CN107365754A - 一种m‑mlv逆转录酶的冻干工艺 - Google Patents

一种m‑mlv逆转录酶的冻干工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种M‑MLV逆转录酶的冻干工艺，包括以下步骤：（1）预处理：将M‑MLV逆转录酶溶解在一定浓度的海藻糖溶液中，分装，作为待冻干样品；（2）预冻：开启冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内温度至‑50℃以下，将经过预处理的M‑MLV逆转录酶放入冷冻干燥机内快速冷冻；（3）真空条件下，调节冷冻干燥室内温度至‑40±3℃，维持5±0.5小时；（4）真空条件下，调节冷冻干燥室内温度至‑25±3℃，维持10±0.5小时；（5）真空条件下，调节冷冻干燥室内温度至0±3℃，每小时回温≤2℃，维持5±0.5小时；（6）真空条件下，调节冷冻干燥室内温度至10±3℃，每小时回温≤7.5℃，维持2±0.5小时；（7）关闭冷冻干燥机，取出M‑MLV逆转录酶冻干品。

Description

一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺。
背景技术
M-MLV逆转录酶是一种莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反转录酶(简称M-MLVRTase)，本酶是通过点突变使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性与野生型相同，同时其延伸能力也有显著提高。逆转录酶（M-MLV）一个活性单位定义为在37℃，10min条件下，使1nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。
M-MLV逆转录酶应用于cDNA的第一链合成和引物的延伸。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子，当以mRNA为模板时，先合成单链DNA（ssDNA），再在反转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下，以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA（dsDNA），再由核酸酶S1切成二条单链的双链DNA。因此，反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝，然后可大量扩增插入载体后的cDNA，也可用来标记cDNA作为放射性的分子探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。
在病原体诊断领域，个体化医疗领域，M-MLV逆转录酶作为关键原料参与到一步法PCR扩增体系中去，从而实现检测临床样本中的靶基因。
但是，M-MLV逆转录酶其活性和稳定性也受到温度、pH值、保存时间等因素的影响，其溶液必须于-20±5℃条件下保存，且有效期不会超过1年，这给逆转录酶的运输、保存及应用都带来了不便，所以，摸索和改进M-MLV逆转录酶的冻干工艺，加强逆转录酶干粉的稳定性、延长其贮存期限并保持M-MLV逆转录酶在冻干后的活性非常有必要。
而20世纪90年代以来的研究表明，海藻糖对生物大分子具有独特的非特异性保护作用；生物大分子周围包裹着一层维持其结构和功能必不可少的水分子，在干燥、冷冻等条件下，海藻糖能替代此类水分子，构成一种“玻璃态”，使生物大分子运动和变性非常微弱，其空间结构得到维持；海藻糖还能与蛋白质表面残余水分子结合，使分子结构更紧密，构象更稳定，有利于抵御冷冻干燥对蛋白质的损害。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺依次包括下列步骤：
（1）预处理：将M-MLV逆转录酶溶解在一定浓度的海藻糖溶液中，分装，作为待冻干样品；
（2）预冻：开启冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内温度至-50℃以下，将经过预处理的M-MLV逆转录酶放入冷冻干燥机内快速冷冻；
（3）在真空度a条件下，调节冷冻干燥室内温度至-40±3℃，维持5±0.5小时；
（4）在真空度b条件下，调节冷冻干燥室内温度至-25±3℃，维持10±0.5小时；
（5）在真空度c条件下，调节冷冻干燥室内温度至0±3℃，每小时回温≤2℃，维持5±0.5小时；
（6）在真空度d条件下，调节冷冻干燥室内温度至10±3℃，每小时回温≤7.5℃，维持2±0.5小时；
