合。关于APRIL与其受体BCMA和TACI的结合的信息在以下文献中有详细描述：Kimberley等人,TheJournal of Biological Chemistry.287(44):37434-37446,2012，将其通过引用以其整体并入本文。
铰链和跨膜结构域
如本文所述的每种CAR必须包括跨膜结构域，其将细胞外靶标结合结构域与细胞内信号传导结构域连接。
如本文所用，“铰链结构域”是指允许结合部分和T细胞膜的分离和柔性的氨基酸区域。柔性铰链的长度还允许与相对难以接近的表位更好地结合，例如，更长的铰链区允许最佳结合。本领域技术人员将能够为给定的CAR靶标确定适当的铰链。在一个实施方案中，本文所述的任何CAR多肽的跨膜结构域或其片段包含CD8或4-1BB铰链结构域。
如本文所述的每种CAR必须包括跨膜结构域，其将细胞外靶标结合结构域与细胞内信号传导结构域连接。
因此，在一些实施方案中，CAR的结合结构域的后面任选地是一个或多个“铰链结构域”，其在将靶标结合结构域定位地远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、靶标结合和激活方面起作用。CAR任选地在结合结构域和跨膜结构域(TM)之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适合用于在本文所述的CAR中使用的说明性铰链结构域包括从1型膜蛋白(诸如CD8(例如，CD8α)、CD4、CD28、4-1BB和CD7)的细胞外区域衍生的铰链区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在一些实施方案中，铰链区衍生自免疫球蛋白样蛋白(例如，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、CD28或CD8的铰链区。在一个实施方案中，铰链结构域包含CD8α铰链区。
如本文所用，“跨膜结构域”(TM结构域)是指CAR的穿过细胞的质膜的通常疏水性区域。TM结构域可以是跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白或其他跨膜蛋白)的跨膜区或其片段、人工疏水性序列或其组合。尽管本文提供了具体例子并将其用于实施例中，但是其他跨膜结构域对本领域技术人员而言将是清楚的并且可以与本技术的替代实施方案结合使用。所选跨膜区或其片段优选地将不干扰CAR的预期功能。如关于蛋白质或多肽的跨膜结构域所使用的，“其片段”是指跨膜结构域的足以将蛋白质锚定或附接至细胞表面的一部分。
在一个实施方案中，本文所述的任何CAR多肽的跨膜结构域或其片段包含选自CD8或4-1BB跨膜结构域的跨膜结构域。在任何方面的替代实施方案中，本文所述的CAR的跨膜结构域或其片段包含选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。
4-1BB是一种膜受体蛋白，也称为CD137，并且是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。4-1BB在激活的T淋巴细胞上表达。已知许多物种的4-1BB序列，例如人4-1BB，也称为TNFRSF9(NCBI基因ID：3604)和mRNA(NCBI参考序列：NM_001561.5)。4-1BB可以是指人4-1BB，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，4-1BB可以是指例如狗、猫、牛、马、猪等的4-1BB。本领域技术人员针对此类物种容易地鉴定人4-1BB的同系物和/或直系同源物，例如使用NCBI直系同源物搜索功能或在给定物种的可用序列数据中搜索与参考4-1BB序列类似的序列。
如本文所用，铰链和跨膜结构域或铰链/跨膜结构域是指同时包含铰链和跨膜结构域的结构域。在一个实施方案中，4-1BB铰链和跨膜序列对应于选自SEQ ID NO:10或16的核苷酸序列；或包含选自SEQ ID NO:10或16的序列；或包含与选自SEQ ID NO:10或16的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中，4-1BB铰链和跨膜序列对应于选自SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列；或包含选自SEQ ID NO:28或34的序列；或包含与选自SEQ ID NO:28或34的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。
CD8是一种优先在细胞毒性T淋巴细胞的细胞表面上发现的抗原。CD8介导免疫系统内的细胞-细胞相互作用，并且充当T细胞共受体。CD8由α(CD8α或CD8a)和β(CD8β或CD8b)链组成。已知许多物种的CD8a序列，例如人CD8a(NCBI基因ID：925)多肽(NCBI Ref Seq NP_001139345.1)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq NM_000002.12)。CD8可以是指人CD8，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，CD8可以是指例如狗、猫、牛、马、猪等的CD8。本领域技术人员针对此类物种容易地鉴定人CD8的同系物和/或直系同源物，例如使用NCBI直系同源物搜索功能或在给定物种的可用序列数据中搜索与参考CD8序列类似的序列。
在一个实施方案中，CD8铰链和跨膜结构域序列对应于SEQ ID NO:4或53的核苷酸序列；或包含SEQ ID NO:4或53的序列；或包含与SEQ ID NO:4或53的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中，CD8铰链和跨膜序列对应于SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:22或42的序列；或包含与SEQ ID NO:22或42的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。
共刺激结构域
本文所述的每种CAR任选地包含共刺激分子的细胞内结构域、或共刺激结构域。如本文所用，术语“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体以外的细胞表面分子，其在与抗原结合后提供T淋巴细胞的高效激活和功能所需的第二信号。此类共刺激分子的说明性例子包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70。在一个实施方案中，细胞内结构域是4-1BB、CD27、CD28或OX40的细胞内结构域。
在一个实施方案中，CAR多肽还包含细胞内结构域。如本文所用，“细胞内结构域”是指完全包含在细胞内的核酸。在一个实施方案中，细胞内结构域是指受体的细胞内结构域。细胞内结构域可以与细胞内部相互作用。关于受体的细胞内结构域，细胞内结构域可以起到中继所转导的信号的作用。受体的细胞内结构域可以包含酶促活性。
在一个实施方案中，细胞内结构域是4-1BB的细胞内结构域。在一个实施方案中，4-1BB细胞内结构域序列对应于选自SEQ ID NO:5、11、17或54的核苷酸序列；或包含选自SEQ ID NO:5、11、17或54的序列；或与选自SEQ ID NO:5、11、17或54的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性。在一个实施方案中，4-1BB细胞内结构域氨基酸序列对应于选自SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列；或包含选自SEQ ID NO:23、29、35或43的序列；或与选自SEQ ID NO:23、29、35或43的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性。
细胞内信号传导结构域
如本文所述的CAR包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指CAR多肽的这样的部分，其参与将CAR与靶抗原有效结合的信息转导至免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括向CAR结合的靶细胞释放细胞毒性因子、或在抗原与CAR的细胞外靶标结合结构域结合后引发的其他细胞反应。
CD3是当同时参与适当的共刺激(例如，共刺激分子的结合)时促进T淋巴细胞激活的T细胞共受体。CD3复合物由4条不同的链组成；哺乳动物CD3由一条CD3γ链、一条CD3δ链和两条CD3ε链组成。这些链与称为T细胞受体(TCR)的分子和CD3ζ缔合，以在T淋巴细胞中产生激活信号。完整的TCR复合物包含TCR、CD3ζ和完整的CD3复合物。
在任何方面的一些实施方案中，本文所述的CAR多肽包含细胞内信号传导结构域，其包含来自CD3 zeta(CD3ζ)、ITAM突变的CD3ζ、CD3η或CD3θ的基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。在任何方面的一些实施方案中，ITAM包含CD3ζ的ITAM(ITAM3)的三个基序。在任何方面的一些实施方案中，突变CD3ζ的ITAM的三个基序。
ITAM被称为初级信号传导结构域，其以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。在本技术中特别有用的含有ITAM的细胞内信号传导结构域的非限制性例子包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3δ、CD3η、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
本领域技术人员将能够使用标准技术将突变引入基因或基因产物(例如，ITAM)的核酸序列中。例如，可以经由定点的点诱变(一种PCR技术)来引入点突变。定点诱变试剂盒可例如通过New England Biolabs(马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA))商购获得。将点突变引入基因或基因产物的核酸序列的替代方法的非限制性例子包括盒式诱变或全质粒诱变。
在一个实施方案中，在CAR中利用的ITAM是基于CD3ζ的替代物(包括来自CD3ζ(其含有3个ITAM基序)、CD3ζ的截短、和称为CD3ε、CD3η、CD3θ的可变剪接变体的突变的ITAM)，以及被工程化以表达在CD3ε、CD3η或CD3θ与CD3ζ之间的融合物的人工构建体。
在一些实施方案中，本文所述的CAR多肽包含CD3ζ(包括CD3ζ的变体，例如ITAM突变的CD3ζ)、CD3η或CD3θ的细胞内信号传导结构域。
例如，本文所述的CAR多肽包含CD3ζ的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导序列对应于选自SEQ ID NO:6、12或55的核苷酸序列；或包含选自SEQ ID NO:6、12或55的序列；或包含与选自SEQ ID NO:6、12或55的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导序列对应于选自SEQ ID NO:24、30或44的氨基酸序列；或包含选自SEQ ID NO:24、30或44的序列；或包含与选自SEQ ID NO:24、30或44的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。
在另外的实施方案中，本文所述的CAR多肽包含CD3θ的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，CD3θ细胞内信号传导序列对应于SEQ ID NO:18的核苷酸序列；或包含SEQID NO:18的序列；或包含与SEQ ID NO:18的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中，CD3θ细胞内信号传导序列对应于SEQID NO:36的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:36的序列；或包含与SEQ ID NO:36的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。
对CAR和CAR T细胞的更详细描述可以在以下文献中找到：Maus等人Blood 2014123:2624-35；Reardon等人Neuro-Oncology 2014 16:1441-1458；Hoyos等人Haematologica 2012 97:1622；Byrd等人J Clin Oncol 2014 32:3039-47；Maher等人Cancer Res 2009 69:4559-4562；以及Tamada等人Clin Cancer Res 2012 18:6436-6445；将所述文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。
在一个实施方案中，CAR多肽还包含CD8前导序列。如本文所用，“前导序列”(也称为前导RNA)是指正好位于起始密码子上游的mRNA区域。前导序列对于调节转录物的翻译可能是重要的。
在一个实施方案中，CD8前导序列对应于选自SEQ ID NO:2、8、14或47的核苷酸序列；或包含选自SEQ ID NO:2、8、14或47的序列；或包含与选自SEQ ID NO:2、8、14或47的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一个实施方案中，CD8前导序列对应于选自SEQ ID NO:20、26或32的氨基酸序列；或包含选自SEQID NO:20、26或32的序列；或包含与选自SEQ ID NO:20、26或32的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的CAR多肽包括信号肽。信号肽可以衍生自具有细胞外结构域或被分泌的任何蛋白质。如本文所述的CAR多肽可以包括本领域已知的任何信号肽。在一些实施方案中，CAR多肽包括CD8信号肽，例如对应于SEQ ID NO:20、26或32的氨基酸序列、或包含SEQ ID NO:20、26或32的氨基酸序列、或包含与SEQ ID NO:20、26或32的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列的CD8信号肽。在另外的实施方案中，CD8信号肽由如下核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于选自SEQ ID NO:2、8、14或47的核苷酸序列；或包含选自SEQ ID NO:2、8、14或47的序列；或包含与选自SEQ ID NO:2、8、14或47的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，CAR还包含接头结构域。如本文所用，“接头结构域”是指将如本文所述CAR的任何结构域/区域连接在一起的长度为约2至100个氨基酸的寡肽或多肽区域。在一些实施方案中，接头可以包括柔性残基诸如甘氨酸和丝氨酸或由其构成，使得相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。可用于本发明的接头序列包括本领域已知的或如本文所述的任何接头序列，例如SEQ ID NO:41、58、61、62或63的接头序列。当期望确保两个相邻结构域在空间上不相互干扰时，可以使用更长的接头。接头可以是可切割的或不可切割的。可切割的接头的例子包括2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等效物、及其组合。在一个实施方案中，接头区域是衍生自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的T2A。接头的非限制性例子包括衍生自明脉扁刺蛾β四体病毒的接头和衍生自内部核糖体进入位点(IRES)序列的接头。
在一个实施方案中，如本文所述的CAR还包含报告分子，例如以允许非侵入性成像(例如，正电子发射断层摄影PET扫描)。在包括报告分子的双特异性CAR中，第一细胞外结合结构域和第二细胞外结合结构域可以包括不同或相同的报告分子。在双特异性CAR T细胞中，第一CAR和第二CAR可以表达不同或相同的报告分子。在另一个实施方案中，如本文所述的CAR还包含可以单独成像或与底物或化学物质(例如9-[4-[18F]氟-3-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤([18F]FHBG))组合成像的报告分子(例如潮霉素磷酸转移酶(hph))。在另一个实施方案中，如本文所述的CAR还包含可以使用非侵入性技术容易地成像的纳米颗粒(例如，用64Cu2+官能化的金纳米颗粒(GNP))。例如，在以下文献中综述了用于非侵入性成像的CAR T细胞的标记：Bhatnagar P等人Integr Biol.(Camb).2013年1月；5(1):231-238，以及Keu KV等人Sdci Transl Med.2017年1月18日；9(373)，将所述文献通过引用以其整体并入本文。
GFP和mCherry在本文中被证明为可用于使T细胞(例如，CAR T细胞)上表达的CAR成像的荧光标签。预期基本上本领域已知的任何荧光蛋白都可以用作用于此目的的荧光标签。对于临床应用，CAR不需要包括荧光标签或荧光蛋白。
本发明的另一个方面涉及一种CAR多肽，其包含与选自SEQ ID NO:19、25、31、39、57、64或65的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列，或者由包含与SEQ ID NO:1、7、13或45的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的核苷酸序列的核酸编码。
本发明的另一个方面涉及一种CAR多肽，其包含选自SEQ ID NO:19、25、31、39、57、64或65的序列，或者由包含选自SEQ ID NO:1、7、13或45的核苷酸序列的核酸编码。
本发明的另一个方面涉及一种CAR多肽，其包含与选自SEQ ID NO:19、25、31或39、57、64或65的序列相对应的序列，或者由包含选自SEQ ID NO:1、7、13或45的核苷酸序列的核酸编码。
在一些实施方案中，本文所述的CAR多肽包含全人序列。根据本领域已知的方法产生此类多肽。
本文所述的发明的另一个方面涉及一种多肽复合物，其包含两种或更多种(例如，两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、或十种或更多种)本文所述的任何CAR多肽。在一个实施方案中，多肽复合物包含三种本文所述的任何CAR多肽。
核酸和细胞
在一些实施方案中，本文所述的任何CAR多肽(例如，SEQ ID NO:19、25、31、39、57、64或65的CAR多肽)由病毒载体中包含的多核苷酸编码。任选地，可以将编码如本文所述的CAR多肽的多核苷酸进行密码子优化以增强表达或稳定性。可以根据本领域已知的任何标准方法来进行密码子优化。
逆转录病毒(诸如慢病毒)提供了用于递送编码目的基因或嵌合基因的核酸序列的便利平台。可以使用本领域已知的技术将所选核酸序列插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其例如在体外或离体地递送到细胞中。逆转录病毒系统是本领域熟知的，并且在例如以下文献中有描述：美国专利号5,219,740；Kurth和Bannert(2010)“Retroviruses:Molecular Biology,Genomics and Pathogenesis”Calster Academic Press(ISBN:978-1-90455-55-4)；以及Hu和Pathak PharmacologicalReviews 2000 52:493-512；将所述文献通过引用以其整体并入本文。可以从OriGene(马里兰州罗克维尔(Rockville,MD))购买用于高效递送DNA的慢病毒系统。在替代实施方案中，本文所述的任何CAR的CAR多肽经由转染或电穿孔包含编码CAR的核酸的表达载体而在哺乳动物细胞中表达。转染或电穿孔方法是本领域已知的。
可以使用检测编码CAR的核酸的mRNA、DNA或基因产物的标准测定(诸如RT-PCR、FACS、northern印迹、western印迹、ELISA或免疫组织化学)来评估本文所述的任何CAR多肽的CAR多肽的高效表达。
在一个实施方案中，本文所述的任何CAR多肽的CAR多肽是组成型表达的。在一个实施方案中，本文所述的任何CAR多肽的CAR多肽由重组核酸序列编码。
本发明的另一个方面涉及一种哺乳动物细胞，其包含本文所述的任何CAR多肽；或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸。在一个实施方案中，哺乳动物细胞包含抗体、抗体试剂、其抗原结合部分、或本文所述的任何CAR多肽；或者编码这样的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分、或本文所述的任何CAR多肽的核酸。哺乳动物细胞或组织可以是人、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫源的，但是可以使用任何其他哺乳动物细胞。在任何方面的优选实施方案中，哺乳动物细胞是人的。在一个实施方案中，细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在任何方面的替代实施方案中，细胞是免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫反应中起作用的细胞。免疫细胞是造血起源的，并且包括淋巴细胞，诸如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞；NK细胞；NKT细胞；淋巴细胞，诸如B细胞和T细胞；以及骨髓细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
免疫细胞可以从患有或被诊断为患有癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病或障碍的受试者获得。例如，免疫细胞可以从患有癌症(例如，多发性骨髓瘤、郁积型骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症)的受试者获得。在一些实施方案中，免疫细胞从对抗BCMA疗法有抗性的受试者获得。免疫细胞也可以从同种异体供体获得，所述同种异体供体是与细胞的预期接受者相同的物种的非遗传上相同的个体。
可以用于本发明的免疫细胞(例如，人免疫细胞)包括自体细胞，其是在离体修饰和扩增后从随后将向其给予所述细胞的受试者获得的。例如，免疫细胞可以从患有或被诊断为患有癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病或障碍的个体获得。免疫细胞也可以从同种异体供体获得，所述同种异体供体是与细胞的预期接受者相同的物种的非遗传上相同的个体。可用于本发明的免疫细胞包括T细胞和NK细胞。
获得T细胞和NK的方法是本领域已知的，并且可用于本文所述的工程化免疫细胞。T细胞和NK细胞通常从通过例如静脉穿刺或通过植入口或导管抽取而从受试者收集的外周血获得。任选地，可以通过包括白细胞单采术(其中白细胞从受试者的血液获得而其他血液组分返回受试者)的过程获得血液。使用本领域已知的方法处理血液或白细胞单采术产物(新鲜或冷冻保存的)以富集T细胞或NK细胞。例如，可以进行密度梯度离心(使用例如Ficoll)和/或逆流离心淘析来富集单核细胞(包括T细胞或NK细胞)。在一个例子中，对于T细胞，可以进一步进行采用例如涂覆在磁珠上的CD3/CD28抗体或表达例如细胞表面结合的抗CD3和抗CD28抗体片段的人工抗原呈递细胞(aAPC)(参见下文)的T细胞刺激步骤，以便刺激T细胞并耗尽其他细胞(例如，B细胞)。然后可以对富集的T细胞制剂的T细胞进行基因修饰。
作为外周血的替代物，可以将包括骨髓、淋巴结、脾脏和肿瘤在内的组织用作T细胞和NK细胞的来源。T细胞和NK细胞可以是人、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫源的，但是可以使用任何其他哺乳动物细胞。在任何方面的某些实施方案中，T或NK细胞是人的。
免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以被工程化以包含本文所述的任何CAR多肽(例如，SEQ ID NO:19、25、31、39、57、64或65的CAR多肽)；或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸(例如，编码SEQ ID NO:19、25、31、39、57、64或65的CAR多肽的核酸)。
此外，本发明提供了治疗和预防疾病和病症的组合物和方法，所述疾病和病症包括例如癌症、自身免疫性疾病或障碍、或浆细胞疾病或障碍。这些方法包括使用包括如本文所述的CAR多肽或编码所述CAR的核酸的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)，以及向受试者给予经修饰的免疫细胞以治疗例如癌症。在任何方面的一些实施方案中，在给予受试者之前，刺激和/或激活经修饰的免疫细胞(例如，包括如本文所述的一种或多种另外的修饰的T细胞或NK细胞)。
治疗方法
本发明提供了使用本文所述的CAR多肽治疗癌症(例如，多发性骨髓瘤)、浆细胞障碍或自身免疫性疾病或障碍的组合物和方法。在特定实施方案中，癌症(例如，多发性骨髓瘤、郁积型骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症)表达BCMA和/或TACI。在另外的实施方案中，癌症(例如，多发性骨髓瘤、郁积型骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症)已经降低或消除了BCMA表达。此外，本发明提供了治疗对抗BCMA疗法有抗性的患者的癌症(例如，多发性骨髓瘤、郁积型骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症)的方法。
如本文所用的“癌症”可以是指细胞的过度增殖，所述细胞的独特特征(丧失正常的细胞控制)导致不受调节的生长、缺乏分化、局部组织浸润和转移，并且可以是白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或实体瘤。白血病的非限制性例子包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在一个实施方案中，癌症是ALL或CLL。淋巴瘤的非限制性例子包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、毛细胞白血病(HCL)和华氏巨球蛋白血症。在一个实施方案中，癌症是DLBCL或滤泡性淋巴瘤。实体瘤的非限制性例子包括肾上腺皮质瘤、腺泡状软组织肉瘤、癌、软骨肉瘤、结直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦瘤、上皮样血管内皮瘤、尤因肉瘤(Ewing Sarcoma)、生殖细胞肿瘤(实体瘤)、骨和软组织巨细胞肿瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、肾瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(NRSTS)、骨肉瘤、脊柱旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤或维尔姆斯瘤(Wilms Tumor)。实体瘤可以发现于骨骼、肌肉或器官中，并且可以是肉瘤或癌。预期本文所述的发明的任何方面可以用于治疗所有类型的癌症，包括在本申请中未列出的癌症。如本文所用，术语“肿瘤”是指细胞或组织的(例如，恶性类型或良性类型的)异常生长。
如本文所用，“自身免疫性疾病或障碍”的特征在于人的免疫系统无法在外来细胞与健康细胞之间作出区分。这会导致人的免疫系统靶向人的健康细胞以发生程序性细胞死亡。自身免疫性疾病或障碍的非限制性例子包括炎性关节炎、1型糖尿病、多发性硬化症、银屑病、炎性肠病、SLE和血管炎、过敏性炎症(诸如过敏性哮喘、特应性皮炎和接触性超敏反应)、类风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮、格雷夫斯病(Graves'disease)(甲状腺功能亢进)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)(甲状腺功能低下)、慢性移植物抗宿主病、具有抗凝血因子抗体的血友病、乳糜泻、克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)、原发性胆汁性硬化症/肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、雷诺现象(Raynaud's phenomenon)、硬皮病、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、古德帕斯丘综合征(Goodpasture's syndrome)、韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)、风湿性多肌痛、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、慢性疲劳综合征(CFS)、银屑病、自身免疫性艾迪生病(Addison's Disease)、强直性脊柱炎、急性播散性脑脊髓炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、斜视性眼阵挛-肌阵挛综合征(opsoclonus myoclonus syndrome)、视神经炎、奥德甲状腺炎(Ord's thyroiditis)、天疱疮、恶性贫血、犬多关节炎、莱特尔综合征(Reiter'ssyndrome)、大动脉炎(Takayasu's arteritis)、温抗体型自身免疫性溶血性贫血(warmautoimmune hemolytic anemia)、韦格纳肉芽肿和纤维肌痛(FM)。
在一个实施方案中，针对患有免疫系统障碍的患者获得了哺乳动物细胞，所述免疫系统障碍导致异常低的免疫系统活性或免疫缺陷障碍，这阻碍了人对抗外来细胞(即，病毒或细菌细胞)的能力。
浆细胞是由B淋巴细胞产生的白细胞，所述B淋巴细胞的功能是产生和释放对抗感染所需的抗体。如本文所用，“浆细胞障碍或疾病”的特征在于浆细胞的异常增殖。异常的浆细胞能够“排挤”健康的浆细胞，这导致对抗外来物体(诸如病毒或细菌细胞)的能力降低。浆细胞障碍的非限制性例子包括淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症、骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、郁积型骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤和浆细胞骨髓瘤。
本文所述的发明的一个方面涉及一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、淀粉样变性或自身免疫性疾病或障碍的方法，所述方法包括：将T细胞工程化以在T细胞表面上包含本文所述的任何CAR多肽；向所述受试者给予所述工程化T细胞。
本文所述的发明的另一个方面涉及一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病或障碍的方法，所述方法包括给予细胞，所述细胞包含本文所述的任何CAR多肽或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸。
在一个实施方案中，所述方法还包括例如根据如本文其他地方所述的方法，在向受试者给予细胞之前激活或刺激CAR T细胞。
本文所述的发明提供了治疗受试者的癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者给予包含如本文所述的CAR多肽(例如，SEQ ID NO:19、25、31、39、57、64或65的CAR多肽)和/或能够编码所述CAR的核酸的免疫细胞(例如，T或NK细胞)或其组合物。在一些实施方案中，癌症包含表达B细胞激活因子(BAFF)、B细胞成熟抗原(BCMA)和/或跨膜激活剂和CAML相互作用分子(TACI)的细胞。在一个实施方案中，癌细胞包含肿瘤抗原BAFF+、BCMA+和/或TACI+癌症。在一些实施方案中，受试者对抗BCMA疗法有抗性。在一些实施方案中，癌症包含具有降低的BCMA表达的细胞。在另外的实施方案中，浆细胞障碍是淀粉样变性。在一些实施方案中，自身免疫性障碍是具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症或慢性移植物抗宿主病。
在一个实施方案中，癌症是骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤、郁积型骨髓瘤)或华氏巨球蛋白血症。
此外，本文所述的CAR多肽可以用于治疗或预防受试者的移植排斥的方法。在一些实施方案中，受试者具有高水平的抗HLA抗体。
给予
