JP3282819B2 - 核酸増幅用の安定化された酵素組成物 - Google Patents
核酸増幅用の安定化された酵素組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、分子生物学の分野、概して、核酸増幅およ
び安定化された生体組成物に関する。特に、本発明は、
１種類またはそれ以上の核酸ポリメラーゼを含有する安
定な凍結乾燥酵素組成物に関する。
び安定化された生体組成物に関する。特に、本発明は、
１種類またはそれ以上の核酸ポリメラーゼを含有する安
定な凍結乾燥酵素組成物に関する。
発明の背景 デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）は、
共有結合したヌクレオチドサブユニットから成る大型の
直鎖状巨大分子である。DNAは、通常、２本のDNA鎖が水
素結合によって逆平行様式で結合している「二本鎖」の
形で見出される。RNAは、通常、１本のポリヌクレオチ
ド鎖として天然に存在する。ヌクレオチドは、糖（デオ
キシリボースかまたはリボース）および含窒素塩基部分
を有する分子であり、通常、ホスホジエステル結合によ
って互いに結合して核酸になっている。５種類の通常の
含窒素塩基が存在する。３種類はDNAでもRNAでも見ら
れ、これらは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）および
シトシン（Ｃ）である。他の二つは、チミン（Ｔ）およ
びウラシル（Ｕ）であり、それぞれDNAおよびRNAに特有
である。
共有結合したヌクレオチドサブユニットから成る大型の
直鎖状巨大分子である。DNAは、通常、２本のDNA鎖が水
素結合によって逆平行様式で結合している「二本鎖」の
形で見出される。RNAは、通常、１本のポリヌクレオチ
ド鎖として天然に存在する。ヌクレオチドは、糖（デオ
キシリボースかまたはリボース）および含窒素塩基部分
を有する分子であり、通常、ホスホジエステル結合によ
って互いに結合して核酸になっている。５種類の通常の
含窒素塩基が存在する。３種類はDNAでもRNAでも見ら
れ、これらは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）および
シトシン（Ｃ）である。他の二つは、チミン（Ｔ）およ
びウラシル（Ｕ）であり、それぞれDNAおよびRNAに特有
である。
あらゆる生物遺伝情報の大部分は（全部ではないとし
ても）、DNAまたはRNAの形で一つの世代から次の世代へ
と伝えられる。この情報は、遺伝コードを構成する一本
の核酸鎖すなわち「鎖」に沿ったヌクレオチドの配列で
伝えられる。更に、核酸鎖の含窒素塩基はそれぞれ、同
じかまたは異なった核酸鎖の１種類またはそれ以上の他
の含窒素塩基と特異的に水素結合する能力を有する。し
たがって、通常の条件下において、ＡはＴ（またはＵ）
と水素結合し且つＣはＧと水素結合し、この特異的水素
結合は塩基対合と称される。二本鎖DNAの場合、その２
本の鎖それぞれが１本のヌクレオチド鎖から成り、それ
らヌクレオチドの大部分または全部がもう一方の鎖と塩
基対合している。このような場合、一方のDNA鎖上のヌ
クレオチオドの順序が、もう一方のDNA鎖上のヌクレオ
チドの順序を決定する。この方式で互いに「鏡像」であ
る２本の核酸鎖は、完全に相補的であるといわれる。
ても）、DNAまたはRNAの形で一つの世代から次の世代へ
と伝えられる。この情報は、遺伝コードを構成する一本
の核酸鎖すなわち「鎖」に沿ったヌクレオチドの配列で
伝えられる。更に、核酸鎖の含窒素塩基はそれぞれ、同
じかまたは異なった核酸鎖の１種類またはそれ以上の他
の含窒素塩基と特異的に水素結合する能力を有する。し
たがって、通常の条件下において、ＡはＴ（またはＵ）
と水素結合し且つＣはＧと水素結合し、この特異的水素
結合は塩基対合と称される。二本鎖DNAの場合、その２
本の鎖それぞれが１本のヌクレオチド鎖から成り、それ
らヌクレオチドの大部分または全部がもう一方の鎖と塩
基対合している。このような場合、一方のDNA鎖上のヌ
クレオチオドの順序が、もう一方のDNA鎖上のヌクレオ
チドの順序を決定する。この方式で互いに「鏡像」であ
る２本の核酸鎖は、完全に相補的であるといわれる。
核酸は、それぞれの核酸鎖が完全に相補的な鎖のヌク
レオチドの順序を指定するという事実を利用する機序に
よってインビボで合成され、このことは、所望の核酸が
RNAであろうとDNAであろうと、そして鋳型として用いら
れる核酸がRNAであるかDNAであるかに関係なく変わるこ
とがない。DNA複製のための独特の機序の大部分は、鋳
型核酸鎖に水素結合したポリヌクレオチドプライマーの
3'ヒドロキシル基に対してヌクレオチドを逐次的に加え
るためにDNAポリメラーゼの使用を必要とする。新たに
加えられるヌクレオチドは、鋳型鎖の対応するヌクレオ
チドと対合するそれらの能力に基づいてDNAポリメラー
ゼによって選択される。プライマーの一端にヌクレオチ
ドを加えるこの過程は、時々、プライマー伸長と呼ばれ
る。
レオチドの順序を指定するという事実を利用する機序に
よってインビボで合成され、このことは、所望の核酸が
RNAであろうとDNAであろうと、そして鋳型として用いら
れる核酸がRNAであるかDNAであるかに関係なく変わるこ
とがない。DNA複製のための独特の機序の大部分は、鋳
型核酸鎖に水素結合したポリヌクレオチドプライマーの
3'ヒドロキシル基に対してヌクレオチドを逐次的に加え
るためにDNAポリメラーゼの使用を必要とする。新たに
加えられるヌクレオチドは、鋳型鎖の対応するヌクレオ
チドと対合するそれらの能力に基づいてDNAポリメラー
ゼによって選択される。プライマーの一端にヌクレオチ
ドを加えるこの過程は、時々、プライマー伸長と呼ばれ
る。
DNA合成とは異なり、RNA合成は、通常、ポリヌクレオ
チドプライマーの存在を必要としない。むしろ、RNA合
成は、通常、核酸鋳型の１個またはそれ以上の特定のヌ
クレオチド配列を認識するRNAポリメラーゼによって媒
介される。プロモーターと称される、RNAポリメラーゼ
が結合する鋳型領域は、通常、二本鎖である。プロモー
ターに結合した後、RNAポリメラーゼは、鋳型鎖を「読
取り」、そしてその鋳型に相補的な共有結合したポリリ
ボヌクレオチド鎖を合成する。異なる生物に由来するRN
Aポリメラーゼは、異なるプロモーター配列を優先的に
認識する。
チドプライマーの存在を必要としない。むしろ、RNA合
成は、通常、核酸鋳型の１個またはそれ以上の特定のヌ
クレオチド配列を認識するRNAポリメラーゼによって媒
介される。プロモーターと称される、RNAポリメラーゼ
が結合する鋳型領域は、通常、二本鎖である。プロモー
ターに結合した後、RNAポリメラーゼは、鋳型鎖を「読
取り」、そしてその鋳型に相補的な共有結合したポリリ
ボヌクレオチド鎖を合成する。異なる生物に由来するRN
Aポリメラーゼは、異なるプロモーター配列を優先的に
認識する。
DNAおよびRNAポリメラーゼ酵素は、多数の異なった生
物から精製されてきた。大腸菌（E.coli）DNAポリメラ
ーゼＩ、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントお
よび種々のRNAポリメラーゼなどのこれらの酵素のいく
つかは、分子生物学および核酸生化学研究の手段として
インビトロで一般的に用いられている。一般的には、例
えば、サムブルック（Sambrook）ら,Molecular Clonin
g:ALaboratory Manual（第２版，コールド・スプリング
・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）198
9）を参照されたい。
物から精製されてきた。大腸菌（E.coli）DNAポリメラ
ーゼＩ、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントお
よび種々のRNAポリメラーゼなどのこれらの酵素のいく
つかは、分子生物学および核酸生化学研究の手段として
インビトロで一般的に用いられている。一般的には、例
えば、サムブルック（Sambrook）ら,Molecular Clonin
g:ALaboratory Manual（第２版，コールド・スプリング
・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）198
9）を参照されたい。
核酸ポリメラーゼのもう一つの使用は、ポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）などの核酸増幅の様々な方法の出現と
ともに始まった。例えば、マリス（Mullis）ら，米国特
許第4,683,195号明細書、同第4,683,202号明細書および
同第4,800,159号明細書を参照されたい。PCRの最も簡単
な形では、標的ヌクレオチド配列領域の内、標的核酸に
関して3'側に位置した標的核酸の領域にそれぞれ相補的
なプライマーである２種類のオリゴヌクレオチドプライ
マーが合成される。それぞれのプライマーは、２本の相
補的核酸鎖の一方に相補的であり、その標的領域は、二
本鎖標的核酸の両方の核酸鎖を包含するヌクレオチド配
列領域を含む。これらプライマーを基質と水素結合
（「ハイブリッド形成」）させ、そしてDNAポリメラー
ゼをヌクレオチド三リン酸と一緒に反応混合物に対して
加えた場合、それぞれのハイブリッド形成したプライマ
ーは、酵素によって5'→3'方向に伸長する。次に、反応
混合物を加熱してプライマー伸長生成物：鋳型ハイブリ
ッドを融解させ、温度を低下させてプライマー／標的ハ
イブリダイゼーションをもう１回可能にし、そしてより
多くのDNAポリメラーゼを加えて、高温段階で失活したD
NAポリメラーゼを置換する。その過程を所望のサイクル
数繰り返すことにより、標的ヌクレオチド配列を有する
核酸の量は指数的に増加する。更に最近、サーマス・ア
クアティクス（Thermus aquaticus）に由来する熱安定D
NAポリメラーゼは、PCR法で首尾よく用いられて、高価
な酵素を多量に繰り返し加える必要性を減少させた。Ta
qポリメラーゼは、90〜95℃での不活性化に耐えるの
で、各回の鎖分離後に繰り返し酵素を加える必要性をな
くする。
連鎖反応（PCR）などの核酸増幅の様々な方法の出現と
ともに始まった。例えば、マリス（Mullis）ら，米国特
許第4,683,195号明細書、同第4,683,202号明細書および
同第4,800,159号明細書を参照されたい。PCRの最も簡単
な形では、標的ヌクレオチド配列領域の内、標的核酸に
関して3'側に位置した標的核酸の領域にそれぞれ相補的
なプライマーである２種類のオリゴヌクレオチドプライ
マーが合成される。それぞれのプライマーは、２本の相
補的核酸鎖の一方に相補的であり、その標的領域は、二
本鎖標的核酸の両方の核酸鎖を包含するヌクレオチド配
列領域を含む。これらプライマーを基質と水素結合
（「ハイブリッド形成」）させ、そしてDNAポリメラー
ゼをヌクレオチド三リン酸と一緒に反応混合物に対して
加えた場合、それぞれのハイブリッド形成したプライマ
ーは、酵素によって5'→3'方向に伸長する。次に、反応
混合物を加熱してプライマー伸長生成物：鋳型ハイブリ
ッドを融解させ、温度を低下させてプライマー／標的ハ
イブリダイゼーションをもう１回可能にし、そしてより
多くのDNAポリメラーゼを加えて、高温段階で失活したD
NAポリメラーゼを置換する。その過程を所望のサイクル
数繰り返すことにより、標的ヌクレオチド配列を有する
核酸の量は指数的に増加する。更に最近、サーマス・ア
クアティクス（Thermus aquaticus）に由来する熱安定D
NAポリメラーゼは、PCR法で首尾よく用いられて、高価
な酵素を多量に繰り返し加える必要性を減少させた。Ta
qポリメラーゼは、90〜95℃での不活性化に耐えるの
で、各回の鎖分離後に繰り返し酵素を加える必要性をな
くする。
増幅過程の一段階としてRNA転写を用いるような核酸
増幅の他の方法が考案されている。一つのこのような方
法は、PCR反応で用いられるプライマーの一つにプロモ
ーター配列を包含させ、次にPCR法により増幅させた後
に、DNA依存性RNAポリメラーゼによる一本鎖RNAの転写
の鋳型として二本鎖DNAを用いることによって働く。例
えば、ムラカワ（Murakawa）ら,DNA 7:287−295（198
8）を参照されたい）。
増幅の他の方法が考案されている。一つのこのような方
法は、PCR反応で用いられるプライマーの一つにプロモ
ーター配列を包含させ、次にPCR法により増幅させた後
に、DNA依存性RNAポリメラーゼによる一本鎖RNAの転写
の鋳型として二本鎖DNAを用いることによって働く。例
えば、ムラカワ（Murakawa）ら,DNA 7:287−295（198
8）を参照されたい）。
他の増幅法は、DNAまたはRNA標的を増幅させるのにRN
A依存性DNA合成および転写の多数のサイクルを用いる。
例えば、バーグ（Burg）ら,WO 89/1050号；ジンジェラ
ス（Gingeras）ら,WO 88/10315号（時々、転写増幅系ま
たはTASと称される）；カシアン（Kacian）およびフル
ツ（Fultz）,EPO公開第408,295号（本出願と同一所有権
者を有する）；デイビー（Davey）およびマレク（Male
k）,EPO出願第88113948.9号；マレクら,WO 91/02818号
を参照されたい）。これらの方法は、相補的DNA鎖の合
成の鋳型としてRNAまたはDNAを用いることができる酵素
である逆転写酵素（RT）を使用する。これらの方法のい
くつかはまた、必須成分として細胞性RNアーゼＨ活性を
利用する。モロニーネズミ白血病ウイルス（MMLV）およ
びトリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）によってコードされ
るものなどの大部分のレトロウイルス逆転写酵素は、RN
A依存性DNAポリメラーゼ、DNA依存性DNAポリメラーゼ活
性、並びにRNアーゼＨ活性を有する。RNアーゼＨ活性
は、RNA:DNAハイブリッド核酸分子のRNA鎖を選択的に破
壊するので、温度循環を必要とすることなく増幅反応を
進行させる。
A依存性DNA合成および転写の多数のサイクルを用いる。
例えば、バーグ（Burg）ら,WO 89/1050号；ジンジェラ
ス（Gingeras）ら,WO 88/10315号（時々、転写増幅系ま
たはTASと称される）；カシアン（Kacian）およびフル
ツ（Fultz）,EPO公開第408,295号（本出願と同一所有権
者を有する）；デイビー（Davey）およびマレク（Male
k）,EPO出願第88113948.9号；マレクら,WO 91/02818号
を参照されたい）。これらの方法は、相補的DNA鎖の合
成の鋳型としてRNAまたはDNAを用いることができる酵素
である逆転写酵素（RT）を使用する。これらの方法のい
くつかはまた、必須成分として細胞性RNアーゼＨ活性を
利用する。モロニーネズミ白血病ウイルス（MMLV）およ
びトリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）によってコードされ
るものなどの大部分のレトロウイルス逆転写酵素は、RN
A依存性DNAポリメラーゼ、DNA依存性DNAポリメラーゼ活
性、並びにRNアーゼＨ活性を有する。RNアーゼＨ活性
は、RNA:DNAハイブリッド核酸分子のRNA鎖を選択的に破
壊するので、温度循環を必要とすることなく増幅反応を
進行させる。
