CN110327459B - 抗病原体感染用靶向免疫检查点pd-l1的融合疫苗 - Google Patents

抗病原体感染用靶向免疫检查点pd-l1的融合疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗病原体感染用靶向免疫检查点PD‑L1的融合疫苗；是将PD‑L1Igv样结构域与Pro的C‑末端融合，命名为Pro‑PDL1E。本发明具有以下优点：Pro‑PDL1E诱导得到PD‑L1特异性抗体，并实现在体外阻断PD‑L1和PD‑1结合；Pro‑PDL1E减轻了小鼠模型中巴贝斯虫(Babesia microti)的负担，降低了T细胞上的PD‑1表达；基于H&E染色结果，Pro‑PDL1E疫苗未引起明显的组织损伤。并且，本发明提供的靶向免疫检查点PD‑L1的疫苗设计策略，可用于其他自体免疫检查点靶向疫苗的设计，是一种潜力巨大的动物疫苗设计和佐剂开发的有价值的策略。

Description

抗病原体感染用靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种抗病原体感染用靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗。
背景技术
巴贝斯虫是经蜱吸血传播从而寄生于大小型动物包括人类红细胞中的一类原虫。人的感染病例近年来达到上千例，且呈全球性分布，包括英、法、美、德、瑞士、瑞典、西班牙、芬兰、墨西哥和爱尔兰等国。在我国内蒙古、新疆、黑龙江、浙江、山东和云南等地已发现70多个人的巴贝斯虫感染病例。目前有4种巴贝斯虫及3个未鉴定种可感染人，包括田鼠巴贝斯虫(Babesia mircoti)、分歧巴贝斯虫(B.divergens)、杜氏巴贝斯虫(B.duncani)和猎户巴贝斯虫(B.venatorum)。其中，田鼠巴贝斯虫是引起人类疾病的主要虫种。现在人和动物的巴贝斯虫病主要依靠药物治疗，如奎宁和氯林可霉素等，但这些药物均产生一系列副作用，动物用药则因代谢缓慢而产生药物残留问题。截止目前还没有有效的疫苗对此原虫病进行预防。
慢性感染(如巴贝斯虫感染)、持续的抗原刺激以及肿瘤可诱发炎症反应，从而激活一系列免疫信号。此免疫应答受到正反馈和负反馈调节，两者共同维护免疫系统的平衡。其中负反馈调节相关信号中，以B7家族PD-L1/PD-1和CTL-4所在的信号通路为主要代表。多篇文献报道PD-L1/PD-1和CTLA-4所在的信号通路，在多种病原体的发生发展过程起到免疫抑制作用，阻断这些抑制信号可以显著增强机体的免疫应答，促进机体对病原体的清除。研究表明，治疗性单抗PD-L1的应用可提高机体血液中疟原虫的清除能力。由此推测，阻断PD-L1/PD-1信号通路也可能是治疗巴贝斯虫病的有效策略。但是单抗价格高昂，PD-L1等免疫检查点单克隆抗体很少用于病原体相关疾病的预防和控制，并且预先存在的PD-L1特异性抗体的作用尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗病原体感染用靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗。本发明设计了一种靶向PD-L1的疫苗，是将PD-L1 Igv样结构域与Pro的C-末端融合，命名为Pro-PDL1E，并以此为疫苗。通过主动免疫诱导机体PD-L1特异性免疫应答，评价其在田鼠巴贝斯虫感染小鼠模型中的保护效果及作用机制。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗，将PD-L1 Igv样结构域与巴贝斯虫基因Profilin的C-末端融合制得重组蛋白Pro-PDL1E，即所述疫苗。
所述巴贝斯虫基因Profilin的C-末端序列的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
所述PD-L1 Igv样结构域的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，蛋白序列如SEQ ID NO.4所示。
所述融合包括如下步骤：
S1、巴贝斯虫基因Profilin的C末端与PD-L1的细胞外IgV样结构域通过linker(GGGS)3进行连接，构成Pro-PDL1E融合序列(此全序列的DNA片段由生工生物工程上海(股份)有限公司合成)，并连接到pMD-18T载体；