（7）关闭冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内环境至常压、常温后，取出M-MLV逆转录酶冻干品。
进一步的，所述步骤（2）可分为两个阶段，a.调节冷冻干燥室内温度至-50±5℃，产品预冻2±0.5小时；b.调节冷冻干燥室内温度至-40±5℃，产品预冻2±0.5小时。
进一步的，所述海藻糖溶液浓度为10%-15%。
进一步的，所述真空度a为500±10.0Pa。
进一步的，所述真空度b为500±10.0Pa。
进一步的，所述真空度c为5.0±5.0Pa。
进一步的，所述真空度d为5.0±5.0Pa。
本发明的有益效果：
本发明所公开的技术方案，采用海藻糖溶液对M-MLV逆转录酶进行保护，通过产品预处理、冻干条件调节等方式，从而保证M-MLV逆转录酶原有空间结构、M-MLV逆转录酶生物活性的基础上，实现M-MLV逆转录酶的冷冻干燥。
通过海藻糖溶液对M-MLV逆转录酶进行保护的冻干方式，得到的M-MLV逆转录酶冻干品，其贮存受温度的影响较常规冻干工艺低；M-MLV逆转录酶冻干品可在室温下贮存2年或以上，期间M-MLV逆转录酶冻干品溶解后活性能够保持不变，因此M-MLV逆转录酶冻干品生产以及运输过程的条件更为宽泛。
附图说明
图1为本发明三种PCR扩增试剂检测样本1的结果图；
图2为本发明三种PCR扩增试剂检测样本2的结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺，包括以下步骤：
（1）预处理：将M-MLV逆转录酶溶解在一定浓度的海藻糖溶液中，分装，作为待冻干样品；
（2）预冻：开启冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内温度至-50℃以下，将经过预处理的M-MLV逆转录酶放入冷冻干燥机内快速冷冻；
（3）在真空度a条件下，调节冷冻干燥室内温度至-40±3℃，维持5±0.5小时；
（4）在真空度b条件下，调节冷冻干燥室内温度至-25±3℃，维持10±0.5小时；
（5）在真空度c条件下，调节冷冻干燥室内温度至0±3℃，每小时回温≤2℃，维持5±0.5小时；
（6）在真空度d条件下，调节冷冻干燥室内温度至10±3℃，每小时回温≤7.5℃，维持2±0.5小时；
（7）关闭冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内环境至常压、常温后，取出M-MLV逆转录酶冻干品。
本发明提供的冻干工艺能够使冻干后的M-MLV逆转录酶具有良好的稳定性。
本发明步骤（1）中把M-MLV逆转录酶溶解在一定浓度的海藻糖溶液中，能够对M-MLV逆转录酶进行保护，保证M-MLV逆转录酶在后续冷冻干燥过程中保持原有的空间结构及生物活性。
优选的，所述海藻糖溶液浓度为10%-15%，更优选的，所采用海藻糖溶液浓度为10%。
本发明再经过两个预冻阶段，通过调节预冻的温度，能够加速晶体之间的相互溶解，相互渗透，保证后续加热升华的过程中水分能够充分的升华。
优选的，所述步骤（2）可分为两个阶段，a.调节冷冻干燥室内温度至-50℃，产品预冻2小时；b.调节冷冻干燥室内温度至-40℃，产品预冻2小时。
优选的，所述步骤（3）中，在真空度为500Pa条件下，调节冷冻干燥室内温度至-40℃，维持5小时；
优选的，所述步骤（4）中，在真空度为490Pa条件下，调节冷冻干燥室内温度至-25℃，维持10小时；
优选的，所述步骤（5）中，在真空度为10.0Pa条件下，调节冷冻干燥室内温度至0℃，每小时回温2℃，维持5小时；
优选的，所述步骤（6）中，在真空度为6.0Pa条件下，调节冷冻干燥室内温度至10℃，每小时回温7.5℃，维持2小时；
优选的，所述经过预处理的M-MLV逆转录酶样品的质量分数为8%。
优选的，所述M-MLV逆转录酶冻干品，可通过肉眼看到白色粉末于管底，使用M-MLV逆转录酶溶解液进行溶解后溶液呈透明澄清状态。
实施例1 M-MLV逆转录酶的冻干工艺步骤
A.预处理：将M-MLV逆转录酶溶解在10%的海藻糖溶液中，分装在螺口冻存管中，作为待冻干样品；
B.预冻：开启冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内温度至-60℃，将经过预处理的M-MLV逆转录酶放入冷冻干燥机内快速冷冻；调节冷冻干燥室内温度至-50℃，产品预冻2小时；调节冷冻干燥室内温度至-40℃，产品预冻2小时；
C.真空度为500Pa条件下，调节冷冻干燥室内温度至-40℃，维持5小时；
D.真空度为490Pa条件下，调节冷冻干燥室内温度至-25℃，维持10小时；