核酸増幅は、種々の設定において独特のまたは特徴的
な核酸セグメントの特異的識別および／または増幅のた
めの益々一般的な手段である。したがって、核酸増幅
は、食糧農業試験、医学的診断、ヒト遺伝子分析および
カウンセリング、考古学並びに刑事弁論で用いられる。
これらの方法は全て酵素を用いるので、極めて活性な酵
素を多量に製造する、包装する、輸送するおよび貯蔵す
る方法は、核酸増幅用酵素およびキットの製造、マーケ
ティングおよび販売において極めて重要な問題点となっ
ている。具体的に、転写に基づく増幅を用いる方法に関
して、逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの活性標品を
貯蔵するための商業的に許容しうる方法および標品は、
核酸増幅用キットについて成功した製造およびマーケテ
ィングに不可欠である。
な核酸セグメントの特異的識別および／または増幅のた
めの益々一般的な手段である。したがって、核酸増幅
は、食糧農業試験、医学的診断、ヒト遺伝子分析および
カウンセリング、考古学並びに刑事弁論で用いられる。
これらの方法は全て酵素を用いるので、極めて活性な酵
素を多量に製造する、包装する、輸送するおよび貯蔵す
る方法は、核酸増幅用酵素およびキットの製造、マーケ
ティングおよび販売において極めて重要な問題点となっ
ている。具体的に、転写に基づく増幅を用いる方法に関
して、逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの活性標品を
貯蔵するための商業的に許容しうる方法および標品は、
核酸増幅用キットについて成功した製造およびマーケテ
ィングに不可欠である。
逆転写酵素およびRNAポリメラーゼ酵素（並びに分子
生物学研究で用いられる多数の他の酵素）を安定化させ
る一般的な方法は、50％（v/v）グリセロールおよびジ
チオトレイトール（DTT）またはβ−メルカプトエタノ
ール（βME）などの還元剤を含有する溶液中のそれぞれ
の酵素の液体標品を−20℃で貯蔵することによる。この
方法は、酵素の活性を何か月間もほとんど活性を失うこ
となく保存する。対照的に、酵素を室温でまたは４℃で
貯蔵する場合、酵素活性は容易に失われる。これらの標
品は、概して、酵素供給者から最終使用者までドライア
イス中で輸送され、このような輸送の際に、酵素標品の
凍結融解のために酵素活性が30％またはそれ以上減少す
ることは一般的である。これらの酵素は、別個に配合さ
れ且つ供給される。
生物学研究で用いられる多数の他の酵素）を安定化させ
る一般的な方法は、50％（v/v）グリセロールおよびジ
チオトレイトール（DTT）またはβ−メルカプトエタノ
ール（βME）などの還元剤を含有する溶液中のそれぞれ
の酵素の液体標品を−20℃で貯蔵することによる。この
方法は、酵素の活性を何か月間もほとんど活性を失うこ
となく保存する。対照的に、酵素を室温でまたは４℃で
貯蔵する場合、酵素活性は容易に失われる。これらの標
品は、概して、酵素供給者から最終使用者までドライア
イス中で輸送され、このような輸送の際に、酵素標品の
凍結融解のために酵素活性が30％またはそれ以上減少す
ることは一般的である。これらの酵素は、別個に配合さ
れ且つ供給される。
冷凍を必要とすることなく逆転写酵素およびRNAポリ
メラーゼを貯蔵し且つ輸送する方法は、ドライアイス、
ウェットパック、ドライパックまたはスチロフォーム輸
送容器などの冷蔵輸送および／または貯蔵法の必要性を
なくすであろう。このような方法はまた、酵素活性を維
持するこれらの方法に関係した生産経費が不必要である
ので、原価効率がよりよいと考えられる。酵素標品があ
る限られた高温暴露に耐えることを可能にする酵素貯蔵
方法は、その酵素標品が輸送中に積載ドック上またはト
ラック中にある場合に、起こりうる酵素活性の減少をな
くすであろう。このような方法は、極めて再現可能であ
るべきであろう。更に、酵素が単一容器中において（任
意の必要な副因子および基質の全部または大部分を含有
する配合物中などの）それらの目的用途に適合した形で
提供される場合、このような標品は製造するのにより経
済的であり且つ使用するのにより好都合であろう。
メラーゼを貯蔵し且つ輸送する方法は、ドライアイス、
ウェットパック、ドライパックまたはスチロフォーム輸
送容器などの冷蔵輸送および／または貯蔵法の必要性を
なくすであろう。このような方法はまた、酵素活性を維
持するこれらの方法に関係した生産経費が不必要である
ので、原価効率がよりよいと考えられる。酵素標品があ
る限られた高温暴露に耐えることを可能にする酵素貯蔵
方法は、その酵素標品が輸送中に積載ドック上またはト
ラック中にある場合に、起こりうる酵素活性の減少をな
くすであろう。このような方法は、極めて再現可能であ
るべきであろう。更に、酵素が単一容器中において（任
意の必要な副因子および基質の全部または大部分を含有
する配合物中などの）それらの目的用途に適合した形で
提供される場合、このような標品は製造するのにより経
済的であり且つ使用するのにより好都合であろう。
凍結乾燥（lyophilization）は、食品、生体膜、全細
胞（例えば、American Society for Microbiology,Manu
al of Methods for General Becteriology 210−217（1
981）を参照されたい）、および酵素を含めた生体高分
子を保存するのに用いられてきた。凍結乾燥は、減圧下
での昇華によって凍結試料から水を除去することを必要
とする。昇華とは、液体状態を経ることなく固体を蒸発
させる過程である。
胞（例えば、American Society for Microbiology,Manu
al of Methods for General Becteriology 210−217（1
981）を参照されたい）、および酵素を含めた生体高分
子を保存するのに用いられてきた。凍結乾燥は、減圧下
での昇華によって凍結試料から水を除去することを必要
とする。昇華とは、液体状態を経ることなく固体を蒸発
させる過程である。
凍結乾燥の理論的局面は複雑である。タンパク質など
の生体物質が水溶液中にある場合、その分子は、水分子
を含む水和殻によって取り囲まれていると考えられ、こ
の水和殻はタンパク質を安定させ且つその活性を維持す
るのに役立つ。水が除去された時、通常は水和殻で隠さ
れているタンパク質の反応性基は自由になって互いに反
応し、それによって新たに、本質的に不可逆性の結合を
形成する。これらの結合は、タンパク質の自然のコンホ
メーションを歪めることがある。更に、水の不存在下で
は、新たな疎水／親水相互作用が起こるかもしれず、こ
れもまたタンパク質のコンホメーションを歪めることが
ある。多数のタンパク質の三次元コンホメーションは生
物学的活性を与えるので、そのコンホメーションの歪み
は、乾燥時に生物学的活性を変化させることがある。同
様の機序により、タンパク質の架橋および凝集が起こり
うる。
の生体物質が水溶液中にある場合、その分子は、水分子
を含む水和殻によって取り囲まれていると考えられ、こ
の水和殻はタンパク質を安定させ且つその活性を維持す
るのに役立つ。水が除去された時、通常は水和殻で隠さ
れているタンパク質の反応性基は自由になって互いに反
応し、それによって新たに、本質的に不可逆性の結合を
形成する。これらの結合は、タンパク質の自然のコンホ
メーションを歪めることがある。更に、水の不存在下で
は、新たな疎水／親水相互作用が起こるかもしれず、こ
れもまたタンパク質のコンホメーションを歪めることが
ある。多数のタンパク質の三次元コンホメーションは生
物学的活性を与えるので、そのコンホメーションの歪み
は、乾燥時に生物学的活性を変化させることがある。同
様の機序により、タンパク質の架橋および凝集が起こり
うる。
タンパク質試料を乾燥させる前に凍結させることは、
乾燥によるコンホメーション歪度を少なくするのに役立
つ。低下した初期温度は、反応物のエネルギーを奪うこ
とによってアミノ酸反応性基間の望ましくない反応を最
小限に維持するのに役立つ。同時に、凍結状態でのタン
パク質は、溶液の場合よりも立体的にあまり自由ではな
く且つ総体的なコンホメーション変化がほとんどない傾
向がある。
乾燥によるコンホメーション歪度を少なくするのに役立
つ。低下した初期温度は、反応物のエネルギーを奪うこ
とによってアミノ酸反応性基間の望ましくない反応を最
小限に維持するのに役立つ。同時に、凍結状態でのタン
パク質は、溶液の場合よりも立体的にあまり自由ではな
く且つ総体的なコンホメーション変化がほとんどない傾
向がある。
しかしながら、完全に乾燥された凍結乾燥物は、低百
分率の水をまだ含有している不完全に乾燥された凍結乾
燥物の場合よりも「保存」すなわち貯蔵寿命が短い傾向
がある。このような不完全に乾燥された凍結乾燥物は、
しばしば、約４〜10℃以下の温度で貯蔵される必要があ
り、そしてなお、水が存在しないところでは起こりえな
い不活性化学反応が進行しうる。したがって、多数の不
完全乾燥で凍結乾燥された生物学的活性タンパク質の保
存寿命は、完全に乾燥されているものよりも長いが、活
性を維持するために標品を冷蔵することはなお必要であ
る。たとえそうでも、このような標品の活性は比較的短
期間で減少する。更に、ホスフルクトキナーゼなどの若
干の酵素は、その標品が完全に乾燥されているか否かに
関わりなく、凍結保護物質の不存在下では凍結乾燥後に
完全に失活する。例えば、カーペンター（Carpenter）
ら,Crwyobiology 25:372−376（1988）を参照された
い。
分率の水をまだ含有している不完全に乾燥された凍結乾
燥物の場合よりも「保存」すなわち貯蔵寿命が短い傾向
がある。このような不完全に乾燥された凍結乾燥物は、
しばしば、約４〜10℃以下の温度で貯蔵される必要があ
り、そしてなお、水が存在しないところでは起こりえな
い不活性化学反応が進行しうる。したがって、多数の不
完全乾燥で凍結乾燥された生物学的活性タンパク質の保
存寿命は、完全に乾燥されているものよりも長いが、活
性を維持するために標品を冷蔵することはなお必要であ
る。たとえそうでも、このような標品の活性は比較的短
期間で減少する。更に、ホスフルクトキナーゼなどの若
干の酵素は、その標品が完全に乾燥されているか否かに
関わりなく、凍結保護物質の不存在下では凍結乾燥後に
完全に失活する。例えば、カーペンター（Carpenter）
ら,Crwyobiology 25:372−376（1988）を参照された
い。
本明細書中で用いられる「凍結保護物質」という用語
は、生物学的活性物質の凍結、乾燥および／またはその
乾燥物質の再構成の際に、その活性を保護する傾向があ
る化合物または組成物を意味するものである。
は、生物学的活性物質の凍結、乾燥および／またはその
乾燥物質の再構成の際に、その活性を保護する傾向があ
る化合物または組成物を意味するものである。
「安定化剤」という用語は、生物学的活性物質に対し
て加えられた場合に、その物質が安定化剤の不存在下で
貯蔵されている場合と比較して、その物質の生物学的活
性の経時減少を妨げるまたは遅らせる物質を意味する。
て加えられた場合に、その物質が安定化剤の不存在下で
貯蔵されている場合と比較して、その物質の生物学的活
性の経時減少を妨げるまたは遅らせる物質を意味する。
特定のタンパク質を含めた生体材料を乾燥させる場合
に生物学的活性を保存するのに役立つ賦形剤として用い
るために各種凍結保護物質添加剤が用いられまたは提案
されてきた。クレッグ（Clegg）ら,Cryobiology 19:106
−316（1982）は、乾燥保存後も生存しうる状態にある
海産エビアルテミア（Artemia）の嚢子の能力における
グリセロールおよび／またはトレハロースの役割を研究
してきた。カーペンターら,Cryobiology 24:455−464
（1987）は、二糖マルトース、スクロース、ラクトース
およびトレハロースが、空気乾燥された精製酵素標品に
おいてホスホフルクトキナーゼ活性の安定化を増加させ
る役割を果たしうるということを報告している。EPO公
開第0431882A2号は、誘導体化された後にマンニトール
またはラクトースの存在下で凍結乾燥された精製アルカ
リ性ホスファターゼの安定化された標品を開示してい
る。EPO公開第0091258A2号は、ヒト血清アルブミン、ゼ
ラチン、ヒトγグロブリンまたはサケ硫酸プロタミンな
どの安定化タンパク質の存在下での精製タンパク質の貯
蔵または凍結乾燥による、腫瘍壊死因子（TNF）を安定
化させる方法を開示している。米国特許第4,451,569号
明細書は、精製グルタチオンペルオキシターゼの活性を
安定化させるペントース、糖アルコールおよび若干の二
糖の使用を開示している。安定化された組成物は、凍結
乾燥された後、20℃未満の温度で貯蔵することができ
る。EPO公開第0448146A1号は、ジカルボン酸塩を含有す
る安定化された凍結乾燥ゴナドトロピン標品を検討して
いる。その標品は、スクロースまたはトレハロースなど
の二糖を更に含むことができる。ロサー（Roser）,Biop
harm,47−53（1991年９月）は、トレハロースを用いて
周囲温度で乾燥された種々の生体分子の生物学的活性を
保存することを検討している。PCT公開第WO87/00196号
は、トレハロースの存在下の空気乾燥による単クローン
性抗体およびウシ腸アルカリ性ホスファターゼの安定化
を報告している。PCT公開第WO89/00012号および同第WO8
9/06542号は、若干の食品および生きているウイルス粒
子の抗原性を保存するためのトレハロースの使用を検討
している。EPO公開第02270799A1号は、界面活性剤また
はグリセロールなどの安定化剤を含有する配合物中の組
換えβ−インターフェロンの安定化を報告している。そ
の組成物は、追加の安定化剤としてスクロースおよびト
レハロースを含めた種々の糖、糖アルコール、およびタ
ンパク質を更に含むことができ、これらの内で最も好ま
しいのはデキストロースである。
に生物学的活性を保存するのに役立つ賦形剤として用い
るために各種凍結保護物質添加剤が用いられまたは提案
されてきた。クレッグ（Clegg）ら,Cryobiology 19:106
−316（1982）は、乾燥保存後も生存しうる状態にある
海産エビアルテミア（Artemia）の嚢子の能力における
グリセロールおよび／またはトレハロースの役割を研究
してきた。カーペンターら,Cryobiology 24:455−464
（1987）は、二糖マルトース、スクロース、ラクトース
およびトレハロースが、空気乾燥された精製酵素標品に
おいてホスホフルクトキナーゼ活性の安定化を増加させ
る役割を果たしうるということを報告している。EPO公
開第0431882A2号は、誘導体化された後にマンニトール
またはラクトースの存在下で凍結乾燥された精製アルカ
リ性ホスファターゼの安定化された標品を開示してい
る。EPO公開第0091258A2号は、ヒト血清アルブミン、ゼ
ラチン、ヒトγグロブリンまたはサケ硫酸プロタミンな
どの安定化タンパク質の存在下での精製タンパク質の貯
蔵または凍結乾燥による、腫瘍壊死因子（TNF）を安定
化させる方法を開示している。米国特許第4,451,569号
明細書は、精製グルタチオンペルオキシターゼの活性を
安定化させるペントース、糖アルコールおよび若干の二
糖の使用を開示している。安定化された組成物は、凍結
乾燥された後、20℃未満の温度で貯蔵することができ
る。EPO公開第0448146A1号は、ジカルボン酸塩を含有す
る安定化された凍結乾燥ゴナドトロピン標品を検討して
いる。その標品は、スクロースまたはトレハロースなど