S2、以步骤S1构建于pMD-18T载体的Pro-PDL1E融合片段为模板，通过PCR与酶切酶连将融合片段插入载体pGEX-6p-1，形成带GST标签的Pro-PDL1E重组质粒；
S3、所述Pro-PDL1E重组质粒经转化在大肠杆菌BL21菌株中表达，诱导，纯化得到所述重组蛋白Pro-PDL1E。
步骤S2中，PCR使用的引物为如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的引物对。
Pro-PDL1-6p-1-P1:CCGGATCCATGTCTGAGGACGAAGTTTG SEQ ID NO.5；
Pro-PDL1-6p-1-P2:GGCTCGAGTTAGCGGTATGGGGCATTGAC SEQ ID NO.6。
步骤S3中，所述诱导是采用1mM IPTG进行诱导。
步骤S3中，所述纯化是用AKTA蛋白纯化系统进行纯化。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)Pro-PDL1E诱导得到PD-L1特异性抗体，并实现在体外阻断PD-L1和PD-1结合；
2)Pro-PDL1E减轻了小鼠模型中巴贝斯虫(Babesia microti)的负担，降低了T细胞上的PD-1表达；
3)基于H&E染色结果，Pro-PDL1E疫苗未引起明显的组织损伤；
4)本发明提供的靶向免疫检查点PD-L1的疫苗设计策略，可用于其他自体免疫检查点靶向疫苗的设计，是一种潜力巨大的动物疫苗设计和佐剂开发的有价值的策略。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1.Pro(A)和Pro-PDL1E(B)的重组质粒构成图及Pro-PDL1E的二维结构预测图(C)；
图2.Pro和Pro-PDL1E重组蛋白的纯化结果；
图3.Pro或Pro-PDL1E疫苗接种诱导的抗体反应；其中(A)ELISA检测Pro-PDL1E，Pro或GST免疫小鼠(n＝5)诱导产生的PD-L1抗体水平；(B)Pro-PDL1E疫苗接种诱导的抗PD-L1 IgG亚型分析；(C)不同免疫组诱导产生的Pro抗体水平分析；(D)Pro-PDL1E和Pro疫苗接种诱导的Pro IgG亚型；NS：差异不显著；
图4.Pro-PDL1E免疫小鼠的血清抑制PD-L1/PD-1结合(A)，抑制效果与抗体浓度呈正相关的曲线图(B)；
图5.疫苗接种、攻虫和采血时间表(A)；Pro-PDL1E，Pro或GST免疫对田鼠巴贝斯虫感染率的影响(B)，*P<0.01；
图6.未免疫小鼠感染巴贝斯虫后，随进程发展，红细胞染虫率曲线图及CD45阳性细胞中PD-L1+和PD1+的细胞比例图(A)；Pro-PDL1E疫苗增加CD45+细胞中PD-L1+细胞的比例(B)，降低CD45+细胞中PD-1+细胞的比例(C)；*P<0.05，NS:差异不显著；
图7.Pro-PDL1E疫苗的安全性评估；Pro-PDL1E，Pro和GST免疫组小鼠的心脏，肝脏，脾脏和肾脏切片HE染色(比例尺100μm)；
图8.Pro-PDL1E疫苗的安全性评估；(A)不同免疫组之间的体重比较；自动血液分析仪分析白细胞(B)，红细胞(C)和血小板(D)的数量。NS：差异不显著。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
Profilin(Pro)是寄生虫体内一种极为重要的蛋白，其可协助寄生虫入侵宿主细胞，研究表明Pro可作为一种针对巴贝虫病的候选疫苗。
本发明设计了一种靶向PD-L1的疫苗，是将PD-L1 Igv样结构域与Pro的C-末端融合，命名为Pro-PDL1E，并以此为疫苗。通过主动免疫诱导机体PD-L1特异性免疫应答，评价其在田鼠巴贝斯虫感染小鼠模型中的保护效果及作用机制。具体如下：
1、材料与方法
1.1寄生虫与实验动物
田鼠巴贝斯虫来自美国标准菌库(ATCC)下的ATCCR PRA-99TM，经购自上海斯莱克实验动物有限责任公司的BALC/c鼠传代增殖和保存。
1.2细菌与质粒
大肠杆菌DH5α(Invitrogen)和BL21(DE3)(Novagen)用于质粒构建及蛋白表达。测序载体为pGEM-T Easy(Promega)，表达载体为pGEX-6p-1(Novagen)。
1.3质粒构建与重组蛋白表达