在一些实施方案中，本文所述的方法涉及用包含本文所述的任何CAR多肽或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸的哺乳动物细胞治疗患有或被诊断为患有癌症、浆细胞疾病或障碍、或自身免疫性疾病或障碍的受试者。如本文所用，“如本文所述的CAR T细胞”是指包含本文所述的任何CAR多肽或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸的哺乳动物细胞。如本文所用，“病症”是指癌症、浆细胞疾病或障碍或自身免疫性疾病或障碍。医生可以使用诊断病症的当前方法来鉴定患有病症的受试者。表征这些病症并有助于诊断的病症症状和/或并发症是本领域熟知的，并且包括但不限于疲劳、持续感染和持续出血。可能有助于诊断例如病症的测试包括但不限于血液筛查和骨髓测试，并且对于给定病症而言是本领域已知的。病症的家族病史或对病症的危险因素的暴露也可以有助于确定受试者是否可能患有病症或有助于做出病症的诊断。
可以将本文所述的组合物给予患有或被诊断为患有病症的受试者。在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者给予有效量的本文所述的激活的CAR T细胞，以便减轻病症的症状。如本文所用，“减轻病症的症状”是改善任何病症或与病症相关的症状。与等效的未经治疗的对照相比，如通过任何标准技术测量的，这种降低为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。用于向受试者给予本文所述的组合物的多种手段是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，全身或局部给予本文所述的组合物。在优选实施方案中，静脉内给予本文所述的组合物。在另一个实施方案中，在肿瘤部位给予本文所述的组合物。
如本文所用的术语“有效量”是指减轻疾病或障碍的至少一种或多种症状所需的激活的CAR T细胞的量，并且涉及足以提供所需效果的细胞制剂或组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指激活的CAR T细胞当给予典型受试者时足以提供特定抗病症效果的量。在各种背景下，如本文所用的有效量还将包括足以延迟疾病症状的发展、改变症状疾病的进程(例如但不限于减慢病症进展)或逆转病症症状的量。因此，指定确切的“有效量”通常不可行。然而，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员仅使用常规实验就可以确定适当的“有效量”。
可以通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中评价有效量、毒性和治疗功效。剂量可以取决于所采用的剂型和所利用的给予途径而变化。在毒性效果与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为比率LD50/ED50。展现出大的治疗指数的组合物和方法是优选的。最初可以从细胞培养测定来估计治疗有效剂量。同样，可以在动物模型中配制剂量，以达到包括如在细胞培养物中或在适当的动物模型中所确定的IC50(即，激活的CAR T细胞的浓度，其实现症状的半最大抑制)在内的循环血浆浓度范围。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。可以通过合适的生物测定(例如，用于骨髓测试的测定等)来监测任何特定剂量的效果。剂量可以由医生确定，并且根据需要进行调整以适合所观察到的治疗效果。
在本发明的一个方面，本文所述的技术涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的激活的CAR T细胞和任选地药学上可接受的载体。药物组合物的活性成分至少包含如本文所述的激活的CAR T细胞。在一些实施方案中，药物组合物的活性成分基本上由如本文所述的激活的CAR T细胞组成。在一些实施方案中，药物组合物的活性成分由如本文所述的激活的CAR T细胞组成。用于基于细胞的治疗配制品的药学上可接受的载体包括盐水和水性缓冲溶液、林格氏溶液和血清组分(诸如血清白蛋白、HDL和LDL)。术语诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。
在一些实施方案中，包含如本文所述的激活的CAR T细胞的药物组合物可以是肠胃外剂型。由于肠胃外剂型的给予通常绕过患者对污染物的天然防御，因此除CAR T细胞本身以外的组分优选地是无菌的或能够在给予患者之前被灭菌。肠胃外剂型的例子包括但不限于准备好用于注射的溶液、准备好用于溶解或悬浮于药学上可接受的注射媒介物中的干燥产品、准备好用于注射的悬浮液、和乳剂。可以将这些中任何一种在给予之前添加到激活的CART细胞制剂中。
可以用于提供如本文所公开的激活的CAR T细胞的肠胃外剂型的合适的媒介物是本领域技术人员熟知的。例子包括但不限于：盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介物，包括但不限于氯化钠注射液、林格注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液和乳酸化林格注射液；可与水混溶的媒介物，诸如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性媒介物，诸如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
剂量
如本文所用的术语“单位剂型”是指用于合适的一次给予的剂量。通过举例的方式，单位剂型可以是置于递送装置(例如，注射器或静脉内滴注袋)中的治疗剂的量。在一个实施方案中，单位剂型以单次给予的方式给予。在另一个实施方案中，可以同时给予超过一种单位剂型。
在一些实施方案中，将本文所述的激活的CAR T细胞作为单一疗法给予，即，不将用于病症的另一种治疗并行地给予受试者。
包含本文所述的T细胞的药物组合物通常可以按104至109个细胞/kg体重、在一些情形下105至106个细胞/kg体重(包括在那些范围内的所有整数值)的剂量给予。如果需要，也可以按这些剂量多次给予T细胞组合物。细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来给予(参见例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在某些方面，可能需要向受试者给予激活的CAR T细胞，然后随后重新抽血(或进行单采术)，激活如本文所述的从其获得的T细胞，并且向患者再输注这些激活和扩增的T细胞。可以将此过程每几周进行多次。在某些方面，可以从10cc至400cc的抽血中激活T细胞。在某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中激活T细胞。
给予方式可以包括例如静脉内(i.v.)注射或输注。可以将本文所述的组合物经动脉地、瘤内地、节内地或髓内地给予患者。在一些实施方案中，可以将T细胞的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。在一个实施方案中，将本文所述的组合物给予到体腔或体液(例如，腹水、胸膜液、腹膜液或脑脊液)中。
在特定的示例性方面，受试者可以经历白细胞单采术，其中将白细胞离体收集、富集或耗尽，以选择和/或分离目的细胞，例如T细胞。这些T细胞分离物可以通过与如本文所述的aAPC(例如，表达如本文所述的抗CD28和抗CD3 CDR的aAPC)接触而扩增，并且被处理使得可以引入本发明的一种或多种CAR构建体，由此产生CAR T细胞。有需要的受试者随后可以经历高剂量化学疗法的标准治疗，随后经历外周血干细胞移植。在移植之后或与之并行，受试者可以接受扩增的CAR T细胞的输注。在一个实施方案中，在手术之前或之后给予扩增的细胞。
在一些实施方案中，在给予如本文所述的一种或多种CAR T细胞之前，对受试者进行淋巴细胞清除。在此类实施方案中，淋巴细胞清除可以包括给予美法仑、癌得星(Cytoxan)、环磷酰胺和氟达拉滨中的一种或多种。
将要给予患者的上述治疗的剂量将随所治疗病症的确切性质和治疗接受者而变化。可以根据本领域接受的实践来进行用于人类给予的剂量的缩放。
在一些实施方案中，需要单一治疗方案。在其他实施方案中，可以进行一种或多种后续剂量或治疗方案的给予。例如，在每两周治疗三个月之后，可以每月重复一次治疗，持续六个月或一年或更长时间。在一些实施方案中，在初始治疗后不给予另外的治疗。
如本文所述的组合物的剂量可以由医生确定，并且根据需要进行调整以适合所观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医师通常监视受试者以便确定何时治疗提供治疗益处，并且确定是给予另外的细胞、中止治疗、恢复治疗还是对治疗方案进行其他改变。剂量不应太大而引起不良副作用，诸如细胞因子释放综合征。通常，剂量将随患者的年龄、病症和性别而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在有任何并发症的情况下，剂量也可以由个体医生进行调整。
组合疗法
本文所述的激活的CAR T细胞可以与其他已知的药剂和疗法组合使用。在一个实施方案中，还向受试者给予抗BCMA疗法。在一个实施方案中，受试者对抗BCMA疗法有抗性。如本文所用，“组合”给予意指在受试者受障碍折磨的过程期间向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者已经被诊断患有障碍之后和在障碍已经被治愈或根除或出于其他原因治疗已经停止之前递送所述两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当开始第二种治疗的递送时，一种治疗的递送仍在发生，因此在给予方面存在重叠。在本文中有时将这称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方案中，由于组合给予，治疗更有效。例如，与如果在不存在第一种治疗的情况下给予第二种治疗所看到的情况相比，第二种治疗更有效，例如，用更少的第二种治疗看到等效的效果，或者第二种治疗以更大的程度减轻症状，或者用第一种治疗的情况下看到类似的情形。在一些实施方案中，递送使得与障碍有关的症状或其他参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减少。所述两种治疗的效果可以是部分累加的、完全累加的或大于累加的。递送可以使得当递送第二种治疗时仍然可检测到所递送的第一种治疗的效果。本文所述的激活的CAR T细胞和所述至少一种另外的治疗剂可以同时(在相同或分开的组合物中)或依次给予。对于依次给予，可以首先给予本文所述的表达CAR的细胞，其次可以给予另外的药剂，或者可以颠倒给予顺序。可以在障碍活跃期期间或在疾病缓解期或较不活跃期期间给予CAR T疗法和/或其他治疗剂、程序或模式。可以在另一种治疗之前、与所述治疗并行、治疗后或在障碍缓解期间给予CAR T疗法。
当组合给予时，可以将激活的CAR T细胞和另外的药剂(例如，第二种或第三种药剂)或全部以比每种药剂例如作为单一疗法单独使用的量或剂量更高、更低或与之相同的量或剂量给予。在某些实施方案中，激活的CAR T细胞、另外的药剂(例如，第二种或第三种药剂)或全部的给予量或剂量比每种药剂单独使用的量或剂量更低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方案中，激活的CAR T细胞、另外的药剂(例如，第二种或第三种药剂)或全部导致所需效果(例如，癌症的治疗)的量或剂量比达到相同治功效果单独需要的每种药剂的量或剂量更低(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在另外的实施方案中，本文所述的激活的CAR T细胞可以与以下组合用于治疗方案中：手术、化学疗法、放射、mTOR途径抑制剂、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体、或其他免疫消融剂(诸如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法)、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子或肽疫苗(诸如在Izumoto等人2008 J Neurosurg 108:963-971中所描述的肽疫苗)。
在一个实施方案中，本文所述的激活的CAR T细胞可以与检查点抑制剂组合使用。示例性检查点抑制剂包括抗PD-1抑制剂(纳武单抗、MK-3475、派姆单抗、匹利珠单抗(Pidilizumab)、AMP-224、AMP-514)、抗CTLA4抑制剂(伊匹单抗和曲美目单抗(Tremelimumab))、抗PDL1抑制剂(阿特珠单抗、阿维单抗(Avelomab)、MSB0010718C、MEDI4736和MPDL3280A)和抗TIM3抑制剂。
在一个实施方案中，本文所述的激活的CAR T细胞可以与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环类药物(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))；长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)；烷化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪(decarbazine)、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)；免疫细胞抗体(例如，阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)；抗代谢药(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))；mTOR抑制剂；TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂；蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)；免疫调节剂，诸如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺)。考虑用于在组合疗法中使用的普通化学治疗剂包括阿那曲唑
Figure BDA0002667249210000571
比卡鲁胺
Figure BDA0002667249210000572
硫酸博来霉素
Figure BDA0002667249210000573
白消安
Figure BDA0002667249210000574
白消安注射液
Figure BDA0002667249210000575
卡培他滨
Figure BDA0002667249210000576
N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0002667249210000577
卡莫司汀
Figure BDA0002667249210000578
苯丁酸氮芥
Figure BDA0002667249210000579
顺铂
Figure BDA00026672492100005710
克拉屈滨
Figure BDA00026672492100005711
环磷酰胺(
Figure BDA00026672492100005712
或
Figure BDA00026672492100005713
)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)
Figure BDA00026672492100005714
阿糖胞苷脂质体注射液
Figure BDA00026672492100005715
达卡巴嗪
Figure BDA00026672492100005716
更生霉素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA0002667249210000581
柠檬酸柔红霉素脂质体注射液
Figure BDA0002667249210000582
地塞米松、多西他赛
Figure BDA0002667249210000583
盐酸多柔比星
Figure BDA0002667249210000584
依托泊苷
Figure BDA0002667249210000585
磷酸氟达拉滨
Figure BDA0002667249210000586
5-氟尿嘧啶
Figure BDA0002667249210000587
氟他胺
Figure BDA0002667249210000588
替扎西他滨(tezacitibine)、吉西他滨(二氟脱氧胞苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲
Figure BDA0002667249210000589
伊达比星
Figure BDA00026672492100005810
异环磷酰胺
Figure BDA00026672492100005811
伊立替康
Figure BDA00026672492100005812
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00026672492100005813
亚叶酸钙、美法仑
Figure BDA00026672492100005814
6-巯基嘌呤
Figure BDA00026672492100005815
甲氨蝶呤
Figure BDA00026672492100005816
米托蒽醌
Figure BDA00026672492100005817
麦罗塔(mylotarg)、紫杉醇
Figure BDA00026672492100005818
phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生20和卡莫司汀植入物
Figure BDA00026672492100005819
柠檬酸他莫昔芬
Figure BDA00026672492100005820
替尼泊苷
Figure BDA00026672492100005821
6-硫代鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明
Figure BDA00026672492100005822
注射用盐酸拓扑替康
Figure BDA00026672492100005823
长春碱
Figure BDA00026672492100005824
长春新碱
Figure BDA00026672492100005825
和长春瑞滨
Figure BDA00026672492100005826
示例性烷化剂包括但不限于氮芥(nitrogen mustard)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：乌拉莫司汀(Aminouracil
Figure BDA00026672492100005827
Figure BDA00026672492100005828
Uracilnitrogen
Figure BDA00026672492100005829
)、氮芥(chlormethine)
Figure BDA00026672492100005830
环磷酰胺(
Figure BDA00026672492100005831
Figure BDA00026672492100005832
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure BDA00026672492100005833
美法仑
Figure BDA00026672492100005834
苯丁酸氮芥
Figure BDA00026672492100005835
哌泊溴烷
Figure BDA00026672492100005836
曲他胺
Figure BDA00026672492100005837
三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺
Figure BDA00026672492100005838
噻替派
Figure BDA00026672492100005839
白消安
Figure BDA00026672492100005840
卡莫司汀
Figure BDA00026672492100005841
洛莫司汀
Figure BDA00026672492100005842
链脲菌素
Figure BDA00026672492100005843
和达卡巴嗪
Figure BDA00026672492100005844
另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂
Figure BDA00026672492100005845
替莫唑胺(
Figure BDA00026672492100005846
和
Figure BDA00026672492100005847
)；更生霉素(也称为放射菌素D，
Figure BDA00026672492100005848
)；美法仑(也称为L-PAM、L-沙可来新和苯丙氨酸氮芥，
Figure BDA00026672492100005849
)；六甲蜜胺(也称为六甲三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00026672492100005850
)；卡莫司汀
Figure BDA00026672492100005851
苯达莫司汀
Figure BDA00026672492100005852
白消安(
Figure BDA00026672492100005853
和
Figure BDA00026672492100005854
)；卡铂
Figure BDA00026672492100005855
洛莫司汀(也称为CCNU，
Figure BDA00026672492100005856
)；顺铂(也称为CDDP，
Figure BDA00026672492100005857
和
Figure BDA00026672492100005858
-AQ)；苯丁酸氮芥
Figure BDA00026672492100005859
环磷酰胺(
Figure BDA00026672492100005860
和
Figure BDA00026672492100005861
)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑羧酰胺，
Figure BDA0002667249210000591
)；六甲蜜胺(也称为六甲三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA0002667249210000592
)；异环磷酰胺
Figure BDA0002667249210000593
泼尼氮芥(Prednumustine)；丙卡巴肼
Figure BDA0002667249210000594
氮芥(Mechlorethamine)(也称为氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和盐酸氮芥(mechloroethaminehydrochloride)，
Figure BDA0002667249210000595
)；链脲菌素
Figure BDA0002667249210000596
噻替派(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA，
Figure BDA0002667249210000597
)；环磷酰胺
Figure BDA0002667249210000598
Figure BDA0002667249210000599
和苯达莫司汀HC1
Figure BDA00026672492100005910
示例性mTOR抑制剂包括例如坦罗莫司(temsirolimus)；地磷莫司(ridaforolimus)(以前称为deferolimus，(lR,2R,45)-4-[(2R)-2
[(1R,95,125,15R,16E,18R,19R,21R,235,24E,26E,28Z,305,325,35R)-l,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-l l,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04'9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并且描述于PCT公开号WO 03/064383中)；依维莫司(
Figure BDA00026672492100005911
或RADOOl)；雷帕霉素(AY22989，
Figure BDA00026672492100005912
)；simapimod(塞马莫德)(CAS 164301-51-3)；emsirolimus、(5-{2,4-双[(35,)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-(i]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[iraw5,-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-JJ嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS1013101-36-4)；以及N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-a-天冬氨酰基-L-丝氨酸-,内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)、和XL765。示例性免疫调节剂包括例如阿托珠单抗(afutuzumab)(可从
Figure BDA00026672492100005913
获得)；培非格司亭
Figure BDA00026672492100005914
来那度胺(CC-5013，
Figure BDA00026672492100005915
)；沙利度胺
Figure BDA00026672492100005916
actimid(CC4047)；以及IRX-2(人细胞因子的混合物，包括白细胞介素1、白细胞介素2和干扰素γ，CAS 951209-71-5，可从IRX Therapeutics获得)。示例性蒽环类药物包括例如多柔比星(
Figure BDA00026672492100005917
和
Figure BDA00026672492100005918
)；博来霉素
Figure BDA00026672492100005919
柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸红比霉素，
Figure BDA00026672492100005920
)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质，
Figure BDA00026672492100005921
)；米托蒽醌(DHAD，
Figure BDA00026672492100005922
)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(
Figure BDA00026672492100005923
Idamycin
Figure BDA00026672492100005924
)；丝裂霉素C
Figure BDA00026672492100005925
格尔德霉素；除莠霉素；拉维霉素(ravidomycin)；和去乙酰基拉维霉素。示例性长春花生物碱包括例如酒石酸长春瑞滨
Figure BDA0002667249210000601
长春新碱
Figure BDA0002667249210000602
和长春地辛
Figure BDA0002667249210000603
长春碱(又称为硫酸长春碱、长春花碱和VLB，
Figure BDA0002667249210000604
和
Figure BDA0002667249210000605
)；和长春瑞滨
Figure BDA0002667249210000606
示例性蛋白体抑制剂包括硼替佐米
Figure BDA0002667249210000607
卡非佐米(carfilzomib)(PX-171-007，(5)-4-甲基-N-((5)-l-(((5)-4-甲基-l-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-l-氧代戊-2-基)氨基)-l-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((5,)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；马里佐米(marizomib)(NPT0052)；枸橼酸艾沙佐米(ixazomib citrate)(MLN-9708)；地兰佐米(delanzomib)(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
本领域技术人员可以容易地鉴定使用的化学治疗剂(例如参见，Physicians'Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014,Edward Chu,Vincent T.DeVita Jr.,Jones&Bartlett Learning；Principles of Cancer Therapy,第85章Harrison's Principles ofInternal Medicine,第18版；Therapeutic Targeting of Cancer Cells:Era ofMolecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology,第28-29章Abeloff’sClinical Oncology,2013 Elsevier；以及Fischer D S(编辑):The Cancer ChemotherapyHandbook,第4版St.Louis,Mosby-Year Book,2003)。
在一个实施方案中，将本文所述的激活的CAR T细胞与降低靶向GITR和/或调节GITR功能的分子的活性和/或水平的分子、减少Treg细胞群的分子、mTOR抑制剂、GITR激动剂、激酶抑制剂、非受体酪氨酸激酶抑制剂、CDK4抑制剂和/或BTK抑制剂组合给予受试者。
功效
熟练的临床医师可以确定激活的CAR T细胞在例如治疗本文所述的病症或诱导如本文所述的反应(例如癌细胞减少)方面的功效。然而，如果本文所述病症的一种或多种体征或症状以有益的方式发生改变，其他临床接受的症状得到改进，或甚至得到改善，或者在根据本文所述方法治疗后所需反应被诱导了例如至少10％，则治疗被视为如本文所用的术语“有效治疗”。可以例如通过测量根据本文所述方法所治疗的病症的标记、指标、症状和/或发生率、或者任何其他适当的可测量参数来评估功效。根据本文所述方法的治疗可以将病症的标记或症状的水平降低例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
功效还可以通过个体没有如通过住院所评估的恶化或没有对医疗干预的需要(即疾病进展停止)来测量。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中有描述。
治疗包括对个体或动物(一些非限制性例子包括人或动物)的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如防止症状(例如疼痛或炎症)恶化；或(2)缓解疾病的严重性，例如导致症状消退。治疗疾病的有效量意指当给予有需要的受试者时足以导致对所述疾病的有效治疗(如所述术语在本文中所定义)的量。可以通过评估病症或所需反应的物理指标来确定药剂的功效。通过测量此类参数中的任何一个或参数的任何组合来监测给予和/或治疗的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。可以在本文所述病症(例如ALL的治疗)的动物模型中评估给定方法的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标记的统计学上显著的变化时，就证明了治疗的功效。
在整个本申请中所引用的所有专利和其他出版物(包括参考文献、已发布的专利、已公开的专利申请和共同未决的专利申请)出于描述和公开例如将在此类出版物中所描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法的目的明确地通过引用并入本文。提供这些出版物仅仅是因为它们的公开在本申请的提交日期之前。在这方面的任何内容都不应当被解释为承认诸位发明人无权凭借在先发明或出于任何其他原因而先于这种公开。关于日期的所有陈述或关于这些文件内容的表述均基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
对本公开文本的实施方案的描述并非旨在是详尽的或将本公开文本限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明目的描述了本公开文本的具体实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开文本的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但是替代实施方案可以按不同的顺序执行功能，或者功能可以基本上并行执行。本文提供的本公开文本的传授可以酌情应用于其他程序或方法中。本文所述的各种实施方案可以组合以提供另外的实施方案。如果需要，可以修改本公开文本的各方面以采用上述参考文献和申请的组成、功能和概念来提供本公开文本的又另外的实施方案。此外，由于生物学功能等效性考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或量的情况下对蛋白质结构进行一些改变。根据具体实施方式，可以对本公开文本进行这些和其他改变。所有此类修改均旨在被包括在所附权利要求的范围内。
