CN105601752B - 一种多基因重组嵌合抗原受体分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种多基因重组嵌合抗原受体分子；本发明的多基因重组嵌合抗原受体分子，包括：1)两个通过连接肽相连的、结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段的胞外区和跨膜区结构域；以及2)共刺激信号分子胞内结构域肽段；本发明的多基因重组嵌合抗原受体分子，具有完整表达、保持识别、结合功能的特异性，同时具有活化T细胞作用和生存能力延长功能。

Description

一种多基因重组嵌合抗原受体分子

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种多基因重组嵌合抗原受体分子。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命的疾病。恶性肿瘤或癌症的发病机理多种多样，其共同的表现在于变异的肿瘤细胞不受机体免疫系统的清除，能够无限制的繁殖和扩散，破坏周围组织的正常细胞和功能。长期以来，医药学界在尝试医治和控制肿瘤疾病的病程方面做了大量的努力，但收效甚微。目前，在恶性肿瘤的治疗上，除根除手术外，主流医学界的临床辅助治疗手段仍然是放射线治疗、化学药物治疗和抗体治疗。现有的治疗手段，对于肿瘤的复发几乎无效。

1985年，美国科学家尝试分离病人的单个核细胞，并在体外用各种细胞因子诱导、激活、产生杀伤性T细胞(Cytokine-induced killer cells，CIK)，继而发现这些细胞通过静脉滴注回输给病人后，对肿瘤的生长有杀伤作用。经过近三十年的临床应用和技术发展，用免疫杀伤细胞治疗肿瘤已经成为第四种公认的恶性肿瘤辅助治疗手段。常见的用于临床治疗的免疫杀伤细胞：自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)、γδT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)、NK样T淋巴细胞(Natural killer-like Tcells，NKT)、Th1效应细胞(Effector cells)等。抗原提呈细胞之一树突状细胞(Dentriticcells，DC)也常用于免疫细胞治疗的应用，DC可以提高免疫杀伤细胞的特异性、加强免疫杀伤细胞的活力。

免疫活性细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤效果，取决于肿瘤细胞膜表面的受体分子表达。例如，γδT细胞、细胞毒性T淋巴细胞、Th1效应细胞等是通过T细胞受体(TCR)识别肿瘤细胞表达的组织相容性复合物(MHC)或白细胞抗原(HLA)结合的“抗原”肽片段序列而实施杀伤的；对于不表达MHC或HLA的肿瘤细胞无杀伤作用。而NKT、NK和γδT细胞的杀伤作用通过其他受体(CD1d、KAR等)结合机制，不依赖于肿瘤细胞MHC的表达。与大部分正常组织细胞相似，很多种肿瘤细胞并不表达或弱表达MHC分子，因此肿瘤细胞膜表面MHC分子表达的多样性是免疫细胞治疗疗效及临床应用推广受限的原因之一。

为了克服免疫杀伤细胞特异性低下的缺点，美国科学家发明一种转基因的方法：将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段(Single chain antibody fragment of variable regions，scFv)，再与其他基因的跨膜蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，转染至T细胞内而形成嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor，CAR-T)。早期CAR-T的信号肽是CD3受体的Zeta亚基，后来发现嵌合CD28、CD137等蛋白的胞内信号肽后能加强Zeta的作用并显著延长CAR-T细胞的体内生存时间。临床研究结果表明，不同单抗制备的转基因CAR-T细胞对不同肿瘤有不同程度的疗效，明显高于非特异性的免疫杀伤细胞；其中“抗CD19单抗-CAR-T”细胞对急、慢性淋巴性白血病的疗效达到93％。这是恶性肿瘤治疗领域的一项重大突破。

CAR-T细胞在临床对其他实体瘤的治疗效果明显低于“抗CD19单抗-CAR-T”细胞对急、慢性淋巴性白血病的疗效。原因之一是淋巴性白血病癌细胞中95％都表达B细胞抗原CD19，而其他实体瘤细胞的特异性抗原表达在40-70％之间；所以在实体瘤的治疗中，单一的单抗CAR-T细胞不可能杀伤表达其他肿瘤特异性抗原的癌细胞。原因之二是免疫杀伤细胞通过血液/淋巴液循环浸润到实体肿瘤的速度和数目。原因之三是肿瘤组织细胞对免疫活性细胞的负调节作用。