1.3.1将巴贝斯虫基因Profilin的C末端与小鼠基因PD-L1的细胞外IgV样结构域通过linker(GGGS)3进行连接，构成Pro-PDL1E融合序列(此全序列的DNA片段由生工生物工程上海(股份)有限公司合成)，并连接到pMD-18T载体，得到构建于pMD-18T载体的合成Pro-PDL1E融合片段。
所述巴贝斯虫基因Profilin的C-末端序列：
ATGTCTGAGGACGAAGTTTGGATAGATATTTTGAAAAAGACAGCATTGGCTGACAATGCGTGTTACAGTGCGGGTATTGCTTCAGAAGACTGTGTTGTTAACACTGCAGCGCACGTGGACAAGCCAGGAATATTTTATGATGCCATTTATAAGGAGGGTTATTCTGTGGAGGACAAAGATACTGGCAAGTCCGTCGAGATTGTCGAAGGCGCCACTATCAAATCTTGTTTTGAAACAAAATCTTCCCCAACTGGTGTCTATATTGGCGGTGCCAAGTATACTTTCATAAGTTACGACAAATTAGATTCCACCGATGGTAAACATTCATTTGAAGCAATCATTTTGGCTAGACCTAAGGGGGGCGCCCATTTGATTAGAACTCCGAATGACAGCGTTGTTATTGGATTACACGAGGAAACTAGGGGACAAGACAAAACGAATTCTAGACTCGCTTGCATCAAATTGGCTGAGTATCTTGCGGATAACGATATGTGA SEQ ID NO.1
蛋白序列：
MSEDEVWIDILKKTALADNACYSAGIASEDCVVNTAAHVDKPGIFYDAIYKEGYSVEDKDTGKSVEIVEGATIKSCFETKSSPTGVYIGGAKYTFISYDKLDSTDGKHSFEAIILARPKGGAHLIRTPNDSVVIGLHEETRGQDKTNSRLACIKLAEYLADNDM SEQ ID NO.2
PD-L1 Igv样结构域序列：
TTTACTATCACGGCTCCAAAGGACTTGTACGTGGTGGAGTATGGCAGCAACGTCACGATGGAGTGCAGATTCCCTGTAGAACGGGAGCTGGACCTGCTTGCGTTAGTGGTGTACTGGGAAAAGGAAGATGAGCAAGTGATTCAGTTTGTGGCAGGAGAGGAGGACCTTAAGCCTCAGCACAGCAACTTCAGGGGGAGAGCCTCGCTGCCAAAGGACCAGCTTTTGAAGGGAAATGCTGCCCTTCAGATCACAGACGTCAAGCTGCAGGACGCAGGCGTTTACTGCTGCATAATCAGCTACGGTGGTGCGGACTACAAGCGAATCACGCTGAAAGTCAATGCCCCATACCGCTAA SEQ ID NO.3
蛋白序列：
FTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYGGADYKRITLKVNAPYR SEQ ID NO.4
1.3.2将巴贝斯虫基因profilin(Pro)(F:CCGGATCCATGTCTGAGGACGAAGTTTG SEQID NO.5和R:GGCTCGAGTTACATATCGTTATCCGCAAGATAC SEQ ID NO.7)插入pGEX-6p-1质粒。
与此同时，将构建于pMD-18T载体的合成Pro-PDL1E融合片段为模板，通过PCR(反应体系和反应条件见下方表1、2、3)与酶切酶连插入pGEX-6p-1。引物如下：
Pro-PDL1-6p-1-P1:CCGGATCCATGTCTGAGGACGAAGTTTG SEQ ID NO.5；
Pro-PDL1-6p-1-P2:GGCTCGAGTTAGCGGTATGGGGCATTGAC SEQ ID NO.6；
从而分别形成Pro和Pro-PDL1E重组质粒(如图1)。重组质粒的转化、重组蛋白的表达和纯化均采用传统方法，即重组质粒经转化在大肠杆菌BL21菌株中表达，经1mM IPTG诱导8小时后，用AKTA蛋白纯化系统(GE)纯化得到可溶性的含GST标签的重组蛋白Pro和Pro-PDL1E。GST标签蛋白经纯化作为阴性对照。Detoxi-GelTM内毒素去除试剂盒(ThermoScientific，美国)去除内毒素，并用内毒素检测试剂盒(GenScript，中国)进行内毒素水平检测。
反应体系：
表1
试剂 用量(μL)
