JP4663988B2 - Dna操作のための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本出願は2002年4月12日出願の米国特許仮出願第60/372,352号、2002年4月15日出願の米国特許仮出願第60/372,675号および2002年10月24日出願の米国特許仮出願第60/421,010号の優先権を主張するもので、それらの出願は参照として本明細書に取り込まれる。
定義
本明細書および付属する特許請求の範囲に使用される以下の用語の定義は下記の通りである。それらの定義は、用語が使用されている文脈が特に要求しない限り適用されるべきである。
ポリヌクレオチド分子中で一重鎖を伸張する工程は、ポリヌクレオチド分子にカセットを先ず挿入することを包含する。カセットは、例えば、制限エンドヌクレアーゼクローニング法またはPCR増幅を用いていかなるポリヌクレオチド分子にも挿入することができる。
上記の3’一重鎖伸張の生成とは別の方法としては、プライマーが特異的部位に修飾ヌクレオチドを含有している、標的分子のプライマー依存性増幅が含まれる。増幅産物は、修飾ヌクレオチドにおいて特異的に切込みを入れる切込み剤で処理される。相補鎖から切込みされた一重鎖末端の解離によって、一重鎖伸張が生成する。プライマー依存的増幅の例としては以下を包含する:ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、鎖置換増幅法(Strand Displacement Amplification:SDA)、転写介在増幅法(TMA)およびリガーゼ連鎖反応法(LCR)。
(A)DNA Nグリコシラーゼは、以下の酵素およびヒト同族体を包含する高級真核生物における同族体を包含する:ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)および3−メチルアデニンDNAグリコシラーゼII(AlkA)(NakabeppuらのJ.Biol.Chem.259:13723−13729(1984)、VarshneyらのJ.Biol.Chem.263:7776−7784(1988)、VarshneyらのBiochemistry30:4055−4061(1991))。さらにDNA NグリコシラーゼはTagIグリコシラーゼおよびMUGグリコシラーゼを包含する(SakumiらのJ.Biol.Chem.261:15761−15766(1986)、BarretらのCell92:117−129(1998))。
(i)酸化型ピリミジンを特異的に認識し除去することのできる酵素は、E.coliエンドヌクレアーゼVIII(EndoVIII)、E.coliエンドヌクレアーゼIII(NTH)、およびS.cerevisiae(NTG1およびNTG2)およびヒト(hNTH1)中の同族体を包含する(MazumderらのBiochemistry30:1119−1126(1991)、JiangらのJ.Biol.Chem.272:32230−32239(1997)、HarrisonらのNucl.Acid Res.26:932−941(1998)、SenturkerらのNucl.Acid Res.26:5270−5276(1998)、
(ii)酸化型プリンを特異的に認識し除去することのできる酵素は、E.coliFAPY−DNAグリコシラーゼ(FPG)およびそのヒト同族体hOGG1およびhOGG2を包含する(Boiteux EMBO J.6:3177−3183(1987)、BoiteuxらのJ.Biol.Chem.265:3916−3922(1990)、RadicellaらのProc.Natl.Acad.Sci.USA94:8010−8015(1997)、VidalらのNucl.Acid Res.29:1285−1292(2001)、および
(iii)UV誘発シクロブタンピリミジンダイマーに特異的な酵素は、T4エンドVを包含する(GordonらのJ.Biol.Chem.255:12047−12050(1980)、SeawellらのJ.Virol.35:790−796(1980))。
本明細書に記載された方法の優れた特徴は、DNA操作単独または併用の広範な実施を可能にする方法の普遍性および柔軟性である。これらの方法はその普遍性および柔軟性ゆえに、多数の操作を実行する骨の折れる段階的な実験を必要とする、制限エンドヌクレアーゼ依存性クローニングあるいは操作のような従来のシステムと区別される。
A)PCR産物の方向性を有するクローニング(図7に例示);
B)ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の置換、挿入、欠失または融合を包含する部位特異的突然変異誘発(図8−12に例示);
C)複数の中間断片からの標的分子の組立て(図13−15に例示);
D)多数の標的分子のレシピエント分子への方向性のある組立て(図16に例示);
E)公知配列の境界の外側での染色体性/環境性DNAクローニング(染色体歩行)(図17に例示);