の二糖を更に含むことができる。ロサー（Roser）,Biop
harm,47−53（1991年９月）は、トレハロースを用いて
周囲温度で乾燥された種々の生体分子の生物学的活性を
保存することを検討している。PCT公開第WO87/00196号
は、トレハロースの存在下の空気乾燥による単クローン
性抗体およびウシ腸アルカリ性ホスファターゼの安定化
を報告している。PCT公開第WO89/00012号および同第WO8
9/06542号は、若干の食品および生きているウイルス粒
子の抗原性を保存するためのトレハロースの使用を検討
している。EPO公開第02270799A1号は、界面活性剤また
はグリセロールなどの安定化剤を含有する配合物中の組
換えβ−インターフェロンの安定化を報告している。そ
の組成物は、追加の安定化剤としてスクロースおよびト
レハロースを含めた種々の糖、糖アルコール、およびタ
ンパク質を更に含むことができ、これらの内で最も好ま
しいのはデキストロースである。
これら添加剤のいくつかは、周囲温度においてほぼ脱
水状態で貯蔵された場合、生物学的活性物質の保存寿命
を何か月またはそれ以上まで延長することが判ってい
る。しかしながら、具体的な予想される添加剤の有効
性、適合性または利点は、安定化するように求められる
生物学的活性物質の化学組成に依り、タンパク質の場
合、これらの因子としては、限定されることなく、その
タンパク質のアミノ酸配列、並びにその二次、三次およ
び四次構造を挙げることができる。したがって、特定の
組成物が特定の生物学的活性物質の生物学的活性を保存
するように働くかどうかを演繹的に予想することはでき
ない。
水状態で貯蔵された場合、生物学的活性物質の保存寿命
を何か月またはそれ以上まで延長することが判ってい
る。しかしながら、具体的な予想される添加剤の有効
性、適合性または利点は、安定化するように求められる
生物学的活性物質の化学組成に依り、タンパク質の場
合、これらの因子としては、限定されることなく、その
タンパク質のアミノ酸配列、並びにその二次、三次およ
び四次構造を挙げることができる。したがって、特定の
組成物が特定の生物学的活性物質の生物学的活性を保存
するように働くかどうかを演繹的に予想することはでき
ない。
更に、タンパク質を凍結乾燥させる場合、緩衝液組
成、凍結速度、負圧の量、凍結乾燥初期温度、作業温度
および最終温度並びに凍結乾燥手順の長さを含めた追加
の因子は、これに限定されることなく、活性タンパク質
の安定性および保存寿命を決定するのに重要である。
成、凍結速度、負圧の量、凍結乾燥初期温度、作業温度
および最終温度並びに凍結乾燥手順の長さを含めた追加
の因子は、これに限定されることなく、活性タンパク質
の安定性および保存寿命を決定するのに重要である。
若干のタンパク質は、多数の酵素活性を有することが
知られている。例えば、モロニーネズミ白血病ウイルス
に由来する酵素などのレトロウイルス逆転写酵素（MMLV
−RT）は、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性、RNA依存性D
NAポリメラーゼ活性およびRNアーゼＨ活性を有する。こ
れらの活性は同一酵素中に含まれるが、乾燥標品中のこ
れらの活性のいずれか一つを保存するための条件は、残
りの酵素活性の一つまたは両方もまた同一の条件下で保
存されることを約束するものではない。
知られている。例えば、モロニーネズミ白血病ウイルス
に由来する酵素などのレトロウイルス逆転写酵素（MMLV
−RT）は、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性、RNA依存性D
NAポリメラーゼ活性およびRNアーゼＨ活性を有する。こ
れらの活性は同一酵素中に含まれるが、乾燥標品中のこ
れらの活性のいずれか一つを保存するための条件は、残
りの酵素活性の一つまたは両方もまた同一の条件下で保
存されることを約束するものではない。
更に、カシアンおよびフルツ，上記（本出願と同一所
有権者を有し且つ本明細書中に援用される）の転写に基
づく核酸増幅系の場合と同様に、逆転写酵素の３種類の
活性の相対比活性の均衡は、再構成後も、乾燥前のこれ
らの活性の均衡と同様の状態にあるということが特定の
用途に要求される場合、特定の保存法は、これらの酵素
活性の微妙な均衡を失わせ、それによってその酵素をこ
の種の使用に不適当にさせることがある。例えば、酵素
のRNアーゼ活性がRNA依存性DNAポリメラーゼ活性により
多く保存される場合、RNA:DNA開始複合体は、DNA合成が
開始できる前に分解されることがある。
有権者を有し且つ本明細書中に援用される）の転写に基
づく核酸増幅系の場合と同様に、逆転写酵素の３種類の
活性の相対比活性の均衡は、再構成後も、乾燥前のこれ
らの活性の均衡と同様の状態にあるということが特定の
用途に要求される場合、特定の保存法は、これらの酵素
活性の微妙な均衡を失わせ、それによってその酵素をこ
の種の使用に不適当にさせることがある。例えば、酵素
のRNアーゼ活性がRNA依存性DNAポリメラーゼ活性により
多く保存される場合、RNA:DNA開始複合体は、DNA合成が
開始できる前に分解されることがある。
ある与えられた酵素活性の長期保存に有効な与えられ
た凍結保護組成物は、別の酵素活性に対して適用された
場合の有効性または利点が明らかではないので、種々の
酵素は、しばしば、活性安定化について全く異なった議
論を必要とする。結果として、商業的に製造された凍結
乾燥酵素標品の内の全部または大部分は、その特定の酵
素の活性を保存するように受注生産された配合物中に、
乾燥された１種類の酵素のみを含む。
た凍結保護組成物は、別の酵素活性に対して適用された
場合の有効性または利点が明らかではないので、種々の
酵素は、しばしば、活性安定化について全く異なった議
論を必要とする。結果として、商業的に製造された凍結
乾燥酵素標品の内の全部または大部分は、その特定の酵
素の活性を保存するように受注生産された配合物中に、
乾燥された１種類の酵素のみを含む。
発明の概要 本発明は、酵素活性を実質的に減少することなく周囲
温度で長期間貯蔵することができる逆転写酵素およびRN
Aポリメラーゼの乾燥配合物を含む組成物およびキット
に関する。好ましくは、該配合物は、レトロウイルス逆
転写酵素および／またはバクテリオファージRNAポリメ
ラーゼの標品を含む。更に好ましくは、該配合物は、凍
結保護賦形剤中に、モロニーネズミ白血病ウイルスに由
来する逆転写酵素（MMLV−RT）およびバクテリオファー
ジT7 RNAポリメラーゼを含む。なお一層好ましくは、
本発明は、１種類またはそれ以上の凍結保護賦形剤中に
MMLV−RTおよびT7 RNAポリメラーゼ両方を含有する乾
燥配合物を含む単一容器に関する。最も好ましくは、本
発明は、MMLV−RTおよびT7 RNAポリメラーゼ、トレハ
ロースおよびポリビニルピロリドン（PAP）のどちらか
または両方を含む１種類またはそれ以上の凍結保護賦形
剤、ヌクレオチド三リン酸、並びに前記酵素活性に必要
な金属イオンおよび副因子を含有する乾燥配合物を含む
単一容器であって、安定化された凍結乾燥物の再構成並
びに標的核酸および１種類またはそれ以上の適当なプラ
イマーの添加の際に、該配合物が、過度の取扱いを必要
とすることなく核酸増幅に好都合で且つ原価効率がよい
形である上記単一容器に関する。場合により、このよう
な配合物は、核酸合成の開始のためのプライマーを含ん
でいてよい。最後に、本発明は、上記の乾燥配合物の製
造方法および使用方法に関する。
温度で長期間貯蔵することができる逆転写酵素およびRN
Aポリメラーゼの乾燥配合物を含む組成物およびキット
に関する。好ましくは、該配合物は、レトロウイルス逆
転写酵素および／またはバクテリオファージRNAポリメ
ラーゼの標品を含む。更に好ましくは、該配合物は、凍
結保護賦形剤中に、モロニーネズミ白血病ウイルスに由
来する逆転写酵素（MMLV−RT）およびバクテリオファー
ジT7 RNAポリメラーゼを含む。なお一層好ましくは、
本発明は、１種類またはそれ以上の凍結保護賦形剤中に
MMLV−RTおよびT7 RNAポリメラーゼ両方を含有する乾
燥配合物を含む単一容器に関する。最も好ましくは、本
発明は、MMLV−RTおよびT7 RNAポリメラーゼ、トレハ
ロースおよびポリビニルピロリドン（PAP）のどちらか
または両方を含む１種類またはそれ以上の凍結保護賦形
剤、ヌクレオチド三リン酸、並びに前記酵素活性に必要
な金属イオンおよび副因子を含有する乾燥配合物を含む
単一容器であって、安定化された凍結乾燥物の再構成並
びに標的核酸および１種類またはそれ以上の適当なプラ
イマーの添加の際に、該配合物が、過度の取扱いを必要
とすることなく核酸増幅に好都合で且つ原価効率がよい
形である上記単一容器に関する。場合により、このよう
な配合物は、核酸合成の開始のためのプライマーを含ん
でいてよい。最後に、本発明は、上記の乾燥配合物の製
造方法および使用方法に関する。
逆転写酵素およびRNAポリメラーゼ酵素は、バーグ
ら，上記；ジンジェラスら，上記（時々、転写増幅系ま
たはTASと称される）；カシアンおよびフルツ，上記；
デイビーおよびマレク,EPO出願第88113948.9号；および
マレクら,PCT公開第WO 91/02818号で記載されたよう
な、転写媒介性核酸増幅法において重要な物質である。
このような方法は、法医学および医学的診断などの分野
において益々重要であり、そこでは、増幅試薬の経時安
定性が、核酸増幅を用いる製品の製造、マーケティング
および使用の費用の重要な要件である。
ら，上記；ジンジェラスら，上記（時々、転写増幅系ま
たはTASと称される）；カシアンおよびフルツ，上記；
デイビーおよびマレク,EPO出願第88113948.9号；および
マレクら,PCT公開第WO 91/02818号で記載されたよう
な、転写媒介性核酸増幅法において重要な物質である。
このような方法は、法医学および医学的診断などの分野
において益々重要であり、そこでは、増幅試薬の経時安
定性が、核酸増幅を用いる製品の製造、マーケティング
および使用の費用の重要な要件である。
出願人は、逆転写酵素のDNA依存性DNAポリメラーゼ、
RNA依存性DNAポリメラーゼおよびRNアーゼＨ活性の保存
のための方法および乾燥配合物を発見した。同方法およ
び配合物は、RNAポリメラーゼ活性の保存に適している
ことが発見された。更に、出願人は、意外にも、両方の
酵素および４種類全部の酵素活性が、高温で長時間のイ
ンキュベーション後でさえも、かなりの期間にわたって
４種類の活性をいずれもほとんど失うことなく、単一容
器中の乾燥配合物として安定化され且つ保存されうるこ
とを発見した。
RNA依存性DNAポリメラーゼおよびRNアーゼＨ活性の保存
のための方法および乾燥配合物を発見した。同方法およ
び配合物は、RNAポリメラーゼ活性の保存に適している
ことが発見された。更に、出願人は、意外にも、両方の
酵素および４種類全部の酵素活性が、高温で長時間のイ
ンキュベーション後でさえも、かなりの期間にわたって
４種類の活性をいずれもほとんど失うことなく、単一容
器中の乾燥配合物として安定化され且つ保存されうるこ
とを発見した。
本方法の一つの態様は、活性な精製逆転写酵素を、非
還元性二糖（好ましくは、スクロースまたはトレハロー
ス）またはポリビニルピロリドン（PAP）を含む凍結保
護賦形剤と一緒に、または逆転写酵素および該凍結保護
物質を含有する溶液を、限定されるわけではないが凍結
乾燥などの方法によって酵素を乾燥した後に、逆転写酵
素のDNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラ
ーゼおよびRNアーゼＨ活性を保護し且つ保存する物質と
して作用するのに有効な量のこれらの化合物の混合物と
一緒に提供することを含む。
還元性二糖（好ましくは、スクロースまたはトレハロー
ス）またはポリビニルピロリドン（PAP）を含む凍結保
護賦形剤と一緒に、または逆転写酵素および該凍結保護
物質を含有する溶液を、限定されるわけではないが凍結
乾燥などの方法によって酵素を乾燥した後に、逆転写酵
素のDNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラ
ーゼおよびRNアーゼＨ活性を保護し且つ保存する物質と
して作用するのに有効な量のこれらの化合物の混合物と
一緒に提供することを含む。
第二の態様において、本発明は、活性な精製RNAポリ
メラーゼ、好ましくは、T7 RNAポリメラーゼを、室温
で90日間を越えて実質的に安定な脱水状態で安定化させ
且つ保存する方法を特徴とする。この態様において、RN
Aポリメラーゼは、Mg++またはZn++を含有するような金
属塩；非還元性二糖、好ましくは、トレハロース、およ
びポリビニルピロリドン（PAP）から成る群より選択さ
れる１種類またはそれ以上の保護安定化剤；並びにｎ−
アセチル−Ｌ−システイン（NALC）などの還元剤の存在
下で乾燥される。理論によって制限されることを望むも
のではないが、出願人は、還元剤が、酵素中に存在する
任意のシステイン残基の酸化による酵素の失活を妨げる
のに役立つと考えている。この態様において、RNAポリ
メラーゼは、好ましくは、その脱水配合物を45℃の温度
に対して少なくとも30日間、または35℃に少なくとも61
日間暴露後に、その元の活性の少なくとも70％を保持し
ている。
メラーゼ、好ましくは、T7 RNAポリメラーゼを、室温
で90日間を越えて実質的に安定な脱水状態で安定化させ
且つ保存する方法を特徴とする。この態様において、RN
Aポリメラーゼは、Mg++またはZn++を含有するような金
属塩；非還元性二糖、好ましくは、トレハロース、およ
びポリビニルピロリドン（PAP）から成る群より選択さ
れる１種類またはそれ以上の保護安定化剤；並びにｎ−
アセチル−Ｌ−システイン（NALC）などの還元剤の存在
下で乾燥される。理論によって制限されることを望むも
のではないが、出願人は、還元剤が、酵素中に存在する
任意のシステイン残基の酸化による酵素の失活を妨げる
のに役立つと考えている。この態様において、RNAポリ
メラーゼは、好ましくは、その脱水配合物を45℃の温度
に対して少なくとも30日間、または35℃に少なくとも61
日間暴露後に、その元の活性の少なくとも70％を保持し
ている。
もう一つの態様において、本発明は、逆転写酵素（好
ましくは、MMLV−RT）、RNAポリメラーゼ（好ましく
は、T7 RNAポリメラーゼ）、乾燥酵素の酵素活性を保
存するのに有効な量の凍結保護賦形剤（好ましくは、ト
レハロースおよび／またはポリビニルピロリドン）、ヌ
クレオチド三リン酸、必要な副因子、任意のオリゴヌク
レオチドプライマー、および還元剤、好ましくは、チオ
ール化合物の混合物を含有する単一乾燥配合物を特徴と
する。
ましくは、MMLV−RT）、RNAポリメラーゼ（好ましく
は、T7 RNAポリメラーゼ）、乾燥酵素の酵素活性を保
存するのに有効な量の凍結保護賦形剤（好ましくは、ト
レハロースおよび／またはポリビニルピロリドン）、ヌ
クレオチド三リン酸、必要な副因子、任意のオリゴヌク
レオチドプライマー、および還元剤、好ましくは、チオ
ール化合物の混合物を含有する単一乾燥配合物を特徴と
する。
更にもう一つの態様において、本発明は、生物の１種
類またはそれ以上の系統発生分類に属する核酸の増幅お
よび特異的識別のための、例えば、属の中の１種類若し
くはそれ以上の種、または科の中の１種類若しくはそれ
以上の属の特異的検出のためのキットの成分を含む。本
