JP6413228B2 - 長期保存可能な核酸増幅試薬 - Google Patents
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T7RNAポリメラーゼ、AMV逆転写酵素およびリボヌクレアーゼH(RNase H)からなる酵素群と、キャリアタンパク質、二糖類、二糖類誘導体および糖重合体からなる賦形剤とを含む凍結乾燥体(特許文献8参照)や、
T7RNAポリメラーゼおよびMMLV逆転写酵素からなる酵素群と、トレハロースからなる賦形剤とを含む凍結乾燥体(特許文献9参照)、
があげられる。いずれの凍結乾燥体も、冷蔵温度以上で数ヶ月間、核酸合成酵素としての活性が保持されることが示されている。
酵素、血清、抗体、抗原等などの生理活性物質と、トレハロースからなる賦形剤とを含む溶液を、室温・大気圧下で乾燥する方法(風乾法)(特許文献10参照)や、
前記生理活性物質と、フィコールなどの糖類誘導体からなる賦形剤とを含む溶液を、室温以上・大気圧の90%以下の条件で乾燥する方法(蒸発乾燥法)(非特許文献3および特許文献11参照)、
があげられる。これら乾燥法は凍結を必要としないことから、凍結乾燥法の凍結工程における酵素の損傷を防ぐことができる点で有用である。しかしながら、これら乾燥法では、乾燥時に被乾燥物が室温以上に長時間曝露されるため、被乾燥物が核酸合成酵素の場合、その酵素活性の劣化が懸念される。特に核酸合成酵素の一つであるAMV逆転写酵素の、蒸発乾燥法による安定化の報告例はない。
(1)RNAポリメラーゼ
(2)デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸
(3)標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチド
また本発明の第三の態様は、溶液中に含まれるトレハロースの濃度が60mMから600mMの間である、前記第一または第二の態様に記載の核酸増幅試薬である。
トレハロースとAMV逆転写酵素とを含む蒸発乾燥体の保存安定性を以下の方法で評価した。
(1)下記の組成からなる、トレハロースとAMV逆転写酵素とを含んだ被乾燥溶液Aを調製し、市販の0.5mL容量PCR用チューブ(Individual Dome Cap PCR Tube、SSI社製)に15μL/tubeで分注した。なお、AMV逆転写酵素は1.0Mのトレハロースを含む15U/μLのAMV逆転写酵素溶液(トレハロース(+)、表1)を0.43μL/tube添加し、T7RNAポリメラーゼは0.5Mのトレハロースを含む100U/μLのT7RNAポリメラーゼ溶液(トレハロース(+)、表2)を1.42μL/tube添加して調製した。また下記の組成のうち、トレハロース濃度は、AMV逆転写酵素溶液(トレハロース(+))およびT7RNAポリメラーゼ溶液(トレハロース(+))からのトレハロースの持ち込みを含んだ値である。
6.4U AMV逆転写酵素
37.9mM、100mM、150mM、200mMまたは250mM トレハロース(各酵素液から持ち込まれるトレハロースを含む)
60mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.65)
各0.3mM dATP、dTTP、dGTP、dCTP
各3.0mM ATP、UTP、GTP、CTP
3.4mM ITP
0.16μM 切断用オリゴヌクレオチド(配列番号1)
1.0μM 第一のプライマー(配列番号2)
1.0μM 第二のプライマー(配列番号3)
25nM チアゾールオレンジ標識プローブ(配列番号4、非特許文献2に記載の方法を基づき作製)
142U T7RNAポリメラーゼ
6.4U AMV逆転写酵素
60mM トリス塩酸緩衝液(pH8.65)
各0.3mM dATP、dTTP、dGTP、dCTP
各3.0mM ATP、UTP、GTP、CTP
3.4mM ITP
0.16μM 切断用オリゴヌクレオチドDNA(配列番号1)
1.0μM 第一のプライマー(配列番号2)
1.0μM 第二のプライマー(配列番号3)
25nM チアゾールオレンジ標識プローブ(配列番号4、非特許文献2に記載の方法を基づき作製)
142U T7RNAポリメラーゼ
(3)(1)で調製した被乾燥溶液Aを分注したPCR用チューブ、および(2)で調製した被乾燥溶液Bを分注したPCR用チューブを、それぞれアルミラックにセットし、棚式凍結乾燥機(AdVantage Plus EL−85、Virtis社製)に入れて蒸発乾燥を行なった。蒸発乾燥は、減圧度が12kPaから14kPaになるように制御のもと、棚温度25℃で12時間、続いて棚温度50℃で2時間、行なった。
(4)蒸発乾燥後、PCR用チューブを取り出して、蒸発乾燥体が吸湿しないよう、直ちにアルミシールにて密封した。得られた蒸発乾燥体は透明フィルム状であった(図1)。(5)(4)で密封した蒸発乾燥体を含むPCR用チューブを、温度40℃、相対湿度(RH)5%以下の条件で一定期間貯蔵した。
(6)一定期間貯蔵後のPCR用チューブに、標的核酸(103コピーの結核菌(Mycobacterium tuberculosis)16S rRNA)を含む溶液15μLを添加し、46℃で5分間静置することで蒸発乾燥体を溶解させた。