F)公知配列の境界を越えてcDNAのクローニングを含む、cDNAライブラリーの構築(図18に例示);および
G)上記応用の同時使用(図35−37に例示)。
相補性一重鎖伸張は、線状化したレシピエント分子およびPCR産物で発生させることができ、ここで各々の伸張によって、他と会合してコンピテント宿主細胞に導入することができる組換え分子が製造できる(図7)。
(1)レシピエント分子での一重鎖伸張の発生は、線状化されたレシピエント分子の各末端に望ましい長さおよび組成の3’一重鎖伸張をつくるカセットを担持したレシピエント分子の構築を包含する(上記で考察)。
(2)PCR断片での一重鎖伸張の生成は、上記したようにPCR断片の選択された位置に特異的修飾ヌクレオチドを挿入し、特異的切込み剤で修飾ヌクレオチドにおいて断片に切込みを入れ、そして切込みを入れた5’末端オリゴヌクレオチドを相補鎖から解離して、望ましい長さおよび組成の一重鎖伸張を有する断片をつくることを包含する。
望ましい長さおよび組成の相補性一重鎖伸張を、少なくとも二つのポリヌクレオチド分子の端で生成させることができる。次いで、ポリヌクレオチド分子を一重鎖伸張を経て会合し単一標的分子を形成する(図8)。この方法は、実際に標的分子のいかなる位置におけるいかなるDNAセグメントの部位特異的突然変異、欠失、挿入、遺伝子融合または置換のような、広範囲のDNA操作の基本を形成しており、また、上記で同時に行われたどのような組合せの多数のDNA断片からの標的分子の組立てにも応用することができる。
図13−15は、標的分子を二つ以上の中間断片から正確に組立てることを望むときに設計される、重複プライマーP1およびP2の模式図を示している。
図16は、どのようにして多数の標的分子のレシピエント分子への直接的組立てを達成することができるかの模式的図解を示している。
図17は、公知配列の境界の外側のDNAをクローニングするための戦略の模式図を示す。その方法は、レシピエント分子において一重鎖伸張に相補性の一重鎖伸張を生成することに基づいている。第一のステップにおいて、一重鎖フランキング配列のライブラリーが、公知の領域での一プライマーとの線状増幅によって生成する。増幅された一重鎖フランキング配列の未知の末端に開始部位を導入するために、dCTPおよびターミナルトランスフェラーゼを使用して3’末端にホモオリゴマーシトシンが末端につながれる。次のステップで、末端につながれた一重鎖フラグメントが、5’末端にベクター適合性配列を担持している一対のプライマーを用いて増幅される。標的分子の未知の領域に会合する一つのプライマーは、ポリグアニン配列から成り、5’末端から6番目の位置に修飾ヌクレオチド、例えば8−オキソグアニンを担持している。また、標的分子の公知の領域に会合する5’領域の別のプライマーは、結合部に5つのグアニンを担持し、かつ8−オキソグアニンによって補充されている。
図18は、総RNA試料からのcDNAライブラリーの構築戦略を表した模式図を示す。第一鎖合成は、逆転写酵素および5’末端から6番目の位置に8−オキソグアニンを有するヘキサグアニン5’末端を含有するオリゴdTプライマーを用いて、総RNAからの一重鎖cDNA産物のライブラリーを生成する(図18におけるプライマー1)。次いで、dCTPおよびターミナルトランスフェラーゼを用いて一重鎖cDNA産物の3’末端にホモオリゴマーシトシン末端が加えられる。第二鎖合成は、5’末端から6番目の位置に8−オキソグアニンを有するポリdGプライマーを用いて、DNAポリメラーゼIで実行される(図18のプライマーP3およびP4)。
望ましい長さと構造の独特な3’一重鎖伸長を有する直鎖状DNAベクターについて、pNEB205A(SEQ ID NO:1)、pNEB200A(SEQ ID NO:3)、pNEB210A(SEQ ID NO:4)およびpUC−TT(SEQ ID NO:6)を以下に示す方法で作製した(図19−22)。これらベクターは全て多重クローニングサイトへのカセットの挿入によってpNEB193ベクター(New England Biolab カタログ 2002−2003、p.318)から誘導されたものである(図27Aおよび27B)。直鎖状ベクターそれぞれに形成される一重鎖伸長は、ベクター末端が再会合し、形質転換しやすい環状DNAが形成される問題を避けるため、およびベクターに挿入されるいかなる標的分子の配向性も制御すべく、互いに相補的でないように設計した。
2つの逆方向のN.BbvCIB切込みサイト(CC↓TCAGC)および1つのXbaI制限サイト(T↓CTAGA)を含むカセット5’GCTGAGGGAAAGTCTAGATGTCTCCTCAGC(SEQ ID NO:1)をpNEB193プラスミドの多重クローニングサイトに挿入した。新しいコンストラクトをpNEB205Aと表記した(図19、27AおよびB)。
2つのXbaI制限サイト(T↓CTAGA)および2つの逆方向のN.BstNBI切込みサイト(5’−GAGCTNNNN↓)を含むカセット5’ACGAGACTCTAGAGGATCCGTCTAGAGTCTGGT(SEQ ID NO:3)をpNEB193プラスミドの多重クローニングサイトに挿入した。新しいコンストラクトをpNEB200Aと表記した(図20)。