2×Pfu PCR MasterMix 25μL
Pro-PDL1-6p-1 1μL
Pro-PDL1-6p-2 1μL
合成全长DNA模板 1μL
Nuclease free dH<sub>2</sub>O 22μL
Total 50μL
反应条件：
表2
Figure BDA0002176167020000051
Figure BDA0002176167020000061
将获得的融合片段经过EcoR1和XhoI酶酶切后，按照以下连接体系完成连接反应。4℃过夜。连接体系如下：
表3
试剂 用量(μL)
T4 DNA连接酶 1
Linearized Vector(pGEX-6P-1) 1
Purified PCR Fragment(DPDL1E) 5
Nuclease free dH<sub>2</sub>O 3
Total 10
1.4抗血清的制备与收集
100ug重组蛋白Pro-PDL1E或Pro与等体积弗氏完全佐剂充分混匀后，进行小鼠腹腔注射。在初次免疫后第14天和28天，以充分混匀的重组蛋白和不完全佐剂进行加强免疫两次。抗体效价经ELISA测定后收集小鼠抗血清。
1.5抗血清中IgG亚型分析
分别以1μg/mL终浓度的Pro-PDL1E或Pro蛋白作为抗原包被ELISA板4℃过夜，封闭后加入1:200稀释的抗Pro-PDL1E或Pro血清，洗涤后加入抗IgG1、IgG3、IgG2a和IgG2b的羊抗鼠二抗(1:3000稀释)，洗涤后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色，从而明确各种IgG亚型的抗体滴度。
1.6抗体阻断实验
将抗Pro-PDL1E或Pro血清用封闭液(2％BSA in Washing Buffer,pH 7.4)按照1:1,1:40,1:100,1:500稀释后按100μL/孔加入96孔板进行孵育，然后每孔加入100μL PD-L1，37℃孵育1h，洗涤后每孔加入100μL生物素标记的小鼠PD-1蛋白(终浓度2.5μg/mL)，37℃孵育1h。洗涤后加入100μL HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，以200μL TMB底物显色，读取OD450值。以抗PD-L1单克隆抗2μg/100μL/well作为阳性对照，封闭液100μL/well作为空白对照。
1.7抗原免疫与攻虫实验
用Pro-PDL1E或Pro蛋白以14天的间隔对雌性BALB/c小鼠(n＝8)皮下免疫三次，同时免疫GST蛋白作为阴性对照。在第三次免疫后第7天，每只小鼠腹膜内注射(i.p)0.5mL含有1×108个B.microti感染的红细胞，分别在注射后第3，6，9，12，20和30天收集血液。用吉姆萨(Giemsa)染色的方法检测B.microti感染的红细胞的数量并进行统计学分析。
1.8抗原接种对免疫状态的影响
采集B.microti感染后0、3、6、9、12、20和30天的小鼠外周血，用于检测PD-L1+和PD-1+细胞在CD45+细胞中的比例，操作如下所述。同时，Pro和Pro-PDL1E蛋白免疫小鼠后，感染B.microti，采集染虫后6天的外周血，放入预先加入1mL 0.109mol/L(3.2％)枸橼酸钠抗凝剂的15mL离心管中，立刻混匀。离心收集红细胞，加入5mL红细胞裂解液，经裂解和PBS洗涤后，用染色缓冲液(staining buffer)重悬，制备成2×107/ml浓度的细胞悬液。加入配制好的0.5％同种异体多抗血清，4℃封闭30min。离心并洗涤后，用200μL配制好的各流式抗体重悬细胞沉淀，4℃避光孵育30min，用染色缓冲液(staining buffer)洗2次，最后用100μL染色缓冲液(staining buffer)重悬。用空白细胞调节流式条件后，检测各处理组样品中PD-L1+和PD-1+细胞在CD45+细胞中的比例。同时设置对应的阳性对照，GST免疫组作为阴性对照。
1.9抗原的安全性评价
分离Pro-PDL1E、Pro和GST蛋白免疫组小鼠的脾脏、心脏、肝脏、肺脏和肾脏等主要组织器官，4％中性甲醛固定后，经梯度酒精脱水、二甲苯透明处理和石蜡包埋，切5μm切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水各10min，苏木素染色3min，水洗，0.5％盐酸酒精分色5-10s，流水冲洗30min-1h，后放入蒸馏水片刻，然后分别经70％的酒精和90％酒精中脱水各5min。伊红染色液(95％酒精溶液)中染色1min，染色后的切片经无水乙醇脱水5min，再经二甲苯将切片透明化处理。最后滴上树胶，盖上盖玻片封固，晾干后置于显微镜下观察拍照。