E.真空度为10.0Pa条件下，调节冷冻干燥室内温度至0℃，每小时回温2℃，维持5小时；
F.真空度为6.0Pa条件下，调节冷冻干燥室内温度至10℃，每小时回温7.5℃，维持2小时；
G.关闭冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内环境至常压、常温后，取出M-MLV逆转录酶冻干品。
实施例2 M-MLV逆转录酶冻干品稳定性比较实验
1.使用广州和实生物技术有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒提取两份甲型流感病毒样品核酸，分别为样本1和样本2。
2.准备新制备的保存于-20±5℃的M-MLV逆转录酶溶液、室温条件下放置2年的实施例1条件下制备的M-MLV逆转录酶冻干品、实施例1条件下新制备的M-MLV逆转录酶冻干品各两份。
3.分别使用新制备的保存于-20±5℃的M-MLV逆转录酶溶液、室温条件下放置2年的实施例1条件下制备的M-MLV逆转录酶冻干品、实施例1条件下新制备的M-MLV逆转录酶冻干品与甲型流感病毒核酸检测试剂盒配制出甲型流感病毒的一步法PCR扩增试剂。
4.将步骤3中得到的三种PCR扩增试剂分别与步骤1中得到的样本1进行混合，用于检测样本1，检测结果如图1所示。
5.将步骤3中得到的三种PCR扩增试剂分别与步骤1中得到的样本2进行混合，用于检测样本2，检测结果如图2所示。
6.该实验结果表明，室温条件下放置2年的实施例1条件下制备的M-MLV逆转录酶冻干品与新制备的保存于-20±5℃的M-MLV逆转录酶溶液和实施例1条件下新制备的M-MLV逆转录酶冻干品就能检测出样本1与样本2含有甲型流感病毒，且三者具有同样灵敏度的检测效果，说明本发明下制得的M-MLV逆转录酶冻干品在经过2年常温条件下贮存后仍能保持其生物活性，且在贮存过程中受温度和时间影响较常规工艺小，本发明下制得的M-MLV逆转录酶冻干品的生产以及运输条件更为宽泛。
当然，本发明创造并不局限于上述实施方式，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本发明所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺，其特征在于：所述冻干工艺依次包括下列步骤：
预处理：将M-MLV逆转录酶溶解在一定浓度的海藻糖溶液中，分装，作为待冻干样品；
预冻：开启冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内温度至-50℃以下，将经过预处理的M-MLV逆转录酶放入冷冻干燥机内快速冷冻；
在真空度a条件下，调节冷冻干燥室内温度至-40±3℃，维持5±0.5小时；
在真空度b条件下，调节冷冻干燥室内温度至-25±3℃，维持10±0.5小时；
在真空度c条件下，调节冷冻干燥室内温度至0±3℃，每小时回温≤2℃，维持5±0.5小时；
在真空度d条件下，调节冷冻干燥室内温度至10±3℃，每小时回温≤7.5℃，维持2±0.5小时；
关闭冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内环境至常压、常温后，取出M-MLV逆转录酶冻干品。
2.根据权利要求1所述的一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺，其特征在于：所述步骤（2）可分为两个阶段，
a.调节冷冻干燥室内温度至-50±5℃，产品预冻2±0.5小时；
b.调节冷冻干燥室内温度至-40±5℃，产品预冻2±0.5小时。
3.根据权利要求1所述的一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺，其特征在于：所述海藻糖溶液浓度为10%-15%。
4.根据权利要求1所述的一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺，其特征在于：所述真空度a为500±10.0Pa。
5.根据权利要求1所述的一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺，其特征在于：所述真空度b为500±10.0Pa。
6.根据权利要求1所述的一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺，其特征在于：所述真空度c为5.0±5.0Pa。
7.根据权利要求1所述的一种M-MLV逆转录酶的冻干工艺，其特征在于：所述真空度d为5.0±5.0Pa。
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