2つの逆方向のN.BbvCIB切込みサイト(CC↓TCAGC)、1つのBamHI制限サイト(G↓GATCC)および1つのXbaI制限サイト(T↓CTAGA)を含むカセット5’GCTGAGGGGGGGATCCTTTTCATTCTAGATGTCTCCTCAGC(SEQ ID NO:4)をpNEB193プラスミドの多重クローニングサイトに挿入した。新しいコンストラクトをpNEB210Aと表記した(図21)。
2つの逆方向のN.BbvCIB切込みサイト(CC↓TCAGC)、および2つのBamHI制限サイト(G↓GATCC)を含むカセット5’GCTGAGGGGGGGATCCTTTTCATGGATCCCCCCCTCAGC(SEQ ID NO:6)をpNEB193プラスミドの多重クローニングサイトに挿入した。新しいコンストラクトをpUC−TTと表記した(図22)。
この実施例では2本鎖DNA分子のデオキシウリジンに切込みを入れ、ヌクレオチドの溝を生じさせて切込み位置に5’リン酸および3’リン酸を残す2つの人工切込み剤、USERTM酵素およびUSERTM酵素2の調製について説明する。それぞれの人工切込み剤は2つの成分で構成される。USERTM酵素はUDG DNAグリコシラーゼとEndoVIII DNAグリコシラーゼ/リアーゼを含み、一方、USERTM酵素2はUDG DNAグリコシラーゼとFPG DNAグリコシラーゼ/リアーゼを含む。人工切込み剤の1活性単位は、10μLの反応バッファーに溶かした10pmol(ピコモル)のデオキシアデニンと対を成す1個のデオキシウリジンを含有する34マー(mer)の2本鎖オリゴヌクレオチドを37℃、15分間で切断が完了するのに必要な量の個別成分を有するものと定義した。従って、1つの人工切込み剤を作るための混合物中の成分の最適な比率は単位の定義に基づいて決められる。
この実施例ではデオキシウリジンを含有するプライマーを用いてDNA増幅した後の標的分子のクローニングについて説明する(図26Aおよび26B)。増幅生成物を切込み剤のUSERTM酵素(実施例2を参照)で処理して独自の3’一重鎖伸長を作り、それが次に相補的な3’一重鎖伸長を有する直鎖状のベクターpNEB205A(実施例1のA)を参照)と会合する。この方法は制限エンドヌクレアーゼの切断に依存しないし、標的生成物をベクターに挿入するためにDNAリガーゼを必要としない。
直鎖状ベクターpNEB205A、10μL(0.1μg/μL)
USERTM酵素、10μL(1unit/μL)、
配列決定用プライマー:
M13/pUC 配列決定用プライマー(−47)
(5'−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC−3’(SEQ ID NO:31))、50μL(3.2pmol/μL)、
M13/pUC 逆方向配列決定用プライマー(−48)
(5'−AGCGGATAACAATTTCACACAGGA−3’(SEQ ID NO:32))、50μL(3.2pmol/μL)、
使用説明書(New England Biolabs,Inc.,ビバリー、マサチューセッツ州、米国)
標的分子の増幅はTaq DNAポリメラーゼとプライマー対を使って達成されるが、ここで使われるプライマー対の各プライマーは標的分子と相補的な配列を有し、さらに直鎖状ベクターの一重鎖伸長と適合性の良い5’末端配列を有している(図26A)。ベクター内の標的分子の配向性は、プライマー間のベクター特異的5’末端配列を交換することにより反対向きにすることができる。
切込み剤(USERTM酵素)は試験した全てのPCRバッファー及び一般に使われる他の種々のバッファー中で活性があることを確認した(表1)。(a)に述べた方法で作られた増幅生成物(PCRフラグメント)は分子あたり2個のウラシル残基を含んでいる(図26B(b))。USERTM酵素の1活性ユニット(実施例2を参照)は5pmolの増幅DNAに切込みを入れることができる。これを質量濃度に換算すると、5pmolのDNAは100bp(塩基対)長のDNA0.33μgに、または1000bp長のDNA3.29μgに相当する。
(b)の組立て反応液2〜12μL中で会合してできた組換え体分子は、化学受容性大腸菌(E.coli)細胞の形質転換に用いられる。次に、100μg/mLのアンピシリン含有のLBプレート、または青−白で選別するために、100μg/mLのアンピシリン、0.1mMのIPTG(イソプロピルチオガラクトシド)及び0.01mg/mLのX−gal含有のLBプレートのどちらかで形質転換細胞を平板培養した。青−白選別を用いると、組換え体分子の入った形質転換細胞は白色のコロニーを形成するが、非修飾のベクターが入った形質転換細胞は青色のコロニーを形成する。
標的分子は、必要に応じて、pNEB205Aの多重クローニングサイト(MCS)内にある種々の独特な制限サイトを使って、他の発現ベクターにサブクローニングすることができる(図27B及び27C)。多重クローニングサイト(MCS)は4個の独特な8−塩基制限サイト(AscI,PacI,PmeIおよびSbfI用)を挿入サイトの横側に有するている。
