JP2000509241A - グリコシラーゼによる候補座位のヌクレオチド配列の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 標的核酸試料中の候補座位における特定の核酸配列の有無を迅速に検出する方法は、i）ＤＮＡグリコシラーゼの基質である修飾塩基を前記候補座位の一つまたはそれ以上の事前選択された部位に導入し、ii）非塩基部位を生成するために前記ＤＮＡグリコシラーゼによって修飾塩基を切除し、iii）工程ii）で生成した非塩基部位のリン酸結合を切断し、iv）前記標的核酸配列中の前記候補座位における前記特定の核酸配列の有無を同定するために工程iii）の切断産物を解析することを含む。本法はＤＮＡ中の既知の多数の変異の検出を含むＤＮＡ試料中の特定の変異の検出に特に適用される。大量の試料の処理をが迅速・簡便に達成することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 グリコシラーゼによる候補座位のヌクレオチド配列の検出 技術分野 本発明は、標的核酸試料中の候補座位の特定の核酸配列の存在の有無を迅速 に検出するための方法に関する。特に、本発明はＤＮＡ試料における特定の突然 変異を検出するための方法に関する。 背景となる技術 標的核酸試料中の候補座位の特定の核酸配列の検出は、遺伝性障害および感 染性疾患の診断に関していくつかの理由で非常に重要である。多くの異なる突然 変異を検出することは、特定の遺伝的障害の存在をスクリーニングするために必 要である。増幅したＤＮＡ試料において特定の配列を検出することにより、注目 をする生物そして特に感染性の生物を検出するための近年のＤＮＡ診断方法が顕 著に改善される。候補座位における配列の検出に関する近年の技術は、扱いにく く、特異性に欠け、最適化および使用が困難であるか、または試料の量が多くな ると、適応性が乏しいかのいずれかである。 標的核酸試料中の候補座位の特定の核酸試料を検出するための既知の方法が いくつかある。これらの方法の詳細を以下に述べる。 １）制限酵素解析 制限酵素解析による特定のＤＮＡ配列の検出。制限酵素は特定のＤＮＡ配列 を切断する。例えば、ＥｃｏＲＩ酵素は、二本鎖ＤＮＡをＧＡＡＴＴＣの配列で 切断する。従って、特定のＤＮＡ試料中の候補座位がＥｃｏＲＩで切断されるか を確認することによって、候補座位にＧＡＡＴＴＣ配列が存在するか存在しない かを決定できる。候補座位の制限部位の出現または消失によって、候補座位の配 列中で１つまたはそれ以上の塩基配列が変化したことが示唆される。従って、候 補座位における制限部位の出現または消失は、各々の制限部位のいずれかの塩基 または複数の塩基 の変化を含みうる。それゆえ、候補座位における制限部位の出現または消失から は、研究者は厳密な配列変化知り得ない。しかし、候補座位における特定の配列 を検出するための制限酵素の使用にともなういくつかの問題点がある。これには 以下を含む： a）候補座位における特定の配列の存在の有無は、一般に制限部位に起こらない ； b）異なる制限酵素は異なる認識配列を持つため、異なる制限酵素が、一般に異 なる候補座位における特定の配列の存在の有無を検出するために必要である；そ して c）異なる酵素は異なる候補座位における特定の配列の存在の有無を検出するた めに必要であるために、量が大量になると、この手法により遂行することは困難 になり、かつ自動化は困難である。 ２）ＤＮＡシーケンス ＤＮＡシーケンスは、いかなる候補座位の特定の配列も検出可能である。Ｄ ＮＡシーケンスの主要な方法は、ジデオキシ法またはチェーンターミネーション 法としても知られているサンガー法（Sanger，F.およびCoulson，A.R.(1975)J.M ol.Biol．94,444-448）、および化学法としても知られているマキサム・ギルバ ート法（Maxam，A.M.およびGilbert,W.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,560-5 64）である。 