(7)下記の組成からなる核酸増幅開始溶液A 15μLを(6)の溶解液に添加し、撹拌した。
10.5% DMSO
6.5% グリセロール
21.0mM 塩化マグネシウム
83.0mM 塩化カリウム
(8)(7)のPCR用チューブを、直接検出可能な温調機能付き蛍光分光光度計に供し、46℃で核酸増幅反応させると同時に反応溶液の蛍光強度(励起波長500nm、蛍光波長540nm)を経時的に30分間検出した。核酸増幅に必要な因子溶液を添加した時点を反応開始時間として、蛍光強度比(所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った値)が1.2になった時点の反応時間を検出時間とした。
本発明の核酸増幅試薬にさらに水溶性高分子を含んだときの、保存安定性への影響を評価した。
(1)下記の組成からなる、トレハロースとAMV逆転写酵素と水溶性高分子を含む被乾燥溶液Cを調製し、市販の0.5mL容量PCR用チューブ(Individual Dome Cap PCR Tube、SSI社製)に15μL/tubeで分注した。なお、AMV逆転写酵素は1.0Mのトレハロースを含む15U/μLのAMV逆転写酵素溶液(トレハロース(+)、表1)を0.63μL/tube添加し、T7RNAポリメラーゼは0.5Mのトレハロースを含む100U/μLのT7RNAポリメラーゼ溶液(トレハロース(+)、表2)を1.42μL/tube添加して調製した。また下記の組成のうち、トレハロース濃度は、AMV逆転写酵素溶液(トレハロース(+))およびT7RNAポリメラーゼ溶液(トレハロース(+))からのトレハロースの持ち込みを含んだ値であり、水溶性高分子は(a)0.25% Ficoll 400(商品名)、(b)1.00% Ficoll 400(商品名)、(c)0.25% デキストラン 200kDa、(d)1.00% デキストラン 200kDa、(e)0.25% ポリビニルピロリドン K90、のいずれかである(濃度はいずれも核酸反応時の終濃度)。
9.4U AMV逆転写酵素
150mM トレハロース(各酵素液から持ち込まれるトレハロースを含む)
60mM トリス塩酸緩衝液(pH8.65)
各0.3mM dATP、dTTP、dGTP、dCTP
各3.0mM ATP、UTP、GTP、CTP
3.06mM ITP
0.16μM 切断用オリゴヌクレオチド(配列番号1)
1.0μM 第一のプライマー(配列番号2)
1.0μM 第二のプライマー(配列番号3)
50nM チアゾールオレンジ標識プローブ(配列番号4、非特許文献2に記載の方法を基づき作製)
142U T7RNAポリメラーゼ
水溶性高分子(上記参照)
(2)実施例1(3)に記載の方法で蒸発乾燥を行ない、アルミシールにて密封した。得られた蒸発乾燥体は実施例1と同様、透明フィルム状であった。
(3)(2)で作製した、密封した蒸発乾燥体を含むPCR用チューブを、温度13℃、相対湿度(RH)95%以上の条件で一定期間貯蔵した。
(4)一定期間貯蔵後のPCR用チューブに、標的核酸(103コピーの結核菌(Mycobacterium tuberculosis)16S rRNA)を含む溶液15μLを添加し、46℃で5分間静置することで蒸発乾燥体を溶解させた。
(5)下記の組成からなる核酸増幅開始溶液B 15μLを(5)の溶解液に添加し、撹拌した。
10.0% DMSO
5.0% グリセロール
19mM 塩化マグネシウム
100mM 塩化ナトリウム
(6)実施例1(8)と同様な方法で核酸増幅反応を行ない、標的核酸を検出した。
Claims (5)
- 核酸増幅試薬の製造方法であって、
1)AMV逆転写酵素とトレハロースとを含む被乾燥溶液を調製する工程、および
2)前記1)で得られた被乾燥溶液を、蒸発乾燥させる工程
を含み、
前記蒸発乾燥が凍結工程を含まない条件で乾燥する方法であり、
被乾燥溶液中の前記トレハロースの濃度が200mM以上400mM以下の範囲である、方法。 - 前記工程2)が、
前記1)で得られた被乾燥溶液を、10kPaから580kPaの減圧条件下、20℃から40℃で乾燥させた後、さらに40℃から60℃で乾燥させる工程
である、請求項1に記載の方法。 - 核酸増幅試薬が、さらに以下の(1)から(3)のいずれか一つ以上を含む、請求項1または2に記載の方法。
(1)RNAポリメラーゼ
(2)デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸
(3)標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチド - 請求項1〜3のいずれかに記載の方法で得られた核酸増幅試薬に、標的核酸を含む試料を添加し、塩類を含む核酸増幅開始液を添加する工程、および
核酸増幅反応を行うことで前記標的核酸を検知する工程、
を含む、標的核酸の検出方法。 - 核酸増幅反応がNASBA法、TMA法、TRC法のいずれかである、請求項4に記載の方法。
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