可以将任何前述实施方案的特定要素组合或替代为其他实施方案中的要素。此外，尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开文本的某些实施方案相关的优点，但是其他实施方案也可以展现出此类优点，并且并非所有实施方案都需要展现出此类优点以落入本公开文本的范围内。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，所述实施例决不应当被解释为进一步限制。
可以根据以下任何编号的段落来限定本文所述的技术的一些实施方案：
1.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含：
a)两个或更多个细胞外结构域，所述细胞外结构域各自包含肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体或其一部分；
b)跨膜结构域；和
c)细胞内信号传导结构域。
2.根据段落1所述的CAR多肽，其中所述跨膜结构域包含铰链/跨膜结构域。
3.根据段落1或2所述的CAR多肽，其还包含一个或多个共刺激结构域。
4.根据段落1-3中任一项所述的CAR多肽，其中所述TNF超家族受体配体是增殖诱导配体(APRIL)。
5.根据段落1-3中任一项所述的CAR多肽，其中所述TNF超家族受体配体是TNF-α、淋巴毒素β、OX40配体(OX40L)、CD154、Fas配体(FasL)、LIGHT、TNF样配体1A(TL1A)、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体(4-1BBL)、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、核因子κB受体激活剂配体(RANKL)、TNF相关弱凋亡诱导剂(TWEAK)、B细胞激活因子(BAFF)、钙调节配体(CAMLG)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3(NT-3)、神经营养蛋白4(NT-4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(TNFR)相关蛋白(GITR)配体或外异蛋白A2(EDA-A2)。
6.根据段落1-5中任一项所述的CAR多肽，其中所述两个或更多个细胞外结构域各自包含相同TNF超家族受体配体的一部分。
7.根据段落1-5中任一项所述的CAR多肽，其中所述细胞外结构域中的至少两个各自包含不同TNF超家族受体配体的一部分。
8.根据段落1-7中任一项所述的CAR多肽，其中所述两个或更多个细胞外结构域通过一个或多个接头序列彼此连接。
9.根据段落8所述的CAR多肽，其中每个接头序列包含与SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据段落8或9所述的CAR多肽，其中每个接头序列包含SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列。
11.根据段落1-10中任一项所述的CAR多肽，其还包含前导序列。
12.根据段落11所述的CAR多肽，其中所述前导序列是CD8前导序列。
13.根据段落12所述的CAR多肽，其中所述CD8前导序列包含SEQ IDNO:20、26或32的序列。
14.根据段落4和6-13中任一项所述的CAR多肽，其中APRIL的所述部分不包含APRIL的富赖氨酸区域。
15.根据段落4和6-14中任一项所述的CAR多肽，其中APRIL的所述部分不包含弗林蛋白酶切割位点。
16.根据段落4和6-15中任一项所述的CAR多肽，其中APRIL的所述部分包含SEQ IDNO:21、27、33或40的序列。
17.根据段落1-16中任一项所述的CAR多肽，其中所述铰链和跨膜结构域包含CD28、CD8或4-1BB的铰链和跨膜结构域。
18.根据段落17所述的CAR多肽，其中所述CD8铰链和跨膜结构域包含SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列。
19.根据段落17所述的CAR多肽，其中所述4-1BB铰链和跨膜结构域包含SEQ IDNO:28或34的氨基酸序列。
20.根据段落1-19中任一项所述的CAR多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ、CD3ε或CD3θ的细胞内信号传导结构域。
21.根据段落20所述的CAR多肽，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:24、30或44的氨基酸序列。
22.根据段落20所述的CAR多肽，其中所述CD3θ细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列。
23.根据段落1-22中任一项所述的CAR多肽，其中所述共刺激结构域包含4-1BB、CD28、CD27、ICOS或OX40的细胞内结构域。
24.根据段落1-23中任一项所述的CAR多肽，其中所述共刺激结构域是4-1BB的细胞内结构域。
25.根据段落24所述的CAR多肽，其中4-1BB的所述细胞内结构域包含SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列。
26.根据段落1-25中任一项所述的CAR多肽，其中所述CAR多肽包含三个细胞外结构域，所述细胞外结构域各自包含TNF超家族受体配体的一部分。
27.一种CAR多肽，其与SEQ ID NO:39、57、64或65的序列具有至少95％序列同一性，或者由与SEQ ID NO:45的序列具有至少95％序列同一性的序列编码。
28.一种CAR多肽，其包含SEQ ID NO:39、57、64或65的序列，或者由SEQ ID NO:45的序列编码。
29.一种CAR多肽，其包含与SEQ ID NO:39、57、64或65的序列相对应的序列，或者由SEQ ID NO:45的序列编码。
30.一种多肽复合物，其包含两种或更多种根据段落1-29中任一项所述的CAR多肽。
31.根据段落30所述的多肽复合物，其中所述多肽复合物包含三种根据段落1-29中任一项所述的CAR多肽。
32.一种哺乳动物细胞，其包含：
a)根据段落1-29中任一项所述的CAR多肽；
b)编码根据段落1-29中任一项所述的CAR多肽的核酸；或
c)根据段落30或31所述的多肽复合物。
33.根据段落32所述的细胞，其中所述细胞是T或自然杀伤(NK)细胞。
34.根据段落32或33所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
35.根据段落32-34中任一项所述的细胞，其中所述细胞从患有或被诊断为患有癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病或障碍的个体获得。
36.一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、淀粉样变性、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥的方法，所述方法包括：
a)将T细胞工程化以在T细胞表面上包含根据段落1-29中任一项所述的CAR；以及
b)向所述受试者给予所述工程化T细胞。
37.一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥的方法，所述方法包括向所述受试者给予根据段落32-35中任一项所述的细胞。
38.根据段落36或37所述的方法，其中所述癌症是BAFF+、B细胞成熟抗原(BCMA)+和/或跨膜激活剂和钙调节配体(CAML)相互作用分子(TACI)+。
39.根据段落36-38中任一项所述的方法，其中还向所述受试者给予抗BCMA疗法。
40.根据段落36-39中任一项所述的方法，其中所述受试者对抗BCMA疗法有抗性。
41.根据段落36-40中任一项所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤、郁积型骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症。
42.根据段落36-41中任一项所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。
43.根据段落36-42中任一项所述的方法，其中所述受试者具有高水平的抗人白细胞抗原(HLA)抗体。
44.一种被配制用于治疗癌症的组合物，其包含根据段落1-29中任一项所述的CAR多肽、根据段落30或31所述的多肽复合物或根据段落32-35中任一项所述的细胞。
45.根据段落44所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
46.一种治疗对抗BCMA疗法有抗性的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含CAR和/或编码所述CAR的多核苷酸，其中所述CAR包含含有两个或更多个APRIL结构域的细胞外靶标结合结构域。
47.根据段落46所述的方法，其中所述受试者患有癌症、浆细胞障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥。
48.根据段落47所述的方法，其中所述癌症包含表达BCMA和/或TACI的细胞。
49.根据段落47或48所述的方法，其中所述癌症包含具有降低的BCMA表达的细胞。
50.根据段落47-49中任一项所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症。
51.根据段落47-50中任一项所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤或郁积型骨髓瘤。
52.根据段落47所述的方法，其中所述浆细胞障碍是淀粉样变性。
53.根据段落47所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或障碍选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。
54.根据段落47所述的方法，其中所述受试者具有高水平的抗HLA抗体。
55.根据段落46-54中任一项所述的方法，其中所述CAR包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
56.根据段落46-55中任一项所述的方法，其中所述CAR还包含一个或多个共刺激结构域。
57.根据段落55或56所述的方法，其中所述跨膜结构域包含铰链/跨膜结构域。
58.根据段落57所述的方法，其中所述铰链/跨膜结构域包含免疫球蛋白样蛋白、CD28、CD8或4-1BB的铰链/跨膜结构域。
59.根据段落57或58所述的方法，其中所述铰链/跨膜结构域包含CD8的铰链/跨膜结构域，其任选地包含SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列。
60.根据段落57或58所述的方法，其中所述铰链/跨膜结构域包含4-1BB的铰链/跨膜结构域，其任选地包含SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列。
61.根据段落55-60中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3δ、CD3ε、CD3η、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞内信号传导结构域。
62.根据段落61所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含SEQ ID NO:24、30或44的氨基酸序列。
63.根据段落61所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3θ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
64.根据段落56-63中任一项所述的方法，其中所述共刺激结构域包含4-1BB、CD27、CD28或OX40的共刺激结构域。
65.根据段落64所述的方法，其中所述共刺激结构域包含4-1BB的共刺激结构域，其任选地包含SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列。
66.根据段落46-65中任一项所述的方法，其中每个APRIL结构域包含与SEQ IDNO:21、27、33或40的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
67.根据段落66所述的方法，其中每个APRIL结构域包含SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列。
68.根据段落46-67中任一项所述的方法，其中所述APRIL结构域通过一个或多个接头序列彼此连接。
69.根据段落68所述的方法，其中所述接头序列包含与SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
70.根据段落68或69所述的方法，其中所述接头序列包含SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列。
71.根据段落46-70中任一项所述的方法，其中所述细胞外靶标结合结构域包含三个APRIL结构域。
72.根据段落46-71中任一项所述的方法，其中所述细胞外靶标结合结构域包含与SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
73.根据段落46-72中任一项所述的方法，其中所述细胞外靶标结合结构域包含SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列。
74.根据段落46-73中任一项所述的方法，其中所述CAR包含与SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
75.根据段落46-74中任一项所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列。
76.根据段落46-75中任一项所述的方法，其中编码所述CAR的所述多核苷酸还包含自杀基因。
77.根据段落46-76中任一项所述的方法，其中编码所述CAR的所述多核苷酸还包含编码信号序列的序列。
78.根据段落46-77中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T或NK细胞。
79.根据段落46-78中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是人细胞。
80.一种CAR，其包含含有三个APRIL结构域的细胞外靶标结合结构域。
81.根据段落80所述的CAR，其中所述CAR包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
82.根据段落81所述的CAR，其中所述CAR还包含一个或多个共刺激结构域。
83.根据段落81或82所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含铰链/跨膜结构域。
84.根据段落83所述的CAR，其中所述铰链/跨膜结构域包含免疫球蛋白样蛋白、CD28、CD8或4-1BB的铰链/跨膜结构域。
85.根据段落83或84所述的CAR，其中所述铰链/跨膜结构域包含CD8的铰链/跨膜结构域，其任选地包含SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列。
86.根据段落83或84所述的CAR，其中所述铰链/跨膜结构域包含4-1BB的铰链/跨膜结构域，其任选地包含SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列。
87.根据段落81-86中任一项所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3δ、CD3ε、CD3η、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞内信号传导结构域。
88.根据段落87所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含SEQ ID NO:24、30或44的氨基酸序列。
89.根据段落87所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3θ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
90.根据段落82-89中任一项所述的CAR，其中所述共刺激结构域包含4-1BB、CD27、CD28或OX40的共刺激结构域。
91.根据段落90所述的CAR，其中所述共刺激结构域包含4-1BB的共刺激结构域，其任选地包含SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列。
92.根据段落80-91中任一项所述的CAR，其中每个APRIL结构域包含与SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
93.根据段落92所述的CAR，其中每个APRIL结构域包含SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列。
94.根据段落80-93中任一项所述的CAR，其中所述APRIL结构域通过一个或多个接头序列彼此连接。
95.根据段落94所述的CAR，其中所述接头序列包含与SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
96.根据段落94或95所述的CAR，其中所述接头序列包含SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列。
97.根据段落80-96中任一项所述的CAR，其中所述细胞外靶标结合结构域包含与SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
98.根据段落80-97中任一项所述的CAR，其中所述细胞外靶标结合结构域包含SEQID NO:56或59的氨基酸序列。
99.根据段落80-98中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含与SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
100.根据段落80-99中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列。
101.一种CAR，其包含与SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
102.一种CAR，其包含SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列。
103.一种多核苷酸，其编码根据段落80-102中任一项所述的CAR。
104.根据段落103所述的多核苷酸，其还包含自杀基因。
105.根据段落103或104所述的多核苷酸，其还包含编码信号序列的序列。
106.一种免疫细胞，其包含根据段落80-102中任一项所述的CAR和/或根据段落103-105中任一项所述的多核苷酸。
107.根据段落106所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T或NK细胞。
108.根据段落106或107所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是人细胞。
109.一种药物组合物，其包含根据段落80-102中任一项所述的CAR、根据段落103-105中任一项所述的多核苷酸和/或根据段落106-108中任一项所述的免疫细胞。
110.一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥的方法，所述方法包括向所述受试者给予根据段落106-108中任一项所述的免疫细胞和/或根据段落109所述的药物组合物。
111.根据段落110所述的方法，其中所述癌症包含表达BCMA和/或TACI的细胞。
112.根据段落110或111所述的方法，其中所述癌症包含具有降低的BCMA表达的细胞。
113.根据段落110-112中任一项所述的方法，其中所述受试者对抗BCMA疗法有抗性。
114.根据段落110-113中任一项所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症。
115.根据段落114所述的方法，其中所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤或郁积型骨髓瘤。
116.根据段落110所述的方法，其中所述浆细胞障碍是淀粉样变性。
117.根据段落110所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或障碍选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。
118.根据段落110所述的方法，其中所述受试者具有高水平的抗HLA抗体。
可以根据以下任何另外的编号的段落来限定本文所述的技术的仍其他实施方案：
1.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含：
a)一个或多个细胞外结构域，所述细胞外结构域包含肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体的一部分；
b)铰链和跨膜结构域；
c)共刺激结构域；和
d)细胞内信号传导结构域。
2.根据段落1所述的CAR多肽，其中所述TNF超家族受体配体是增殖诱导配体(APRIL)。
3.根据段落1所述的CAR多肽，其中所述TNF超家族受体配体是TNF-α、淋巴毒素β、OX40L、CD154、FasL、LIGHT、TL1A、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、BAFF、CAMLG、LIGHT、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体、TL1A或EDA-A2。
4.根据段落1-3中任一项所述的CAR多肽，其还包含CD8前导序列。
5.根据段落4所述的CAR多肽，其中所述CD8前导序列包含选自SEQ ID NO:20、26或32的序列。
6.根据段落2、4或5中任一项所述的CAR多肽，其中APRIL的所述部分不包含APRIL的富赖氨酸区域。
7.根据段落2或4-6中任一项所述的CAR多肽，其中APRIL的所述部分包含选自SEQID NO:21、27或33的序列。
8.根据段落1-7中任一项所述的CAR多肽，其中所述铰链和跨膜结构域包含CD8或4-1BB的铰链和跨膜结构域。
9.根据段落1-8中任一项所述的CAR多肽，其中所述CD8铰链和跨膜结构域序列包含SEQ ID NO:22的序列。
10.根据段落1-9中任一项所述的CAR多肽，其中所述4-1BB铰链和跨膜结构域序列包含选自SEQ ID NO:28或34的序列。
11.根据段落1-10中任一项所述的CAR多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ、CD3ε或CD3θ的信号传导结构域。
12.根据段落1-11中任一项所述的CAR多肽，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域序列包含选自SEQ ID NO:24或30的序列。
13.根据段落1-12中任一项所述的CAR多肽，其中所述CD3θ细胞内信号传导结构域序列包含SEQ ID NO:36的序列。
14.根据段落1-13中任一项所述的CAR，其中所述共刺激结构域是选自4-1BB ICD、CD28 ICD、CD27 ICD、ICOS ICD和OX40 ICD的细胞内结构域。
15.根据段落1-14中任一项所述的CAR多肽，其中所述共刺激结构域是4-1BB的细胞内结构域。
16.根据段落15所述的CAR多肽，其中4-1BB序列的所述细胞内结构域包含选自SEQID NO:23、29或35的序列。
17.根据段落1-16中任一项所述的CAR多肽，其中所述CAR多肽包含两个或更多个细胞外结构域，所述细胞外结构域包含TNF超家族受体配体的一部分。
18.根据段落17所述的CAR多肽，其中所述CAR多肽包含三个细胞外结构域，所述细胞外结构域包含TNF超家族受体配体的一部分。
19.一种CAR多肽，其与选自SEQ ID NO:19、25或31的序列具有至少95％同一性，或者由与选自SEQ ID NO:1、7或13的序列具有至少95％同一性的序列编码。
20.一种CAR多肽，其包含选自SEQ ID NO:19、25或31的序列，或者由选自SEQ IDNO:1、7或13的序列编码。
21.一种CAR多肽，其包含与选自SEQ ID NO:19、25或31的序列相对应的序列，或者由选自SEQ ID NO:1、7或13的序列编码。
22.一种多肽复合物，其包含两种或更多种根据段落1-21中任一项所述的CAR多肽。
23.根据段落22所述的多肽复合物，其中所述多肽复合物包含三种根据段落1-21中任一项所述的CAR多肽。
24.一种哺乳动物细胞，其包含：
a)根据段落1-21中任一项所述的CAR多肽；
b)编码根据段落1-21中任一项所述的CAR多肽的核酸；或
c)根据段落22或23所述的多肽复合物。
25.根据段落24所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
26.根据段落24或25所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
27.根据段落24-26中任一项所述的细胞，其中所述细胞从患有或被诊断为患有癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病的个体获得。
28.一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、淀粉样变性或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：
a)将T细胞工程化以在T细胞表面上包含根据段落1-21中任一项所述的CAR；
b)向所述受试者给予所述工程化T细胞。
29.一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给予根据段落24-27中任一项所述的细胞。
30.根据段落28或29所述的方法，其中所述癌症是BAFF+、BCMA+和/或TACI+。
31.根据段落28-30中任一项所述的方法，其中还向所述受试者给予抗BCMA疗法。
32.根据段落28-31中任一项所述的方法，其中所述受试者对抗BCMA疗法有抗性。
33.根据段落28-32中任一项所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤或郁积型骨髓瘤。
34.根据段落28-32中任一项所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。
35.一种被配制用于治疗癌症的组合物，其包含根据段落1-21中任一项所述的CAR多肽、根据段落22或23所述的多肽复合物或根据段落24-27中任一项所述的细胞。
36.根据段落35所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
实施例
下文是本发明的方法和组合物的实施例。应理解，根据本文提供的描述可以实施各种其他实施方案。
实施例1.基于APRIL的嵌合抗原受体(CAR)的设计
本文描述了嵌合抗原受体，其是基于与CD8或4-1BB的跨膜结构域和T细胞激活受体CD3ζ、CD3η或CD3θ的信号传导结构域融合的APRIL(增殖诱导配体)的细胞外结构域。这些CAR可以克服对抗BCMA靶向疗法的抗性，并且利用二聚化和三聚化跨膜结构域实现最佳功能。这些CAR被考虑用于治疗癌症(例如，多发性骨髓瘤)、浆细胞障碍和/或严重的自身免疫性疾病。
诸位发明人考虑了，BCMA的天然配体可以用于工程化抗原结合部分以产生抗骨髓瘤CAR T细胞。比较了基于scFv和基于天然配体(APRIL)的CART细胞在表达BCMA、TACI和/或BAFF受体的骨髓瘤细胞系中的细胞毒性活性、抗原特异性增殖和细胞因子产生。
BCMA是一种以低亲和力结合BAFF而以高亲和力结合APRIL的小的III型跨膜蛋白；BCMA信号传导保护骨髓瘤细胞免于凋亡。
BCMA具有两个紧密的家族成员：TACI和BAFF受体。TACI在相似的B细胞发育水平和阶段表达，然而BAFF受体在B细胞发育的较早阶段表达，并且与APRIL相比以更高的亲和力结合BAFF。BCMA和TACI的细胞内结构域均与TRAF相互作用，并且可能在促进浆细胞存活方面具有多余的功能。鉴于BCMA的表位结合区域较小，专门针对BCMA产生的抗体和scFv与TACI交叉反应的可能性与相反的情况相比较小。实际上，文献表明临床环境中没有抗BCMA产物(抗体、scFv或双特异性T细胞接合剂)与BAFF受体或TACI发生交叉反应。
设计具有新颖特异性的CAR T细胞的最大挑战之一是确定靶标的脱肿瘤表达。令人鼓舞的是，抗BCMA产物在各种临床环境中被认为是安全的，没有证据表明存在脱肿瘤反应性。针对BCMA的CAR T细胞产物已与细胞因子释放综合征相关。然而，来自TCGA、ENCODE、BLUEPRINT和GTEX的可公开获得的数据表明BCMA和TACI的表达谱对于经由CAR T细胞靶向似乎是安全的(数据未显示)；除浆细胞和B细胞以外，这两种分子均未被健康的成体组织表达，并且两种分子在多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞性白血病中均以高水平表达。此外，鉴于有关接受抗CD19指导的CAR T细胞的患有急性成淋巴细胞性白血病的患者中抗原逃逸变体的新兴数据，开发结合具有相似表达谱和信号传导冗余的两种抗原的重新定向的T细胞可以提供避免逃逸变体的机制。
存在三种推定的方式产生一种设计成与两种抗原反应的CAR。(1)产生与两种靶标交叉反应的scFv。这种策略的危险在于，混杂的scFv也可能具有脱肿瘤反应性，这在临床前环境中可能难以预测。(2)产生由具有两种不同特异性的scFv串联构成的CAR。例如，正在针对CD19和CD22以及针对CD19和CD20追求这种策略。然而，必须凭经验确定两个scFv之间的最佳间隔，并且形成交叉反应性双抗体-scFv也可能导致脱靶结合。这种方法是可行的，但是具有挑战性且昂贵，尤其是因为必须独立地产生和测试scFv，然后将其组合。(3)开发与两种受体结合的高亲和力配体，并且将其融合到嵌合抗原受体的其余组分(跨膜和信号传导结构域)上。在这种情况下，诸位发明人意识到利用使用APRIL的第三种方法(图1)的独特机会。
关于使用APRIL作为CAR T细胞的细胞外结合结构域存在四个潜在问题：(1)APRIL自然形成同三聚体，然而基于scFv的CAR被认为进行同源二聚化。尚不清楚APRIL同二聚体是否结合BCMA/TACI，或者如果它们形成三聚体CAR是否可以发出信号。值得注意的是，4-1BB也自然形成三聚体，而包括4-1BB共刺激结构域的CAR构建体却具有很高的活性，这表明在将TNF相关蛋白同源二聚化和同源三聚化之间发挥功能的灵活性。经由使用可溶性BCMA和TACI的流式细胞术以及经由针对表达BCMA和TACI的靶细胞的细胞毒性测定，轻松地在体外测试与BCMA/TACI合适地结合的活性CAR的形成。(2)APRIL还与跟多配体聚糖家族的蛋白聚糖(包括CD138，多配体聚糖1)相关的硫酸乙酰肝素链结合，所述硫酸乙酰肝素链可能比TACI和BCMA表达更弥散；因此，存在脱肿瘤活性的可能性增加。具体地，APRIL与硫酸乙酰肝素链的结合是经由其N末端的富赖氨酸区域发生，然而TNF样区域与BCMA和TACI受体相互作用。在骨髓瘤细胞中，与CD138的结合可以充当APRIL与TACI结合的共受体。由于APRIL CAR与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖分子的假定结合之间的距离，因此预期这种相互作用将不会导致细胞毒性，但是可以在表达CD138而无TACI或BCMA的细胞系中系统地测试这一预测。另外，可以产生缺少N末端富赖氨酸区域以避免与硫酸乙酰肝素链结合的APRIL形式。(3)存在推定的APRIL受体，其尚未得到确认，但是被假设在上皮组织中表达；这种相互作用将需要对针对上皮细胞的APRIL-CAR指导的活性进行测试和建模。(4)天然的APRIL序列从其内源性跨膜结构域上切割下来，并且可以促进骨髓瘤细胞的存活信号；因此，建议仅将APRIL的N末端结构域(远离切割位点)锚定至CAR的跨膜和细胞内结构域，以便避免APRIL从CAR T细胞脱落。
实验设计
本文描述了在我们的CAR骨架的背景下，基于鼠类和噬菌体展示衍生的抗BCMA构建体的公开序列，测试一小组对BCMA具特异性的scFv序列。另外，表征了基于APRIL的CAR，其仅利用与BCMA和TACI结合的APRIL结构域的最细胞外部分。还描述了消除与硫酸乙酰肝素链结合的富赖氨酸区域的APRIL的N末端截短形式。接下来，在用生物素化的可溶性BCMA-Ig和TACI-Ig(可商购获得的)染色之后，将具有两种基于scFv和两种基于APRIL的CAR的慢病毒载体用于经由流式细胞术测试原代T细胞的CAR表达。最后，通过从T细胞培养物中收集上清液并经由ELISA测量可溶性APRIL，验证了基于APRIL的CAR不会分泌或切割APRIL作为可溶性蛋白。