発明は、単一容器中に逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、
リボヌクレオチド三リン酸、デオキシリボヌクレオチド
三リン酸、亜鉛および／またはマグネシウム塩、および
還元剤を含む再構成可能な乾燥配合物を提供する。増幅
プライマーおよび再構成水溶液は、キットの１種類また
はそれ以上の更に別の成分として与えられることができ
る。或いは、増幅プライマーは、乾燥配合物中に含まれ
ることができる。標的配列特異的核酸ハイブリダイゼー
ション検定プローブおよび任意の望ましい未標識ヘルパ
ーオリゴヌクレオチドは、乾燥配合物中に含まれるかま
たは別の試薬で提供されることができる。乾燥配合物の
再構成およびオリゴヌクレオチドプライマー（既に存在
していない場合）を添加したのち、混合物を不完全また
は完全な一本鎖標的核酸と接触させる。標的核酸が１個
または複数のプライマー（またはプロモーター−プライ
マー（１個または複数の）のプライマー部分）と相補的
なヌクレオチド配列を有する場合、核酸増幅に充分な温
度での反応混合物のインキュベーションの際に反応が進
行するであろう。
類またはそれ以上の系統発生分類に属する核酸の増幅お
よび特異的識別のための、例えば、属の中の１種類若し
くはそれ以上の種、または科の中の１種類若しくはそれ
以上の属の特異的検出のためのキットの成分を含む。本
発明は、単一容器中に逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、
リボヌクレオチド三リン酸、デオキシリボヌクレオチド
三リン酸、亜鉛および／またはマグネシウム塩、および
還元剤を含む再構成可能な乾燥配合物を提供する。増幅
プライマーおよび再構成水溶液は、キットの１種類また
はそれ以上の更に別の成分として与えられることができ
る。或いは、増幅プライマーは、乾燥配合物中に含まれ
ることができる。標的配列特異的核酸ハイブリダイゼー
ション検定プローブおよび任意の望ましい未標識ヘルパ
ーオリゴヌクレオチドは、乾燥配合物中に含まれるかま
たは別の試薬で提供されることができる。乾燥配合物の
再構成およびオリゴヌクレオチドプライマー（既に存在
していない場合）を添加したのち、混合物を不完全また
は完全な一本鎖標的核酸と接触させる。標的核酸が１個
または複数のプライマー（またはプロモーター−プライ
マー（１個または複数の）のプライマー部分）と相補的
なヌクレオチド配列を有する場合、核酸増幅に充分な温
度での反応混合物のインキュベーションの際に反応が進
行するであろう。
もう一つの態様において、本発明は、逆転写酵素（好
ましくは、MMLV−RT）、RNAポリメラーゼ（好ましく
は、T7 RNAポリメラーゼ）、凍結保護賦形剤、ヌクレ
オチド三リン酸、必要な副因子および、好ましくはチオ
ール基を有する還元剤の組み合わせを含有する単一凍結
乾燥物を含む。該凍結乾燥物は、冷蔵を必要とすること
なく輸送され且つ貯蔵されうるし、そして酵素活性を有
意に減少させることなく一時的な高温暴露、例えば、限
定されることなく、55℃で30日間に耐えることができ
る。
ましくは、MMLV−RT）、RNAポリメラーゼ（好ましく
は、T7 RNAポリメラーゼ）、凍結保護賦形剤、ヌクレ
オチド三リン酸、必要な副因子および、好ましくはチオ
ール基を有する還元剤の組み合わせを含有する単一凍結
乾燥物を含む。該凍結乾燥物は、冷蔵を必要とすること
なく輸送され且つ貯蔵されうるし、そして酵素活性を有
意に減少させることなく一時的な高温暴露、例えば、限
定されることなく、55℃で30日間に耐えることができ
る。
「ヌクレオチド三リン酸」とは、それぞれRNAポリメ
ラーゼおよびDNAポリメラーゼ（好ましくは逆転写酵
素）の基質として役立つことができるリボ−またはデオ
キシリボヌクレオチド三リン酸およびそれらの誘導体を
意味する。このような誘導体としては、限定されること
なく、含窒素塩基（通常、アデニン、チミンまたはウラ
シル、シトシンおよびグアニン）、リボース若しくはデ
オキシリボース部分、またはリン酸基に包含されたメチ
ル（または他のアルキル）および／または硫黄基を有す
るヌクレオチドを挙げることができる。
ラーゼおよびDNAポリメラーゼ（好ましくは逆転写酵
素）の基質として役立つことができるリボ−またはデオ
キシリボヌクレオチド三リン酸およびそれらの誘導体を
意味する。このような誘導体としては、限定されること
なく、含窒素塩基（通常、アデニン、チミンまたはウラ
シル、シトシンおよびグアニン）、リボース若しくはデ
オキシリボース部分、またはリン酸基に包含されたメチ
ル（または他のアルキル）および／または硫黄基を有す
るヌクレオチドを挙げることができる。
「ヌクレオチド」とは、一つの含窒素塩基（通常、ア
デニン、チミンまたはウラシル、シトシンおよびグアニ
ン）、糖部分（リボースまたはデオキシリボース）およ
びリン酸基を含む核酸サブユニットを意味する。本明細
書中で用いられる用語は、用いられる文脈に応じて、取
り込まれていないリボ−またはデオキシリボヌクレオチ
ド三リン酸およびオリゴヌクレオチドまたは核酸鎖の共
有結合したヌクレオチドサブユニット両方を意味する。
デニン、チミンまたはウラシル、シトシンおよびグアニ
ン）、糖部分（リボースまたはデオキシリボース）およ
びリン酸基を含む核酸サブユニットを意味する。本明細
書中で用いられる用語は、用いられる文脈に応じて、取
り込まれていないリボ−またはデオキシリボヌクレオチ
ド三リン酸およびオリゴヌクレオチドまたは核酸鎖の共
有結合したヌクレオチドサブユニット両方を意味する。
発明の詳細な説明 本発明は、DNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼ酵
素の酵素活性を安定化させる方法であって、凍結保護物
質または安定化「増量剤」の存在下においてこれらの酵
素の１種類またはそれ以上を含有する溶液から溶媒を除
去することによる上記方法に関する。このような凍結保
護物質としては、サッカライド、特に、非還元性二糖、
および酵素と水素結合するのに利用可能な陽性および／
または陰性基を有する水溶性ポリマーがある。特に好ま
しい凍結保護物質は、二糖のスクロースおよびトレハロ
ース並びにポリマーのポリビニルピロリドン（PAP）で
ある。
素の酵素活性を安定化させる方法であって、凍結保護物
質または安定化「増量剤」の存在下においてこれらの酵
素の１種類またはそれ以上を含有する溶液から溶媒を除
去することによる上記方法に関する。このような凍結保
護物質としては、サッカライド、特に、非還元性二糖、
および酵素と水素結合するのに利用可能な陽性および／
または陰性基を有する水溶性ポリマーがある。特に好ま
しい凍結保護物質は、二糖のスクロースおよびトレハロ
ース並びにポリマーのポリビニルピロリドン（PAP）で
ある。
本発明は、更に、乾燥保存されたDNAポリメラーゼ、
乾燥保存されたRNAポリメラーゼ、またはDNAポリメラー
ゼおよびRNAポリメラーゼ両方を含有する乾燥保存され
た混合物を含む安定な組成物に関する。これらの組成物
を含む好ましい酵素は、逆転写酵素およびバクテリオフ
ァージRNAポリメラーゼであり；特に好ましい酵素は、
モロニーネズミ白血病ウイルス由来レトロウイルス逆転
写酵素およびバクテリオファージT7由来RNAポリメラー
ゼである。
乾燥保存されたRNAポリメラーゼ、またはDNAポリメラー
ゼおよびRNAポリメラーゼ両方を含有する乾燥保存され
た混合物を含む安定な組成物に関する。これらの組成物
を含む好ましい酵素は、逆転写酵素およびバクテリオフ
ァージRNAポリメラーゼであり；特に好ましい酵素は、
モロニーネズミ白血病ウイルス由来レトロウイルス逆転
写酵素およびバクテリオファージT7由来RNAポリメラー
ゼである。
本発明のDNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼを乾
燥保存する好ましい方法は凍結乾燥による。この方法で
は、酵素含有溶液を凍結させ、凍結した酵素溶液に真空
を適用し、そして昇華によって標品から溶媒を除去し
て、溶質を残す。
燥保存する好ましい方法は凍結乾燥による。この方法で
は、酵素含有溶液を凍結させ、凍結した酵素溶液に真空
を適用し、そして昇華によって標品から溶媒を除去し
て、溶質を残す。
本発明は、更に、１種類またはそれ以上の特定の核酸
配列の複製のための組成物であって、DNAポリメラーゼ
（好ましくは、逆転写酵素）、RNAポリメラーゼ、ヌク
レオチド三リン酸、および酵素活性に必要な副因子の乾
燥保存された標品を含む上記組成物を特徴とする。乾燥
保存された標品は、標的ヌクレオチド配列の特異的複製
のための増幅プライマーおよび／またはハイブリダイゼ
ーション検定プローブおよびヘルパーを更に含むことが
できる。好ましくは、乾燥保存組成物を凍結乾燥によっ
て製造する。
配列の複製のための組成物であって、DNAポリメラーゼ
（好ましくは、逆転写酵素）、RNAポリメラーゼ、ヌク
レオチド三リン酸、および酵素活性に必要な副因子の乾
燥保存された標品を含む上記組成物を特徴とする。乾燥
保存された標品は、標的ヌクレオチド配列の特異的複製
のための増幅プライマーおよび／またはハイブリダイゼ
ーション検定プローブおよびヘルパーを更に含むことが
できる。好ましくは、乾燥保存組成物を凍結乾燥によっ
て製造する。
本発明の組成物は、たとえ高温で貯蔵された場合に
も、長期間安定している。このような組成物は、したが
って、これらの酵素の市販標品およびこれらの酵素を含
む核酸増幅用キットの輸送および貯蔵において有用であ
る。
も、長期間安定している。このような組成物は、したが
って、これらの酵素の市販標品およびこれらの酵素を含
む核酸増幅用キットの輸送および貯蔵において有用であ
る。
実施例 以下の実施例は、本発明の現在好ましい様々な実施態
様を例証するものであり、いずれにせよその範囲を制限
しないということは理解されるであろう。実施態様の開
示もまた、本発明によって対応することが求められる一
つまたはそれ以上の目的を達成するのにより有効である
本発明の他の実施態様が存在しないかもしれないという
ことを示すものではない。
様を例証するものであり、いずれにせよその範囲を制限
しないということは理解されるであろう。実施態様の開
示もまた、本発明によって対応することが求められる一
つまたはそれ以上の目的を達成するのにより有効である
本発明の他の実施態様が存在しないかもしれないという
ことを示すものではない。
実施例1:逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの凍結乾燥 この実施例および以下の実施例で用いた逆転写酵素
は、大腸菌（E.coli）菌株1200で発現され且つ細胞ペー
ストから精製された組換えモロニーネズミ白血病ウイル
ス逆転写酵素かまたは、ユナイテッド・ステーツ・バイ
オケミカルズ（United States Biochemicals），クリー
ブランド，オハイオから入手した商業的に入手可能な精
製MMLV−RT標品であった。酵素標品は、20〜50mMトリス
−HCl（pH7.5）、0.1M NaCl、0.1mMエチレンジアミン
四酢酸（EDTA）、1.0mMジチオトレイトール（DTT）、0.
01％（v/v）TERGITOL NP−40（TERGITOL NPは、ユニオ
ン・カーバイド・ケミカルズ・アンド・プラスティクス
・カンパニー・インコーポレーテッド（Union Carbide
Chemicals and Plastics Co.,Inc.）の登録商標であ
る）または0.1％（v/v）TRITON X−100（TRITONは、ユ
ニオン・カーバイド・ケミカルズ・アンド・プラスティ
クス・カンパニー・インコーポレーテッドの登録商標で
ある）および50％（v/v）グリセロールを含有する貯蔵
用緩衝液中に−20℃で貯蔵された。精製T7 RNAポリメ
ラーゼは、エピセントル・テクノロジーズ（Epicentre
Technologies），マディソン,WIから入手した。透析の
前に、酵素を50％（v/v）グリセロール、50mMトリス−H
Cl（pH7.5）、0.1M NaCl、1.0mM DTT、0.1mM EDTAお
よび0.1％（v/v）TRITONX−100中で貯蔵した。この酵素
もまた、透析の前に−20℃で貯蔵した。
は、大腸菌（E.coli）菌株1200で発現され且つ細胞ペー
ストから精製された組換えモロニーネズミ白血病ウイル
ス逆転写酵素かまたは、ユナイテッド・ステーツ・バイ
オケミカルズ（United States Biochemicals），クリー
ブランド，オハイオから入手した商業的に入手可能な精
製MMLV−RT標品であった。酵素標品は、20〜50mMトリス
−HCl（pH7.5）、0.1M NaCl、0.1mMエチレンジアミン
四酢酸（EDTA）、1.0mMジチオトレイトール（DTT）、0.
01％（v/v）TERGITOL NP−40（TERGITOL NPは、ユニオ
ン・カーバイド・ケミカルズ・アンド・プラスティクス
・カンパニー・インコーポレーテッド（Union Carbide
Chemicals and Plastics Co.,Inc.）の登録商標であ
る）または0.1％（v/v）TRITON X−100（TRITONは、ユ
ニオン・カーバイド・ケミカルズ・アンド・プラスティ
クス・カンパニー・インコーポレーテッドの登録商標で
ある）および50％（v/v）グリセロールを含有する貯蔵
用緩衝液中に−20℃で貯蔵された。精製T7 RNAポリメ
ラーゼは、エピセントル・テクノロジーズ（Epicentre
Technologies），マディソン,WIから入手した。透析の
前に、酵素を50％（v/v）グリセロール、50mMトリス−H
Cl（pH7.5）、0.1M NaCl、1.0mM DTT、0.1mM EDTAお
よび0.1％（v/v）TRITONX−100中で貯蔵した。この酵素
もまた、透析の前に−20℃で貯蔵した。
３種類の酵素標品を凍結乾燥用に透析した。第一標品
は、20mM HEPES（［２−ヒドロキシエチル］ピペラジ
ン−N'−［２−エタンスルホン酸］）（pH7.5）、0.1M
NaCl、0.1mM EDTA、2mM NALC、0.1mM硫酸亜鉛、0.2
Mトレハロースおよび水を含有する緩衝液中に希釈され
たMMLV−RT 324,012単位を含んだ。その最終容量は720
μｌであった。これを、同緩衝液（トレハロース緩衝液
（Trehalose Buffer））250mlに対して４℃で６時間透
析した。透析膜は、２％（w/v）重炭酸ナトリウムおよ
び10mM EDTA（pH8.0）中で、次に、10mM EDTA（pH8.
0）中で、そして最後に、脱イオン水中でそれぞれ10分
間沸騰させることによって調製された。次に、その膜
を、使用前に脱イオン水で充分に洗浄した。透析用緩衝
液を同量の新鮮な緩衝液と交換し、そして透析を更に10
時間続けた。緩衝後を再度交換し、そして更に３時間続
けた。最終容量は655μｌであった。
は、20mM HEPES（［２−ヒドロキシエチル］ピペラジ
ン−N'−［２−エタンスルホン酸］）（pH7.5）、0.1M
NaCl、0.1mM EDTA、2mM NALC、0.1mM硫酸亜鉛、0.2
Mトレハロースおよび水を含有する緩衝液中に希釈され
たMMLV−RT 324,012単位を含んだ。その最終容量は720
μｌであった。これを、同緩衝液（トレハロース緩衝液
（Trehalose Buffer））250mlに対して４℃で６時間透
析した。透析膜は、２％（w/v）重炭酸ナトリウムおよ
び10mM EDTA（pH8.0）中で、次に、10mM EDTA（pH8.