1.10统计学分析
使用Graph Pad Prism 6软件分析所有数据。数值数据表示为平均值±SD。通过使用Student's t检验分析两个独立组之间的差异。当多个条件比较时，进行Dunnett多重比较检验。P<0.05被认为具有统计学意义。
2、结果
2.1 Pro和Pro-PDL1E重组蛋白的表达与纯化
如图2所示，经表达和纯化，成功得到分子量分别为44kDa(Pro)和59kDa(Pro-PDL1E)的带GST标签的可溶性重组蛋白，其中Pro-PDL1E浓度为2mg/ml，纯度>95％，内毒素水平低于0.1EU/mL。
2.2 Pro-PDL1E和Pro免疫产生的IgG抗体亚型
结果如图3所示，Pro-PDL1E免疫的小鼠可诱导产生高水平的PD-L1特异性抗体，但Pro或GST免疫的小鼠中均未检测到PD-L1抗体的表达(图3A)。此外，抗PD-L1抗体中包含高水平的IgG1和IgG3以及低水平的IgG2a和IgG2b(图3B)，这表明免疫应答偏向于Th2型，即体液免疫应答。同时，在Pro-PDL1E和Pro免疫的小鼠中均检测到抗Profilin特异性抗体，但两个蛋白免疫组之间差异不显著(图3C)，且Pro-PDL1E和Pro免疫组中抗Profilin的IgG亚类无显著差异(图3D)。此结果表明，Pro-PDL1E免疫可以诱导机体同时产生抗PD-L1和抗profilin的抗体，且对Profilin特异性抗体的产生无影响。
2.3抗Pro-PDL1E抗体可阻断PD-L1和PD-1结合，从而增强机体抵抗力
Pro-PDL1E抗血清可有效阻断PD-L1和PD-1结合(图4A)，并且阻断能力与抗体浓度呈正相关(图4B)。因PD-L1和PD-1结合在感染虫体过程中，起到免疫抑制作用，抗Pro-PDL1E抗体可阻断此结合，从而缓解免疫抑制。
2.4 Pro-PDL1E抗原免疫可增强小鼠红细胞染虫率
为评估Pro-PDL1E抗原的免疫保护效果，在第三次免疫小鼠后第7天，用1×108个B.microti感染的红细胞分别腹腔接种已免疫Pro-PDL1E，Pro和GST的小鼠，在感染后的不同时间点，分别检测各处理组的红细胞感染率(图5A)。结果显示，与Pro和GST免疫组相比，Pro-PDL1E免疫组B.microti感染的红细胞比例显著降低(图5B)。
2.5 Pro-PDL1E抗原注射增强了机体免疫
为了评估Pro-PDL1E对CD45阳性细胞中PD-L1+和PD1+细胞比例的影响，首先追踪了未免疫小鼠感染B.microti全程发展过程中PD-L1+和PD1+的细胞比例。结果如图6A，感染后第6天，红细胞染虫率达到峰值，且PD-L1+和PD1+的细胞比例均呈现上升趋势。对于免疫Pro-PDL1E、Pro或GST组，在虫体感染小鼠后的第6天，与GST和Pro对照组相比，Pro-PDL1E增加了CD45+细胞中PD-L1+细胞的比例(图6B)，但降低了PD-1+细胞的比例(图6C)。由此暗示，Pro-PDL1E疫苗接种可能通过降低PD-1+细胞的比例，进而减少PD-1与PD-L1的结合，降低虫体感染带来免疫抑制强度，改变机体的免疫状态。
2.6 Pro-PDL1E抗原注射对器官无影响
为评估Pro-PDL1E体内免疫的风险，通过HE染色分析不同免疫组小鼠的心脏，肝脏，脾脏和肾脏的组织病理学变化。结果显示，不同免疫组小鼠的主要组织器官均未发现病理性损伤(图7)，且Pro-PDL1E免疫组与GST对照组的小鼠体重无显著性差异(图8A)。使用自动血液分析仪进一步对血细胞计数，白细胞(图8B)，红细胞(图8C)和血小板(图8D)的水平在各个免疫组之间无显著性差异。此结果表明Pro-PDL1E疫苗无强烈的毒性反应。
综上所述，Pro-PDL1E融合抗原通过主动靶向免疫检查点PD-L1，诱导机体产生特异性阻断抗体。通过选择的病原体模型，发现融合PD-L1胞外结构域后，显著增强宿主抵抗巴贝斯虫抗感染的能力。本研究的策略可以用于其他免疫检查点阻断疫苗的设计，是一种具有潜力的病原体疫苗联合设计策略，适于进一步研究和开发。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 抗病原体感染用靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗
<130> DD06064
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 495
<212> DNA
<213> 巴贝斯虫(Babesiidae)
<400> 1
atgtctgagg acgaagtttg gatagatatt ttgaaaaaga cagcattggc tgacaatgcg 60
tgttacagtg cgggtattgc ttcagaagac tgtgttgtta acactgcagc gcacgtggac 120
aagccaggaa tattttatga tgccatttat aaggagggtt attctgtgga ggacaaagat 180
actggcaagt ccgtcgagat tgtcgaaggc gccactatca aatcttgttt tgaaacaaaa 240
tcttccccaa ctggtgtcta tattggcggt gccaagtata ctttcataag ttacgacaaa 300
ttagattcca ccgatggtaa acattcattt gaagcaatca ttttggctag acctaagggg 360
ggcgcccatt tgattagaac tccgaatgac agcgttgtta ttggattaca cgaggaaact 420
aggggacaag acaaaacgaa ttctagactc gcttgcatca aattggctga gtatcttgcg 480
gataacgata tgtga 495
<210> 2
<211> 164
<212> PRT
<213> 巴贝斯虫(Babesiidae)
<400> 2
Met Ser Glu Asp Glu Val Trp Ile Asp Ile Leu Lys Lys Thr Ala Leu
1 5 10 15
Ala Asp Asn Ala Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Ser Glu Asp Cys Val
20 25 30
Val Asn Thr Ala Ala His Val Asp Lys Pro Gly Ile Phe Tyr Asp Ala
35 40 45
Ile Tyr Lys Glu Gly Tyr Ser Val Glu Asp Lys Asp Thr Gly Lys Ser
50 55 60
Val Glu Ile Val Glu Gly Ala Thr Ile Lys Ser Cys Phe Glu Thr Lys
65 70 75 80
Ser Ser Pro Thr Gly Val Tyr Ile Gly Gly Ala Lys Tyr Thr Phe Ile
85 90 95
Ser Tyr Asp Lys Leu Asp Ser Thr Asp Gly Lys His Ser Phe Glu Ala
100 105 110
Ile Ile Leu Ala Arg Pro Lys Gly Gly Ala His Leu Ile Arg Thr Pro
115 120 125
Asn Asp Ser Val Val Ile Gly Leu His Glu Glu Thr Arg Gly Gln Asp
130 135 140
Lys Thr Asn Ser Arg Leu Ala Cys Ile Lys Leu Ala Glu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Asn Asp Met
<210> 3
<211> 354
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
tttactatca cggctccaaa ggacttgtac gtggtggagt atggcagcaa cgtcacgatg 60
gagtgcagat tccctgtaga acgggagctg gacctgcttg cgttagtggt gtactgggaa 120
aaggaagatg agcaagtgat tcagtttgtg gcaggagagg aggaccttaa gcctcagcac 180