ＤＮＡシーケンスは特定の候補座位に特定の配列が存在するかまたは存在しな いかを決定する究極的な手法であるが、以下のようないくつかの好ましくない点 がある： a）異なる候補座位における特定の配列の存在の有無を日常的に検出するにはや っかいで困難な方法である； b）与えられた候補座位における特定の配列の存在の有無を決定するためにはフ ルサイズのシーケンスゲルが必要である； c）解析に使用するＤＮＡ試料は、質の高いＤＮＡ配列を得るために高品質であ ることが必要がある； d）直接増幅したＤＮＡ試料のＤＮＡシーケンスは一般に問題点が多い； e）シーケンスゲルはしばしば解読困難でありうる； f）高い成功率で大量に読むことは達成困難である； g）ＤＮＡ配列の中には他と比較して入手困難であるものもある；そして h）候補座位における特定の配列の存在の有無を検出するために、多くの異なる 大きさのＤＮＡ断片を解読することが必要である。 ３）ウラシル干渉 増幅したＤＮＡ分子中にウラシルをランダムに低レベルでとりこませる方法 が示された。これは、通常のＤＮＡ前駆体ヌクレオチドおよびｄＵＴＰの存在下 においてＤＮＡを増幅することによって行われる。ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰの比 率を選択し、それにより増幅過程においてｄＴＴＰがアデニン残基の反対に高頻 度で取り込まれるのに対して、ｄＵＴＰが鋳型鎖のアデニン残基の反対側に時々 取り込まれる。この結果、増幅分子の中全体に、低量のウラシル残基がランダム に分布している産物の母集団が得られる。ウラシルグリコシラーゼで増幅産物を 処理し、非塩基部位（abasic）を切断することで、結果的にウラシル残基が取り 込まれた位置で分子が切断される。ウラシルがアデニン残基の反対側に低レベル でランダムに取り込まれるために、異なる分子はウラシル残基が取り込まれた場 所に依存して切断される。従って、増幅過程において使用したプライマーのうち ひとつを標識して、ＤＮＡシーケンスゲルですべての切断産物を分離すれば、増 幅したＤＮＡ試料の片側鎖に取り込まれたウラシルの位置の総数を決定すること が可能である(Tu，W.T.およびStruhl，K．Nuc．Acids Res.,(1992)20,771-775.D evchand，P.R.ら,Nuc.Acids Res.(1993)21,3437-3443)。 概要を示した手法の主な応用は、ＤＮＡフットプリントである（特定のタン パク質が結合するＤＮＡの塩基を同定するために使用する方法）。 ウラシル取込み法は、増幅したＤＮＡ試料におけるウラシル残基の総数の位 置を決定するのに使用可能である。しかし、 a）特定の候補座位におけるウラシル残基を迅速に検出するのにはやっかいで困 難な方法である； b）特定の候補座位におけるウラシル残基を決定するためには、フルサイズのシ ーケンスゲルが必要である； c）シーケンスゲルはしばしば解読/読みとりが困難である；そして d）特定の候補座位におけるウラシル残基を検出するのに、多くの異なる大きさ のＤＮＡ断片を解読することが必要である。 ４）ミスマッチヌクレオチドグリコシラーゼの使用 ミスマッチヌクレオチドグリコシラーゼを使用した２例は、点突然変異の検 出について報告している(Lu，A-LおよびShu，I-C,Genomics（1992）14，249-255 およびHsu，I-Cら、Carcinogencsis（1994）14，1657-1662)。問題のグリコシラ ーゼは、一般的なグリコシラーゼ活性およびＧ/Ｔミスマッチを切断するヒトチ ミジンＤＮＡグリコシラーゼにより、Ａ/Ｇミスマッチのミス対合したアデニン を効率的に解離させ、Ａ/Ｃミスマッチのミス対合したアデニンを非効率的に解 離させるE．coliのＭｕｔＹ遺伝子産物である。これらの酵素は、ミスマッチが 存在する増幅したヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子中の変異を検出するのに使用されてき た。増幅反応に使用したプライマーのうちひとつを標識することで、グリコシラ ーゼ処理、非塩基部位（abasic）での切断、そしてゲル電気泳動で断片を解読し た後にミスマッチの位置を検出することが可能である。 