在正常情况下，人体的血液循环中存在少量的活性杀伤细胞，如NK，γδT细胞等，其作用在于清除衰老、变异的组织细胞或抵御病毒入侵。免疫细胞的活性主要受到T调节细胞(Regulatory T cells，Treg)的控制，当T调节细胞的控制减弱时，会造成免疫功能亢进或产生自身免疫性疾病；当控制增强时，会使免疫功能低下，滋生肿瘤或其他病毒性皮肤病。目前确认的参与负调节的蛋白因子有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen-4,CTLA4)和程序性死亡蛋白1/程序性死亡蛋白1配基1(Programmed cell death protein 1/Programmed cell death protein 1 ligand 1，PD-1/PD-L1)等分子。抑制性T调节细胞表达CTLA4，可以与免疫细胞DC和T细胞表面的B7族蛋白亚基相互作用，抑制免疫细胞功能。B7蛋白家族成员有B7-H1(PD-L1)，B7-H2(PD-1L2)等。B7-H1(PD-L1)也可以通过结合淋巴细胞PD-1分子，进一步抑制靶细胞的活性功能。PD-1和PD-L1相互作用对T细胞功能的抑制是免疫细胞治疗肿瘤的一个主要障碍。在大多数实体瘤组织中，癌细胞表达PD-L1/PD-1的水平增高，对浸润到癌组织的活化淋巴细胞产生直接的抑制，这也是肿瘤逃逸机体免疫监管的机制之一；活化T细胞表面PD-1的表达增加，更容易受到负调节的抑制。最新的抗体药物CTLA4单抗、PD-1单抗以及PD-L1单抗已被美国FDA批准临床治疗恶性肿瘤，其作用原理是阻断CTLA4/B7以及PD-1/PD-L1的相互结合，从而解除体内T调节细胞或癌细胞对活性T杀伤细胞的抑制，让体内免疫活性细胞对肿瘤细胞进行杀伤、清除。有研究表明，体外活化的免疫杀伤细胞与体内自然存在的组织浸润性T淋巴细胞(Tissue infiltration lymphocytes，TIL)不同，是高水平表达PD-1分子，这也许是阻碍循环免疫杀伤细胞杀伤实体瘤组织癌细胞的原因。在临床应用中，如果免疫细胞治疗联合使用抗CTLA和PD-1/PD-L1的单抗药物，可以明显提高免疫细胞治疗的疗效。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有完整表达、保持识别、结合功能的特异性，同时具有活化T细胞作用和生存能力延长功能多基因重组嵌合抗原受体分子。

本发明第一方面提供一种多基因重组嵌合抗原受体分子，包括：

1)两个通过连接肽相连的、结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段的胞外区和跨膜区；以及

2)共刺激信号分子胞内结构域肽段。

进一步的，所述免疫抑制分子选自肿瘤细胞或肿瘤基质细胞膜蛋白，所述结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段为相应免疫抑制分子的配体/受体天然肽段、或者单链抗体。

进一步的，所述配体/受体天然肽段包括PD-1和PD-L1，所述单链抗体包括Anti-CD44-scFv。

进一步的，所述多基因重组嵌合抗原受体分子的跨膜区选自PD-1或PD-L1或PD-L2的跨膜区。

进一步的，所述共刺激信号分子胞内结构域肽段选自CD28、CD3zeta、CD137的胞内结构域肽段中的一种或多种。

进一步的，所述多基因重组嵌合抗原受体分子还包括信号肽。信号肽可以提高多基因重组嵌合抗原受体分子这种融合蛋白分泌的效果，在信号肽与融合蛋白其它氨基酸序列一起被表达后，最终被蛋白酶切除。蛋白酶具有一定的识别序列，而信号肽与其后面的肽段融合后构成新的氨基酸序列，所以如果选择的信号肽不当，可能会导致蛋白酶的误切，蛋白失活。

进一步的，所述多基因重组嵌合抗原受体分子的氨基酸序列包含或为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的氨基酸序列。