右側プライマー:5’−[GGGAAAGU+(制限サイト)+開始配列]
実施例3で説明した方法を使い、cat(Cmr)遺伝子をpGPS2.1プラスミドの950bpフラグメントとして、Taq DNAポリメラーゼ及び下に示すプライマーを用いて増幅した。
左側プライマー:5’−GGAGACAUCGGATCCATACCTGTGACGGAAG(SEQ ID NO:33)
右側プライマー:5’−GGGAAAGUGGATCCAGGCGTTTAAGGGCACC(SEQ ID NO:34)
94℃ 5分
94℃ 30秒
55℃ 1分 1サイクル
72℃ 40秒
72℃ 5分
この実施例では、いかに多様なDNA操作が行われるか、例えば部位特異的突然変異、標的分子の融合、消去、挿入または標的分子のあらゆる位置にあるDNA区分の置換、複数のDNAフラグメントから標的分子の組立て、修飾ヌクレオチド(X)としてデオキシウリジンを使用した上記応用のあらゆる同時的組合せ(図8〜15)などについて説明する。
標的分子は図31に示したように複数のプライマー対を使って増幅させ得る。重複プライマーのP1およびP2は、5’末端の2〜20ヌクレオチドが互いに重複しているが、標的分子上の反対対側のDNA鎖を開始させる。開始サイトは標的分子配列上の操作点またはその近傍に選択できる。重複プライマーの両方で、重複配列の側面に接する3’ヌクレオチドはデオキシウリジン(U)にすることができる。好ましくは、重複しているヌクレオチド配列は2つ折の対称軸を有せず、自己相補性がないことである。操作点における標的DNAの配列が重複のための適切な開始配列を提示しないところでは、配列変更を導入し、必要なAまたはCを、例えば、第3位の縮重コドンに入れることができる。
標的分子は、(P1+P3)および(P2+P4)のプライマー対を使った別々のPCR反応における2つの重複フラグメントとして、Taq DNAポリメラーゼを使って増幅することができる。増幅の結果は2つのフラグメントで、各々のフラグメントの1つの末端は所定の位置(分断サイト)に出来ている。分断サイトでは、各PCRフラグメントは、反対側のDNA鎖にウラシルがある場合を除き、重複した同一のコピーによって側面を接している(図8)。PCRフラグメントは好ましくは精製して、濃度を0.1〜1.0μMに調整する。
3’一重鎖伸長の研磨PCRフラグメント上への生成は、USERTM酵素を用い、デオキシウリジン(U)の3'側および5’側のPCRフラグメントに切込みをいれて生じた短いオリゴヌクレオチドを解離させ、1つの鎖上の5’リン酸と側面を接したフラグメントおよびもう片方の鎖上の3'一重鎖伸長に側面を接したフラグメントを形成させることによって行われる。切込みは、(b)の50μLの反応液に1ユニット(1μL)のUSERTM酵素(実施例2を参照)を追加し37℃で15分間インキュベートすることによって入れることができる。
(c)に述べた相補的一重鎖伸長を有する個々のPCRフラグメント調製物を、等モル量で混合する。1μLのT4 DNAリガーゼをPCRフラグメントの混合液に添加し、室温で30分間インキュベートしてPCRフラグメントを会合させる。つぎに、会合反応液の1/20量を取出しアガロースゲル上で泳動させ会合効率を調べる。もし会合収率が満足できるようなら、80℃で20分間加熱してT4DNAリガーゼを失活させる。
会合生成物は、外側のP3およびP4プライマーに組込まれた配列を認識する適切な制限エンドヌクレアーゼで消化され、同一または相当する制限エンドヌクレアーゼであらかじめ切断してある最適ベクターに、ゲル精製および標的フラグメントの会合を含む従来のプロトコルを使ってクローニングされる。代わりに、実施例3および4に従って、会合生成物をベクターに導入することができる。
キットの成分表
10倍T4 DNAリガーゼ用バッファー、500μL;
10mM dNTP溶液、100μL;
DNAポリメラーゼI,ラージ(クレノウ)フラグメント,20μL(5ユニット/μL);
USERTM酵素、10μL(1ユニット/μL);
T4 DNAリガーゼ、20μL(400ユニット/μL);
使用説明書
2つのプライマー対、P1/P4およびP2/P3、の設計とそのhincIIRエンドヌクレアーゼ遺伝子修飾への使用を図32に示した。プライマーP1ではコドンCAAの代わりにコドンTTTをコードさせた。hincIIR遺伝子の420bpおよび380bpのフラグメントをTaq DNAポリメラーゼとそれぞれのプライマー対であるP1/P4およびP2/P3を使って増幅した。それぞれのPCR反応液の総量は100μLずつ6本である。増幅の後、6個の同一反応のPCR生成物をまとめ、フェノール・クロロフォルム抽出およびアルコール沈殿で精製した後、50μLのTEバッファーに溶解した。DNA濃度の決定はゲル電気泳動で行い、それぞれのPCRフラグメントは0.2mg/mLと推定された。2つの50μLスケールの反応を次のように準備した:
380bpまたは420bpのPCRフラグメント、25μL(〜20pmol)
10倍濃度 T4 DNAリガーゼバッファー、5μL
10mM dNTPs、1μL
Milli−QTM 水、18μL
クレノウ・フラグメント、1μL(5ユニット)
2つのプライマー対、P1/P4およびP2/P3、の設計と、制限サイトの挿入およびpUC19から一つの配列の削除におけるそれらの使用を図33に示した。pUC19上の開始プライマーのP1およびP2は削除される18bpの配列で隔てられている。6bp長の重複領域を作るために、P1およびP2プライマーの5’末端に6ヌクレオチドの挿入配列を補足し、これが同時にBsrGIおよびAvrII制限サイトを作り出している。pUC19の2つのフラグメント(610bpおよび810bp)はTaq DNAポリメラーゼとそれぞれプライマー対のP1/P4およびP2/P3を使って増幅させた。同じ100μLのPCR反応を6系列実施した。増幅後、PCR生成物を(それぞれのフラグメントに分けて)一緒にし、フェノール・クロロフォルム抽出およびアルコール沈殿により精製した後、50μLのTEバッファーに溶解した。610bpのPCRフラグメントの濃度は0.15mg/mL(0.38pmol/μL)であり、810bpフラグメントの濃度は0.3mg/mL(0.57pmol/μL)であった。末端研磨反応(100μL)を次のように準備した:
Milli−QTM 水、62μL
610bpフラグメント、15μL(5.7pmol)
810bpフラグメント、10μL(5.7pmol)
10倍濃度T4 DNAリガーゼバッファー、10μL
10mM dNTPs、2.0μL
クレノウ・フラグメント、1.0μL(5ユニット)
2つのプライマー対、P1/P4およびP2/P3、の設計と、エンドヌクレアーゼ遺伝子構築におけるそれらの使用を図34に示した。P1およびP2プライマーの7ヌクレオチド長の重複配列には、EndoVIII遺伝子の最後の2ヌクレオチドおよびMxe Intein遺伝子の最初の5ヌクレオチドが含まれる。800bpのEndoVIII遺伝子はE.coliのゲノム(染色体)DNAからTaq DNAポリメラーゼとプライマー対のP2/P3を用いて増幅させた。265bpのMxe Intein遺伝子の5’末端フラグメントはpTXB1からTaq DNAポリメラーゼとプライマー対のP1/P4を用いて増幅させた。それぞれのPCRの増幅反応は100μLずつ6本のチューブで行った。
Milli−QTM 水、4μL
800bpフラグメント、10μL(2pmol)
265bpフラグメント、20μL(6pmol)
10倍濃度T4 DNAリガーゼバッファー、4μL
10mM dNTPs、1.0μL
クレノウ・フラグメント、1.0μL(5ユニット)
突然変異体遺伝子の構築と突然変異体遺伝子のベクターへの挿入の実験的図式を図35に示した。図35(a)は望ましい生成物の略図で、本実施例の生産物である。4個のプライマー対、P1/P2,P3/P4,P5/P6およびP7/P8は、図35(b)に表示した通りであり、相当する3組の重複プライマー、P2/P3,P4/P5,P6/P7が含まれる。
10倍T4 DNAリガーゼバッファー、5μL
10mM dNTPs、1.0μL
クレノウ・フラグメント、1.0μL(5ユニット)
Milli−QTM 水、28μL
PCR1,15μL(44pmol)
(または、PCR2、15μL(20pmol))
(または、PCR3、15μL(18pmol))
(または、PCR4、15μL(20pmol))
サイレント突然変異と組合せたhAP1遺伝子の組立ての実験的図式を図36に示した。図36(a)は、ヒトAP1エンドヌクレアーゼ遺伝子のcDNAの略図である。5個のプライマー対、P1/P2,P3/P4、P5/P6、P7/P8およびP9/P10は、図36(b)に表示した通りであり、それぞれ4組の重複プライマー、P2/P3、P4/P5、P6/P7、P8/P9が含まれる。
50μLスケールの反応を次のように準備した:
10倍T4 DNAリガーゼバッファー、5μL
10mM dNTPs、1.0μL
クレノウ・フラグメント、1.0μL
PCR1、またはPCR2、またはPCR3、またはPCR4,またはPCR5,40μL(4pmol)
Milli−QTM 水、全量を50μLにする量
PCR1:PCR2:PCR3:PCR4:PCR5=4:1:1:1:3
ここで用いた部位特異的突然変異を作る実験的取組み方の概略を図37に示した。2つのPCRプライマー対は図37に表記した通りである。重複プライマーのP1およびP2は、93番目のコドンのGTC(バリンをコード)からCAA(グルタミンをコード)への変化を含んでいる。プライマーP1には2個のヌクレオチド変更がある。すなわち、TCがAAで置換されている。プライマーP2には3個のヌクレオチド変更がある。すなわち、GACがTUGで置換されている。プライマーP3およびP4の5’末端には、直鎖状pNEB205Aベクター上の一重鎖伸長(実施例2を参照)に適合性のある新たな8ヌクレオチドが補足された。9oNmポリメラーゼ遺伝子の2041bpおよび287bpのフラグメントは、TaqI DNAポリメラーゼとそれぞれのプライマー対P1/P4およびP2/P3を用いて増幅した。それぞれのPCRの反応液量は100μLであった。組立て反応は次のように準備した:
287bpPCRフラグメント、1μL(0.1pmol)
2041bpPCRフラグメント、10μL(0.1pmol)
pNEB205A 直鎖状ベクター(20ng)、1μL
10mM dNTPs、2.0μL
USERTM酵素、1.0μL(1ユニット)
Pseudomonas alcaligenes NEB#545(New England Biolabs、Inc.,ビバリー、マサチューセッツ州、米国)から得られるスーパーインテグロンの、contig C(Vaisvila,et al.,Mol.Microbiol.,42:587−601(2001))の下流にある未知3’ゲノム領域をクローニングするために用いた方法の概略を図38に示した。
94℃ 4分
94℃ 30秒
57℃ 1分 1サイクル
72℃ 1分
94℃ 4分
94℃ 30秒
57℃ 1分 1サイクル
72℃ 1分
72℃ 5分
Claims (62)
- (a)二重鎖核酸上のA、T、G及びCからなる群より選ばれる塩基からなる特定の塩基配列を認識して二重鎖核酸の一重鎖のみを特定の位置で切断するエンドヌクレアーゼ(以下、配列特異的切込みエンドヌクレアーゼという)によって認識され切断される配列(以下、切込みサイトという)を少なくとも一つ有し、及び配列特異的制限エンドヌクレアーゼによって認識され切断される少なくとも一つの配列特異的制限サイトを有する二重鎖核酸でなるカセットを2本鎖ポリヌクレオチド分子の所定の部位に挿入し;
(b)カセット内の切込みサイトに特異的な切込みエンドヌクレアーゼで、及びカセット内の制限サイトに特異的な制限エンドヌクレアーゼによってカセット内のポリヌクレオチド分子を切断し;並びに
(c)切込みサイトと制限サイト間で切断されたポリヌクレオチド分子の解離を可能にして望ましい長さと配列構造を有する一重鎖伸長を生成させる;
ことを含んで成るポリヌクレオチド分子上に望ましい長さと配列構造を有する、14ヌクレオチドより少ない長さの一重鎖伸長を生成する方法。 - カセットが1つの切込みサイトおよび1つの制限サイトを含む、請求項1に記載の方法。
- カセットが、切込みサイトの隣接する位置に1つの制限サイトを含む、請求項1に記載の方法。
- カセットが、2つの一重鎖伸長を生成するために、2つの切込みサイトの間に位置した2つの制限サイトを含む、請求項1に記載の方法。
- スペーサー配列が2つの制限サイトの間に位置する、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- スペーサー配列がマーカーをコードする、請求項5に記載の方法。
- マーカーが、毒素、薬剤耐性因子、酵素、抗原、蛍光物質、およびsiRNAから選択される、請求項6に記載の方法。
- カセットの構造が一重鎖伸長の構造を決定する、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- カセットが、5ヌクレオチドを超える長さを有する、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 2つの切込みサイトが、互いに逆向の配列で配向している、請求項3または4に記載の方法。
- カセット内の1個以上の切込みサイトと1個以上の制限サイトの間の所定の配列が、望ましい一重鎖伸長の構造に従って選択される、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 2本鎖ポリヌクレオチド分子が2本鎖DNAである、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 2本鎖ポリヌクレオチド分子が宿主細胞内で複製できるレシピエント分子である、請求項12に記載の方法。
- レシピエント分子がベクターである、請求項13に記載の方法。
- ベクターが、pNEB205A、pNEB200A、pNEB210,及びpUC−TTから選択される、請求項14に記載の方法。
- 制限サイト内の切断部位から14ヌクレオチドより少ない位置に切込みサイト内の切断部位を有し、ポリヌクレオチド分子内に挿入できる2本鎖DNAを含んで成るカセットであり、カセット内の制限サイトがポリヌクレオチド分子内には存在しない、請求項1から15のいずれかに記載の方法に用いられるカセット。
- 2本鎖DNAが1つの切込みサイトと1つの制限サイトを有する、請求項16に記載のカセット。
- 2本鎖DNAが2つの切込みサイトと1つの制限サイトを有する、請求項16に記載のカセット。
- 2本鎖DNAが、2つの3'または5’の一重鎖伸長を生成するために、2つの切込みサイトの間に位置した2つの制限サイトを有する、請求項16に記載のカセット。
- 2本鎖DNAが、2つの制限サイトの間にスペーサー配列を有する、請求項16又は19に記載のカセット。