0）中で、そして最後に、脱イオン水中でそれぞれ10分
間沸騰させることによって調製された。次に、その膜
を、使用前に脱イオン水で充分に洗浄した。透析用緩衝
液を同量の新鮮な緩衝液と交換し、そして透析を更に10
時間続けた。緩衝後を再度交換し、そして更に３時間続
けた。最終容量は655μｌであった。
第二標品は、720μｌ中にT7 RNAポリメラーゼ144,00
0単位を含んだ。これを、トレハロース緩衝液に対して
逆転写酵素標品と同様の計画でおよび同量で透析した。
最終容量は1270μｌであった。
0単位を含んだ。これを、トレハロース緩衝液に対して
逆転写酵素標品と同様の計画でおよび同量で透析した。
最終容量は1270μｌであった。
第三標品は、逆転写酵素およびRNAポリメラーゼ両方
を含み、逆転写酵素324,012単位およびRNAポリメラーゼ
144,000単位を組合わせて、最終容量1440μｌとした。
これの、３等量のトレハロース緩衝液に対して他の二つ
の標品と同様の計画で透析した。透析液の最終容量は19
75μｌであった。
を含み、逆転写酵素324,012単位およびRNAポリメラーゼ
144,000単位を組合わせて、最終容量1440μｌとした。
これの、３等量のトレハロース緩衝液に対して他の二つ
の標品と同様の計画で透析した。透析液の最終容量は19
75μｌであった。
透析後、各標品を12等分のアリコートとしてバイアル
中に分割した。各バイアルは、逆転写酵素27,000単位、
T7 RNAポリメラーゼ12,000単位、または両酵素をこれ
らの量で含んだ。それらのバイアルを、FCP−III制御シ
ステムを備えたプログラム化しうるビルティス（Virti
s）型凍結乾燥器101−SRCに入れた。バイアルを約５分
間で−40℃まで冷却した。凍結乾燥は、圧力を−180ト
ルまで低下させることによって開始され、その真空は、
凍結乾燥プロトコル中、一定に保たれた。次に、温度を
−10℃まで次の２時間中に直線的に上昇させ、そしてこ
の温度で次の６時間維持した。次に、その温度を10℃ま
で次の１時間中に直線的に上昇させ、そして10℃で４時
間維持した。その温度を25℃まで次の30分間にわたって
再度直線的に上昇させ、そして25℃で次の10.5時間維持
した。次に、乾燥窒素の導入によって圧力を大気圧に戻
し、そしてバイアルを凍結乾燥器から取出す前に、それ
らを窒素下において密封した。次に、バイアルを25℃で
22日間貯蔵した。
中に分割した。各バイアルは、逆転写酵素27,000単位、
T7 RNAポリメラーゼ12,000単位、または両酵素をこれ
らの量で含んだ。それらのバイアルを、FCP−III制御シ
ステムを備えたプログラム化しうるビルティス（Virti
s）型凍結乾燥器101−SRCに入れた。バイアルを約５分
間で−40℃まで冷却した。凍結乾燥は、圧力を−180ト
ルまで低下させることによって開始され、その真空は、
凍結乾燥プロトコル中、一定に保たれた。次に、温度を
−10℃まで次の２時間中に直線的に上昇させ、そしてこ
の温度で次の６時間維持した。次に、その温度を10℃ま
で次の１時間中に直線的に上昇させ、そして10℃で４時
間維持した。その温度を25℃まで次の30分間にわたって
再度直線的に上昇させ、そして25℃で次の10.5時間維持
した。次に、乾燥窒素の導入によって圧力を大気圧に戻
し、そしてバイアルを凍結乾燥器から取出す前に、それ
らを窒素下において密封した。次に、バイアルを25℃で
22日間貯蔵した。
貯蔵期間後、凍結乾燥された酵素標品を、再構成用緩
衝液（Reconstitution Buffer））（0.01％（v/v）TRIT
ON Ｘ−100、41.6mM MgCl2、1mM ZnC2H3O2、10％（v
/v）グリセロール、0.3％（v/v）エタノール、0.02％
（w/v）メチルパラジンおよび0.01％（w/v）プロピルパ
ラベン）中に再構成し、そして核酸増幅を支持するそれ
らの能力について検定した。
衝液（Reconstitution Buffer））（0.01％（v/v）TRIT
ON Ｘ−100、41.6mM MgCl2、1mM ZnC2H3O2、10％（v
/v）グリセロール、0.3％（v/v）エタノール、0.02％
（w/v）メチルパラジンおよび0.01％（w/v）プロピルパ
ラベン）中に再構成し、そして核酸増幅を支持するそれ
らの能力について検定した。
全容量90μｌの反応混合物は、50mMトリス−HCl（pH
8.0）、17.5mM、2mMスペルミジン、25mM KCl、各2mMの
dATP、dCTP、dTTPおよびdGTP、2.5mM CTPおよびUTP、
6.5mM ATPおよびGTP、5mM DTT、バクテリオファージT
7遺伝子10の一方の鎖の領域に相補的な標的結合領域を
有するプロモーター−プライマー（配列番号:1）の675
μg/ml溶液0.44μｌ、バクテリオファージT7遺伝子10の
もう一方の鎖に相補的な標的結合領域を有するプライマ
ー（配列番号:2）の451μg/ml溶液0.3μｌ、T7遺伝子10
標的核酸100コピーおよび水を含んで調製された。T7遺
伝子10RNA標的は、プラスミドpGEMEX−１（プロメガ・
コーポレーション（Promega Corporation），マディソ
ン,WI）に由来するプラスミド由来T7遺伝子10制限フラ
グメントの（＋）センス転写物であった。精製RNA転写
物は、0.61ピコモル／μｌの濃度で存在した。標的核酸
100コピーを各試験管に加えた。各試験管に鉱油200μｌ
を更に重層させて、検定中の試料の蒸発を防止した。
8.0）、17.5mM、2mMスペルミジン、25mM KCl、各2mMの
dATP、dCTP、dTTPおよびdGTP、2.5mM CTPおよびUTP、
6.5mM ATPおよびGTP、5mM DTT、バクテリオファージT
7遺伝子10の一方の鎖の領域に相補的な標的結合領域を
有するプロモーター−プライマー（配列番号:1）の675
μg/ml溶液0.44μｌ、バクテリオファージT7遺伝子10の
もう一方の鎖に相補的な標的結合領域を有するプライマ
ー（配列番号:2）の451μg/ml溶液0.3μｌ、T7遺伝子10
標的核酸100コピーおよび水を含んで調製された。T7遺
伝子10RNA標的は、プラスミドpGEMEX−１（プロメガ・
コーポレーション（Promega Corporation），マディソ
ン,WI）に由来するプラスミド由来T7遺伝子10制限フラ
グメントの（＋）センス転写物であった。精製RNA転写
物は、0.61ピコモル／μｌの濃度で存在した。標的核酸
100コピーを各試験管に加えた。各試験管に鉱油200μｌ
を更に重層させて、検定中の試料の蒸発を防止した。
試験管は全て、95℃で５分間インキュベートし、そし
て上記のように再構成された酵素を加える前に室温まで
冷却したが、この工程は、標的核酸がRNAであるかまた
は二本鎖DNAではなく一本鎖DNAである場合は不必要であ
り、初期加熱工程は、RNA分子内水素結合のいずれかの
領域を融解させるのに役立つ。次に、別々に凍結乾燥さ
れた酵素標品が入っている試験管に、T7 RNAポリメラ
ーゼ400単位および凍結乾燥MMLV−RT 600単位かまたは
900単位を含有する溶液10μｌを入れた。同時凍結乾燥
されたT7 RNAポリメラーゼおよびMMLV−RTは、それぞ
れ、400単位および900単位/10μｌの濃度で存在した。
試験管を37℃で３時間インキュベートした。
て上記のように再構成された酵素を加える前に室温まで
冷却したが、この工程は、標的核酸がRNAであるかまた
は二本鎖DNAではなく一本鎖DNAである場合は不必要であ
り、初期加熱工程は、RNA分子内水素結合のいずれかの
領域を融解させるのに役立つ。次に、別々に凍結乾燥さ
れた酵素標品が入っている試験管に、T7 RNAポリメラ
ーゼ400単位および凍結乾燥MMLV−RT 600単位かまたは
900単位を含有する溶液10μｌを入れた。同時凍結乾燥
されたT7 RNAポリメラーゼおよびMMLV−RTは、それぞ
れ、400単位および900単位/10μｌの濃度で存在した。
試験管を37℃で３時間インキュベートした。
反応中に生じた増幅核酸の量は、アーノルド（Arnol
d）およびネルソン（Nelson），米国特許第5,283,174号
明細書（本出願と同一所有権者を有し且つ本明細書中に
援用される）に記載の均一保護検定を用いて測定された
が、放射性標識プローブを用いることによるなどの核酸
標的を検出する多数の他の検定システムおよび方法が当
該技術分野において利用可能であるということは当業者
に明らかであろう。
d）およびネルソン（Nelson），米国特許第5,283,174号
明細書（本出願と同一所有権者を有し且つ本明細書中に
援用される）に記載の均一保護検定を用いて測定された
が、放射性標識プローブを用いることによるなどの核酸
標的を検出する多数の他の検定システムおよび方法が当
該技術分野において利用可能であるということは当業者
に明らかであろう。
増幅反応は、200mMコハク酸リチウム（pH5.2）、17％
（w/v）ラウリル硫酸リチウム、3mM EDTA（エチレンジ
アミン四酢酸）および3mM EGTA（［エチレンビス（オ
キシエチレニトリロ）］−四酢酸）、およびT7遺伝子10
RNA転写物に相補的なアクリジニウムエステル標識プロ
ーブ（配列番号:3）を含有するハイブリダイゼーション
緩衝液100μｌを各試験管に加えることで終結した。そ
の試験管を60℃で20分間インキュベートした。ハイブリ
ッド形成していないプローブと結合したアクリジニウム
エステルを、300μｌの182mM NaOH、600mMホウ酸およ
び１％（v/v）TRITONX−100を加えることで加水分解
し、そしてその試験管を60℃で５分間インキュベートし
た。残りの化学発光は、0.4N HNO3中１％（v/v）H2O2
200μｌを加えた直後に1M NaOH（200μｌ）を直ちに
加えて溶液をアルカリ化した時にルミノメーターで測定
された。結果は相対光単位（RLU）で報告されるが、こ
れは、化学発光標識によって発せられた光子の数の尺度
である。結果を下記の表１に示す。
（w/v）ラウリル硫酸リチウム、3mM EDTA（エチレンジ
アミン四酢酸）および3mM EGTA（［エチレンビス（オ
キシエチレニトリロ）］−四酢酸）、およびT7遺伝子10
RNA転写物に相補的なアクリジニウムエステル標識プロ
ーブ（配列番号:3）を含有するハイブリダイゼーション
緩衝液100μｌを各試験管に加えることで終結した。そ
の試験管を60℃で20分間インキュベートした。ハイブリ
ッド形成していないプローブと結合したアクリジニウム
エステルを、300μｌの182mM NaOH、600mMホウ酸およ
び１％（v/v）TRITONX−100を加えることで加水分解
し、そしてその試験管を60℃で５分間インキュベートし
た。残りの化学発光は、0.4N HNO3中１％（v/v）H2O2
200μｌを加えた直後に1M NaOH（200μｌ）を直ちに
加えて溶液をアルカリ化した時にルミノメーターで測定
された。結果は相対光単位（RLU）で報告されるが、こ
れは、化学発光標識によって発せられた光子の数の尺度
である。結果を下記の表１に示す。
これらの結果は、同時凍結乾燥されたMMLV−RTおよび
T7 RNAポリメラーゼが、酵素標品をもう一方の酵素の
液体酵素標品と組合わせた反応混合物かまたは両酵素が
凍結乾燥されていない反応混合物の場合よりも効果的に
RNA遺伝子10標的の増幅を引き起こしたことを示す。液
体酵素と比較して、増幅を触媒するいずれの凍結乾燥酵
素標品の能力にも有意の減少はなかった。したがって、
結果は、それぞれの酵素が、単独でかまたは一緒に、ト
レハロースの存在下の乾燥状態での貯蔵によって効果的
に安定化されうることを更に実証する。これらの条件下
の核酸増幅は、逆転写酵素の３種類全部の酵素活性（RN
A依存性DNAポリメラーゼ、DNA依存性DNAポリメラーゼお
よびRNアーゼＨ）の存在に依るので、その検定は、これ
らの活性が本方法によって効果的に安定化されているこ
とおよび核酸増幅を促進するような方式で活性が調和し
た状態に維持されていることを有効に示すものである。
T7 RNAポリメラーゼが、酵素標品をもう一方の酵素の
液体酵素標品と組合わせた反応混合物かまたは両酵素が
凍結乾燥されていない反応混合物の場合よりも効果的に
RNA遺伝子10標的の増幅を引き起こしたことを示す。液
体酵素と比較して、増幅を触媒するいずれの凍結乾燥酵
素標品の能力にも有意の減少はなかった。したがって、
結果は、それぞれの酵素が、単独でかまたは一緒に、ト
レハロースの存在下の乾燥状態での貯蔵によって効果的
に安定化されうることを更に実証する。これらの条件下
の核酸増幅は、逆転写酵素の３種類全部の酵素活性（RN
A依存性DNAポリメラーゼ、DNA依存性DNAポリメラーゼお
よびRNアーゼＨ）の存在に依るので、その検定は、これ
らの活性が本方法によって効果的に安定化されているこ
とおよび核酸増幅を促進するような方式で活性が調和し
た状態に維持されていることを有効に示すものである。
追加の実験は、逆転写酵素が、同様の条件下において
トレハロースではなくスクロースの存在下で凍結乾燥さ
れうることを示したが、トレハロースうは、凍結保護安
定化剤としてスクロースよりも僅かに優れていると考え
られた。（実施例６を参照されたい。） b.非イオン性界面活性剤の存在下での逆転写酵素および
T7 RNAポリメラーゼの凍結乾燥 酵素の透析中酵素活性を維持しながら、凍結乾燥操作
中のタンパク質の沈殿を最小限にすることを試みるため
に、逆転写酵素およびRNAポリメラーゼを非イオン性界
面活性剤の存在下で同時透析し且つ凍結乾燥させた。６
種類の透析混合物を、透析緩衝液中に０％、0.01％、0.
05％、0.1％、0.2％および0.5％TRITON Ｘ−102を含む
よう調製した。透析緩衝液は、20mM HEPES、0.1M NaC
l、0.1mM EDTA、5mM NALC、0.1mM酢酸亜鉛および0.2M
トレハロースを含んだ。各透析混合物の最終容量は250m
lであった。それぞれの緩衝液467マイクロリットルを、
MMLV−RT（2900単位／μｌ）46μｌおよびT7 RNAポリ
メラーゼ（800単位／μｌ）74μｌと混合して、それぞ
れの透析液の開始容量を587μｌとした。試料を該当す
る緩衝液60mlに対して４℃で透析し、同量の緩衝液を３
回取換えた。３回目の緩衝液交換後、０％、0.01％およ
び0.05％TRITONX−102含有試料で沈殿が見られたが、こ
のような沈殿は、0.1％、0.2％または0.5％TRITON Ｘ
−102含有試料では見られなかった。
トレハロースではなくスクロースの存在下で凍結乾燥さ
れうることを示したが、トレハロースうは、凍結保護安
定化剤としてスクロースよりも僅かに優れていると考え
られた。（実施例６を参照されたい。） b.非イオン性界面活性剤の存在下での逆転写酵素および
T7 RNAポリメラーゼの凍結乾燥 酵素の透析中酵素活性を維持しながら、凍結乾燥操作
中のタンパク質の沈殿を最小限にすることを試みるため
に、逆転写酵素およびRNAポリメラーゼを非イオン性界
面活性剤の存在下で同時透析し且つ凍結乾燥させた。６
種類の透析混合物を、透析緩衝液中に０％、0.01％、0.
05％、0.1％、0.2％および0.5％TRITON Ｘ−102を含む
よう調製した。透析緩衝液は、20mM HEPES、0.1M NaC
l、0.1mM EDTA、5mM NALC、0.1mM酢酸亜鉛および0.2M
トレハロースを含んだ。各透析混合物の最終容量は250m
lであった。それぞれの緩衝液467マイクロリットルを、
MMLV−RT（2900単位／μｌ）46μｌおよびT7 RNAポリ
メラーゼ（800単位／μｌ）74μｌと混合して、それぞ
れの透析液の開始容量を587μｌとした。試料を該当す
る緩衝液60mlに対して４℃で透析し、同量の緩衝液を３
回取換えた。３回目の緩衝液交換後、０％、0.01％およ
び0.05％TRITONX−102含有試料で沈殿が見られたが、こ
のような沈殿は、0.1％、0.2％または0.5％TRITON Ｘ
−102含有試料では見られなかった。
透析後、各透析液の容量を測定し、そして計算された
酵素濃度を適宜に調整した。それぞれの試料を４個のバ
イアルに分け、各バイアルには、MMLV−RT24,750単位お
よびT7 RNAポリメラーゼ11,000単位が含まれていた。
凍結乾燥を上のように行った。乾燥後の界面活性剤含有
凍結乾燥物の外観は、TRITON Ｘ−102の不存在下で製
造された凍結乾燥物と区別できなかった。凍結乾燥後、
バイアルを４℃および55℃で32日間貯蔵した。
酵素濃度を適宜に調整した。それぞれの試料を４個のバ
イアルに分け、各バイアルには、MMLV−RT24,750単位お
よびT7 RNAポリメラーゼ11,000単位が含まれていた。
凍結乾燥を上のように行った。乾燥後の界面活性剤含有
凍結乾燥物の外観は、TRITON Ｘ−102の不存在下で製
造された凍結乾燥物と区別できなかった。凍結乾燥後、
バイアルを４℃および55℃で32日間貯蔵した。
非イオン性界面活性剤の酵素活性に対する効果は、T7
遺伝子10増幅システムを用いる増幅検定で評価された。
それぞれの凍結乾燥酵素標品を再構成用緩衝液中で再水
和させ、MMLV−RT 900単位およびT7 RNAポリメラーゼ
400単位をそれぞれの反応混合物中で評価した。RNA遺伝
子10転写物（100コピー／反応）を標的核酸として用い
た。検定は、特に断らない限り、上記のように行われ
た。結果はRLUで報告される。
遺伝子10増幅システムを用いる増幅検定で評価された。
それぞれの凍結乾燥酵素標品を再構成用緩衝液中で再水
和させ、MMLV−RT 900単位およびT7 RNAポリメラーゼ
400単位をそれぞれの反応混合物中で評価した。RNA遺伝
子10転写物（100コピー／反応）を標的核酸として用い
た。検定は、特に断らない限り、上記のように行われ
た。結果はRLUで報告される。
これらの結果は、TRITON Ｘ−102などの非イオン性
界面活性剤が、MMLV−RTまたはT7 RNAポリメラーゼの
透析後のタンパク質沈殿の形成を効果的に防止しうるこ
とを実証する。結果は、更に、TRITON Ｘ−102が、標
的核酸の増幅に有害な作用を及ぼさないし、しかも凍結
乾燥酵素を高温で貯蔵した場合に、経時酵素活性を一層
安定させるようにも作用しうることを示している。界面
活性剤は、この検定においてバックグラウンドルミネセ
ンスの増加を引き起こさない。これらの結果はまた、界
面活性剤の不存在下で凍結乾燥された試料（試料Ｂ）で
も、非凍結乾燥酵素とほぼ同様の活性を残していること
を実証する。結果は、更に、凍結乾燥酵素標品を高温で
長期間貯蔵した場合に、凍結乾燥酵素標品では検出可能
な活性の減少を生じないことを示している。
界面活性剤が、MMLV−RTまたはT7 RNAポリメラーゼの
透析後のタンパク質沈殿の形成を効果的に防止しうるこ
とを実証する。結果は、更に、TRITON Ｘ−102が、標
的核酸の増幅に有害な作用を及ぼさないし、しかも凍結
乾燥酵素を高温で貯蔵した場合に、経時酵素活性を一層
安定させるようにも作用しうることを示している。界面
活性剤は、この検定においてバックグラウンドルミネセ
ンスの増加を引き起こさない。これらの結果はまた、界
面活性剤の不存在下で凍結乾燥された試料（試料Ｂ）で
も、非凍結乾燥酵素とほぼ同様の活性を残していること
を実証する。結果は、更に、凍結乾燥酵素標品を高温で
長期間貯蔵した場合に、凍結乾燥酵素標品では検出可能
な活性の減少を生じないことを示している。
これらの結果が、他の非イオン性界面活性剤、例え
ば、限定されるわけではないが、BRIJ系、TWEEN系、TRI
TON系の他の界面活性剤、TERGITOL系の界面活性剤は、
酵素活性に悪影響を与えることなく、凍結乾燥中に乾燥
タンパク質を可溶性状態で維持するそれらの能力につい
て上記のように容易にスクリーニングされうるというこ
とを直接に示唆していることは当業者に明らかであろ
う。
ば、限定されるわけではないが、BRIJ系、TWEEN系、TRI
TON系の他の界面活性剤、TERGITOL系の界面活性剤は、
酵素活性に悪影響を与えることなく、凍結乾燥中に乾燥
タンパク質を可溶性状態で維持するそれらの能力につい
て上記のように容易にスクリーニングされうるというこ
とを直接に示唆していることは当業者に明らかであろ
う。
実施例2:逆転写酵素およびRNAポリメラーゼと増幅試薬
との同時凍結乾燥 モロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素およびT7
RNAポリメラーゼ酵素標品を、乾燥する前に、50mMトリ
ス−HCl（pH7.5）、0.1M NaCl、0.1mM EDTA、1mM DT
T、0.01％（v/v）NP−40または0.1％（v/v）TRITON Ｘ
−100および50％（v/v）グリセロールを含有する貯蔵用
緩衝液中に−20℃で保持した。
との同時凍結乾燥 モロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素およびT7
RNAポリメラーゼ酵素標品を、乾燥する前に、50mMトリ
ス−HCl（pH7.5）、0.1M NaCl、0.1mM EDTA、1mM DT
T、0.01％（v/v）NP−40または0.1％（v/v）TRITON Ｘ
−100および50％（v/v）グリセロールを含有する貯蔵用
緩衝液中に−20℃で保持した。
凍結乾燥用に、MMLV RT 3x106単位およびT7ポリメ
ラーゼ1.3x106単位（各標品2.5ml）を混合し、そして分
画分子量12,000ダルトンの透析膜を用いて、20mM HEPE
S（pH7.5）、5mM NALC、0.1mM EDTA、0.1mM酢酸亜
鉛、0.2％（v/v）TRITONX−102および0.2Mトレハロース
を含有する少なくとも50容量の緩衝液に対して２〜８℃
で透析し、同容量の緩衝液を少なくとも８時間の緩衝液
交換間隔で３回取換えた。
ラーゼ1.3x106単位（各標品2.5ml）を混合し、そして分
画分子量12,000ダルトンの透析膜を用いて、20mM HEPE
S（pH7.5）、5mM NALC、0.1mM EDTA、0.1mM酢酸亜
鉛、0.2％（v/v）TRITONX−102および0.2Mトレハロース
を含有する少なくとも50容量の緩衝液に対して２〜８℃
で透析し、同容量の緩衝液を少なくとも８時間の緩衝液
交換間隔で３回取換えた。
透析された酵素標品20ミリリットルを、10.0mMスペル
ミジン、250mMイミダゾール/150mMグルタミン酸（pH6.