经由慢病毒转导将基于K562细胞的靶细胞系工程化以单独和组合表达BAFF受体、BCMA和TACI。将表达CD138(多配体聚糖1)的K562细胞工程化以测试基于APRIL的CAR与这种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。这些细胞系提供了靶标和抗原呈递细胞，在其中测试抗BCMA scFv-CAR和APRIL-CAR裂解表达BCMA和TACI的靶标并进行抗原特异性增殖的能力。在存在和不存在肝素(其消除APRIL与硫酸乙酰肝素之间的结合)的情况下，测试了带有CD138的靶标对APRIL-CAR介导的结合和毒性的敏感性。通过将效应细胞与靶细胞以各种(E:T)比率共培养来测量特异性裂解；还对靶细胞进行了基因修饰以表达萤光素酶，使得可以通过测量光发射来定量活的靶细胞。
还通过使用可溶性BCMA和可溶性TACI作为将要通过流式细胞术评价的CAR T细胞的染色试剂来测量与CAR结合的交叉反应性。测试了抗BCMA scFv-CAR T细胞和APRIL-CART细胞的响应于呈递BCMA、TACI或两者的靶标以抗原特异性方式增殖的能力。通过稀释荧光染料CFSE并在抗原刺激后一到两周的过程中对T细胞计数来测量增殖。
最后，通过标准流式细胞术检查来自患有多发性骨髓瘤的患者的原代人浆细胞中的BCMA、TACI和BAFF受体的表达。MGH骨髓瘤组具有来自多发性骨髓瘤患者的骨髓标本的生物库，从其中可以检查未鉴定的样品。可以定量来自30名具有可测量浆细胞负荷的患者的浆细胞中BCMA、TACI和BAFF-R的水平。在可行的情况下，将抗BCMA和基于APRIL的CAR T细胞与活的原代骨髓瘤浆细胞共培养；评价共培养物中的骨髓瘤细胞的存活力和CAR T细胞的增殖。另外，可以检查已接受基于scFv的抗BCMA CAR T细胞的患者的骨髓浆细胞中BCMA和TACI表达的水平。在这种情况下，可以定量在我们站点接受治疗的患者的基线骨髓样品和在治疗后1-3个月或在复发时收集的骨髓样品中的BCMA和TACI表达。
预期基于scFv和基于APRIL的CAR转导的原代T细胞响应于表达BCMA的靶细胞发挥细胞毒性活性并增殖，所述表达BCMA的靶细胞是K562转导的细胞系、骨髓瘤细胞系(诸如U266和RPMI-8226)或原代患者骨髓瘤细胞。相比之下，仅基于APRIL的CAR对仅表达TACI的细胞系发挥细胞毒性作用。基于APRIL的CAR结合TACI和BCMA两者的可溶形式，然而基于scFv的抗BCMA CAR仅结合可溶性BCMA。
预期未经转导的T细胞和CD19-CAR转导的T细胞不会响应于表达BCMA的靶细胞或多发性骨髓瘤细胞系显示出细胞毒性活性；将这些细胞用作阴性对照。预期基于APRIL的CAR不将可溶性APRIL分泌到培养基中；如果如通过上清液的ELISA或Luminex分析所测量，发生了可检测的分泌，则可以将CAR重新设计成替代形式(基于在TACI与BCMA之间具有交叉反应性的scFv)，或包括APRIL细胞外远端(C末端)部分的较少氨基酸结构域，以进一步消除可能的切割位点。预期基于APRIL和基于scFv的抗BCMA CAR产生相似水平的细胞因子产生，并且响应于表达BCMA的靶标相似地增殖，但是预期仅基于APRIL的CAR响应于表达TACI的靶标产生IFNγ和IL-2。
由于结合位点之间的距离，在不存在TACI或BCMA的情况下，预期基于APRIL的CAR不介导表达CD138的靶标的细胞溶解；将对已显示在体外和在体内消除骨髓瘤细胞系的基于scFv的抗CD138 CAR进行比较。然而，如果在基于APRIL的CAR的情况下未观察到CD138定向的细胞毒性，则可以通过添加肝素以消除这种相互作用来验证硫酸乙酰肝素的机制。本文还描述了APRIL的N末端截短形式，以便消除富赖氨酸区域，但是仅维持TNF样区域作为CAR的细胞外结合结构域。如果关于基于APRIL的CAR对硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或上皮组织的潜在毒性还有任何剩余的问题，可以针对原代培养的角质形成细胞和在我们的皮肤移植体内模型中测试细胞毒性。在此模型中，为免疫缺陷型小鼠移植上人皮肤(来自整形手术或包皮环切术的丢弃组织)并使其愈合。从活组织检查或移植物切除术中对CAR T细胞的皮肤毒性进行组织病理学监测；皮肤毒性表现为淋巴细胞浸润，伴有表皮/真皮连接处破坏和角质形成细胞凋亡，这是移植物抗宿主病的特殊病征标志。如果仍然担心基于APRIL的CAR T细胞的潜在上皮毒性，则可以在此模型中评价基于APRIL的CAR的安全性。
在从多发性骨髓瘤患者获得的骨髓样品中，预期确认浆细胞中TACI和BCMA的高表达水平、和较低水平的BAFF受体，如通过流式细胞仪和适当的对照所确定(荧光减一)。
实施例2.通过双重抗原靶向限制多发性骨髓瘤中的抗原逃逸
尽管最近在治疗方面有优势，但多发性骨髓瘤仍然是不可治愈的疾病。针对B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR T细胞的几个最新临床试验已导致临床反应，包括多发性骨髓瘤患者的完全缓解。然而，已经在一些患者中描述了由于BCMA的抗原丢失而导致的治疗失败。跨膜激活剂和钙调节剂和亲环素配体相互作用分子(TACI)被认为对BCMA在维持浆细胞存活方面具有多余作用，并且在多发性骨髓瘤细胞中也高度表达。在本文所描述的工作中，将BCMA和TACI的天然配体APRIL用作CAR结合部分。所述方法通过双重靶向多发性骨髓瘤中的多种表面抗原来防止由于抗原逃逸而导致的疾病复发(图3)。
材料和方法
CAR构建体是用带有均与4-1BB和CD3ζ融合的不同的铰链和跨膜结构域(CD8或4-1BB)的基于scFv的抗BCMA CAR和基于APRIL的CAR产生的(图2)。用抗BCMA-CAR或基于APRIL的CAR对人原代T细胞进行慢病毒转导。在多发性骨髓瘤的异种移植模型中，在体外针对一组具有不同BCMA和TACI表达水平的细胞系和在体内评价了细胞毒性、增殖和细胞因子产生。
结果
对于基于APRIL的CAR，看到响应于BCMA+或TACI+靶细胞的激活增加。抗BCMA-CAR仅响应于BCMA+靶细胞而被激活。BCMA和APRIL-CD8铰链/跨膜CAR两者均显示出抗原特异性细胞毒性。有趣的是，与抗BCMA-CAR相比，发现APRIL-CD8铰链/跨膜CAR的细胞因子产生水平较低。此观察结果可能反映出使用APRIL或scFv作为CAR结合部分之间的结合亲和力的差异。在APRIL-CAR中将铰链/跨膜结构域改变为4-1BB会导致细胞毒性降低和有限的细胞因子产生。正在进行的使用异种移植模型的研究已表明，在用抗BCMA-CAR或APRIL-CD8铰链/跨膜CAR治疗的一些小鼠中肿瘤完全缓解。
讨论
本文描述了基于天然配体APRIL的CAR的设计，所述CAR能够识别BCMA和TACI两者以便限制多发性骨髓瘤中的潜在抗原逃逸。包含CD8铰链和跨膜区对APRIL CAR功能是最佳的。尽管APRIL CAR对肿瘤细胞具有细胞毒性功效，但看到较低水平的效应细胞因子产生。这是一个重要的发现，因为CAR T细胞疗法可能导致细胞因子释放综合征。
实施例3.表达基于APRIL的CAR的T细胞
将人T细胞在第0天用CD3/28珠刺激，并且用编码APRIL-CD8TM-4-1BBz CAR表达的APRIL-CD8TM-4-1BBζCAR或BCMA-CD8TM-4-1BBζCAR的慢病毒载体转导。从第0天开始对细胞计数，并且将其生长绘制为群体倍增(图4)。通过mCherry(报告子)阳性来测量转导效率(图5A-5B)。
将CAR转导的T细胞与已经转导以表达萤光素酶的靶标BCMA+TACI+多发性细胞(RMPI-8226)一起孵育18小时。以指定的效应子:靶标比率计算靶细胞的特异性裂解(图6)。
在表达NFAT启动子后的萤光素酶的Jurkat细胞系中测试了CAR介导的T细胞激活(图7)。
实施例4.APRIL CAR T细胞的体外功效
在多发性骨髓瘤细胞系中测量了BCMA和TACI的表面表达(图8)，并且将RPMI8226工程化以表达各种水平的BCMA(图9)。将TACI转导到RPMI-BCMA KO中。
设计并证明了许多APRIL和BCMA CAR构建体有效地转导T细胞(图10)。在用表达BCMA的细胞刺激后，表达CAR的T细胞扩增(图11)。表达APRIL-CAR的T细胞表现出对表达BCMA和TACI的细胞的特异性杀伤(图12)，并且激活具有类似的特异性(图13)。
响应于用RPMI8226亲本刺激，BCMA和APRIL CAR脱粒(图14)。图15中描绘了APRILCAR的细胞因子谱。
实施例5.APRIL CAR核酸序列
pMGH71(APRIL-CD8 CAR)–APRIL/CD8TM/4-1BB/CD3ζ(SEQ ID NO:1)包含：CD8前导序列(核苷酸1-63(SEQ ID NO:2))；APRIL序列(核苷酸64-471(SEQ ID NO:3))；CD8铰链和TM序列(核苷酸472-678(SEQ ID NO:4))；4-1BB ICD序列(核苷酸679-804(SEQ ID NO:5))；以及CD3ζ序列(核苷酸805-1140(SEQ ID NO:6))。
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(SEQ ID NO:1)
CD8前导序列(SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:1的核苷酸1-63))
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC(SEQID NO:2)
APRIL序列SEQ ID NO:3(SEQ ID NO:1的核苷酸64-471)
CACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTG(SEQ ID NO:3)
CD8铰链和TM序列(SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:1的核苷酸472-678))
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT(SEQ ID NO:4)
4-1BB ICD序列(SEQ ID NO:5(SEQ ID NO:1的核苷酸679-804))
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG(SEQ ID NO:5)
CD3ζ序列(SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:1的核苷酸805-1140))
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(SEQ ID NO:6)
pMGH76(APRIL-4-1BB CAR)–APRIL/4-1BBTM/4-1BB/CD3ζ(SEQ ID NO:7)包含CD8前导序列(核苷酸1-63(SEQ ID NO:8))；APRIL序列(核苷酸64-471(SEQ ID NO:9))；4-1BB铰链和TM序列(核苷酸472-633(SEQ ID NO:10))；4-1BB ICD序列(核苷酸634-759(SEQ IDNO:11))；CD3ζ序列(核苷酸760-1095(SEQ ID NO:12))。
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTGCCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(SEQ ID NO:7)
CD8前导序列(SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:7的核苷酸1-63))
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC(SEQID NO:8)
APRIL序列(SEQ ID NO:9(SEQ ID NO:7的核苷酸64-471))
CACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTG(SEQ ID NO:9)
4-1BB铰链和TM序列(SEQ ID NO:10(SEQ ID NO:7的核苷酸472-633))
CCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTT(SEQ ID NO:10)
4-1BB ICD序列(SEQ ID NO:11(SEQ ID NO:7的核苷酸634-759))
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG(SEQ ID NO:11)
CD3ζ序列(SEQ ID NO:12(SEQ ID NO:7的核苷酸760-1095))
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(SEQ ID NO:12)
pMGH77(APRIL-4-1BBθCAR)–APRIL/4-1BBTM/4-1BB/CD3θ(SEQ ID NO:13)包含CD8前导序列(核苷酸1-63(SEQ ID NO:14))；APRIL序列(核苷酸64-471(SEQ ID NO:15))；4-1BB铰链和TM序列(核苷酸472-633(SEQ ID NO:16))；4-1BB ICD序列(核苷酸634-759(SEQID NO:17))；CD3θ序列(核苷酸760-1200)(SEQ ID NO:18))。
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTGCCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGACAGCCACTTCCAAGCAGTTCCAGTACAGGAAAAGAAAAAAAGGCTCAGAAGGGCACCGTGGCGTGCATTCGCCCAGCCCCAGAGGTTAAAGCACCGAAACAATGAACTACCTGACTCCCTAGAGCCCATATATAAAAACATTTGGAACAAAACATTTATAGGAGAG(SEQ IDNO:13)
CD8前导序列(SEQ ID NO:14(SEQ ID NO:13的核苷酸1-63))
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC(SEQID NO:14)
APRIL序列(SEQ ID NO:15(SEQ ID NO:13的核苷酸64-471))
CACTCTGTCCTGCACCTGGTTCCCATTAACGCCACCTCCAAGGATGACTCCGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCAGCTCTTAGGCGTGGGAGAGGCCTACAGGCCCAAGGATATGGTGTCCGAATCCAGGATGCTGGAGTTTATCTGCTGTATAGCCAGGTCCTGTTTCAAGACGTGACTTTCACCATGGGTCAGGTGGTGTCTCGAGAAGGCCAAGGAAGGCAGGAGACTCTATTCCGATGTATAAGAAGTATGCCCTCCCACCCGGACCGGGCCTACAACAGCTGCTATAGCGCAGGTGTCTTCCATTTACACCAAGGGGATATTCTGAGTGTCATAATTCCCCGGGCAAGGGCGAAACTTAACCTCTCTCCACATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTG(SEQ ID NO:15)
4-1BB铰链和TM序列(SEQ ID NO:16(SEQ ID NO:13的核苷酸472-633))
CCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTT(SEQ ID NO:16)
4-1BB ICD序列(SEQ ID NO:17(SEQ ID NO:13的核苷酸634-759))
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG(SEQ ID NO:17)
CD3θ序列(SEQ ID NO:18(SEQ ID NO:13的核苷酸760-1200))
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGACAGCCACTTCCAAGCAGTTCCAGTACAGGAAAAGAAAAAAAGGCTCAGAAGGGCACCGTGGCGTGCATTCGCCCAGCCCCAGAGGTTAAAGCACCGAAACAATGAACTACCTGACTCCCTAGAGCCCATATATAAAAACATTTGGAACAAAACATTTATAGGAGAG(SEQ IDNO:18)
实施例6.APRIL CAR氨基酸序列
在一个实施方案中，如本文其他地方所述，特定残基参与结合BCMA/TACI，即：APRIL的D132、T175、D205、R206、R231。那些残基的位置在下面以粗体描绘。
pMGH71(APRIL-CD8 CAR)-CD8前导序列/APRIL/CD8铰链+TM/4-1BB/CD3z(SEQ IDNO:19)包含CD8前导序列(氨基酸1-21(SEQ ID NO:20))；APRIL序列(氨基酸22-157(SEQ IDNO:21))；CD8铰链和TM序列(氨基酸158-226(SEQ ID NO:22))；4-1BB ICD序列(氨基酸227-268(SEQ ID NO:23))；CD3ζ序列(氨基酸269-380)(SEQ ID NO:24))。
Figure BDA0002667249210000861
CD8前导序列(SEQ ID NO:20(SEQ ID NO:19的氨基酸1-21))
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:20)
APRIL序列(SEQ ID NO:21(SEQ ID NO:19的氨基酸22-157))
Figure BDA0002667249210000871
CD8铰链和TM序列(SEQ ID NO:22(SEQ ID NO:19的氨基酸158-226))
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:22)
4-1BB ICD序列(SEQ ID NO:23(SEQ ID NO:19的氨基酸227-268))
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:23)
CD3ζ序列(SEQ ID NO:24(SEQ ID NO:19的氨基酸269-380))
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:24)
pMGH76(APRIL-4-1BB CAR)-CD8前导序列/APRIL/4-1BB铰链+TM/4-1BB/CD3z(SEQID NO:25)包含CD8前导序列(氨基酸1-21(SEQ ID NO:26))；APRIL序列(氨基酸22-157(SEQID NO:27))；4-1BB铰链和TM序列(氨基酸158-211(SEQ ID NO:28))；4-1BB ICD序列(氨基酸212-253(SEQ ID NO:29))；CD3ζ序列(氨基酸254-365(SEQ ID NO:30))。
Figure BDA0002667249210000872
CD8前导序列(SEQ ID NO:26(SEQ ID NO:25的氨基酸1-21))
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:26)
APRIL序列(SEQ ID NO:27(SEQ ID NO:25的氨基酸22-157))
Figure BDA0002667249210000881
4-1BB铰链和TM序列(SEQ ID NO:28(SEQ ID NO:25的氨基酸158-211))
PSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV(SEQ ID NO:28)
4-1BB ICD序列(SEQ ID NO:29(SEQ ID NO:25的氨基酸212-253))
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:29)
CD3ζ序列(SEQ ID NO:30(SEQ ID NO:25的氨基酸254-365)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:30)
pMGH77(APRIL-4-1BBθCAR)-CD8前导序列/APRIL/4-1BB铰链+TM/4-1BB/CD3θ(SEQID NO:31)包含CD8前导序列(氨基酸1-21(SEQ ID NO:32))；APRIL序列(氨基酸22-157(SEQID NO:33))；4-1BB铰链和TM序列(氨基酸158-211(SEQ ID NO:34))；4-1BB ICD序列(氨基酸212-253(SEQ ID NO:35))；CD3θ序列(氨基酸254-400)(SEQ ID NO:36))。
Figure BDA0002667249210000882
Figure BDA0002667249210000891
CD8前导序列(SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:31的氨基酸1-21))
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:32)
APRIL序列(SEQ ID NO:33(SEQ ID NO:31的氨基酸22-157))
Figure BDA0002667249210000892
4-1BB铰链和TM序列(SEQ ID NO:34(SEQ ID NO:31的氨基酸158-211))
PSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV(SEQ ID NO:34)
4-1BB ICD序列(SEQ ID NO:35(SEQ ID NO:31的氨基酸212-253))
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:35)
CD3θ序列(SEQ ID NO:36(SEQ ID NO:31的氨基酸254-400))
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQDSHFQAVPVQEKKKRLRRAPWRAFAQPQRLKHRNNELPDSLEPIYKNIWNKTFIGE(SEQ ID NO:36)
实施例7.配体寡聚化以增强靶向多聚体抗原的CAR
在这项研究中描述的工作中，将天然寡聚化(例如，同源三聚化)用于开发基于配体的CAR，其对表达其同源受体的细胞具有增加的活性。已知细胞表面受体的某些配体(包括TNF超家族的配体)寡聚化(例如，三聚化)以结合它们的同源受体。例如，如上所述，已知人骨髓瘤表达两种可以被靶向有效抗肿瘤抗原的表面抗原：BCMA和TACI。BCMI和TACI共有一种共同的配体APRIL，其是以纳摩尔亲和力与TACI和BCMA结合的一种紧凑的自身形成的三聚体。
设计并构建了同三聚体APRIL CAR构建体(图16)。此构建体在本文中被称为“TriPRIL CAR”，并且包括通过接头连接的三个串联APRIL多肽、CD8铰链/跨膜结构域(CD8TM)、4-1BB细胞内结构域(4-1BB)和CD3ζ细胞内结构域(CD3ζ)。此构建体与启动子(例如，EF1α启动子)可操作地连接。
评价了TriPRIL CAR构建体向原代人T细胞的转导效率(图17)。大约22.6％的细胞为mCherry阳性，相比之下未经转导的对照为大约0.46％。因此，可以将TriPRIL CAR构建体转导到原代人T细胞中。表达TriPRIL CAR的T细胞表现出对表达BCMA和TACI的细胞的特异性杀伤(图18)。因此，TriPRIL CAR是用于治疗表达BCMA、TACI和/或BAFF受体的肿瘤(例如，骨髓瘤)的有用治疗剂。
使用其他自身寡聚化配体(例如，TNF超家族配体(例如，TNF-α、淋巴毒素β、OX40L、CD154、FasL、LIGHT、TL1A、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、BAFF、CAMLG、LIGHT、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体、TL1A或EDA-A2))的类似CAR构建体可以用于靶向杀伤表达同源受体的不需要的细胞(例如，肿瘤细胞)。
实施例8.用于多发性骨髓瘤的基于APRIL的CAR T细胞
BCMA和TACI代表了用于治疗例如多发性骨髓瘤的有希望的靶标，因为BCMA和TACI在几乎所有恶性浆细胞中均表达。如在多发性骨髓瘤患者的浆细胞上所确定的BCMA和TACI表达示于图19中(n＝25)。
如本文所述，将包括通过短肽接头融合在一起的截短的APRIL的三种单体的CAR(称为TriPRIL CAR)设计成同时靶向BCMA和TACI。
为此，将人T细胞用CD3/CD28涂覆的dyna珠激活，并且进行慢病毒转导(MOI＝5，n＝3)以表达BCMA CAR(pMGH8，图10)、APRIL-CD8 CAR(pMGH71，图10)、APRIL-4-1BB CAR(pMGH76，图10)或TriPRIL CAR(pMGH71b，图16)。如图20所示，基于mCherry表达确定了CART细胞的转导效率。
实施例9.基于APRIL的CAR T细胞的脱粒和激活
确定了靶细胞系RMPI8226、MM.1S、K562-BCMA和K562-TACI的BCMA和TACI表达(图21)。在体外CD69激活测定中测量了CAR T细胞的激活(图22A和22B)。评估了BCMA CAR、APRIL-CD8 CAR、APRIL-4-1BB CAR和TriPRIL CAR T细胞。将来自相同供体的UTD和CAR T细胞与MM.1S、RPMI8226、K562-BCMA和K562-TACI靶细胞一起孵育12小时。将PMA刺激和培养基分别用作阳性和阴性对照。基于在UTD和CAR T细胞上CD69表达的百分比来测量激活(n＝3)。
实施例10.基于APRIL的CAR T细胞在体外的杀伤和细胞因子产生
进行了体外杀伤测定，其中将来自同一供体的UTD和CAR T细胞与RPMI8226、MM.1S、K562-BCMA和K562-TACI靶细胞(全部为CBG-GFP)以不同比率一起孵育16小时。基于生物发光测量使用以下等式计算特异性裂解：％特异性裂解＝100x(lum自然死亡–lum测试)/lum自然死亡；其中lum＝发光。从一式三份样品中计算出平均值和标准偏差。UTD、BCMA CAR、APRIL-CD8 CAR和APRIL-4-1BB CAR T细胞的杀伤示于图23中。类似地，UTD、BCMA CAR、APRIL-CD8 CAR和TriPRIL CAR T细胞对MM.1S、K562-BCMA和K562-TACI靶细胞的杀伤示于图24中。
实施例11.APRILCAR T细胞的体内效力
为NOD scidγ(NSG)小鼠植入5 x 106个表达萤光素酶的MM.1S细胞。在肿瘤注射后7天，将小鼠根据肿瘤负荷随机化，并且使其接受5 x 106个UTD、BCMA-CAR、APRIL-CD8或APRIL-4-1BB CAR T细胞(n＝5-9只/组)(图25A)。在CAR注射后第1、3、6.5和21天接受UTD、BCMA-CAR、APRIL-CD8或APRIL-4-1BB CAR T细胞的小鼠的生物发光图像示于图25B中，并且小鼠体内肿瘤负荷随时间的定量示于图25C中。在注射CAR或UTD后6.5天使用TrueCount珠定量血液中CD3+/mCherry阳性细胞的绝对数量(n＝4-9只/组)，如图25D所示。
实施例12.材料和方法
原代患者浆细胞的流式细胞术
对来自被诊断为多发性骨髓瘤的患者的29份骨抽取物样品进行了另外的BCMA和TACI的染色，这些染色被送至临床流式细胞术实验室；另外的染色是在IRB批准的方案下进行的。基于前向和侧向散射(对于CD45而言是模糊的，并且对于CD138和CD38而言是阳性的)对浆细胞进行门控。
CAR构建体设计
所有CAR均基于公开序列在氨基酸水平上进行分子设计，并且使用Geneious软件进行密码子优化供哺乳动物表达。合成核苷酸序列，并且将其在人EF-1α启动子的调节下克隆到第三代自灭活慢病毒载体转移质粒中。载体还含有编码荧光报告子mCherry的第二转基因，以促进转导效率的计算。使用标准方案产生慢病毒载体。
原代人T细胞培养和CAR T细胞制造
在IND批准的方案下从匿名健康供体白细胞单采术样品(leukopak)(购自MGH血库)中纯化原代人T细胞(Stem Cell Technologies，目录#15061)，并且将其冷冻保存。对于扩增和后续测定，将T细胞解冻，并且以0.5-2x106/ml的细胞浓度在RPMI培养基(10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素(P/S)、补充有20 IU/ml rhIL-2)中培养。用抗CD3/CD28Dynabeads(Life Technologies)以1:3的比率激活人T细胞，并且对于CAR T细胞生产，在24小时后以5-10的感染复数添加慢病毒载体。在培养的第10-14天，通过在冷冻保存之前添加入供体匹配的激活的未经转导的T细胞(UTD)来测量并归一化CAR的表达。对于体外和体内实验，解冻之后立即使用CAR T细胞。
细胞系和培养条件
MM.1S、RPMI8226、K562、Jurkat和NK-92细胞购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。通过以下方式产生MM.1S BCMA KO细胞：首先用编码Cas9的慢病毒载体转导MM.1S细胞，然后用来自Brunello文库的指导RNA进行电穿孔(Doench等人,Nat.Biotechnol.34(2):184-19(2016))以及抗生素选择。用慢病毒载体稳定地转导K562细胞以表达BCMA(K562-BCMA)或TACI(K562-TACI)。具有CD3ζKO的Jurkat细胞被转导以稳定地表达我们的目的CAR。在必要的情况下，将细胞系进行修饰以组成型表达叩甲(click beetle)绿色萤光素酶(CBG-luc)。为了获得修饰后的纯细胞群，将表达所需表型的细胞在FACSAria(BD)上进行分选。将含有10％FBS、1％P/S的RPMI培养基(K562、Jurkat和NK-92细胞)或含有20％FBS、1％P/S的RPMI培养基(MM.1S、RPMI8226)用于细胞系的繁殖。
流式细胞术
所使用的抗体：人BCMA-PE(克隆19F2，Biolegend)、人CD3-BUV395(克隆UCHT1，BD)、人CD3-FITC(克隆SK7，BD)、人CD4-AF647、人CD4-BV510(克隆SK3，BD)、人CD4-BV786(克隆SK3，BD)、人CD8-AF647、人CD8-APC H7(克隆SK1，BD)、人CD8-BUV395(克隆RPA-T8，BD)、人/小鼠CD11b-APC(克隆M1/70，Biolegend)、人CD69-APC(克隆FN50，Biolegend)、人CD107a-AF700(克隆H4A3，BD)、小鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)-APC(克隆RB6-8C5，Biolegend)、小鼠NK-1.1-APC(克隆PK136，Biolegend)、人TACI-PE(克隆1A1，Biolegend)、人TACI-APC(克隆1A1，Biolegend)、小鼠TER-119/红系细胞-APC(克隆TER-119，Biolegend)。所使用的活/死染色：DAPI(Thermo Fisher Scientific，目录#PI62247)、Aqua(Thermo FisherScientific，目录#L34965)。将细胞在黑暗中于4℃下染色30分钟，在PBS+2％FBS中洗涤两次，并且在Fortessa X-20(BD)上获取。
为了测量CAR结合亲和力，根据制造商的方案使用
Figure BDA0002667249210000931
APC抗体和蛋白质标记大小(Innova Biosciences，目录#SKU:705-0010)将可溶性(s)BCMA和sTACI与APC缀合。将细胞在PBS+4％牛血清白蛋白中洗涤，并且与指定量的APC缀合的sBCMA和sTACI在黑暗中于4℃下一起孵育45分钟。在将细胞洗涤三次之后，测量平均荧光强度(MFI)。
分别在与靶细胞以1:1的比率共培养5 h(在布雷菲德菌素A和CD107a抗体的存在下)或过夜之后分析T细胞的脱粒和激活。随后，分别针对CD3、CD4和CD8或者CD3、CD4、CD8和CD69表达对细胞进行染色。根据制造商的方案使用TrucountTM管(BD，目录#340334)对所治疗小鼠的外周血中的CAR T细胞的持久性进行定量。针对人CD3、人/小鼠CD11b、小鼠Ly-6G/Ly-6C、小鼠NK-1.1和小鼠TER-119表达对细胞进行染色。
另外的试剂
所使用的另外的试剂包括重组人APRIL(Peprotech，目录#310-10C)、重组人BCMA(Peprotech，目录#310-16)、重组人IL-2(Peprotech，目录#200-02)、重组人TACI(Peprotech，目录#310-17)、细胞裂解溶液10x浓缩液(目录#349202，BD)、含有PMA/离子霉素的细胞刺激混合物(500x)(eBioscience，目录#00-4970-93)和含有布雷菲德菌素A的蛋白质转运抑制剂(GlogiPlug BD，目录#555029)。
细胞的细胞毒性、全细胞因子分析(bulk cytokine analysis)和单细胞32重IsoCode芯片蛋白组学
对于细胞毒性测定，将归一化的CAR T细胞与表达CBG-luc的靶细胞以指定比率共培养8小时(MM.1S、RPMI8226)或过夜(K562-BCMA、K562-TACI)。根据制造商的方案使用萤光素酶测定系统(Promega，目录#E1501)，并且在Synergy Neo2发光酶标仪(Biotek)上测量萤光素酶活性。将所有样品在技术上一式三份地进行测量。使用以下公式计算特异性裂解的百分比：％特异性裂解＝(总的RLU/仅靶细胞的RLU)x 100(RLU：相对发光单位)。