- スペーサー配列がマーカーをコードする、請求項20に記載のカセット。
- マーカーが、毒素、薬剤耐性因子、酵素、抗原、蛍光物質、およびsiRNAから選択される、請求項21に記載のカセット。
- 2本鎖DNAが、5ヌクレオチド以上の長さを有する、請求項16から22のいずれかに記載のカセット。
- 2つの切込みサイトが2本鎖DNA内で互いに逆向の配列で配向している、請求項18又は19に記載のカセット。
- 2本鎖DNA内の1個以上の切込みサイトと1個以上の制限サイト間の配列が事前に定められたものである、請求項16から24のいずれかに記載のカセット。
- 請求項16から25のいずれかに記載のカセットのいずれかを含んで成り、宿主細胞内で複製可能なポリヌクレオチド分子。
- pNE205A、pNEB200A、pNEB210A及びpUC−TTから選択されたベクターを含んで成る、請求項26に記載のポリヌクレオチド分子。
- 少なくともDNAグリコシラーゼ及び一重鎖切断酵素を含む2種以上の酵素からなる混合物であって、当該混合物中のDNAグリコシラーゼの活性比率が一重鎖切断酵素の少なくとも2倍であり、かつ、前記DNAグリコシラーゼによって切除され得る修飾複素環式塩基を有するヌクレオチドからなる修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチド分子から切除する能力のある混合物からなる、5’末端から14ヌクレオチドより少ない特定の部位に前記修飾ヌクレオチドが挿入されたポリヌクレオチド分子上に一重鎖伸長を生成するのに用いるための切込み剤。
- 少なくとも1つの一重鎖切断酵素が、修飾ヌクレオチドが切除された後のポリヌクレオチド分子に5’リン酸を生じさせる、請求項28に記載の切込み剤。
- 一重鎖切断酵素がFPGグリコシラーゼ/APリアーゼおよびEndoVIIIグリコシラーゼ/APリアーゼから選択される、請求項28又は29に記載の切込み剤。
- 少なくとも1つの一重鎖切断酵素が、修飾ヌクレオチドを切除した後のポリヌクレオチド分子に3’OHを生じさせる、請求項28に記載の切込み剤。
- 一重鎖切断酵素が、EndoIVエンドヌクレアーゼである、請求項28又は31に記載の切込み剤。
- 複数の一重鎖切断酵素が、修飾ヌクレオチドを切除した後のポリヌクレオチド分子に5’リン酸と3’OHを生じさせる、請求項28に記載の切込み剤。
- 複数の一重鎖切断酵素が、(i)EndoIVエンドヌクレアーゼとEndoVIIIグリコシラーゼ/APリアーゼ、および(ii)EndoIVエンドヌクレアーゼとFPGグリコシラーゼ/APリアーゼから選択される、請求項28又は33に記載の切込み剤。
- 修飾ヌクレオチドが、デオキシウリジン(U)、8−オキソ−グアニン、又はデオキシイノシンから選ばれる、請求項28に記載の切込み剤。
- 2つ以上の酵素が、UDGグリコシラーゼおよびEndoIVエンドヌクレアーゼである、請求項28、31、32又は35のいずれかに記載の切込み剤。
- 2つ以上の酵素が、UDGグリコシラーゼおよびFPGグリコシラーゼ/APリアーゼである、請求項28,29,30、又は35のいずれかに記載の切込み剤。
- 2つ以上の酵素が、AlkAグリコシラーゼおよびEndoIVエンドヌクレアーゼである、請求項28,31、又は35のいずれかに記載の切込み剤。
- 2つ以上の酵素が、UDGグリコシラーゼおよびEndoVIIIグリコシラーゼ/APリアーゼである、請求項28、29又は35のいずれかに記載の切込み剤。
- 2つ以上の酵素が、UDGグリコシラーゼ、EndoIVエンドヌクレアーゼおよびEndoVIIIグリコシラーゼ/APリアーゼである、請求項28、33、又は35のいずれかに記載の切込み剤。
- 2つ以上の酵素が、UDGグリコシラーゼ、EndoIVエンドヌクレアーゼおよびFPGグリコシラーゼ/APリアーゼである、請求項28,33,又は35のいずれかに記載の切込み剤。
- 2つ以上の酵素が、AlkAグリコシラーゼおよびEndoVIIIグリコシラーゼ/APリアーゼである、請求項28,29、又は35のいずれかに記載の切込み剤。
- 2つ以上の酵素が、AlkAグリコシラーゼおよびFPGグリコシラーゼ/APリアーゼである、請求項28、29、又は35のいずれかに記載の切込み剤。
- (a)標的分子のプライマー対依存性DNA増幅により生成させたポリヌクレオチド分子の5’末端から14ヌクレオチドより少ない特定の部位に、DNAグリコシラーゼによって切除され得る修飾複素環式塩基を有するヌクレオチドからなる修飾ヌクレオチドを挿入し;
(b)請求項28から43のいずれかに記載の切込み剤によって修飾ヌクレオチドの位置でポリヌクレオチド分子を切断し;および
(c)望ましい長さと配列構造を有する一重鎖伸長を生成するために末端配列を解離する;
ことを含んで成るポリヌクレオチド分子上に望ましい長さと配列構造を有する方法。 - プライマー対の各プライマーが修飾ヌクレオチドを含む、請求項44に記載の方法。
- プライマー対の1つのプライマーが修飾ヌクレオチドを含む、請求項44に記載の方法。
- ポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長が、第2のポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長と相補的である、請求項44から46のいずれかに記載の方法。
- 請求項44から47のいずれかに記載の方法により製造された望ましい長さと配列構造を有する一重鎖伸長を有する2つのポリヌクレオチド分子を会合させることによって標的分子内に部位特異的突然変異を作製する方法であって、
(a)標的分子を増幅するための2組のプライマー対を選択し、そのうちの第1のプライマー対が第1の増幅生成物を作り、第2のプライマー対が第2の増幅生成物を作る。第1および第2各々のプライマー対に含まれる1つのプライマーには、DNAグリコシラーゼによって切除され得る修飾複素環式塩基を有するヌクレオチドが含まれ、それらプライマーの配列は5’末端が互いに相補的である。これらプライマーの一つまたは両方は5’配列に任意の突然変異を含み、標的分子に対して相補的または非相補的となる;
(b)(a)の第1および第2プライマー対を用いて標的分子を増幅し、第1および第2ポリヌクレオチド分子を形成させる;
(c)請求項28から43のいずれかに記載の切込み剤によって第1および第2ポリヌクレオチド分子を修飾ヌクレオチドの位置で切断する;
(d)第1および第2ポリヌクレオチド分子上の切込みと5’末端の間を解離させ、第2のポリヌクレオチド分子の一重鎖伸長と相補的な一重鎖伸長を、第1ポリヌクレオチド分子上に産生させる;および
(e)第1および第2ポリヌクレオチド分子上の互いに相補的な一重鎖伸長を介して再会合させ、部位特異的突然変異を有する標的分子を形成させる;
ことを含んで成る標的分子内に部位特異的突然変異を作製する方法。 - 修飾ヌクレオチドに隣接する5’末端の配列が標的分子と相補的でない、請求項48に記載の方法。
- 部位特異的変異が1個以上のヌクレオチドの改変である、請求項48に記載の方法。
- 部位特異的変異が挿入ヌクレオチド配列である、請求項48から50のいずれかに記載の方法。
- 5’配列がGGAGACAU、GGGAAAGU,ACGAGACU、ACCAGACUおよびGGGGG(8−oxo−G)からなる群から選択され、かつ標的分子の5’末端と同じ配列に隣接することを特徴とするオリゴヌクレオチドからなる、請求項44から47のいずれかに記載の方法に用いられる標的分子の開始に適切なプライマー。
- (a)複数のポリヌクレオチド分子それぞれの一端または両端に、請求項1の方法を用いて一重鎖伸長を生成させ、1つのポリヌクレオチド分子上の少なくとも1個の一重鎖伸長が別のポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長と相補的であるようにする;および
(b)複数のポリヌクレオチド分子が連結して1つの分子を形成する;
ことを含んで成る、複数の直鎖状ポリヌクレオチド分子を連結して1つの分子を形成させる方法。 - (a)複数のポリヌクレオチド分子それぞれの一端または両端に、請求項44の方法を用いて一重鎖伸長を生成させ、1つのポリヌクレオチド分子上の少なくとも1個の一重鎖伸長が別のポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長と相補的であるようにする;および
(b)複数のポリヌクレオチド分子を連結させて1つの分子を形成する:
ことを含んで成る、複数の直鎖状のポリヌクレオチド分子を連結して1つの分子を形成させる方法。 - (a)請求項1の方法を用いてレシピエント分子の第1および第2末端に、第1および第2の、互いに同じかまたは違う、一重鎖伸長を生成させる;
(b)請求項44の方法を用いて標的分子の末端に、レシピエント分子上の第1および第2の一重鎖伸長と相補的な一重鎖伸長を生成させる;および
(c)レシピエント分子と標的分子を会合させて1つの分子を形成する;
ことを含んで成る標的分子をレシピエント分子に挿入する方法。 - 標的分子が、請求項54に記載の複数のポリヌクレオチド分子の連結の産物である、請求項55に記載の方法。
- 複数のポリヌクレオチド分子がエクソンを含んで成る、請求項56に記載の方法。
- 請求項28から43のいずれかに記載の切込み剤および直鎖状ベクターから成る、標的分子をベクターにクローニングするためのキット。
- さらに3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを含んで成る、請求項58に記載のキット。
- さらにT4DNAリガーゼを含んで成る、請求項58又は59に記載のキット。
- さらに少なくとも一つの配列決定プライマーを含んで成る、請求項58から60のいずれかに記載のキット。
- 請求項55から57のいずれかに記載の方法により標的分子が挿入されているレシピエント分子を有する宿主細胞。
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