この方法には以下に述べるいくつかの問題点がある： a）この方法は、問題のある場所でミスマッチ塩基対が形成さているヘテロ二本 鎖分子が形成されることに依存する。従って、ホモ接合体である試料における変 異の検出には、外部のプローブを提供する必要があり、そしてミスマッチを生じ るようなハイブリダーゼーションを行った； b）この方法は、ミスマッチの位置を検出することは可能であるが、ミスマッチ 部位の配列は必ずしも検出することができない；そして c）すべてのミスマッチが等しい効率で認識されるとは限らない。 ５）ミスマッチ塩基対の切断に基づく他の方法 ミスマッチ塩基対の切断に基づく他のいくつかの方法が、点突然変異、欠失 変異および挿入変異を検出することについて示されている。これらは、ミスマッ チ塩基対部位の化学的な切断、ゲル電気泳動でホモ二本鎖分子が迅速に移動する のに対してヘテロ二本鎖はゆっくりと移動することに基づいたヘテロ二本鎖の検 出を含む。ＲＮＡ:ＤＮＡハイブリッドにおけるミスマッチのＲＮＡse切断およ び酵素的手段によるミスマッチの切断。 上述のすべての方法により、ヘテロ二本鎖における変異を検出でき、核酸分 子内のおよその変異の位置を決定することが可能である（試料中の突然変異の存 在の情報を与えるだけのヘテロ二本鎖電気泳動遅延法の場合を除く）。しかし、 これらの方法は、ヘテロ二本鎖の場合にのみ機能し、候補座位に特定の配列が存 在することについて推測（演繹）することは不可能である。 ６）リガーゼ連鎖反応 リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、候補座位における特定の標的配列の存在の 有無を決定するために使用可能なプローブ増幅方法である。これは、変性した標 的ＤＮＡ鎖上に互いに隣り合ってハイブリダイゼーションする２対のオリゴヌク レオチドを結合させるＤＮＡリガーゼ酵素を使用する。酵素は２つのオリゴヌク レオチド間にホスホジエステル結合を形成させ、それによって結合部位のオリゴ ヌクレオチドが鋳型に正確にハイブリダイゼーションするようになる。従って、 結合部位においてオリゴヌクレオチドと標的配列との間で正確に対合すると、オ リゴヌクレオチドがライゲーションして結果として両方のオリゴヌクレオチドを 相加した大きさの大きな産物を形成することができる。アニーリング、ライゲー ションおよび変性を何回も繰り返すと、結果としてより大きな産物が対数的に増 幅する。従って、より大きな産物が存在しない場合には、オリゴヌクレオチド配 列および鋳型ＤＮＡ配列の間に相違があるということを意味する一方、より大き な産物の検出は、候補座位に配列が存在することを示唆する。 この方法は候補座位の特定の配列を検出するための潜在力は高く、大量の試 料を処理することも可能であるが、候補座位に特定の配列が存在することについ て推測（演繹）することが不可能である。加えて、この方法は過程を最適化する ためにかなりの努力が必要である。 ７）ＡＲＭＳ法 ポリメラーゼ連鎖反応において使用する適切なプライマーを設計することに よって、候補座位の特定の配列の存在の有無を検出することが可能である。増幅 耐性法（ＡＲＭＳ）としてして知られているこの方法では、プライマーの3'末端 と標的配列が完全に一致する場合にのみ標的配列の増幅が起こるようなプライマ ーを設計する。従って、プライマーのうちひとつが標的試料の与えられた配列に 相補的で、相手となるプライマーの3'末端が候補座位の野生型配列に相補的であ るように１対のプライマーを設計した場合に、この１対のプライマーは、候補座 位に野生型配列が存在する場合にのみ増幅産物をつくりだしうる。3'末端が候補 座位の突然変異配列に相補的であるように第３のプライマーを設計した場合、標 的試料の与えられた配列に相補的なプライマーと共に使用した場合には、このプ ライマーにより候補座位に変異配列が存在する場合には増幅産物が生産される。 この方法による問題点は以下のようである： a）候補座位に野生型または変異配列が存在するかを決定するために３つのプラ イマーが必要である； b）この方法により候補座位に特定の配列が存在することを推測（演繹）するこ とは不可能である；および c）ＡＲＭＳ法のアニーリング条件は厳密でなければならず、したがってこの方 法を多くの場合に転用することは困難であり、また調べる各々の変異について、 最適化しなければならない。 