8）、99mM NALC、12.5％（w/v）PAP、各12.5mMのrCTP
およびrUTP、各31.2mMのrATPおよびrGTP、各10.0mMのdC
TP、dGTP、dATPおよびdTTPを含有する増幅試薬60mlと混
合した（容量比6:2）。更に別の実験は、試薬を容量比
7:1（増幅試薬対酵素標品）で、有意に異なった結果を
伴うことなく混合しうることを示した。理論的に、透析
酵素標品および増幅試薬は、等比率で混合することがで
き、増幅試薬対酵素の適当な比率の決定は、充分に当業
者の能力の範囲内である。
ミジン、250mMイミダゾール/150mMグルタミン酸（pH6.
8）、99mM NALC、12.5％（w/v）PAP、各12.5mMのrCTP
およびrUTP、各31.2mMのrATPおよびrGTP、各10.0mMのdC
TP、dGTP、dATPおよびdTTPを含有する増幅試薬60mlと混
合した（容量比6:2）。更に別の実験は、試薬を容量比
7:1（増幅試薬対酵素標品）で、有意に異なった結果を
伴うことなく混合しうることを示した。理論的に、透析
酵素標品および増幅試薬は、等比率で混合することがで
き、増幅試薬対酵素の適当な比率の決定は、充分に当業
者の能力の範囲内である。
凍結乾燥前の混合された酵素：増幅試薬配合物の最終
組成は、MMLVRT 2.7x106単位およびT7ポリメラーゼ1.2
x106単位、各酵素6X106単位、5.0mM HEPES（pH6.8〜7.
0）、0.025mM EDTA、0.025mM酢酸亜鉛、10.0mMスペル
ミジン、187.5mMイミダゾール、112.5mMグルタミン酸、
75.6mM NALC、0.05％（v/v）TRITON X−102、9.4％（w
/v）PAP（平均分子量40,000ダルトン）、0.05Mトレハロ
ース、各9.4mMのrCTPおよびrUTP、各23.4mMのrATPおよ
びrGTP、並びに各7.5mMのdCTP、dCTP、dATPおよびdTTP
であった。
組成は、MMLVRT 2.7x106単位およびT7ポリメラーゼ1.2
x106単位、各酵素6X106単位、5.0mM HEPES（pH6.8〜7.
0）、0.025mM EDTA、0.025mM酢酸亜鉛、10.0mMスペル
ミジン、187.5mMイミダゾール、112.5mMグルタミン酸、
75.6mM NALC、0.05％（v/v）TRITON X−102、9.4％（w
/v）PAP（平均分子量40,000ダルトン）、0.05Mトレハロ
ース、各9.4mMのrCTPおよびrUTP、各23.4mMのrATPおよ
びrGTP、並びに各7.5mMのdCTP、dCTP、dATPおよびdTTP
であった。
混合された酵素：増幅試薬標品（以下、酵素：増幅試
薬）800マイクロリットルを、凍結乾燥のためにそれぞ
れ個々のガラスバイアル中に入れた（全酵素約39,000単
位／バイアル）。凍結乾燥は、実施例１の場合と同様に
行われた。凍結乾燥後、バイアルを以下の実施例で示さ
れたように処理した。
薬）800マイクロリットルを、凍結乾燥のためにそれぞ
れ個々のガラスバイアル中に入れた（全酵素約39,000単
位／バイアル）。凍結乾燥は、実施例１の場合と同様に
行われた。凍結乾燥後、バイアルを以下の実施例で示さ
れたように処理した。
実施例3:凍結乾燥された試薬の増幅活性検定 逆転写酵素、RNAポリメラーゼおよび増幅試薬の新た
に凍結乾燥された標品を、25℃、35℃および45℃におい
て３〜61日間の様々な時間でインキュベートした。全て
のバイアルを同じ標品から全く同じに調製した。指示さ
れた時点で、凍結乾燥試薬が入っているバイアルを高温
から取出し、そして最後の試料が集められるまで−30℃
で貯蔵した。それぞれの温度に関して「ゼロ」時を示す
試料を、−30℃で全実験期間中貯蔵した。
に凍結乾燥された標品を、25℃、35℃および45℃におい
て３〜61日間の様々な時間でインキュベートした。全て
のバイアルを同じ標品から全く同じに調製した。指示さ
れた時点で、凍結乾燥試薬が入っているバイアルを高温
から取出し、そして最後の試料が集められるまで−30℃
で貯蔵した。それぞれの温度に関して「ゼロ」時を示す
試料を、−30℃で全実験期間中貯蔵した。
最後の時点のバイアルが集められた時に、全ての試料
を再構成用試薬（Reconstituting Reagent）（0.01％
（v/v）TRITON X−102、41.6mM MgCl2、1mM ZnC2H
3O2、10％（v/v）グリセロール、0.3％（v/v）エタノー
ル、0.02％（w/v）メチルパラベンおよび0.01％（w/v）
プロピルパラベン）1.5ml中で再水和し、そして各バイ
アルの内容物の核酸増幅を引き起こす能力について検定
した。
を再構成用試薬（Reconstituting Reagent）（0.01％
（v/v）TRITON X−102、41.6mM MgCl2、1mM ZnC2H
3O2、10％（v/v）グリセロール、0.3％（v/v）エタノー
ル、0.02％（w/v）メチルパラベンおよび0.01％（w/v）
プロピルパラベン）1.5ml中で再水和し、そして各バイ
アルの内容物の核酸増幅を引き起こす能力について検定
した。
モデル増幅システムにおける活性は、この実施例にお
いて以下の方法で測定された。各増幅反応混合物は、標
的核酸としてＢ型肝炎ウイルスゲノムの一部分を有する
プラスミド（Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの2.6kbフラグメ
ントを有するPUCプラスミド）からの二本鎖DNA制限フラ
グメント500コピーを含んだ。標的DNAを水かまたはヒト
血清20μｌで希釈した。負の対照は、標的DNA不含であ
る以外は同様に作成された。これを、2Xプライマー溶液
20μｌに対して加えた。この溶液の最終組成は、全容量
40μｌ中に0.1N KOH、17.5mM EGTA、25mMイミダゾー
ル、25mMグルタミン酸、0.025％（w/v）フェノールレッ
ドおよび各0.3μＭの２種類のプライマーであった。第
一プライマー（（−）センス）は、DNA標的の（＋）セ
ンス鎖に相補的な3'標的結合ヌクレオチド配列領域から
成り、そして5'非相補的部分は、T7 RNAポリメラーゼ
のプロモーターのヌクレオチド配列を有する5'非相補的
領域から下流に位置した。第二プライマー（（＋）セン
ス）は、もう一方の（（−）センス）DNA鎖に相補的な
標的結合領域から成るヌクレオチド配列を有した。
いて以下の方法で測定された。各増幅反応混合物は、標
的核酸としてＢ型肝炎ウイルスゲノムの一部分を有する
プラスミド（Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの2.6kbフラグメ
ントを有するPUCプラスミド）からの二本鎖DNA制限フラ
グメント500コピーを含んだ。標的DNAを水かまたはヒト
血清20μｌで希釈した。負の対照は、標的DNA不含であ
る以外は同様に作成された。これを、2Xプライマー溶液
20μｌに対して加えた。この溶液の最終組成は、全容量
40μｌ中に0.1N KOH、17.5mM EGTA、25mMイミダゾー
ル、25mMグルタミン酸、0.025％（w/v）フェノールレッ
ドおよび各0.3μＭの２種類のプライマーであった。第
一プライマー（（−）センス）は、DNA標的の（＋）セ
ンス鎖に相補的な3'標的結合ヌクレオチド配列領域から
成り、そして5'非相補的部分は、T7 RNAポリメラーゼ
のプロモーターのヌクレオチド配列を有する5'非相補的
領域から下流に位置した。第二プライマー（（＋）セン
ス）は、もう一方の（（−）センス）DNA鎖に相補的な
標的結合領域から成るヌクレオチド配列を有した。
反応混合物それぞれ40μｌを、約95℃でインキュベー
トして、二本鎖DNA標的を変性させた。次に、反応を室
温まで５分間冷却し、そして330mMイミダゾールおよび2
00mMグルタミン酸を含有する緩衝液10μｌで中和した。
標的核酸がDNAではなくRNAであるならば、この変性工程
は不必要であろう。
トして、二本鎖DNA標的を変性させた。次に、反応を室
温まで５分間冷却し、そして330mMイミダゾールおよび2
00mMグルタミン酸を含有する緩衝液10μｌで中和した。
標的核酸がDNAではなくRNAであるならば、この変性工程
は不必要であろう。
再構成された酵素：増幅試薬それぞれ50マイクロリッ
トルを、変性され中和されたDNA反応混合物50μｌに加
えた後、それを37℃で３時間インキュベートした。それ
ぞれの反応は、RNアーゼ不含DNアーゼＩを20μｌ（40単
位）加えることによって終結した。
トルを、変性され中和されたDNA反応混合物50μｌに加
えた後、それを37℃で３時間インキュベートした。それ
ぞれの反応は、RNアーゼ不含DNアーゼＩを20μｌ（40単
位）加えることによって終結した。
再構成された酵素：増幅試薬それぞれの相対増幅は、
アーノルドおよびネルソン，米国特許第5,283,174号明
細書に記載された均一保護検定（HPA）を用いることに
よって決定されたが、放射性標識などの種々の検出手段
を用いる他の検定法を用いることができることは当業者
に理解されるであろう。各増幅反応に、増幅されたRNA
アンプリコンに相補的であるように設計された約75フェ
ムトモル（fmol）のアクリジニウムエステル標識オリゴ
ヌクレオチドプローブ（（＋）センス）を含有する、10
mMコハク酸リチウム（pH5.0）、２％（w/v）ラウリル硫
酸リチウム、1mMメルカプトエタンスルホン酸、0.3％
（w/v）PAP−40、230mM LiOH、1.2M LiCl、20mM EGT
A、20mM EDTA、100mMコハク酸（pH4.7）および15mM
2,2'−ジピリジルジスルフィドの溶液100μｌを加え
た。各試験管を混合し、60℃で20分間インキュベートし
た後、冷却した。各反応混合物に、0.6Mホウ酸ナトリウ
ム（pH8.5）、１％（v/v）TRITON Ｘ−100および182Mm
NaOHを含有する溶液300μｌを加え、そして60℃で６
分間インキュベートして、ハイブリッド形成プローブと
結合していない標識を破壊した。
アーノルドおよびネルソン，米国特許第5,283,174号明
細書に記載された均一保護検定（HPA）を用いることに
よって決定されたが、放射性標識などの種々の検出手段
を用いる他の検定法を用いることができることは当業者
に理解されるであろう。各増幅反応に、増幅されたRNA
アンプリコンに相補的であるように設計された約75フェ
ムトモル（fmol）のアクリジニウムエステル標識オリゴ
ヌクレオチドプローブ（（＋）センス）を含有する、10
mMコハク酸リチウム（pH5.0）、２％（w/v）ラウリル硫
酸リチウム、1mMメルカプトエタンスルホン酸、0.3％
（w/v）PAP−40、230mM LiOH、1.2M LiCl、20mM EGT
A、20mM EDTA、100mMコハク酸（pH4.7）および15mM
2,2'−ジピリジルジスルフィドの溶液100μｌを加え
た。各試験管を混合し、60℃で20分間インキュベートし
た後、冷却した。各反応混合物に、0.6Mホウ酸ナトリウ
ム（pH8.5）、１％（v/v）TRITON Ｘ−100および182Mm
NaOHを含有する溶液300μｌを加え、そして60℃で６
分間インキュベートして、ハイブリッド形成プローブと
結合していない標識を破壊した。
反応混合物を５分間冷却し、そして残りの化学発光
は、0.1％（v/v）H2O2、0.1mM硝酸 200μｌを自動注入
した直後に1.0N NaOHを注入後起、ルミノメーター（LE
ADER（登録商標）ジェン・プローブ・インコーポレーテ
ッド（Gen−Probe Incorporated），サン・ディエゴ,C
A）で測定した。引き続き発せられる光の量は、相対光
単位（RLU）で報告される。これらの条件下において、
発光のバックグラウンド水準は、約2000〜4000RLUの範
囲内であった。
は、0.1％（v/v）H2O2、0.1mM硝酸 200μｌを自動注入
した直後に1.0N NaOHを注入後起、ルミノメーター（LE
ADER（登録商標）ジェン・プローブ・インコーポレーテ
ッド（Gen−Probe Incorporated），サン・ディエゴ,C
A）で測定した。引き続き発せられる光の量は、相対光
単位（RLU）で報告される。これらの条件下において、
発光のバックグラウンド水準は、約2000〜4000RLUの範
囲内であった。
結果を記録し、そして下記に示されたように各貯蔵温
度（25℃、35℃および45℃）に関して表示した。各試料
を三重反復試験で検定し且つ平均した。この平均を用い
て、各温度に関するデータをグラフにプロットした。図
１は表３に対応し、図２は表４に、そして図３は表５に
対応する。
度（25℃、35℃および45℃）に関して表示した。各試料
を三重反復試験で検定し且つ平均した。この平均を用い
て、各温度に関するデータをグラフにプロットした。図
１は表３に対応し、図２は表４に、そして図３は表５に
対応する。
これらのデータは、本明細書中に記載の方法によって
製造された同時凍結乾燥酵素：増幅試薬が、用いられた
転写媒介性増幅法にしたがって核酸増幅を行うのに必要
な４種類全部（RNA依存性DNAポリメラーゼ、DNA依存性D
NAポリメラーゼ、RNアーゼＨおよびRNAポリメラーゼ）
の酵素活性を保持していることを示す。したがって、そ
のデータは、試薬を逆転写酵素およびRNAポリメラーゼ
と一緒に同時凍結乾燥する場合、ヌクレオチド三リン酸
または増幅試薬の任意の他の成分に対する顕著な有害作
用が存在しないことを示す。
製造された同時凍結乾燥酵素：増幅試薬が、用いられた
転写媒介性増幅法にしたがって核酸増幅を行うのに必要
な４種類全部（RNA依存性DNAポリメラーゼ、DNA依存性D
NAポリメラーゼ、RNアーゼＨおよびRNAポリメラーゼ）
の酵素活性を保持していることを示す。したがって、そ
のデータは、試薬を逆転写酵素およびRNAポリメラーゼ
と一緒に同時凍結乾燥する場合、ヌクレオチド三リン酸
または増幅試薬の任意の他の成分に対する顕著な有害作
用が存在しないことを示す。
これらの結果は、更に、増幅反応がヒト血清などの複
雑な生体試料の存在下で行われる場合、逆転写酵素の酵
素活性およびRNAポリメラーゼ酵素活性は有意に阻害さ
れないということを示す。したがって、凍結乾燥増幅試
薬は、臨床診断設定で得られるような試料と一緒に用い
るのに適していると考えられる。
雑な生体試料の存在下で行われる場合、逆転写酵素の酵
素活性およびRNAポリメラーゼ酵素活性は有意に阻害さ
れないということを示す。したがって、凍結乾燥増幅試
薬は、臨床診断設定で得られるような試料と一緒に用い
るのに適していると考えられる。
そのデータは多数の方法で解釈することができ、より
有用な解釈手段の一つは、アレーニウス式の形式を利用
して、実際に試験されるよりも長期間にわたる組成物の
安定性を予測する。アレーニウス式は、化学反応の速度
および種々の熱不安定性化合物の安定性を温度の関数と
して予測するのに当業者によって一般的に用いられてい
る。
有用な解釈手段の一つは、アレーニウス式の形式を利用
して、実際に試験されるよりも長期間にわたる組成物の
安定性を予測する。アレーニウス式は、化学反応の速度
および種々の熱不安定性化合物の安定性を温度の関数と
して予測するのに当業者によって一般的に用いられてい
る。
本明細書中で用いられるように、アレーニウス式は、
活性酵素（または試薬）がある与えられた温度で単一の