使用多重Luminex阵列(Luminex Corp.，FLEXMAP 3D)对来自1:1比率的指定效应子和靶细胞的过夜共培养物的无细胞上清液进行全细胞因子分析。
对于单细胞32重IsoCode芯片蛋白组学，使用抗CD4或抗CD8微珠(Miltenyi)分离CD4+和CD8+T细胞亚组，然后以1:1:1的比率用K562-BCMA和K562-TACI细胞刺激20小时。将被相同地刺激的未经转导的T细胞用作阴性对照。通过使用抗CD235a缀合的磁珠，通过耗尽K562细胞，进一步富集了共培养的CD4+或CD8+T细胞。将CAR T细胞在室温下针对CD4和CD8表达染色10分钟，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗一次，并且以1x 106/mL的密度重新悬浮于完全RPMI培养基中。将大约30μl细胞悬浮液加载到IsoCode芯片中，并且在37℃、5％CO2下再孵育16小时。通过32重抗体条码化的芯片捕获了来自约1000个单T细胞的蛋白质分泌物，并且通过IsoSpeak软件分析了五个功能组中的多功能谱：
效应子：颗粒酶B、TNFα、IFN-γ、MIP1α、穿孔素、TNFβ；
刺激性：GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-21；
趋化性：CCL11、IP-10、MIP-1β、RNATES；
调节性：IL-4、IL-10、IL-13、IL-22、sCD137、sCD40L、TGFβ1；
炎性：IL-6、IL-17A、IL-17F、MCP-1、MCP-4、IL-1β。
使用预先指定的公式计算CD4+或CD8+T细胞的PSI，其被定义为多功能细胞的百分比乘以由那些细胞分泌的蛋白质的平均荧光强度(MFI)：
Figure BDA0002667249210000951
通过多功能热图进一步揭示了在单细胞水平上共同分泌组合蛋白的多功能CD4+或CD8+T细胞亚组。
长期增殖测定
通过将归一化的CAR T细胞与先前以10,000 rad辐照过的表达BCMA和TACI的K562细胞以1:1的比率共培养来评估响应于抗原刺激的CAR T细胞增殖。对T细胞进行计数，并且每周一次用辐照过的靶细胞重新铺板。
体内研究
根据联邦和机构动物护理和使用委员会(Federal and Institutional AnimalCare and Use Committee，IACUC)的要求，所有动物实验均在MGH批准的方案下进行。对于异种移植研究，用1 x 106个被转导以表达CBG-luc的MM.1S或MM.1S BCMA KO细胞静脉内(i.v.)注射NOD SCIDγ-链-/-小鼠(NSG，Jackson Laboratories)。在14天后通过生物发光成像确认肿瘤的植入之后，i.v.注射2 x 106个CAR T细胞或UTD。通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤负荷，并且收集外周血并通过流式细胞术检查CAR T细胞持久性。在Ami光谱成像仪上在腹膜内注射D-萤光素底物溶液(30 mg/ml，Fischer Scientific，目录#PI88294)之后进行BLI，并且使用IDL软件版本4.3.1进行分析。当结束实验时或当满足IACUC预定义的终点时，按照实验方案中所规定的对小鼠实施安乐死。
统计分析
除非另有说明，否则等方差的正常数据，使用双尾学生t检验或双因素方差分析检验。认为显著性为p<0.05，并且在图例中用*表示。使用GraphPad Prism版本7.0进行分析。
实施例13.设计成靶向BCMA和/或TACI的CAR
用嵌合抗原受体(CAR)T细胞靶向B细胞成熟抗原(BCMA)在治疗多发性骨髓瘤(MM)方面已显示出巨大的成功，但是受到异质抗原表达和即将发生的肿瘤细胞抗原逃逸的限制。组合抗原靶向可能有助于解决这些挑战。以天然存在的受体-配体对为模型，基于单体和三聚体的增殖诱导配体(APRIL)的CAR同时靶向BCMA以及跨膜激活剂和CAML相互作用分子(TACI)。BCMA和TACI两者都仅在B细胞上表达，并且在几乎所有恶性浆细胞上均被上调，使得它们成为多发性骨髓瘤的有吸引力的靶标。
评估了BCMA和TACI在从29名MM患者的骨髓样品获得的浆细胞上的表面表达。首先，从多发性骨髓瘤患者获得浆细胞，并且用BCMA-PE或TACI-PE染色以确定BCMA和TACI表达。在前向和侧向散射(CD45模糊、CD38+和CD138+)上对浆细胞进行门控。观察到大多数浆细胞对于BCMA和TACI呈阳性，并且分布模式相似。无论先前疗法的线数如何，均检测到BCMA和TACI两者的表达。在更高级的疗法阶段(>3线先前疗法)，BCMA倾向于分为高度阳性(>＝80％)或轻度阳性(20％-30％)，而TACI表达似乎变化不这么大(图26A)。值得注意的是，在接受更多治疗的患者中较低的BCMA表达无法仅仅通过BCMA指导的疗法的先前治疗来解释，因为此群组中只有一名患者先前接受过BCMA指导的治疗。反映骨髓瘤患者中BCMA和TACI的表达模式，MM细胞系RPMI8226和MM.1S两者均在其表面上表达BCMA和TACI。另外，产生了表达BCMA(K562-BCMA)或TACI(K562-TACI)的K562人工抗原呈递细胞以促进对CAR T细胞的测试。如图26B所示，确定了在人多发性骨髓瘤细胞系RMPI8226和MM.1S、被修饰以表达BCMA的K562细胞和被修饰以表达TACI的K562细胞上BCMA和TACI的表达水平。
为了设计靶向BCMA和TACI两者的CAR，使用天然配体APRIL用作细胞外靶标结合结构域的组分。为了避免潜在的脱靶相互作用，将缺乏弗林蛋白酶的蛋白酶切割位点和蛋白聚糖结合位点的截短形式的APRIL用作结合部分。设计了三种不同的第二代CAR构建体：基于抗BCMA scFv的抗BCMACAR(BCMA CAR)用作对照，含有一个膜栓系的截短的APRIL单体的CAR(APRIL-4-1BB CAR)、以及具有三个截短且融合的APRIL单体的CAR(TriPRIL CAR，例如SEQ ID NO:39)。所设计的三种CAR的示意图示于图26D中。BCMA和TriPRIL CAR构建体具有CD8跨膜结构域和4-1BB-CD3ζ细胞内结构域，而APRIL-4-1BB CAR具有4-1BB跨膜结构域和4-1BB-CD3ζ细胞内结构域。将构建体克隆到慢病毒载体中，并且在EF-1α启动子的控制下进行表达。另外，所有构建体均在2A元件后含有mCherry荧光报告子，以允许对CAR表达进行方便基于流的检测。通过响应于靶抗原的细胞毒性效力、激活(CD69)、脱粒(CD107a)、细胞因子产生和增殖来比较体外效应子功能。在MM的异种移植小鼠模型中评估了体内抗肿瘤效率。
APRIL是TNF家族成员，而BCMA和TACI是TNFR家族成员；因为与所述分子的三聚体形式发生TNF/TNFR相互作用，所以假设通过促进三聚化(通过连接TNFR家族成员的跨膜结构域或通过仅三聚化APRIL部分同时维持稳定的CAR构型)将增强基于APRIL的CAR的结合和信号传导(图26C)。即使当带有4-1BB细胞内信号传导结构域时，使用基于scFv的粘合剂和CD8跨膜结构域的CAR也形成同二聚体(图26C)(Imai等人,Leukemia.18(4):676-84(2004))。因此，将截短的APRIL作为与4-1BB跨膜和细胞内结构域、然后与CD3ζ细胞内结构域串联融合的单体(APRIL-4-1BB CAR)合成，或者作为三个通过接头连接的APRIL单体(TriPRIL CAR)合成。描绘三种不同的CAR与BCMA的理论结合的图示于图26C中。左图示出了BCMA CAR的结合，其中CAR正常地二聚化以进行信号传导。中间图示出了APRIL-4-1BB CAR的结合，其中APRIL自然三聚化以结合BCMA/TACI。右图示出了TriPRIL CAR的结合，其中TriPRIL CAR包括三聚化的APRIL作为细胞外靶标结合结构域。从三个不同的供体成功完成了所有三种构建体的CAR T细胞制造(转导效率为46％-78％)。虽然对CAR的Western印迹分析显示出了TriPRIL和BCMA CAR的多聚化形式，但是仅检测到APRIL CAR的单体形式。
实施例14.CAR T细胞的亲和力和效应子功能
当将BCMA、APRIL-4-1BB和TriPRIL CAR转导到人T细胞中时，对它们的结合和功能特性进行了测试。首先，确定了对可溶性BCMA和可溶性TACI的结合亲和力，如图27A所示。将CAR T细胞与跟APC缀合的可溶性BCMA和可溶性TACI一起孵育，并且基于平均荧光强度(MFI)确定结合亲和力。与APRIL-4-1BB CAR相比，sBCMA和sTACI对TriPRIL CAR的结合亲和力更高。观察到，BCMA CAR与sBCMA的结合强而与sTACI的结合弱，这与衍生出scFv的抗体的所描述的结合特征一致。APRIL CAR对BCMA和TACI均显示出低的结合亲和力，然而TriPRILCAR与两种抗原均结合，但是与BCMA的亲和力低于与抗BCMA CAR的亲和力(图27A)。接下来，测试了三种不同的CAR T细胞构建体对表达BCMA和/或TACI的细胞系MM.1S(图27B)、RPMI8226(图27C)、K562-BCMA(图27D)和K562-TACI(图27E)的细胞毒性。BCMA和TriPRILCAR T细胞以高效率裂解MM.1s(图27B)和RPMI8226(图27C)MM细胞系，而由APRIL-4-1BBCAR T细胞介导的特异性裂解较低。对于仅表达BCMA的靶细胞，观察到相似的模式：通过BCMA CART和TriPRIL CAR T细胞的裂解高效，而通过APRIL CART的裂解较弱(图27D)。相比之下，尽管APRIL介导的裂解仍然看起来比TriPRIL介导的裂解更弱，但是仅APRIL-4-1BB和TriPRIL CAR T细胞能够裂解仅表达TACI的靶细胞(图27E)。
还确定了不同CAR T细胞的脱粒(图27F)和激活(图27G)。在基于萤光素酶的杀伤测定中测量细胞毒性，并且通过流分析脱粒和激活。当与MM靶细胞共培养时观察到BCMACAR T细胞和TriPRIL CAR T细胞的稳健脱粒，而APRIL-4-1BB CAR T细胞仅较弱地脱粒，并且将来自同一供体的未经转导的T细胞在每个实验中用作阴性对照(图27F)。类似地，通过与BCMA阳性靶细胞共培养，在BCMA CAR T细胞中诱导了CD69表达，而仅对TACI呈阳性的细胞不引起其激活。APRIL-4-1BB CAR T细胞最能响应于表达高水平TACI的靶标(K562-TACI)而上调CD69，但是响应于MM细胞系或BCMA仅较弱地上调。TriPRIL CAR T细胞响应于表达BCMA、TACI或两者的靶细胞而被稳健激活(图27G)。不足为奇，作为T细胞激活量度的CD107a和CD69表达的程度都与抗原的表达相关(K562转导的细胞>MM.1s>RPMI8226)，这与靶向CD22(Haso等人,Blood.121(7):1165-74(2013))和其他抗原(Walker等人,Mol.Ther.25(9):2189-2201(2017)；Arcangeli等人,Mol.Ther.25(8):1933-1945(2017)；Caruso等人,Cancer Res.75(17):3505-18(2015))的CAR的公开数据一致。
实施例15.CAR T细胞的长期增殖
尽管短期激活、裂解和结合测定是CAR T细胞表征的基础，但是CAR T细胞随时间的从反复抗原刺激中存活(Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453-64(2009)；Kalos等人,Sci.Transl.Med.3(95):95ra73(2009)；Porter等人,Sci.Transl.Med.7(303):303ra139(2015))和产生多功能细胞因子反应(Rossi等人Blood.132(8):804-814(2018))的能力是T细胞功能的更具区分性的测定，并且被认为更能指示患者功效所需的功能类型。这样的CART细胞持久性、增殖和多功能性也与临床结果相关(Fraietta等人,Nat.Med.24(5):563-571(2018)；Maude等人,N.Engl.J.Med.371(16):1507-17(2014)；Neelapu等人,N.Engl.J.Med.377(26):2531-2544(2017)；Rossi等人Blood.132(8):804-814(2018))。
进行长期增殖测定以测试不同的CAR T细胞响应于用BCMA或TACI进行反复抗原刺激的增殖能力，如图27H和27I所示。从解冻的CAR T细胞制备开始，每周用K562-BCMA刺激导致了BCMA和TriPRIL CAR T细胞在4周内对数生长；在2次刺激之后，APRIL-4-1BB CAR T细胞呈对数生长，但是然后逐渐变弱。相比之下，反复的K562-TACI刺激仅诱导了APRIL-4-1BB和TriPRIL CAR T细胞的对数生长，并且它们之间没有显著差异(图27I)。BCMA CAR T细胞的扩增不超过未经转导的对照细胞(p＝0.5464)(图27I)。因此，APRIL-4-1BB与TriPRILCAR T细胞功能之间的差异的主要驱动因素之一似乎是对BCMA刺激的反应性，然而抗BCMA与TriPRIL功能之间的差异性功能的主要驱动因素是对TACI的反应性。TriPRIL CAR在细胞毒性潜力、脱粒、激活和长期增殖方面优于APRIL CAR。
最后，通过12重Luminex测定在上清液中测量了在与人MM.1S骨髓瘤细胞共培养后不同CAR T细胞的细胞因子产生(图27J)。所有三种CAR构建体均表现出Th1型细胞因子(像IL-2、IFNγ、GM-CSF和TNF-α)的稳健的抗原特异性产生，类似于带有4-1BB共刺激的其他CAR T细胞设计(Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453-64(2009)；Scarfo等人,Blood.132(14):1495-1506(2018))。
实施例16.CAR T细胞的体内活性
通过为NSG小鼠植入高肿瘤负荷的MM.1S骨髓瘤细胞，在多发性骨髓瘤的异种移植模型中评估了CAR T细胞的抗肿瘤效率。向NSG小鼠注射了1 x 106个被修饰以表达叩甲绿色萤光素酶(CBG-luc)的MM.1S骨髓瘤细胞，并且在14天内植入肿瘤。通过生物发光成像(BLI)监测随时间的肿瘤负荷。在肿瘤植入和随机化之后，在第0天向小鼠注射单剂量静脉内(i.v.)剂量的2 x 106个来自同一供体的未经转导的(UTD)、BCMA CAR、APRIL-4-1BB CAR或TriPRIL CAR T细胞(图28A)。通过BLI每周监测肿瘤负荷，并且通过流式细胞术每周测量外周血中CAR T细胞的持久性。虽然在经UTD治疗的组中肿瘤负荷持续进展，但是所有经CART治疗的小鼠均显示出抗肿瘤反应。图28B和28C示出了代表性的生物发光成像和通量随时间的定量。在这种高肿瘤负荷模型中，BCMA和TriPRIL CART能够根除肿瘤，而APRIL-4-1BB CAR T细胞仅导致肿瘤负荷的稳定(图28B)。与UTD对照组相比较，接受CAR T细胞的所有3个组的治疗反应在统计学上均显著。就肿瘤反应而言，在经BCMA与TriPRIL CAR T细胞治疗的动物之间没有显著差异(p＝0.8451)(图28C)。通过流式细胞术测量外周血中CAR T细胞的持久性(图28D)。在外周血中，BCMA CAR T细胞数量显示出迅速增加，然后在CART给予后第14天显示出缩减。相比之下，TriPRIL CAR T细胞经历较慢的扩增动力学，并且在CART细胞给予后第21天细胞数量仍在增加。在分析的时间点，UTD和APRIL-4-1BB CAR T细胞在血液中未显示出可测量的扩增(图28D)。这些数据加在一起表明，我们的基于APRIL的CAR不可能对带有BCMA或TACI的MM细胞发挥最佳功能，并且进一步的研究集中在比较TriPRILCAR T细胞相对于BCMA的情况，特别是它们对丧失BCMA的MM的反应性。TriPRIL CAR和BCMACAR T细胞能够根除肿瘤，而APRIL-4-1BB CAR T细胞仅导致肿瘤负荷的稳定。
实施例17.对BCMA抗原逃逸建模
为了对BCMA抗原逃逸建模，产生了具有CRISPR/Cas9介导的BCMA敲除(KO)的MM.1S骨髓瘤细胞。如图29A所示，确认了BCMA表达的缺乏，而TACI表达水平在敲除细胞系中保持不受影响。MM.1S、MM.1S BCMA KO I和MM.1S BCMA KO II细胞系的群体倍增示于图29B中。亲本和BCMA KO MM.1S骨髓瘤细胞在体外显示出相同的生长动力学，与所使用的指导RNA无关。另外，在NSG小鼠中，MM.1S细胞和MM.1S BCMA KO细胞的肿瘤发生学和生长动力学基本上相同(图29E)。
接下来，在体外测试了BCMA和TriPRIL CAR T细胞对MM.1S和MM.1S BCMA敲除细胞的杀伤。与UTD细胞相比，TriPRIL CAR有效地裂解了MM.1S和MM.1S BCMA KO细胞(图29C)。如图29D所展示，与MM.1S细胞的杀伤相比，BCMA CAR T细胞对MM.1S BCMA敲除细胞的杀伤显著降低，而通过TriPRIL CAR T细胞的杀伤在两种细胞系之间却没有降低(p＝0.8986)。在NSG小鼠中MM.1S和MM.1S BCMA阴性细胞系随时间的肿瘤生长动力学示于图29E中，并且没有表现出变化。
还在体内测试了BCMA抗原逃逸模型，对其的实验设计示于图30A中。向NSG小鼠注射了1 x 106个MM.1S BCMA敲除细胞，并且允许植入14天。监测随时间的肿瘤负荷。在通过BLI确认肿瘤植入后，在第0天向小鼠注射单次i.v.剂量的2 x 106个未经转导的、BCMA CAR或TriPRIL CAR细胞。(图30)。另外，一组小鼠不进行治疗以评估肿瘤发生学和对同种异体排斥的控制，同种异体排斥在MM模型中经常发生，并且限制了体内实验的可评价持续时间。通过BLI监测随时间的肿瘤负荷。在实验过程中，所有经治疗的小鼠均显示出肿瘤消退，而“仅肿瘤”组的疾病负荷持续进展，表明了通过内源性T细胞受体对肿瘤的非抗原特异性同种异体反应。代表性的生物发光成像示于图30B中，并且三个组中的通量的定量示于图30C中。再次，观察到与未经转导的和BCMA CAR T细胞相比，TriPRIL CAR T细胞对MM.1S BCMA敲除细胞有效。仅经TriPRIL CAR T治疗的小鼠到第14天清除了肿瘤(图30B)，这与由CAR T细胞诱导的抗原特异性介导的反应一致。在第7天对肿瘤负荷的定量显示，在接受TriPRILCAR T细胞的组与接受BCMA CAR T细胞或UTD对照细胞的组之间有统计学上显著的差异(p<0.0001)(图30C)。由于尚不清楚的原因，与使用亲本MM.1S细胞的模型相比，更早观察到T细胞对MM.1S BCMA敲除细胞的同种异体反应。
基于APRIL的CAR能够将T细胞的细胞毒性重新定向至BCMA和TACI阳性肿瘤细胞两者。由于这两种受体在恶性浆细胞上均持续上调，因此这是靶向MM的有吸引力的方法。此外，观察到使用三聚体形式的APRIL而不是单体形式作为CAR结合结构域在体外和在体内增加了对MM抗原的识别。
实施例18.CAR T细胞的多功能性
在单细胞水平上的多功能细胞因子产生最近已作为功能性CAR T细胞产物之间的相关功能而出现，所述功能性CAR T细胞产物诱导淋巴瘤患者的临床反应(Rossi等人Blood.132(8):804-814(2018))，并且可能更能指示患者功效所需的功能类型。CAR T细胞多功能性也已经与临床结果相关。多功能性可能视起始T细胞产物和CAR设计两者而定。
用32重抗体测定测量在BCMA和TACI刺激后在每种CAR T细胞产物中多功能CD4+和CD8+T细胞的百分比。多功能性被定义为≥2种细胞因子的分泌。在BCMA刺激后，与未经转导的细胞相比，在供体之间在具有BCMA CAR、APRIL-4-1BB CAR和TriPRIL CAR构建体的CD4+和CD8+CAR T细胞中均观察到了多功能上调(图31A和31B)。BCMA CAR T细胞和TriPRIL CART细胞两者的CD4+亚组均由10％-24％的多功能细胞组成，而多功能APRIL CART的百分比显著更低(5％-10％；p＝0.0064)。CD8+亚组的差异更为明显，其中与BCMA CAR T细胞(8％-15％；p＝0.0003)和APRIL CAR T细胞(0-6％；p<0.0001)产物相比，TriPRIL CAR T细胞产物含有显著更多的多功能细胞(16％-21％)(图31A)。APRIL-4-1BB CAR在三种CAR构建体之间显示出最低的多功能谱，然而CD8+CAR T细胞产物中的TriPRIL具有最高的多功能性。通过BCMA抗原刺激，TriPRIL CAR和BCMA CAR在CD4+CAR T细胞产物中展现出相当的水平。
与多功能上调相一致，在BCMA抗原刺激后，与未经转导的细胞相比，在供体之间在具有BCMA CAR、APRIL-4-1BB CAR和TriPRIL CAR构建体的CD4+和CD8+CAR T细胞中均观察到了多功能强度指数(PSI)的BCMA特异性上调(图32A和32B)。在BCMA抗原刺激后，TriPRILCAR具有最高的PSI，而APRIL-4-1BB CAR在CD4+和CD8+CAR T细胞两者中在三种构建体之间均显示出最少的PSI增加。CD4+和CD8+CAR T细胞两者的增强的PSI均由效应蛋白(包括颗粒酶B、IFN-γ、MIP-1a、穿孔素、TNF-α和TNF-β)主导。在CD4 PSI中独特地构成了低水平的GM-CSF、IL-2、IL-8、sCD40L和IL-17A分泌，而在CD4和CD8 PSI两者中均鉴定出IL-9、MIP-1b和sCD137。
多功能热图(图33A和33B)进一步揭示，增强的多功能细胞亚组在CD4+和CD8+CART细胞两者中均具有不同的蛋白质组合。此外，在具有多种CAR构建体的CD4+和CD8+CAR T细胞两者中均观察到多种蛋白质分泌的增加(图34A-34D)。对单独的细胞因子谱的单细胞分析证明，在CD4+和CD8+T细胞两者中，占主导的细胞因子和所测量的产生的蛋白质均被归类为效应细胞因子，在测试的CAR构建体之间具有相似的谱，但是频率较低(图34A)。
实施例19.在不利的MM环境中的TriPRILCAR T细胞功能
在骨髓微环境中，APRIL从骨髓基质细胞分泌，并且为浆细胞提供生长信号。已报道了在MM患者的骨髓和外周血中sBCMA、sTACI和sAPRIL的超生理浓度。确定了sBCMA、sTACI和sAPRIL是否阻断TriPRIL CAR T细胞对表达膜结合BCMA和TACI的MM细胞的裂解。为此，在培养物中一定的sBCMA、sTACI和sAPRIL浓度范围内，将TriPRIL CAR T细胞与MM.1S靶细胞以不同的效应子与靶标比率共培养。在sBCMA和sAPRIL的最高浓度(1000ng/ml)下，仅在所测试的最低效应子:靶标比率(1:3和1:10)下观察到TriPRIL CAR的细胞毒性降低(图35)。重要的是，我们测试的sTACI和sAPRIL的浓度远远超过了MM患者中报告的水平。然而，所测试的最高sBCMA浓度与一些晚期MM患者中报告的sBCMA浓度相当。这些数据表明，sBCMA与TriPRIL的结合可能抑制其在低E:T比率下的活性，但是这在用其他疗法(诸如也可用作条件性淋巴细胞清除的化学疗法)的患者中通过使用较高剂量的TriPRIL CAR T细胞或降低sBCMA的浓度可以潜在地被克服。
实施例20.TriPRIL CAR核酸序列
pMGH71b–TriPRIL CAR(SEQ ID NO:45)：EF1α启动子(SEQ ID NO:46(SEQ ID NO:45的核苷酸1-1184))；CD8信号肽(SEQ ID NO:47(SEQ ID NO:45的核苷酸1185-1247))；TriPRIL(截短的APRIL(SEQ ID NO:48(SEQ ID NO:45的核苷酸1248-1655))–Gly/Ser接头(SEQ ID NO:49(SEQ ID NO:45的核苷酸1656-1691))–截短的APRIL(SEQ ID NO:50(SEQ IDNO:45的核苷酸1692-2099))–Gly/Ser接头(SEQ ID NO:51(SEQ ID NO:45的核苷酸2100-2135))–截短的APRIL(SEQ ID NO:52(SEQ ID NO:45的核苷酸2136-2543)))；CD8铰链+跨膜结构域(SEQ ID NO:53(SEQ ID NO:45的核苷酸2544-2750))；4-1BB共刺激结构域(SEQ IDNO:54(SEQ ID NO:45的核苷酸2751-2876))；CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO:55(SEQ IDNO:45的核苷酸2877-3212))
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACTGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGTGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCACTCAGTACTCCATCTCGTTCCTATCAATGCAACAAGCAAGGATGATTCTGACGTGACTGAGGTTATGTGGCAACCTGCCCTCCGAAGGGGTAGAGGTCTCCAGGCTCAGGGGTACGGCGTCCGCATCCAGGATGCAGGAGTTTACTTGCTCTATAGTCAGGTTCTCTTTCAGGATGTCACATTCACTATGGGGCAGGTTGTAAGCCGGGAAGGCCAAGGTAGACAGGAGACTCTTTTTCGATGCATCAGGAGTATGCCTTCACATCCAGACCGAGCGTACAATTCCTGCTACTCTGCTGGTGTTTTCCATCTGCACCAAGGTGACATTCTGTCCGTCATAATTCCGAGAGCTAGAGCCAAGCTTAACCTCAGCCCACACGGGACCTTTCTGGGCTTCGTTAAGCTCGGCGGAGGCTCTGGGGGAGGGTCCGGGGGCGGGAGTCATTCAGTGCTTCACCTCGTCCCGATTAACGCAACAAGCAAAGATGACTCCGACGTGACTGAAGTGATGTGGCAGCCAGCATTGAGGCGAGGTAGAGGTCTCCAGGCTCAAGGATATGGTGTCAGAATACAGGATGCAGGAGTTTATCTCCTGTACAGTCAGGTGTTGTTTCAGGATGTTACTTTTACTATGGGCCAAGTTGTAAGTAGAGAAGGTCAGGGAAGGCAAGAGACGCTCTTCAGGTGCATACGAAGTATGCCCAGTCACCCTGATAGAGCATACAACTCTTGCTACAGTGCGGGCGTTTTTCATTTGCACCAGGGAGATATCCTCAGCGTGATCATCCCAAGAGCACGCGCAAAATTGAACCTCTCACCACACGGTACCTTTCTCGGTTTTGTCAAGCTTGGAGGCGGATCAGGAGGGGGCAGCGGCGGGGGCTCTCACTCAGTTTTGCATCTCGTCCCTATCAACGCCACGAGCAAGGACGATTCAGATGTGACTGAAGTCATGTGGCAGCCGGCCCTTCGGAGGGGAAGAGGGTTGCAAGCTCAGGGTTATGGGGTGCGAATACAGGACGCAGGGGTGTACCTCCTCTATTCTCAGGTATTGTTCCAAGACGTAACCTTCACGATGGGTCAAGTCGTCTCCCGAGAAGGTCAAGGGCGCCAAGAAACCCTTTTTAGGTGCATTAGAAGCATGCCAAGCCATCCTGACCGCGCATATAACTCATGTTACTCCGCCGGCGTGTTTCACTTGCACCAAGGTGATATCCTTAGCGTTATTATTCCGCGAGCGCGGGCCAAGCTGAATCTTTCACCGCACGGGACCTTCCTTGGGTTTGTAAAACTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(SEQ ID NO:45)
EF1α启动子(SEQ ID NO:45的核苷酸1-1184)
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACTGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGTGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(SEQ ID NO:46)
CD8信号肽(SEQ ID NO:45的核苷酸1185-1247)
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC(SEQID NO:47)
截短的APRIL(SEQ ID NO:45的核苷酸1248-1655)
CACTCAGTACTCCATCTCGTTCCTATCAATGCAACAAGCAAGGATGATTCTGACGTGACTGAGGTTATGTGGCAACCTGCCCTCCGAAGGGGTAGAGGTCTCCAGGCTCAGGGGTACGGCGTCCGCATCCAGGATGCAGGAGTTTACTTGCTCTATAGTCAGGTTCTCTTTCAGGATGTCACATTCACTATGGGGCAGGTTGTAAGCCGGGAAGGCCAAGGTAGACAGGAGACTCTTTTTCGATGCATCAGGAGTATGCCTTCACATCCAGACCGAGCGTACAATTCCTGCTACTCTGCTGGTGTTTTCCATCTGCACCAAGGTGACATTCTGTCCGTCATAATTCCGAGAGCTAGAGCCAAGCTTAACCTCAGCCCACACGGGACCTTTCTGGGCTTCGTTAAGCTC(SEQ ID NO:48)
Gly/Ser接头(SEQ ID NO:45的核苷酸1656-1691)
GGCGGAGGCTCTGGGGGAGGGTCCGGGGGCGGGAGT(SEQ ID NO:49)
截短的APRIL(SEQ ID NO:45的核苷酸1692-2099)
CATTCAGTGCTTCACCTCGTCCCGATTAACGCAACAAGCAAAGATGACTCCGACGTGACTGAAGTGATGTGGCAGCCAGCATTGAGGCGAGGTAGAGGTCTCCAGGCTCAAGGATATGGTGTCAGAATACAGGATGCAGGAGTTTATCTCCTGTACAGTCAGGTGTTGTTTCAGGATGTTACTTTTACTATGGGCCAAGTTGTAAGTAGAGAAGGTCAGGGAAGGCAAGAGACGCTCTTCAGGTGCATACGAAGTATGCCCAGTCACCCTGATAGAGCATACAACTCTTGCTACAGTGCGGGCGTTTTTCATTTGCACCAGGGAGATATCCTCAGCGTGATCATCCCAAGAGCACGCGCAAAATTGAACCTCTCACCACACGGTACCTTTCTCGGTTTTGTCAAGCTT(SEQ ID NO:50)
Gly/Ser接头(SEQ ID NO:45的核苷酸2100-2135)
GGAGGCGGATCAGGAGGGGGCAGCGGCGGGGGCTCT(SEQ ID NO:51)
截短的APRIL(SEQ ID NO:45的核苷酸2136-2543)
CACTCAGTTTTGCATCTCGTCCCTATCAACGCCACGAGCAAGGACGATTCAGATGTGACTGAAGTCATGTGGCAGCCGGCCCTTCGGAGGGGAAGAGGGTTGCAAGCTCAGGGTTATGGGGTGCGAATACAGGACGCAGGGGTGTACCTCCTCTATTCTCAGGTATTGTTCCAAGACGTAACCTTCACGATGGGTCAAGTCGTCTCCCGAGAAGGTCAAGGGCGCCAAGAAACCCTTTTTAGGTGCATTAGAAGCATGCCAAGCCATCCTGACCGCGCATATAACTCATGTTACTCCGCCGGCGTGTTTCACTTGCACCAAGGTGATATCCTTAGCGTTATTATTCCGCGAGCGCGGGCCAAGCTGAATCTTTCACCGCACGGGACCTTCCTTGGGTTTGTAAAACTG(SEQ ID NO:52)
CD8铰链+跨膜结构域(SEQ ID NO:45的核苷酸2544-2750)
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT(SEQ ID NO:53)
4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:45的核苷酸2751-2876)
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG(SEQ ID NO:54)
CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO:45的核苷酸2877-3212)
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(SEQ ID NO:55)
实施例21.TriPRIL CAR氨基酸序列