agcaacttca gggggagagc ctcgctgcca aaggaccagc ttttgaaggg aaatgctgcc 240
cttcagatca cagacgtcaa gctgcaggac gcaggcgttt actgctgcat aatcagctac 300
ggtggtgcgg actacaagcg aatcacgctg aaagtcaatg ccccataccg ctaa 354
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu Asp Leu
20 25 30
Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val Ile Gln
35 40 45
Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Asn Phe Arg
50 55 60
Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Cys Cys
85 90 95
Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Arg
115
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggatccat gtctgaggac gaagtttg 28
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggctcgagtt agcggtatgg ggcattgac 29
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggctcgagtt acatatcgtt atccgcaaga tac 33

Claims (7)

1.一种靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗，其特征在于，在巴贝斯虫基因Profilin的C末端连接PD-L1 Igv样结构域，融合表达，制得重组蛋白Pro-PDL1E，即所述疫苗。
2.根据权利要求1所述的靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗，其特征在于，所述巴贝斯虫基因Profilin的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗，其特征在于，所述PD-L1Igv样结构域的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，蛋白序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗，其特征在于，所述融合包括如下步骤：
S1、在巴贝斯虫基因Profilin的C末端通过linker（GGGS）3连接PD-L1的细胞外 IgV 样结构域，构成Pro-PDL1E融合序列，并连接到pMD-18T载体；
S2、以步骤S1构建于pMD-18T载体的Pro-PDL1E融合片段为模板，通过PCR与酶切酶连将融合片段插入载体pGEX-6p-1，形成带GST标签的Pro-PDL1E重组质粒；
S3、所述Pro-PDL1E重组质粒经转化在大肠杆菌BL21菌株中表达，诱导，纯化得到所述重组蛋白Pro-PDL1E。
5.根据权利要求4所述的靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗，其特征在于，步骤S2中，PCR使用的引物为如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的引物对。
6.根据权利要求4所述的靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗，其特征在于，步骤S3中，所述诱导是采用1mMIPTG进行诱导。
7.根据权利要求4所述的靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗，其特征在于，步骤S3中，所述纯化是用AKTA蛋白纯化系统进行纯化。
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