本发明第二方面提供一种多核苷酸，其编码本发明第一方面提供的多基因重组嵌合抗原受体分子。

进一步的，包含或为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

本发明第三方面提供一种重组载体，其包含本发明第二方面提供的多核苷酸。

本发明第四方面提供一种重组细胞，其包含本发明第三方面提供的重组载体。

在本发明中：

术语“肿瘤基质细胞”是指肿瘤微环境内一些支撑肿瘤细胞的恶性增殖、抗凋亡、侵袭、转移，逃脱免疫监控等生命活动的细胞，主要包括成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、调节性T细胞(Treg)、未分化的骨髓细胞、内皮细胞、周细胞和血小板、内皮细胞等。

术语“免疫抑制分子”是指由肿瘤细胞或肿瘤基质细胞产生，起抑制免疫作用，使肿瘤细胞逃脱机体免疫监控，诱导免疫耐受的分子。

术语“共刺激信号分子”(Co-stimulating molecule)是指免疫细胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通过与其配体结合，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。

术语“胞外区”是指膜蛋白位于细胞外的区段。

术语“结构域”是指蛋白质生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，常见结构域的氨基酸残基数在100～400个之间，最小的结构域只有40～50个氨基酸残基，大的结构域可超过400个氨基酸残基。

术语“单链抗体”(single-chain antibody variable region fragment,scFv)是指由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经Linker连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。

术语“PD-1”是指人类程序性死亡因子1(programmed cell death protein1)，基因名称PDCD1_HUMAN，对应蛋白序列编号有UniProtKB-Q15116，是T细胞免疫抑制分子，其胞外区结构域类似免疫球蛋白的可变区(V-section)，具有特异性结合其配体PD-L1和PD-L2(Programmed cell death protein 1 ligand 1/2)的特性。PD-1通常在活化的T淋巴细胞中表达，在多种恶性肿瘤细胞中也有表达。

术语“PD-L1”、“PD-L2”是指目前发现的人类程序性死亡因子1配基1和配基2(programmed cell death protein 1 ligand 1/2)。其胞外区结构域具有类似免疫球蛋白的V和C1区，通过V区与PD-1的V区相结合(4zqk Structure 23 2341-2348，2015)。通常在树突状细胞DC、T调节细胞和Th细胞、巨噬细胞、Mast细胞和骨髓中少量表达，在多种恶性肿瘤细胞中也有表达。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明涉及运用分子生物学方法，在常见单克隆CAR结构中加入PD-1/PD-L1/PD-L2分子片段的构建，形成多基因/多功能的CAR分子。亚克隆的PD-1/PD-L1/PD-L2片段包括其胞外和跨膜片段，其胞外部分通过连接肽(Linker)与单链抗体嵌合，仍然保持识别、结合肿瘤抗原的特异性；其胞内部分与受体，例如CD28/CD3，的胞浆内信号分子嵌合，仍然保持活化T细胞作用和生存能力延长的功能。由于自身胞内信号片段的删除，嵌入的PD-1/PD-L1/PD-L2胞外片段和Treg、肿瘤细胞的CTLA4/PD-1/PD-L1结合，一方面失去了抑制T细胞活性的功能，或者说将负调节信号转变为CD28/CD3的正调节信号；另一方面作为“假性诱饵”(Decoy)减少Treg、肿瘤细胞对其他活化T淋巴细胞的抑制。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是多基因CAR构建示意图；

图2是质粒pIres2-EGFP-Clone28ZT用限制性内切酶Bgl II和Sal I作酶切实验的结果图；

图3是质粒pIres2-EGFP-anti-CD44scFv用限制性内切酶Nhe I和Bgl II作酶切实验的结果图；

图4是四种CAR分子构建示意图；

图5是四种CAR分子在真核细胞内的表达图；

图6是Western blot检测CAR结构中PD-1和PD-L1蛋白片段的表达图；

图7是CAR分子在CD3+CIK细胞中表达结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 常见CAR结构跨膜和胞内信号肽片段的构建

基因载体选用真核荧光表达质粒pIres2-EGFP。选定CD28跨膜、胞内片段(UniProtKB：P10747-1，340nt-660nt)和CD3zeta片段(UniProtKB：P20963-1，154nt-495nt)，两端设计5’BglII和3’SalI酶切位点，其中CD28胞内共刺激序列AGGCTCCTG根据文献记载(Blood.2003；102:4320-4325)，变更为CGCGGAGGA，其编码氨基酸由双亮氨酸变为双甘氨酸。该段序列标记为28ZT，序列具体如下：

AGATCTATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCCGCGGAGGACACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAGTCGAC(SEQ ID NO：1)