pMGH71b–TriPRIL CAR(SEQ ID NO:39)：TriPRIL(截短的APRIL(SEQ ID NO:40(SEQ ID NO:39的氨基酸1-136))–Gly/Ser接头(SEQ ID NO:41(SEQ ID NO:39的氨基酸137-148))–截短的APRIL(SEQ ID NO:40(SEQ ID NO:39的氨基酸149-284))–Gly/Ser接头(SEQ ID NO:41(SEQ ID NO:39的氨基酸285-296))–截短的APRIL(SEQ ID NO:40(SEQ IDNO:39的氨基酸297-432)))；CD8铰链+跨膜结构域(SEQ ID NO:42(SEQ ID NO:39的氨基酸433-501))；4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:43(SEQ ID NO:39的氨基酸502-543))；CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO:44(SEQ ID NO:39的氨基酸544-655))
HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLGGGSGGGSGGGSHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLGGGSGGGSGGGSHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:39)
截短的APRIL(SEQ ID NO:39的氨基酸1-136)
HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(SEQ IDNO:40)
Gly/Ser接头(SEQ ID NO:39的氨基酸137-148)
GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:41)
截短的APRIL(SEQ ID NO:39的氨基酸149-284)
HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(SEQ IDNO:40)
Gly/Ser接头(SEQ ID NO:39的氨基酸285-296)
GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:41)
截短的APRIL(SEQ ID NO:39的氨基酸297-432)
HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(SEQ IDNO:40)
CD8铰链+跨膜结构域(SEQ ID NO:39的氨基酸433-501)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:42)
4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:39的氨基酸502-543)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:43)
CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO:39的氨基酸544-655)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:44)
具有Whitlow接头的TriPRIL CAR(SEQ ID NO:57)：TriPRIL(截短的APRIL(SEQ IDNO:40(SEQ ID NO:57的氨基酸1-136))–Whitlow接头(SEQ ID NO:58(SEQ ID NO:57的氨基酸137-154))–截短的APRIL(SEQ ID NO:40(SEQ ID NO:57的氨基酸155-290))–Whitlow接头(SEQ ID NO:58(SEQ ID NO:57的氨基酸291-308))–截短的APRIL(SEQ ID NO:40(SEQ IDNO:57的氨基酸309-444)))；CD8铰链+跨膜结构域(SEQ ID NO:42(SEQ ID NO:57的氨基酸445-513))；4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:43(SEQ ID NO:57的氨基酸514-555))；CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO:44(SEQ ID NO:57的氨基酸556-667))
HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLGSTSGSGKPGSGEGSTKGHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLGSTSGSGKPGSGEGSTKGHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ IDNO:57)
截短的APRIL(SEQ ID NO:57的氨基酸1-136)
HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(SEQ IDNO:40)
Whitlow接头(SEQ ID NO:57的氨基酸137-154)
GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:58)
截短的APRIL(SEQ ID NO:57的氨基酸155-290)
HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(SEQ IDNO:40)
Whitlow接头(SEQ ID NO:57的氨基酸291-308)
GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:58)
截短的APRIL(SEQ ID NO:57的氨基酸309-444)
HSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(SEQ IDNO:40)
CD8铰链+跨膜结构域(SEQ ID NO:57的氨基酸445-513)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:42)
4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:57的氨基酸514-555)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:43)
CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO:57的氨基酸556-667)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:44)
其他实施方案
尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实施例的方式详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应当被解释为限制本发明的范围。将本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用以其整体明确地并入。
序列表
<110> 综合医院公司
<120> 表达嵌合抗原受体的免疫细胞
<130> 51295-012WO4
<150> US 62/773,001
<151> 2018-11-29
<150> US 62/771,998
<151> 2018-11-27
<150> US 62/629,558
<151> 2018-02-12
<150> PCT/US2018/013221
<151> 2018-01-10
<160> 67
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccccactctg tcctgcacct ggttcccatt aacgccacct ccaaggatga ctccgatgtg 120
acagaggtga tgtggcaacc agctcttagg cgtgggagag gcctacaggc ccaaggatat 180
ggtgtccgaa tccaggatgc tggagtttat ctgctgtata gccaggtcct gtttcaagac 240
gtgactttca ccatgggtca ggtggtgtct cgagaaggcc aaggaaggca ggagactcta 300
ttccgatgta taagaagtat gccctcccac ccggaccggg cctacaacag ctgctatagc 360
gcaggtgtct tccatttaca ccaaggggat attctgagtg tcataattcc ccgggcaagg 420
gcgaaactta acctctctcc acatggaacc ttcctggggt ttgtgaaact gaccactacc 480
ccagcaccga ggccacccac cccggctcct accatcgcct cccagcctct gtccctgcgt 540
ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg gccgtgcata cccggggtct tgacttcgcc 600
tgcgatatct acatttgggc ccctctggct ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc 660
gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc 720
ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag gaggacggct gttcatgccg gttcccagag 780
gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc 840
taccaacagg ggcagaacca gctctacaac gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac 900
gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag 960
aatccccaag agggcctgta caacgagctc caaaaggata agatggcaga agcctatagc 1020
gagattggta tgaaagggga acgcagaaga ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga 1080
ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg 1140
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 3
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
cactctgtcc tgcacctggt tcccattaac gccacctcca aggatgactc cgatgtgaca 60
gaggtgatgt ggcaaccagc tcttaggcgt gggagaggcc tacaggccca aggatatggt 120
gtccgaatcc aggatgctgg agtttatctg ctgtatagcc aggtcctgtt tcaagacgtg 180
actttcacca tgggtcaggt ggtgtctcga gaaggccaag gaaggcagga gactctattc 240
cgatgtataa gaagtatgcc ctcccacccg gaccgggcct acaacagctg ctatagcgca 300
ggtgtcttcc atttacacca aggggatatt ctgagtgtca taattccccg ggcaagggcg 360
aaacttaacc tctctccaca tggaaccttc ctggggtttg tgaaactg 408
<210> 4
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 180
ctttcactcg tgatcactct ttactgt 207
<210> 5
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 6
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctacc aacaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
<210> 7
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccccactctg tcctgcacct ggttcccatt aacgccacct ccaaggatga ctccgatgtg 120
acagaggtga tgtggcaacc agctcttagg cgtgggagag gcctacaggc ccaaggatat 180
ggtgtccgaa tccaggatgc tggagtttat ctgctgtata gccaggtcct gtttcaagac 240
gtgactttca ccatgggtca ggtggtgtct cgagaaggcc aaggaaggca ggagactcta 300
ttccgatgta taagaagtat gccctcccac ccggaccggg cctacaacag ctgctatagc 360
gcaggtgtct tccatttaca ccaaggggat attctgagtg tcataattcc ccgggcaagg 420
gcgaaactta acctctctcc acatggaacc ttcctggggt ttgtgaaact gccatctcca 480
gccgacctct ctccgggagc atcctctgtg accccgcctg cccctgcgag agagccagga 540
cactctccgc agatcatctc cttctttctt gcgctgacgt cgactgcgtt gctcttcctg 600
ctgttcttcc tcacgctccg tttctctgtt gttaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac 660
atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg cagactactc aagaggagga cggctgttca 720
tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc 780
gcagatgctc cagcctacca acaggggcag aaccagctct acaacgaact caatcttggt 840
cggagagagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggac gggacccaga aatgggcggg 900
aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg 960
gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac 1020
ggactgtacc agggactcag caccgccacc aaggacacct atgacgctct tcacatgcag 1080
gccctgccgc ctcgg 1095
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 9
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
cactctgtcc tgcacctggt tcccattaac gccacctcca aggatgactc cgatgtgaca 60
gaggtgatgt ggcaaccagc tcttaggcgt gggagaggcc tacaggccca aggatatggt 120
gtccgaatcc aggatgctgg agtttatctg ctgtatagcc aggtcctgtt tcaagacgtg 180
actttcacca tgggtcaggt ggtgtctcga gaaggccaag gaaggcagga gactctattc 240
cgatgtataa gaagtatgcc ctcccacccg gaccgggcct acaacagctg ctatagcgca 300
ggtgtcttcc atttacacca aggggatatt ctgagtgtca taattccccg ggcaagggcg 360
aaacttaacc tctctccaca tggaaccttc ctggggtttg tgaaactg 408
<210> 10
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
ccatctccag ccgacctctc tccgggagca tcctctgtga ccccgcctgc ccctgcgaga 60
gagccaggac actctccgca gatcatctcc ttctttcttg cgctgacgtc gactgcgttg 120
ctcttcctgc tgttcttcct cacgctccgt ttctctgttg tt 162
<210> 11
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 12
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctacc aacaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
<210> 13
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccccactctg tcctgcacct ggttcccatt aacgccacct ccaaggatga ctccgatgtg 120
acagaggtga tgtggcaacc agctcttagg cgtgggagag gcctacaggc ccaaggatat 180
ggtgtccgaa tccaggatgc tggagtttat ctgctgtata gccaggtcct gtttcaagac 240
gtgactttca ccatgggtca ggtggtgtct cgagaaggcc aaggaaggca ggagactcta 300
ttccgatgta taagaagtat gccctcccac ccggaccggg cctacaacag ctgctatagc 360
gcaggtgtct tccatttaca ccaaggggat attctgagtg tcataattcc ccgggcaagg 420
gcgaaactta acctctctcc acatggaacc ttcctggggt ttgtgaaact gccatctcca 480
gccgacctct ctccgggagc atcctctgtg accccgcctg cccctgcgag agagccagga 540
cactctccgc agatcatctc cttctttctt gcgctgacgt cgactgcgtt gctcttcctg 600
ctgttcttcc tcacgctccg tttctctgtt gttaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac 660
atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg cagactactc aagaggagga cggctgttca 720
tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc 780
gcagatgctc cagcctacca acaggggcag aaccagctct acaacgaact caatcttggt 840
cggagagagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggac gggacccaga aatgggcggg 900
aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg 960
gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac 1020
ggactgtacc aggacagcca cttccaagca gttccagtac aggaaaagaa aaaaaggctc 1080
agaagggcac cgtggcgtgc attcgcccag ccccagaggt taaagcaccg aaacaatgaa 1140
ctacctgact ccctagagcc catatataaa aacatttgga acaaaacatt tataggagag 1200
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 15
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
cactctgtcc tgcacctggt tcccattaac gccacctcca aggatgactc cgatgtgaca 60
gaggtgatgt ggcaaccagc tcttaggcgt gggagaggcc tacaggccca aggatatggt 120
gtccgaatcc aggatgctgg agtttatctg ctgtatagcc aggtcctgtt tcaagacgtg 180
actttcacca tgggtcaggt ggtgtctcga gaaggccaag gaaggcagga gactctattc 240
cgatgtataa gaagtatgcc ctcccacccg gaccgggcct acaacagctg ctatagcgca 300
ggtgtcttcc atttacacca aggggatatt ctgagtgtca taattccccg ggcaagggcg 360
aaacttaacc tctctccaca tggaaccttc ctggggtttg tgaaactg 408
<210> 16
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
ccatctccag ccgacctctc tccgggagca tcctctgtga ccccgcctgc ccctgcgaga 60
gagccaggac actctccgca gatcatctcc ttctttcttg cgctgacgtc gactgcgttg 120
ctcttcctgc tgttcttcct cacgctccgt ttctctgttg tt 162
<210> 17
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 18
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctacc aacaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac caggacagcc acttccaagc agttccagta 300
caggaaaaga aaaaaaggct cagaagggca ccgtggcgtg cattcgccca gccccagagg 360
ttaaagcacc gaaacaatga actacctgac tccctagagc ccatatataa aaacatttgg 420
aacaaaacat ttataggaga g 441
<210> 19
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala
20 25 30
Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala
35 40 45
Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp
65 70 75 80
Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg
85 90 95
Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp
100 105 110
Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln
115 120 125
Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn
130 135 140
Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Thr Thr Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
165 170 175
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
180 185 190
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
195 200 205
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
210 215 220
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
225 230 235 240
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
245 250 255
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
260 265 270
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
275 280 285
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
290 295 300
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
305 310 315 320
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
325 330 335
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
340 345 350
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
355 360 365
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375 380
<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 21
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
130 135
<210> 22
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 23
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 25
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala
20 25 30
Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala
35 40 45
Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp
65 70 75 80
Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg
85 90 95
Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp
100 105 110
Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln
115 120 125
Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn
130 135 140
Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Pro Ser Pro
145 150 155 160
Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala
165 170 175
Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu
180 185 190
Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe
195 200 205
Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
245 250 255
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
260 265 270
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
275 280 285
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
290 295 300
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
305 310 315 320
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
325 330 335
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
340 345 350
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360 365
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 27
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
130 135
<210> 28
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe
20 25 30
Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr
35 40 45
Leu Arg Phe Ser Val Val
50
<210> 29
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 31
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala
20 25 30
Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala
35 40 45
Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp
65 70 75 80
Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg
85 90 95
Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp
100 105 110
Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln
115 120 125
Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn
130 135 140
Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Pro Ser Pro
145 150 155 160
Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala
165 170 175
Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu
180 185 190
Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe
195 200 205
Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
245 250 255
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
260 265 270
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
275 280 285
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
290 295 300