失活速度および全試験温度で単一の失活機序を有する酵
素（または試薬）失活の一次反応を仮定する。出願人が
用いた等式は、 ln(k2/k1)＝(−Ea/R)((T2−T1)／(T2×T1)) であり、式中、k2は実験温度（゜K）での速度定数であ
り、k1は対照温度での反応の速度定数であり、Eaは反応
の活性化エネルギーであり、Ｒは気体定数（1.987cal/
゜K−モル）であり、T1は対照温度（例えば、298.16゜K
（25℃））であり、そしてT2は実験温度（゜Kで表わさ
れる）である。
活性酵素（または試薬）がある与えられた温度で単一の
失活速度および全試験温度で単一の失活機序を有する酵
素（または試薬）失活の一次反応を仮定する。出願人が
用いた等式は、 ln(k2/k1)＝(−Ea/R)((T2−T1)／(T2×T1)) であり、式中、k2は実験温度（゜K）での速度定数であ
り、k1は対照温度での反応の速度定数であり、Eaは反応
の活性化エネルギーであり、Ｒは気体定数（1.987cal/
゜K−モル）であり、T1は対照温度（例えば、298.16゜K
（25℃））であり、そしてT2は実験温度（゜Kで表わさ
れる）である。
Eaが15,000cal/モルであると仮定され且つ対照および
実験温度が知られているならば、速度定数の比率k2/k1
を決定することができる。対照および実験温度が両方と
も25℃である簡単な場合、これらの定数比は、定数が同
じであるので１である。実験温度が35℃であり且つ対照
温度が25℃である場合、予測比率は2.27であろう。実験
温度が45℃であり且つ対照温度が25℃である場合、予測
比率は4.91であろう。同じ式を用いて、対照温度が５℃
であり且つ実験温度が45℃である場合、その比率は30.3
3である。
実験温度が知られているならば、速度定数の比率k2/k1
を決定することができる。対照および実験温度が両方と
も25℃である簡単な場合、これらの定数比は、定数が同
じであるので１である。実験温度が35℃であり且つ対照
温度が25℃である場合、予測比率は2.27であろう。実験
温度が45℃であり且つ対照温度が25℃である場合、予測
比率は4.91であろう。同じ式を用いて、対照温度が５℃
であり且つ実験温度が45℃である場合、その比率は30.3
3である。
速度定数比は、貯蔵時間が時で表わされているか、
日、週等であるかいずれにせよ、実験貯蔵時間対標準貯
蔵時間の「分解比率」と考えることができる。したがっ
て、凍結乾燥酵素／増幅試薬が45℃において30日でその
元の能力の90％まで分解する場合、アレーニウス式は、
活性が同様に低下するのに25℃で147.3（30x4.91）日を
要するであろうと予想する。
日、週等であるかいずれにせよ、実験貯蔵時間対標準貯
蔵時間の「分解比率」と考えることができる。したがっ
て、凍結乾燥酵素／増幅試薬が45℃において30日でその
元の能力の90％まで分解する場合、アレーニウス式は、
活性が同様に低下するのに25℃で147.3（30x4.91）日を
要するであろうと予想する。
したがって、そのデータは、凍結乾燥標品の混合され
た成分が、たとえ45℃で30日後でも、増幅を支持するそ
れらの能力を「実時間」で顕著に失うことはないことを
実証する。更に、アレーニウス式を利用することによ
り、同データは、凍結乾燥試薬を使用前に実際に25℃で
ほとんど５か月間または５℃で2.5年間（30.33x30日）
貯蔵したとしても、その試薬は活性を有意に失わないで
あろうと予想する。
た成分が、たとえ45℃で30日後でも、増幅を支持するそ
れらの能力を「実時間」で顕著に失うことはないことを
実証する。更に、アレーニウス式を利用することによ
り、同データは、凍結乾燥試薬を使用前に実際に25℃で
ほとんど５か月間または５℃で2.5年間（30.33x30日）
貯蔵したとしても、その試薬は活性を有意に失わないで
あろうと予想する。
出願人は、本発明の理解を助けるものとしてこれらの
データ分析法を示すが、理論的考察によって制限または
拘束されることを望むものではない。本発明の組成物の
実際の安定性は、凍結乾燥試薬の安定性の予測について
一般的な指標を与えるアレーニウス式の予測とは異なる
ことがありうる。
データ分析法を示すが、理論的考察によって制限または
拘束されることを望むものではない。本発明の組成物の
実際の安定性は、凍結乾燥試薬の安定性の予測について
一般的な指標を与えるアレーニウス式の予測とは異なる
ことがありうる。
実施例4:凍結乾燥試薬のT7 RNAポリメラーゼ検定 実施例２で製造された凍結乾燥酵素：増幅試薬を、35
℃で０日、３日、９日、16日、21日および30日間インキ
ュベートした。これらの各時点で、バイアルをそのスト
レス温度から取出し、そして最後の試料が集められるま
で−30℃で貯蔵した。
℃で０日、３日、９日、16日、21日および30日間インキ
ュベートした。これらの各時点で、バイアルをそのスト
レス温度から取出し、そして最後の試料が集められるま
で−30℃で貯蔵した。
RNAポリメラーゼ活性は、凍結乾燥試薬の各アリコー
トを、再構成用緩衝液（0.01％（v/v）TRITON Ｘ−10
0、41.6mM MgCl2、1mM ZnC2H3O2、10％（v/v）グリセ
ロール、0.3％（v/v）エタノール、0.02％（w/v）メチ
ルパラベンおよび0.01％（w/v）プロピルパラベン）1.5
ml中で再構成することによって測定された。次に、その
試薬を、20mM HEPES（pH7.5）、5mM NALC、0.1mM ED
TA、0.1mM ZnC2H3O2、0.1M NaClおよび0.2％（v/v）T
RITON Ｘ−102を含有する溶液で100倍、200倍および40
0倍に希釈した。22mM MgCl2、各7.8mMのATPおよびGT
P、各2.5mMのCTPおよびUTP、62.5mMトリス（pH7.5）、
2.5mMスペルミジンおよび0.5ナノモルの標的核酸を含む
反応プレミックスを別個に調製した。標的は、バクテリ
オファージT7遺伝子10から直ぐ上流に位置したT7プロモ
ーターを有する直鎖状pUC T7G10プラスミドであった。
このプラスミドは、プラスミドpGEMEX−１（プロメガ・
コーポレーション・マディソン,WI）に由来した。
トを、再構成用緩衝液（0.01％（v/v）TRITON Ｘ−10
0、41.6mM MgCl2、1mM ZnC2H3O2、10％（v/v）グリセ
ロール、0.3％（v/v）エタノール、0.02％（w/v）メチ
ルパラベンおよび0.01％（w/v）プロピルパラベン）1.5
ml中で再構成することによって測定された。次に、その
試薬を、20mM HEPES（pH7.5）、5mM NALC、0.1mM ED
TA、0.1mM ZnC2H3O2、0.1M NaClおよび0.2％（v/v）T
RITON Ｘ−102を含有する溶液で100倍、200倍および40
0倍に希釈した。22mM MgCl2、各7.8mMのATPおよびGT
P、各2.5mMのCTPおよびUTP、62.5mMトリス（pH7.5）、
2.5mMスペルミジンおよび0.5ナノモルの標的核酸を含む
反応プレミックスを別個に調製した。標的は、バクテリ
オファージT7遺伝子10から直ぐ上流に位置したT7プロモ
ーターを有する直鎖状pUC T7G10プラスミドであった。
このプラスミドは、プラスミドpGEMEX−１（プロメガ・
コーポレーション・マディソン,WI）に由来した。
反応プレミックスを40μｌアリコートに分け、そして
各アリコートを37℃で３分間インキュベートした。酵
素：増幅試薬の各希釈液10マイクロリットルを、温めた
プレミックス試験管に加え、そして37℃で20分間インキ
ュベートした。転写産物に相補的であるように設計され
た約75フェムトモルのアクリジニウムエステル標識遺伝
子10オリゴヌクレオチドプローブ（（−）センス）を含
有する、10mMコハク酸リチウム、２％（w/v）ラウリル
硫酸リチウム、1mMメルカプトエタンスルホン酸、0.3％
（w/v）PAP−40、230mM LiOH、1.2M LiCl、20mM EGT
A、20mM EDTA、100mMコハク酸（pH4.7）および15mM
2,2'−ジピリジルジスルフィドの溶液50μｌを、各試験
管に加えた。遺伝子10プローブに相補的な10ウェムトモ
ル（fmol）の一本鎖DNAを含有する標準試料をHPA工程に
包含させて、実験反応混合物中に生じたRNAの量を定量
した。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーシ
ョン容量が半分であったこと以外、本質的に実施例２の
場合のように行われた。ハイブリッド形成されなかった
標識を分解後、残りのアクリジニウムエステルを反応さ
せ、そして発光をルミノメーターでRLUとして測定し
た。
各アリコートを37℃で３分間インキュベートした。酵
素：増幅試薬の各希釈液10マイクロリットルを、温めた
プレミックス試験管に加え、そして37℃で20分間インキ
ュベートした。転写産物に相補的であるように設計され
た約75フェムトモルのアクリジニウムエステル標識遺伝
子10オリゴヌクレオチドプローブ（（−）センス）を含
有する、10mMコハク酸リチウム、２％（w/v）ラウリル
硫酸リチウム、1mMメルカプトエタンスルホン酸、0.3％
（w/v）PAP−40、230mM LiOH、1.2M LiCl、20mM EGT
A、20mM EDTA、100mMコハク酸（pH4.7）および15mM
2,2'−ジピリジルジスルフィドの溶液50μｌを、各試験
管に加えた。遺伝子10プローブに相補的な10ウェムトモ
ル（fmol）の一本鎖DNAを含有する標準試料をHPA工程に
包含させて、実験反応混合物中に生じたRNAの量を定量
した。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーシ
ョン容量が半分であったこと以外、本質的に実施例２の
場合のように行われた。ハイブリッド形成されなかった
標識を分解後、残りのアクリジニウムエステルを反応さ
せ、そして発光をルミノメーターでRLUとして測定し
た。
生データは、次のように、RNAポリメラーゼ活性のμ
ｌ当たりの単位に変換された。正対照反応について得ら
れた原RLUを、負対照（標的DNA不含）で得られたRLUか
ら差し引いた。この数値は、10fmolのRNAが試料中にあ
る場合に得られる正味発光量であり、RLU/fmol RNAとし
て表わすことができる。同様に、それぞれの試料につい
て得られたRLUは、バックグラウンドルミネセンスから
差し引くことができる（RLU/20分間）。この数値を、標
準について得られた数値（RLU/fmol RNA）で割ると、そ
の結果は、それぞれの反応において20分間当たりに生じ
たRNAのfmol数である。RNAポリメラーゼ活性１単位は、
検定条件の下の20分間での1fmol RNAの生成として定義
されたので、この数値は、最初に加えられた酵素の10μ
ｌ容量ごとのRNAポリメラーゼ活性の単位数でもある。
ｌ当たりの単位に変換された。正対照反応について得ら
れた原RLUを、負対照（標的DNA不含）で得られたRLUか
ら差し引いた。この数値は、10fmolのRNAが試料中にあ
る場合に得られる正味発光量であり、RLU/fmol RNAとし
て表わすことができる。同様に、それぞれの試料につい
て得られたRLUは、バックグラウンドルミネセンスから
差し引くことができる（RLU/20分間）。この数値を、標
準について得られた数値（RLU/fmol RNA）で割ると、そ
の結果は、それぞれの反応において20分間当たりに生じ
たRNAのfmol数である。RNAポリメラーゼ活性１単位は、
検定条件の下の20分間での1fmol RNAの生成として定義
されたので、この数値は、最初に加えられた酵素の10μ
ｌ容量ごとのRNAポリメラーゼ活性の単位数でもある。
これらの反応から得られたデータは、最初に、生成し
たRNAのfmolを、各試験管で示された元の1.5mlの再構成
酵素：増幅試薬のマイクロリットル数の関数として表す
ことによって、35℃で貯蔵の各時間に関してプロットさ
れた。簡単な一次関数が描かれた。データがプロットさ
れたら、各時点について得られたデータに最も良く適合
した線を計算し、この曲線の傾きを、T7ポリメラーゼ活
性の単位／マイクロリットルとして表わした。「ゼロ
時」時点を活性100％とみなすと、それぞれの残りの時
点のT7 RNAポリメラーゼの計算された単位は、残りの
活性％として表わされた。
たRNAのfmolを、各試験管で示された元の1.5mlの再構成
酵素：増幅試薬のマイクロリットル数の関数として表す
ことによって、35℃で貯蔵の各時間に関してプロットさ
れた。簡単な一次関数が描かれた。データがプロットさ
れたら、各時点について得られたデータに最も良く適合
した線を計算し、この曲線の傾きを、T7ポリメラーゼ活
性の単位／マイクロリットルとして表わした。「ゼロ
時」時点を活性100％とみなすと、それぞれの残りの時
点のT7 RNAポリメラーゼの計算された単位は、残りの
活性％として表わされた。
図４は、35℃で貯蔵の日数の関数としての、凍結乾燥
酵素：増幅試薬中のT7 RNAポリメラーゼの単位数／マ
イクロリットルのプロットである。この結果は、T7 RN
Aポリメラーゼの減少があったとしても、35℃で30日間
のインキュベーション期間にわたってほとんど起こらな
いことを示している。
酵素：増幅試薬中のT7 RNAポリメラーゼの単位数／マ
イクロリットルのプロットである。この結果は、T7 RN
Aポリメラーゼの減少があったとしても、35℃で30日間
のインキュベーション期間にわたってほとんど起こらな
いことを示している。
実施例5:凍結乾燥試薬の逆転写酵素検定 35℃で３日、９日、16日、21日および30日間インキュ
ベートされた凍結乾燥MMLV逆転写酵素の活性を、次のよ
うに検定した。個々のバイアルを指定の時間にそのスト
レス温度から取出し、そして最後の試料が集められるま
で−30℃で貯蔵した。
ベートされた凍結乾燥MMLV逆転写酵素の活性を、次のよ
うに検定した。個々のバイアルを指定の時間にそのスト
レス温度から取出し、そして最後の試料が集められるま
で−30℃で貯蔵した。
各バイアルを、実施例４の場合と同様に、再構成用緩
衝液1.5ml中で再構成し且つ100倍、200倍および400倍に
希釈した。別個の逆転写酵素プレミックス混合物を、5m
M MgCl2、30mM KCl、各0.25mMのdATP、dTTP、dCTPお
よびdGTP、62.5mMトリス（pH7.5）、2.5mMスペルミジ
ン、3.75nM標的RNAおよび750nMの増幅プライマーを含む
よう製造した。標的RNAは、実施例４で生じたT7遺伝子1
0RNA転写物であった。プライマーは、標的DNAの3'末端
に近い領域に対してハイブリッド形成するように設計さ
れた22塩基長さオリゴヌクレオチドであった。酵素希釈
液10マイクロリットルをそれぞれ、氷上の反応プレミッ
クス40μｌに加えた。反応は、37℃で15分間のインキュ
ベーションによって行われた。それぞれの反応は、アク
リジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションプロー
ブ50μｌの添加によって終止させた。プローブは、新た
に合成された遺伝子10cDNAに相補的であるように設計さ
れた。
衝液1.5ml中で再構成し且つ100倍、200倍および400倍に
希釈した。別個の逆転写酵素プレミックス混合物を、5m