其中，上述序列中的下划线部分，为酶切位点序列。上述序列经限制性内切酶处理，亚克隆到限制性内切酶处理的pIres2-EGFP上，命名为pIres2-EGFP-Clone 28ZT，插入基因全长660nt(加终止密码+酶切位点750nt)。如图2所示，质粒pIres2-EGFP-Clone28ZT用限制性内切酶Bgl II和Sal I作酶切实验的结果显示，图中Lane M为DNA分子大小标志，Lane 1为BglII and Sal I酶切消化的质粒pIres2-EGFP-Clone28ZT，插入基因片段663nt，插入片段与理论值相似。

实施例2 PD-1(PDCD1)跨膜和胞内信号肽片段的构建

从5’端Bgl II开始，设计一个Kozak序列(GCCACC)，起始密码ATG和编码15个氨基酸的连接肽的核酸序列。连接肽核酸序列3’下游依次连接：PD-1(UniProtKB：Q15116，61nt-588nt)，CD28(UniProtKB：P10747-1，538nt-660nt)，CD3zeta(UniProtKB：P20963-1，154nt-495nt)，最后是Sal I酶切位点序列。该段序列标记为PD-1-28ZT，序列具体如下：

AGATCTGCCACCATGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCTGCTCCCGGGCCGCAAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAGTC GAC(SEQ ID NO：2)

其中，上述序列中的下划线部分，为酶切位点序列。上述序列全长1044nt(加终止密码和酶切位点1059nt)，经全基因合成后亚克隆到酶切好的载体，命名为pIres2-EGFP-ClonePD-1-28ZT。

实施例3 PD-L1跨膜和胞内信号肽片段的构建

从5’端Bgl II开始，设计一个Kozak序列(GCCACC)，起始密码ATG和编码15个氨基酸的连接肽的核酸序列。连接肽核酸序列3’下游依次连接：PD-L1(UniProtKB：Q9NZQ7，55nt-792nt)，CD28(UniProtKB：P10747-1，538nt-660nt)，CD3zeta(UniProtKB：P20963-1，154nt-495nt)，最后是Sal I酶切位点序列。该段序列标记为PD-L1-28ZT，序列具体如下：

AGATCTGCCACCATGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCGTTTACTGTCACGGTTCCCAAGGACCTATATGTGGTAGAGTATGGTAGCAATATGACAATTGAATGCAAATTCCCAGTAGAAAAACAATTAGACCTGGCTGCACTAATTGTCTATTGGGAAATGGAGGATAAGAACATTATTCAATTTGTGCATGGAGAGGAAGACCTGAAGGTTCAGCATAGTAGCTACAGACAGAGGGCCCGGCTGTTGAAGGACCAGCTCTCCCTGGGAAATGCTGCACTTCAGATCACAGATGTGAAATTGCAGGATGCAGGGGTGTACCGCTGCATGATCAGCTATGGTGGTGCCGACTACAAGCGAATTACTGTGAAAGTCAATGCCCCATACAACAAAATCAACCAAAGAATTTTGGTTGTGGATCCAGTCACCTCTGAACATGAACTGACATGTCAGGCTGAGGGCTACCCCAAGGCCGAAGTCATCTGGACAAGCAGTGACCATCAAGTCCTGAGTGGTAAGACCACCACCACCAATTCCAAGAGAGAGGAGAAGCTTTTCAATGTGACCAGCACACTGAGAATCAACACAACAACTAATGAGATTTTCTACTGCACTTTTAGGAGATTAGATCCTGAGGAAAACCATACAGCTGAATTGGTCATCCCAGAACTACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAGGACTCACTTGGTAATTCTGGGAGCCATCTTATTATGCCTTGGTGTAGCACTGACATTCATCTTCCGTTTAAGAAAAGGGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAGTCGAC(SEQ ID NO：3)

其中，上述序列中的下划线部分，为酶切位点序列。上述序列全长1254nt(加终止密码子和酶切位点1269nt)，经全基因合成后亚克隆到酶切好的载体，称为pIres2-EGFP-ClonePD-L1-28ZT。

实施例4 单链抗体anti-CD44scFv-CAR及分泌引导信号肽片段的构建

根据申请号为2007/0237761/A1的美国专利，选择和修改anti-CD44单链抗体序列，将文献中轻链、重链可变区分别缩短为339nt和363nt。以CD8a信号肽+重链+连接肽+轻链的顺序合成Anti-CD44-scFv，序列具体如下：

GCTAGCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGATGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTAGGTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACGGCGATGGTCCGATTACTTTGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCCGATGTTGTGATGACTCAGACCCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAATCAAGTCAGAGCCTCTTACATAGTAATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAATCTGGAGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGAATTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTCGGGAGTTTATTACTGCTTGCAAGCTACACATTTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAACTGGAGCTGAAACGGAGATCT(SEQ IDNO：4)

其中，上述序列中的下划线部分，为酶切位点序列。CD8a分泌引导信号肽的核酸序列如SEQ ID NO：14所示。在信号肽核酸序列5’端设置内切酶位点Nhe I，轻链3’端酶切位点为Bgl II。如图3所示，质粒pIres2-EGFP-anti-CD44scFv用限制性内切酶Nhe I和Bgl II作酶切实验的结果，图中Lane M为DNA分子大小标志，Lane 1为Nhe I和Bgl II酶切消化的质粒，插入基因810nt；Lane 2为质粒pIres2-EGFP-anti-CD44scFv，插入片段与理论值相似。重链和轻链之间的连接肽为15个氨基酸(SEQ ID NO：15)。全基因合成后的Anti-CD44-scFv经酶切处理，分别亚克隆至：1)质粒pIres2-EGFP-28ZT；2)质粒pIres2-EGFP-PD-1-28ZT；和3)质粒pIres2-EGFP-PD-L1-28ZT。上述三种Anti-CD44-scFv-CAR的组合序列CAR1(pIres2-EGFP-anti-CD44scFv-28ZT)、CAR2(pIres2-EGFP-anti-CD44scFv-PD-1-28ZT)、CAR3(pIres2-EGFP-anti-CD44scFv-PD-L1-28ZT)分别为1479nt、1860nt、2070nt。未经修饰的CAR1、CAR2、CAR3嵌合受体蛋白的表观分子量分别为59,160道尔顿、74,400道尔顿和82,800道尔顿。

上述CAR中，CD8a的分泌引导信号肽的核酸序列为：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG(SEQID NO：14)

上述CAR中，连接肽的氨基酸为：

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：15)

实施例5 多基因CAR分子及分泌引导信号肽片段的构建

采用与实施例4中相同的方法，将CD8a信号肽与PD-L2膜外免疫球蛋白的V片段(UniProtKB-Q9BQ51，核酸序列58nt-375nt)合成连接，称为PD-L2IGV(SEQ ID NO：5)。亚克隆至质粒pIres2-EGFP-PD-1-28ZT，得到质粒pIres2-EGFP-PD-L2-PD-1-28ZT，该组合序列称为CAR4。PD-L2IGV具体序列如下：

GCTAGCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGTTATTCACAGTGACAGTCCCTAAGGAACTGTACATAATAGAGCATGGCAGCAATGTGACCCTGGAATGCAACTTTGACACTGGAAGTCATGTGAACCTTGGAGCAATAACAGCCAGTTTGCAAAAGGTGGAAAATGATACATCCCCACACCGTGAAAGAGCCACTTTGCTGGAGGAGCAGCTGCCCCTAGGGAAGGCCTCGTTCCACATACCTCAAGTCCAAGTGAGGGACGAAGGACAGTACCAATGCATAATCATCTATGGGGTCGCCTGGGACTACAAGTACCTGACTCTGAAAGTCAAAGCTTCCTACAGGAAAAGATCT(SEQ ID NO：5)

其中，上述序列中的下划线部分，为酶切位点序列。上述CAR1、CAR2、CAR3和CAR4中，CAR2和CAR3具有如图1A所示的相似结构，CAR4具有如图1B的相似结构，四种CAR分子具体的构建示意图分别如图4A、4B、4C和4D所示。编码上述CAR1、CAR2、CAR3和CAR4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：6-9所示，上述CAR1、CAR2、CAR3和CAR4的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：10-13所示。