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
305 310 315 320
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
325 330 335
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Asp Ser His Phe Gln Ala Val Pro
340 345 350
Val Gln Glu Lys Lys Lys Arg Leu Arg Arg Ala Pro Trp Arg Ala Phe
355 360 365
Ala Gln Pro Gln Arg Leu Lys His Arg Asn Asn Glu Leu Pro Asp Ser
370 375 380
Leu Glu Pro Ile Tyr Lys Asn Ile Trp Asn Lys Thr Phe Ile Gly Glu
385 390 395 400
<210> 32
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 33
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
130 135
<210> 34
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe
20 25 30
Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr
35 40 45
Leu Arg Phe Ser Val Val
50
<210> 35
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 36
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Asp Ser His Phe Gln
85 90 95
Ala Val Pro Val Gln Glu Lys Lys Lys Arg Leu Arg Arg Ala Pro Trp
100 105 110
Arg Ala Phe Ala Gln Pro Gln Arg Leu Lys His Arg Asn Asn Glu Leu
115 120 125
Pro Asp Ser Leu Glu Pro Ile Tyr Lys Asn Ile Trp Asn Lys Thr Phe
130 135 140
Ile Gly Glu
145
<210> 37
<211> 132
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp
1 5 10 15
Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu
20 25 30
Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu
35 40 45
Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln
50 55 60
Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys
65 70 75 80
Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr
85 90 95
Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile
100 105 110
Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe
115 120 125
Leu Gly Phe Val
130
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Lys Gln Lys Lys Gln His
1 5
<210> 39
<211> 655
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Ser His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr
145 150 155 160
Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu
165 170 175
Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln
180 185 190
Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val
195 200 205
Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln
210 215 220
Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg
225 230 235 240
Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu
260 265 270
Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser His Ser Val Leu His Leu Val Pro
290 295 300
Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp
305 310 315 320
Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly
325 330 335
Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu
340 345 350
Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly
355 360 365
Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser
370 375 380
His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His
385 390 395 400
Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala
405 410 415
Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
420 425 430
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
435 440 445
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
450 455 460
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
465 470 475 480
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
485 490 495
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
500 505 510
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
515 520 525
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
530 535 540
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
545 550 555 560
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
565 570 575
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
580 585 590
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
595 600 605
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
610 615 620
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
625 630 635 640
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
645 650 655
<210> 40
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
130 135
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 43
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 44
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 45
<211> 3212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccactgagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctcgtgcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtgaatggcc ctccctgtca 1200
ccgccctgct gcttccgctg gctcttctgc tccacgccgc tcggccccac tcagtactcc 1260
atctcgttcc tatcaatgca acaagcaagg atgattctga cgtgactgag gttatgtggc 1320
aacctgccct ccgaaggggt agaggtctcc aggctcaggg gtacggcgtc cgcatccagg 1380
atgcaggagt ttacttgctc tatagtcagg ttctctttca ggatgtcaca ttcactatgg 1440
ggcaggttgt aagccgggaa ggccaaggta gacaggagac tctttttcga tgcatcagga 1500
gtatgccttc acatccagac cgagcgtaca attcctgcta ctctgctggt gttttccatc 1560
tgcaccaagg tgacattctg tccgtcataa ttccgagagc tagagccaag cttaacctca 1620
gcccacacgg gacctttctg ggcttcgtta agctcggcgg aggctctggg ggagggtccg 1680
ggggcgggag tcattcagtg cttcacctcg tcccgattaa cgcaacaagc aaagatgact 1740
ccgacgtgac tgaagtgatg tggcagccag cattgaggcg aggtagaggt ctccaggctc 1800
aaggatatgg tgtcagaata caggatgcag gagtttatct cctgtacagt caggtgttgt 1860
ttcaggatgt tacttttact atgggccaag ttgtaagtag agaaggtcag ggaaggcaag 1920
agacgctctt caggtgcata cgaagtatgc ccagtcaccc tgatagagca tacaactctt 1980
gctacagtgc gggcgttttt catttgcacc agggagatat cctcagcgtg atcatcccaa 2040
gagcacgcgc aaaattgaac ctctcaccac acggtacctt tctcggtttt gtcaagcttg 2100
gaggcggatc aggagggggc agcggcgggg gctctcactc agttttgcat ctcgtcccta 2160
tcaacgccac gagcaaggac gattcagatg tgactgaagt catgtggcag ccggcccttc 2220
ggaggggaag agggttgcaa gctcagggtt atggggtgcg aatacaggac gcaggggtgt 2280
acctcctcta ttctcaggta ttgttccaag acgtaacctt cacgatgggt caagtcgtct 2340
cccgagaagg tcaagggcgc caagaaaccc tttttaggtg cattagaagc atgccaagcc 2400
atcctgaccg cgcatataac tcatgttact ccgccggcgt gtttcacttg caccaaggtg 2460
atatccttag cgttattatt ccgcgagcgc gggccaagct gaatctttca ccgcacggga 2520
ccttccttgg gtttgtaaaa ctgaccacta ccccagcacc gaggccaccc accccggctc 2580
ctaccatcgc ctcccagcct ctgtccctgc gtccggaggc atgtagaccc gcagctggtg 2640
gggccgtgca tacccggggt cttgacttcg cctgcgatat ctacatttgg gcccctctgg 2700
ctggtacttg cggggtcctg ctgctttcac tcgtgatcac tctttactgt aagcgcggtc 2760
ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag actactcaag 2820
aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc gaactgcgcg 2880
tgaaattcag ccgcagcgca gatgctccag cctaccaaca ggggcagaac cagctctaca 2940
acgaactcaa tcttggtcgg agagaggagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggacggg 3000
acccagaaat gggcgggaag ccgcgcagaa agaatcccca agagggcctg tacaacgagc 3060
tccaaaagga taagatggca gaagcctata gcgagattgg tatgaaaggg gaacgcagaa 3120
gaggcaaagg ccacgacgga ctgtaccagg gactcagcac cgccaccaag gacacctatg 3180
acgctcttca catgcaggcc ctgccgcctc gg 3212
<210> 46
<211> 1184
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccactgagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctcgtgcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184
<210> 47
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 48
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
cactcagtac tccatctcgt tcctatcaat gcaacaagca aggatgattc tgacgtgact 60
gaggttatgt ggcaacctgc cctccgaagg ggtagaggtc tccaggctca ggggtacggc 120
gtccgcatcc aggatgcagg agtttacttg ctctatagtc aggttctctt tcaggatgtc 180
acattcacta tggggcaggt tgtaagccgg gaaggccaag gtagacagga gactcttttt 240
cgatgcatca ggagtatgcc ttcacatcca gaccgagcgt acaattcctg ctactctgct 300
ggtgttttcc atctgcacca aggtgacatt ctgtccgtca taattccgag agctagagcc 360
aagcttaacc tcagcccaca cgggaccttt ctgggcttcg ttaagctc 408
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
ggcggaggct ctgggggagg gtccgggggc gggagt 36
<210> 50
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
cattcagtgc ttcacctcgt cccgattaac gcaacaagca aagatgactc cgacgtgact 60
gaagtgatgt ggcagccagc attgaggcga ggtagaggtc tccaggctca aggatatggt 120
gtcagaatac aggatgcagg agtttatctc ctgtacagtc aggtgttgtt tcaggatgtt 180
acttttacta tgggccaagt tgtaagtaga gaaggtcagg gaaggcaaga gacgctcttc 240
aggtgcatac gaagtatgcc cagtcaccct gatagagcat acaactcttg ctacagtgcg 300
ggcgtttttc atttgcacca gggagatatc ctcagcgtga tcatcccaag agcacgcgca 360
aaattgaacc tctcaccaca cggtaccttt ctcggttttg tcaagctt 408
<210> 51
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
ggaggcggat caggaggggg cagcggcggg ggctct 36
<210> 52
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
cactcagttt tgcatctcgt ccctatcaac gccacgagca aggacgattc agatgtgact 60
gaagtcatgt ggcagccggc ccttcggagg ggaagagggt tgcaagctca gggttatggg 120
gtgcgaatac aggacgcagg ggtgtacctc ctctattctc aggtattgtt ccaagacgta 180
accttcacga tgggtcaagt cgtctcccga gaaggtcaag ggcgccaaga aacccttttt 240
aggtgcatta gaagcatgcc aagccatcct gaccgcgcat ataactcatg ttactccgcc 300
ggcgtgtttc acttgcacca aggtgatatc cttagcgtta ttattccgcg agcgcgggcc 360
aagctgaatc tttcaccgca cgggaccttc cttgggtttg taaaactg 408
<210> 53
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 180
ctttcactcg tgatcactct ttactgt 207
<210> 54
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 55
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctacc aacaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
<210> 56
<211> 432
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Ser His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr
145 150 155 160
Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu
165 170 175
Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln
180 185 190
Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val
195 200 205
Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln
210 215 220
Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg
225 230 235 240
Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu
260 265 270
Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser His Ser Val Leu His Leu Val Pro
290 295 300
Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp
305 310 315 320
Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly
325 330 335
Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu
340 345 350
Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly
355 360 365
Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser
370 375 380
His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His
385 390 395 400
Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala
405 410 415
Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
420 425 430
<210> 57
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys
130 135 140
Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly His Ser Val Leu His Leu
145 150 155 160
Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val
165 170 175
Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly
180 185 190
Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln
195 200 205
Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg
210 215 220
Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met
225 230 235 240
Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val
245 250 255
Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala
260 265 270
Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val
275 280 285
Lys Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
290 295 300
Ser Thr Lys Gly His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr
305 310 315 320
Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu
325 330 335
Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln
340 345 350
Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val
355 360 365
Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln
370 375 380
Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg
385 390 395 400
Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly
405 410 415
Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu
420 425 430
Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Thr Thr Thr Pro
435 440 445
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
450 455 460
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
465 470 475 480
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
485 490 495
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
500 505 510
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
515 520 525
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
530 535 540
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
545 550 555 560
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
565 570 575
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
580 585 590
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
595 600 605
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
610 615 620
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
625 630 635 640
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
645 650 655
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
660 665
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 59
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys
130 135 140
Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly His Ser Val Leu His Leu
145 150 155 160
Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val
165 170 175
Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly
180 185 190
Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln
195 200 205
Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg
210 215 220
Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met
225 230 235 240
Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val
245 250 255
Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala
260 265 270
Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val
275 280 285
Lys Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
290 295 300
Ser Thr Lys Gly His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr
305 310 315 320
Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu
325 330 335
Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln
340 345 350
Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val
355 360 365
Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln
370 375 380
Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg
385 390 395 400
Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly
405 410 415
Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu
420 425 430
Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
435 440
<210> 60
<211> 250
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu
35 40 45
Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg
50 55 60
Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp
65 70 75 80
Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn
85 90 95
Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys
100 105 110
Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys
115 120 125
Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg
130 135 140
Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala
145 150 155 160
Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe
165 170 175
Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr
180 185 190
Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr
195 200 205
Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile
210 215 220
Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro
225 230 235 240
His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
245 250
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 62
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 63
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly
<210> 64
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala
20 25 30
Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala
35 40 45
Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp
65 70 75 80
Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg
85 90 95
Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp
100 105 110
Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln
115 120 125
Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn
130 135 140
Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser His Ser Val Leu His Leu Val
165 170 175
Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met
180 185 190
Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr
195 200 205
Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val
210 215 220
Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu
225 230 235 240
Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro
245 250 255
Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe
260 265 270
His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg
275 280 285
Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys
290 295 300
Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser His Ser Val
305 310 315 320
Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val
325 330 335
Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln
340 345 350
Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu
355 360 365
Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val
370 375 380
Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile
385 390 395 400
Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser
405 410 415
Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile
420 425 430
Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu
435 440 445
Gly Phe Val Lys Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
450 455 460
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
465 470 475 480
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
485 490 495
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
500 505 510
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
515 520 525
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
530 535 540
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
545 550 555 560
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
565 570 575
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
580 585 590
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
595 600 605
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
610 615 620
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
625 630 635 640
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
645 650 655
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
660 665 670
Leu Pro Pro Arg
675
<210> 65
<211> 688
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala
20 25 30
Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala
35 40 45
Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp
65 70 75 80
Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg
85 90 95
Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp
100 105 110
Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln
115 120 125
Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn
130 135 140
Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Gly Ser Thr
145 150 155 160
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly His
165 170 175
Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser
180 185 190
Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly
195 200 205
Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr
210 215 220
Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly
225 230 235 240
Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg
245 250 255
Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys
260 265 270
Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val
275 280 285
Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr
290 295 300
Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
305 310 315 320
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly His Ser Val Leu His Leu Val
325 330 335
Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met
340 345 350
Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr
355 360 365
Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val
370 375 380
Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu
385 390 395 400
Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro
405 410 415
Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe
420 425 430
His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg
435 440 445
Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys
450 455 460
Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
465 470 475 480
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
485 490 495
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
500 505 510
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
515 520 525
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
530 535 540
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
545 550 555 560
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
565 570 575
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
580 585 590
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
595 600 605
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
610 615 620
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
625 630 635 640
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
645 650 655
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
660 665 670
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675 680 685
<210> 66
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Arg或Lys
<400> 66
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 67
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 67
Arg Lys Arg Arg
1

Claims (118)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含：
a)两个或更多个细胞外结构域，所述细胞外结构域各自包含肿瘤坏死因子(TNF)超家族受体配体或其一部分；
b)跨膜结构域；和
c)细胞内信号传导结构域。
2.根据权利要求1所述的CAR多肽，其中所述跨膜结构域包含铰链/跨膜结构域。
3.根据权利要求1所述的CAR多肽，其还包含一个或多个共刺激结构域。
4.根据权利要求1所述的CAR多肽，其中所述TNF超家族受体配体是增殖诱导配体(APRIL)。
5.根据权利要求1所述的CAR多肽，其中所述TNF超家族受体配体是TNF-α、淋巴毒素β、OX40配体(OX40L)、CD154、Fas配体(FasL)、LIGHT、TNF样配体1A(TL1A)、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体(4-1BBL)、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、核因子κB受体激活剂配体(RANKL)、TNF相关弱凋亡诱导剂(TWEAK)、B细胞激活因子(BAFF)、钙调节配体(CAMLG)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3(NT-3)、神经营养蛋白4(NT-4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(TNFR)相关蛋白(GITR)配体或外异蛋白A2(EDA-A2)。
6.根据权利要求1所述的CAR多肽，其中所述两个或更多个细胞外结构域各自包含相同TNF超家族受体配体的一部分。
7.根据权利要求1所述的CAR多肽，其中所述细胞外结构域中的至少两个各自包含不同TNF超家族受体配体的一部分。
8.根据权利要求1所述的CAR多肽，其中所述两个或更多个细胞外结构域通过一个或多个接头序列彼此连接。
9.根据权利要求8所述的CAR多肽，其中每个接头序列包含与SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据9所述的CAR多肽，其中每个接头序列包含SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的CAR多肽，其还包含前导序列。
12.根据权利要求11所述的CAR多肽，其中所述前导序列是CD8前导序列。
13.根据权利要求12所述的CAR多肽，其中所述CD8前导序列包含SEQ ID NO:20、26或32的序列。
14.根据权利要求4所述的CAR多肽，其中APRIL的所述部分不包含APRIL的富赖氨酸区域。
15.根据权利要求4所述的CAR多肽，其中APRIL的所述部分不包含弗林蛋白酶切割位点。
16.根据权利要求4所述的CAR多肽，其中APRIL的所述部分包含SEQ ID NO:21、27、33或40的序列。
17.根据权利要求2所述的CAR多肽，其中所述铰链和跨膜结构域包含CD28、CD8或4-1BB的铰链和跨膜结构域。
18.根据权利要求17所述的CAR多肽，其中所述CD8铰链和跨膜结构域包含SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列。
19.根据权利要求17所述的CAR多肽，其中所述4-1BB铰链和跨膜结构域包含SEQ IDNO:28或34的氨基酸序列。
20.根据权利要求1所述的CAR多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ、CD3ε或CD3θ的细胞内信号传导结构域。
21.根据权利要求20所述的CAR多肽，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:24、30或44的氨基酸序列。
22.根据权利要求20所述的CAR多肽，其中所述CD3θ细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列。
23.根据权利要求3所述的CAR多肽，其中所述共刺激结构域包含4-1BB、CD28、CD27、ICOS或OX40的细胞内结构域。
24.根据权利要求23所述的CAR多肽，其中所述共刺激结构域是4-1BB的细胞内结构域。
25.根据权利要求24所述的CAR多肽，其中4-1BB的所述细胞内结构域包含SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列。
26.根据权利要求1所述的CAR多肽，其中所述CAR多肽包含三个细胞外结构域，所述细胞外结构域各自包含TNF超家族受体配体的一部分。
27.一种CAR多肽，其与SEQ ID NO:39、57、64或65的序列具有至少95％序列同一性，或者由与SEQ ID NO:45的序列具有至少95％序列同一性的序列编码。
28.一种CAR多肽，其包含SEQ ID NO:39、57、64或65的序列，或者由SEQ ID NO:45的序列编码。
29.一种CAR多肽，其包含与SEQ ID NO:39、57、64或65的序列相对应的序列，或者由SEQID NO:45的序列编码。
30.一种多肽复合物，其包含两种或更多种根据权利要求1所述的CAR多肽。
31.根据权利要求30所述的多肽复合物，其中所述多肽复合物包含三种根据权利要求1所述的CAR多肽。
32.一种哺乳动物细胞，其包含：
a)根据权利要求1所述的CAR多肽；
b)编码根据权利要求1所述的CAR多肽的核酸；或
c)包含两种或更多种根据权利要求1所述的CAR多肽的多肽复合物。
33.根据权利要求32所述的细胞，其中所述细胞是T或自然杀伤(NK)细胞。
34.根据权利要求32所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
35.根据权利要求32所述的细胞，其中所述细胞从患有或被诊断为患有癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病或障碍的个体获得。
36.一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、淀粉样变性、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥的方法，所述方法包括：
a)将T细胞工程化以在T细胞表面上包含根据权利要求1所述的CAR多肽；以及
b)向所述受试者给予所述工程化T细胞。
37.一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥的方法，所述方法包括向所述受试者给予根据权利要求32所述的细胞。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述癌症是BAFF+、B细胞成熟抗原(BCMA)+和/或跨膜激活剂和钙调节配体(CAML)相互作用分子(TACI)+。
39.根据权利要求36或37所述的方法，其中还向所述受试者给予抗BCMA疗法。
40.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述受试者对抗BCMA疗法有抗性。
41.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤、郁积型骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症。
42.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。
43.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述受试者具有高水平的抗人白细胞抗原(HLA)抗体。
44.一种被配制用于治疗癌症的组合物，其包含根据权利要求1所述的CAR多肽。
45.根据权利要求44所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
46.一种治疗对抗BCMA疗法有抗性的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含CAR和/或编码所述CAR的多核苷酸，其中所述CAR包含含有两个或更多个APRIL结构域的细胞外靶标结合结构域。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者患有癌症、浆细胞障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述癌症包含表达BCMA和/或TACI的细胞。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述癌症包含具有降低的BCMA表达的细胞。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤或郁积型骨髓瘤。
52.根据权利要求47所述的方法，其中所述浆细胞障碍是淀粉样变性。
53.根据权利要求47所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或障碍选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。
54.根据权利要求47所述的方法，其中所述受试者具有高水平的抗HLA抗体。
55.根据权利要求46所述的方法，其中所述CAR包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
56.根据权利要求46所述的方法，其中所述CAR还包含一个或多个共刺激结构域。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述跨膜结构域包含铰链/跨膜结构域。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述铰链/跨膜结构域包含免疫球蛋白样蛋白、CD28、CD8或4-1BB的铰链/跨膜结构域。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述铰链/跨膜结构域包含CD8的铰链/跨膜结构域，其任选地包含SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述铰链/跨膜结构域包含4-1BB的铰链/跨膜结构域，其任选地包含SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列。
61.根据权利要求55所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3δ、CD3ε、CD3η、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞内信号传导结构域。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含SEQ ID NO:24、30或44的氨基酸序列。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3θ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
64.根据权利要求56所述的方法，其中所述共刺激结构域包含4-1BB、CD27、CD28或OX40的共刺激结构域。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述共刺激结构域包含4-1BB的共刺激结构域，其任选地包含SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列。
66.根据权利要求46所述的方法，其中每个APRIL结构域包含与SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
67.根据权利要求66所述的方法，其中每个APRIL结构域包含SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列。
68.根据权利要求46所述的方法，其中所述APRIL结构域通过一个或多个接头序列彼此连接。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述接头序列包含与SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述接头序列包含SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列。
71.根据权利要求46所述的方法，其中所述细胞外靶标结合结构域包含三个APRIL结构域。
72.根据权利要求46所述的方法，其中所述细胞外靶标结合结构域包含与SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
73.根据权利要求46所述的方法，其中所述细胞外靶标结合结构域包含SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列。
74.根据权利要求46所述的方法，其中所述CAR包含与SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
75.根据权利要求46所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列。
76.根据权利要求46所述的方法，其中编码所述CAR的所述多核苷酸还包含自杀基因。
77.根据权利要求46所述的方法，其中编码所述CAR的所述多核苷酸还包含编码信号序列的序列。
78.根据权利要求46所述的方法，其中所述免疫细胞是T或NK细胞。
79.根据权利要求46所述的方法，其中所述免疫细胞是人细胞。
80.一种CAR，其包含含有三个APRIL结构域的细胞外靶标结合结构域。
81.根据权利要求80所述的CAR，其中所述CAR包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
82.根据权利要求81所述的CAR，其中所述CAR还包含一个或多个共刺激结构域。
83.根据权利要求81所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含铰链/跨膜结构域。
84.根据权利要求83所述的CAR，其中所述铰链/跨膜结构域包含免疫球蛋白样蛋白、CD28、CD8或4-1BB的铰链/跨膜结构域。
85.根据权利要求84所述的CAR，其中所述铰链/跨膜结构域包含CD8的铰链/跨膜结构域，其任选地包含SEQ ID NO:22或42的氨基酸序列。
86.根据权利要求84所述的CAR，其中所述铰链/跨膜结构域包含4-1BB的铰链/跨膜结构域，其任选地包含SEQ ID NO:28或34的氨基酸序列。
87.根据权利要求81所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3δ、CD3ε、CD3η、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞内信号传导结构域。
88.根据权利要求87所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含SEQ ID NO:24、30或44的氨基酸序列。
89.根据权利要求87所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3θ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
90.根据权利要求82所述的CAR，其中所述共刺激结构域包含4-1BB、CD27、CD28或OX40的共刺激结构域。
91.根据权利要求90所述的CAR，其中所述共刺激结构域包含4-1BB的共刺激结构域，其任选地包含SEQ ID NO:23、29、35或43的氨基酸序列。
92.根据权利要求80所述的CAR，其中每个APRIL结构域包含与SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
93.根据权利要求92所述的CAR，其中每个APRIL结构域包含SEQ ID NO:21、27、33或40的氨基酸序列。
94.根据权利要求80所述的CAR，其中所述APRIL结构域通过一个或多个接头序列彼此连接。
95.根据权利要求94所述的CAR，其中所述接头序列包含与SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
96.根据权利要求95所述的CAR，其中所述接头序列包含SEQ ID NO:41、58、61、62或63的氨基酸序列。
97.根据权利要求80所述的CAR，其中所述细胞外靶标结合结构域包含与SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
98.根据权利要求80所述的CAR，其中所述细胞外靶标结合结构域包含SEQ ID NO:56或59的氨基酸序列。
99.根据权利要求80所述的CAR，其中所述CAR包含与SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
100.根据权利要求80所述的CAR，其中所述CAR包含SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列。
101.一种CAR，其包含与SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
102.一种CAR，其包含SEQ ID NO:39、57、64或65的氨基酸序列。
103.一种多核苷酸，其编码根据权利要求80所述的CAR。
104.根据权利要求103所述的多核苷酸，其还包含自杀基因。
105.根据权利要求103所述的多核苷酸，其还包含编码信号序列的序列。
106.一种免疫细胞，其包含根据权利要求80所述的CAR和/或编码所述CAR的多核苷酸。
107.根据权利要求106所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T或NK细胞。
108.根据权利要求106所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是人细胞。
109.一种药物组合物，其包含根据权利要求80所述的CAR。
110.一种治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、自身免疫性疾病或障碍、或移植排斥的方法，所述方法包括向所述受试者给予根据权利要求106所述的免疫细胞和/或其药物组合物。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述癌症包含表达BCMA和/或TACI的细胞。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述癌症包含具有降低的BCMA表达的细胞。
113.根据权利要求110所述的方法，其中所述受试者对抗BCMA疗法有抗性。
114.根据权利要求110所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤或郁积型骨髓瘤。
116.根据权利要求110所述的方法，其中所述浆细胞障碍是淀粉样变性。
117.根据权利要求110所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或障碍选自具有抗凝血因子抗体的血友病、重症肌无力、多发性硬化症和慢性移植物抗宿主病。
118.根据权利要求110所述的方法，其中所述受试者具有高水平的抗HLA抗体。
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