M MgCl2、30mM KCl、各0.25mMのdATP、dTTP、dCTPお
よびdGTP、62.5mMトリス（pH7.5）、2.5mMスペルミジ
ン、3.75nM標的RNAおよび750nMの増幅プライマーを含む
よう製造した。標的RNAは、実施例４で生じたT7遺伝子1
0RNA転写物であった。プライマーは、標的DNAの3'末端
に近い領域に対してハイブリッド形成するように設計さ
れた22塩基長さオリゴヌクレオチドであった。酵素希釈
液10マイクロリットルをそれぞれ、氷上の反応プレミッ
クス40μｌに加えた。反応は、37℃で15分間のインキュ
ベーションによって行われた。それぞれの反応は、アク
リジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションプロー
ブ50μｌの添加によって終止させた。プローブは、新た
に合成された遺伝子10cDNAに相補的であるように設計さ
れた。
HPAによる検出は、実施例３で記載のように行われ
た。結果はRLUで測定された。
た。結果はRLUで測定された。
この検定は、MMLV逆転写酵素のRNA依存性DNAポリメラ
ーゼ活性およびRNアーゼＨ活性を測定した。後者の活性
は、遺伝子10プライマーの伸長によって生じたRNA:DNA
ハイブリッドのRNA鎖の分解がなければ、プローブがcDN
Aに対してハイブリッド形成することができないので、
間接的に測定される。
ーゼ活性およびRNアーゼＨ活性を測定した。後者の活性
は、遺伝子10プライマーの伸長によって生じたRNA:DNA
ハイブリッドのRNA鎖の分解がなければ、プローブがcDN
Aに対してハイブリッド形成することができないので、
間接的に測定される。
これら混合された酵素活性の１単位は、上記の反応条
件下の15分間での1fmol cDNAの検出として定義された。
それぞれの時点および希釈での残りの酵素活性の単位の
計算は、実施例４の場合と同様に、標準として10fmolの
増幅cDNAを用いて行われた。
件下の15分間での1fmol cDNAの検出として定義された。
それぞれの時点および希釈での残りの酵素活性の単位の
計算は、実施例４の場合と同様に、標準として10fmolの
増幅cDNAを用いて行われた。
図５は、35℃での貯蔵日数の関数としての、凍結乾燥
酵素：増幅試薬中のRT活性の単位数／マイクロリットル
のプロットである。この結果は、RT活性の低下があった
としても、35℃で30日間のインキュベーション期間にわ
たってほとんど起こらないことを示している。
酵素：増幅試薬中のRT活性の単位数／マイクロリットル
のプロットである。この結果は、RT活性の低下があった
としても、35℃で30日間のインキュベーション期間にわ
たってほとんど起こらないことを示している。
実施例6:逆転写酵素およびRNAポリメラーゼとヌクレオ
チドおよびプライマーとの同時凍結乾燥 前の実施例は、RNAポリメラーゼおよび逆転写酵素の
乾燥保存標品と、ヌクレオチド三リン酸および核酸増幅
に必要な副因子とを一緒に含有する単一試薬の製造およ
び使用を例証した。高温で長期の貯蔵後に核酸を増幅す
るこのような「単一バイアル」試薬の能力があれば、こ
のような試薬を使用する方法において工程数を減少させ
るように且つ核酸増幅用のキットの容器数を３個（例え
ば、凍結乾燥酵素：増幅試薬、プライマーおよび再構成
用試薬）から２個（例えば、凍結乾燥酵素／プライマー
／増幅試薬および再構成用試薬）に減少させるように、
凍結乾燥標品中に１種類または複数の増幅プライマーを
包含させることは容易に可能なはずであるということは
当業者に明らかであろう。
チドおよびプライマーとの同時凍結乾燥 前の実施例は、RNAポリメラーゼおよび逆転写酵素の
乾燥保存標品と、ヌクレオチド三リン酸および核酸増幅
に必要な副因子とを一緒に含有する単一試薬の製造およ
び使用を例証した。高温で長期の貯蔵後に核酸を増幅す
るこのような「単一バイアル」試薬の能力があれば、こ
のような試薬を使用する方法において工程数を減少させ
るように且つ核酸増幅用のキットの容器数を３個（例え
ば、凍結乾燥酵素：増幅試薬、プライマーおよび再構成
用試薬）から２個（例えば、凍結乾燥酵素／プライマー
／増幅試薬および再構成用試薬）に減少させるように、
凍結乾燥標品中に１種類または複数の増幅プライマーを
包含させることは容易に可能なはずであるということは
当業者に明らかであろう。
このような標品は、最初の標的核酸がRNAであり且つ
増幅法が等温のもの、例えば、カシアンおよびフルツ,P
CT公開第WO91/01384号またはカシアンら,RCT公開第WO93
/22461号でのような方法である場合のように、増幅反応
が、一方または両方の酵素を変性する温度を用いない場
合に有用である。
増幅法が等温のもの、例えば、カシアンおよびフルツ,P
CT公開第WO91/01384号またはカシアンら,RCT公開第WO93
/22461号でのような方法である場合のように、増幅反応
が、一方または両方の酵素を変性する温度を用いない場
合に有用である。
実施例7:逆転写酵素とスクロースとの凍結乾燥 出願人は、更に、スクロースを（例えば、0.2M濃度
の）、逆転写酵素の凍結乾燥において凍結保護安定化剤
として用いることができることを発見した。スクロース
の安定化作用は良好であると考えられ、MMLV−RTを含有
し且つ50％（v/v）グリセロール中において−20℃で同
じ時間貯蔵された標準的な液体溶液と比較して、0.2Mス
クロース中で凍結乾燥された標品は、凍結乾燥物を４℃
で30日間貯蔵後に、標準的なMMLV−RT標品の活性の93％
を維持した。スクロースではなく0.2Mトレハロースを含
有する同様に処理された凍結乾燥物は、同様の条件下の
標準について平均105％の活性を示した。
の）、逆転写酵素の凍結乾燥において凍結保護安定化剤
として用いることができることを発見した。スクロース
の安定化作用は良好であると考えられ、MMLV−RTを含有
し且つ50％（v/v）グリセロール中において−20℃で同
じ時間貯蔵された標準的な液体溶液と比較して、0.2Mス
クロース中で凍結乾燥された標品は、凍結乾燥物を４℃
で30日間貯蔵後に、標準的なMMLV−RT標品の活性の93％
を維持した。スクロースではなく0.2Mトレハロースを含
有する同様に処理された凍結乾燥物は、同様の条件下の
標準について平均105％の活性を示した。
実施例8:PAPの存在下での凍結乾燥 出願人は、更に、ポリビニルピロリドン（PAP）が、
凍結乾燥の前の緩衝液中でトレハロースと混合された場
合に、酵素：増幅試薬をトレハロース単独の存在下で凍
結乾燥させる場合よりも大きく、凍結乾燥T7 RNAポリ
メラーゼ:MMLV−RT:増幅試薬標品の安定性を向上させる
ことを発見した。この驚くべき知見は、凍結乾燥酵素：
増幅試薬の安定性が、凍結保護安定化剤としてトレハロ
ースを単独でかまたはトレハロースおよびPAPの組合わ
せを含有する凍結乾燥組成物の場合よりもむしろPAPを
単独で用いることによってほぼ同じかまたは高い程度に
維持されうることを示唆する。酵素の凍結乾燥は、実施
例２で詳述されたように、TRITON Ｘ−100または別の
非イオン性可溶化剤を含有する透析溶液に対して精製酵
素を透析することによって最適化することができる。こ
の透析溶液はトレハロースを含まない。緩衝液交換工程
後、酵素溶液のアリコートを調製し、そして種々の量の
PAPを各アリコートに加えることができる。次に、それ
らのアリコートに、実施例２で詳述されたように酵素：
増幅試薬を加え且つ凍結乾燥することができる。これら
の凍結乾燥試料は、実施例３の場合と同様に、異なった
温度で様々な時間インキュベートされ、そしてそれぞれ
の酵素活性についておよび核酸増幅を支持する再構成さ
れた試薬の能力について検定することができる。
凍結乾燥の前の緩衝液中でトレハロースと混合された場
合に、酵素：増幅試薬をトレハロース単独の存在下で凍
結乾燥させる場合よりも大きく、凍結乾燥T7 RNAポリ
メラーゼ:MMLV−RT:増幅試薬標品の安定性を向上させる
ことを発見した。この驚くべき知見は、凍結乾燥酵素：
増幅試薬の安定性が、凍結保護安定化剤としてトレハロ
ースを単独でかまたはトレハロースおよびPAPの組合わ
せを含有する凍結乾燥組成物の場合よりもむしろPAPを
単独で用いることによってほぼ同じかまたは高い程度に
維持されうることを示唆する。酵素の凍結乾燥は、実施
例２で詳述されたように、TRITON Ｘ−100または別の
非イオン性可溶化剤を含有する透析溶液に対して精製酵
素を透析することによって最適化することができる。こ
の透析溶液はトレハロースを含まない。緩衝液交換工程
後、酵素溶液のアリコートを調製し、そして種々の量の
PAPを各アリコートに加えることができる。次に、それ
らのアリコートに、実施例２で詳述されたように酵素：
増幅試薬を加え且つ凍結乾燥することができる。これら
の凍結乾燥試料は、実施例３の場合と同様に、異なった
温度で様々な時間インキュベートされ、そしてそれぞれ
の酵素活性についておよび核酸増幅を支持する再構成さ
れた試薬の能力について検定することができる。
上の実施例は、本発明の方法および組成物の好ましい
実施態様を単に記載しているだけであり、発明を制限す
るまたは定義するためのものではないということは当業
者に理解されるであろう。他の実施態様は、これらの実
施例に続く請求の範囲に包含される。
実施態様を単に記載しているだけであり、発明を制限す
るまたは定義するためのものではないということは当業
者に理解されるであろう。他の実施態様は、これらの実
施例に続く請求の範囲に包含される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カシアン，ダニエル・ルイス アメリカ合衆国カリフォルニア州92124, サン・ディエゴ，タンバー・ロード 3911 (72)発明者 プットナム，ジェイムズ・ガーフィール ド アメリカ合衆国カリフォルニア州92102, サン・ディエゴ，デイル・ストリート 1933 (72)発明者 デイヴィス，ウィリアム・マイケル アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サン・ディエゴ，ブエナ・ヴィスタ・ス トリート 3628 (56)参考文献 国際公開93−807（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12Q 1/68 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】単一容器中の安定化された酵素組成物を調
製するための方法であって、以下の工程： （ａ）（ｉ）MMLV逆転写酵素およびT7RNAポリメラーゼ
の混合物を含む活性酵素組成物、および （ii）トレハロース から本質的になる溶液を該単一容器中に提供し、 （ｂ）該溶液を凍結させ、 （ｃ）該凍結した溶液の溶媒部分を真空の適用によって
昇華させ、それによって該活性酵素組成物およびトレハ
ロースを含む凍結乾燥物を生成すること ここにおいて、該凍結乾燥物の再構成後、該活性酵素組
成物は核酸増幅を支持することが可能である を含む上記方法。 - 【請求項２】前記凍結乾燥物を再構成し且つ適当な核酸
基質および反応物と混合した場合に、前記溶液が、DNA
重合およびRNA転写の両方を可能にするのに充分なデオ
キシリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リ
ン酸、金属塩および副因子を単一溶液中に更に含む、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記溶液が、少なくとも１種類のオリゴヌ
クレオチド増幅ブライマーを更に含む請求項２に記載の
方法。 - 【請求項４】前記凍結乾燥物を室温で２か月間貯蔵した
場合に、前記酵素組成物が、標的核酸を増幅するその能
力を少なくとも70％保持する請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】前記凍結乾燥物を35℃で２か月間貯蔵した
場合に、前記酵素組成物が、標的核酸を増幅するその能
力を少なくとも70％保持する請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】前記凍結乾燥物を45℃で２か月間貯蔵した
場合に、前記酵素組成物が、標的核酸を増幅するその能
力を少なくとも70％保持する請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】前記凍結乾燥物を55℃で２か月間貯蔵した
場合に、前記酵素組成物が、標的核酸を増幅するその能
力を少なくとも70％保持する請求項２に記載の方法。 - 【請求項８】請求項１−７のいずれか１項に記載の方法
によって製造された安定化酵素組成物。 - 【請求項９】標的核酸の増幅用組成物であって、 （ａ）有効量のMMLV逆転写酵素およびT7RNAポリメラー
ゼ、 （ｂ）トレハロース、 （ｃ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌ
クレオチド三リン酸、 （ｄ）金属塩、および （ｅ）還元剤 を有する単一凍結乾燥物を含み、 ここにおいて、水性溶媒の添加によって該凍結乾燥物を
再構成する場合に、得られる溶液が、標的ヌクレオチド
配列領域を有する一本鎖RNA分子および１種類またはそ
れ以上の適当なオリゴヌクレオチドプライマーを該溶液
に加え且つ該酵素活性を促進するのに充分な温度で該溶
液をインキュベートした時に、該RNA分子を増幅するこ
とを特徴とする上記組成物。 - 【請求項１０】前記１種類またはそれ以上の適当なプラ
イマーが、凍結乾燥物中に含まれている請求項９に記載
の組成物。 - 【請求項１１】標的核酸の増幅用組成物であって、 （ａ）有効量のMMLV逆転写酵素およびT7RNAポリメラー
ゼ、 （ｂ）トレハロース、 （ｃ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌ
クレオチド三リン酸、 （ｄ）金属塩、 （ｅ）還元剤、および （ｆ）緩衝液 を有する単一凍結乾燥物を含み、 但し、該組成物はカルボン酸を含まないという条件付き
であり、 ここにおいて、水性溶媒の添加によって該凍結乾燥物を
再構成する場合に、得られる溶液が、標的ヌクレオチド
配列領域を有する一本鎖RNA分子および１種類またはそ
れ以上の適当なオリゴヌクレオチドプライマーを該溶液
に加え且つ該酵素活性を促進するのに充分な温度で該溶
液をインキュベートした時に、該RNA分子を増幅するこ
とを特徴とする上記組成物。 - 【請求項１２】標的核酸の増幅用キットであって、単一
凍結乾燥配合物中に組合わされたMMLV逆転写酵素および
T7RNAポリメラーゼを、トレハロースと一緒に含み、こ
こにおいて、該凍結乾燥配合物の再水和およびオリゴヌ
クレオチドプライマーの存在下での標的核酸の添加の際
に、若干のまたは全部の該標的核酸が増幅される上記キ
ット。 - 【請求項１３】前記凍結乾燥配合物が、金属塩およびヌ
クレオチド三リン酸を更に含む請求項12に記載のキッ
ト。 - 【請求項１４】少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド
増幅プライマーを更に含む請求項12に記載のキット。
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