实施例6 CAR1、CAR2、CAR3和CAR4的真核细胞内蛋白表达

基于单链抗体anti-CD44-scFv构建的CAR1以及插入PD-1/PD-L1/PD-L2的多基因CAR2、CAR3、CAR4，所得质粒经工程菌培养、放大和制备后，用于真核细胞的表达检测。将HEK293细胞接种于6孔板，等到70-80％饱和度时，用Lip2000转染上述质粒至293细胞，24小时-48小时之间观察细胞绿色荧光。如图5所示，显示单链抗体anti-CD44-scFv按常规方式构建的CAR1(图5A)与插入PD-1/PD-L1的多基因CAR2(图5B)、CAR3(图5C)和CAR4(图5D)均能在转染细胞中有效地短暂表达，根据荧光分布目测转染率在20％左右，不同的CAR转染细胞之间没有明显差别。

将六孔板内转染细胞经胰酶处理后收集，超声破碎制备细胞蛋白溶液，在SDS电泳后做Western Blot，用过氧化物酶标兔抗鼠IgG直接染色，在不同分子量区域六万(CAR1)、七万(CAR2)和八万(CAR3)都可看到相应染色条带,但非特异染色的条带也比较多。用兔抗人PD-1多克隆抗体(货号：10377-T48，Sinobiological)或兔抗人PD-L1多克隆抗体(货号：10084-T24，Sinobiological)做一抗，然后用辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG多克隆抗体(Jackson Immuno Research公司)染色，可以大大减少背景干扰。以CAR1蛋白组作为对照，如图6所示，CAR2蛋白组显示特异性PD-1条带；CAR3蛋白组显示PD-L1条带；含PD-1和PD-L1片段的CAR条带均在分子量7万-10万道尔顿之间，说明CAR2和CAR3分子的完整表达，未见明显降解。

实施例7 多基因重组CAR分子在CIK细胞膜上表达

CIK先后使用γ干扰素、anti-CD3单抗、IL1α和IL2诱导、培养和扩增12天。分别取质粒pIres-EGFP-anti-CD44scFv-28ZT(CAR1)、pIres-EGFP-anti-CD44scFv-PD-1-28ZT(CAR2)、pIres-EGFP-anti-CD44scFv-PD-L1-28ZT(CAR3)各5ug电转至CIK细胞。24小时后收集细胞，PBS洗涤细胞两次，每管加300ul PBS重悬细胞。先加10ul CD3-FITC流式抗体(天津协科生物技术有限公司)染色15min，再加10ul TRITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(上海康成)染色10min，上机检测。图7结果显示TRITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体与各种CAR分子中的Anti-CD44scFv结合反应阳性，说明多基因重组CAR2(图7B)和CAR3(图7C)分子和常规结构的CAR1(图7A)一样在CD3+CIK细胞中的正常表达和跨膜存在，具有潜在的肿瘤杀伤功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于包括：

1)一个识别细胞膜抗原蛋白的单链抗体，通过连接肽相连一个免疫检查点抑制性分子PD-1、PD-L1或PD-L2多肽链的胞外区和跨膜区；以及

2)分泌信号肽；以及

3)共刺激信号分子和信号分子CD3 Zeta胞内结构域肽段；

所述多基因重组嵌合抗原受体分子的氨基酸序列为SEQIDNO：11、SEQID NO：12或SEQIDNO：13所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其单链抗体为小鼠抗人CD19单链抗体，通过连接肽相连的胞外区和跨膜区是PD-1蛋白或PD-L1的天然肽段，其胞内结构域肽段包括共刺激信号分子CD28和信号分子CD3 Zeta胞内结构域肽段。

3.根据权利要求2所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于：所述单链抗体包括Anti-CD44-scFv；所述相连肽链连接包括PD-1、PD-L1或PD-L2胞外及跨膜区天然肽段。

4.根据权利要求3所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于：所述多基因重组嵌合抗原受体分子的跨膜区选自PD-1或PD-L1或PD-L2的跨膜区。

5.根据权利要求1所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于：所述共刺激信号分子胞内结构域肽段选自CD28、CD3zeta、CD137的胞内结构域肽段中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于：所述多基因重组嵌合抗原受体分子还包括信号肽。

7.一种多核苷酸，其特征在于：其编码根据权利要求1至6任一项所述的多基因重组嵌合抗原受体分子。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于：序列为SEQIDNO：7、SEQIDNO：8或SEQIDNO：9所示的核苷酸序列。

9.一种重组载体，其特征在于：其包含根据权利要求7所述的多核苷酸。