従って、核酸診断分野において、迅速に大量の試料について候補座位の特定 の配列を検出するためのしっかりした方法が必要である。 発明の説明 本発明は、以下の工程を含む標的核酸試料における候補座位の特定の核酸配 列の存在の有無を迅速に検出するための方法を提供する： i）前記候補座位の中の１つまたはそれ以上のあらかじめ選択した位置へ、ＤＮ Ａ グリコシラーゼの基質である修飾塩基を導入し； ii）非塩基部位（abasic）を作成するために前記ＤＮＡグリコシラーゼにより修 飾塩基を切断し； iii)工程ii)において生じた非塩基部位(abasic)のリン酸結合を切断し；および iv）前記標的核酸配列中の前記候補座位における前記特定の核酸配列の存在の有 無を特定するための工程iii）の切断産物を解析すること。 本発明による方法は、単一の酵素および単一の工程がＤＮＡにおける多くの 既知の変異を検出するために使用可能である現在知られている方法よりも、顕著 な利点を提供する。従って、大量の試料も、本明細書の以下に例示するように迅 速に容易に処理可能である。 本発明にしたがった方法により、遺伝子変異のような特定の配列が本明細書 中において”候補座位”として既知の特定の位置に存在するか否かを決定するた めに標的核酸を調べることが可能である。 好ましくは、候補座位は正常なＤＮＡ前駆体ヌクレオチドおよび少なくとも １つの修飾前駆体ヌクレオチドを使用して増幅する。 本明細書中において使用した”増幅”という用語は、単一のまたは複数種の ヌクレオチド配列のコピー数を増幅させるin vitroにおける過程のことである。 標的試料の増幅により、結果として増幅されるＤＮＡへ前駆体ヌクレオチドが取 り込まれる。一般的には、標的試料の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） にて適切なプライマーを使用して行う。標的試料の増幅は、リガーゼ連鎖反応（ ＬＣＲ）および短いＰＣＲ工程を使用した変形ＬＣＲ（ＰＬＣＲ）を使用しても 、行うことができる。ＤＮＡ増幅過程の場合における前駆体ヌクレオチドは、本 明細書中で”正常な”ＤＮＡ前駆体ヌクレオチドとして述べたデオキシリボヌク レオチドであるｄＡＴＰ,ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰとして述べる。本明 細書中で使用した修飾前駆体ヌクレオチドは、核酸中に取り込まれた後ＤＮＡグ リコシラーゼ酵素によって認識される基質の単一または複数の塩基（グリコシラ ーゼ基質塩基）を形成することができる修飾された単一または複数のヌクレオチ ドである。 増幅は一般的には、正常なＤＮＡ前駆体ヌクレオチドおよび１つまたはそれ 以上の修飾前駆体ヌクレオチドを使用して、結果として修飾前駆体ヌクレオチド が正常な前駆体ヌクレオチドの一つに置換されるような標的核酸試料を増幅する ことに関する。増幅産物中への修飾前駆体ヌクレオチドの取込みにより、１つま たはそれ以上の位置に増幅産物中でＤＮＡグリコシラーゼ酵素によって認識され る１つまたはそれ以上のグリコシラーゼ基質塩基を生成する。標的核酸試料のす べてまたは一部の候補座位に特定の配列が存在するかもしれないし、または標的 核酸試料には存在しないかもしれない。 さらに好ましくは、すくなくともひとつの増幅用プライマーは候補座位に隣 接して位置している。 従って、増幅の目的に適したプライマーは、プライマーのうちひとつが候補 座位に隣接した位置に（本明細書中においては”隣接プライマー”と呼ぶ）存在 し、増幅過程のあいだ、伸長する隣接プライマーへの最初の修飾前駆体ヌクレオ チドの取込みの位置が、候補座位に存在する特定の配列に従って候補座位または 候補座位から離れている場所になるように設計する。本明細書中において使用し た１対のプライマーのうちもうひとつのプライマーは、本明細書中にて後に定義 するように”末端プライマー”と呼ぶ。 修飾前駆体ヌクレオチドが候補座位にのみ取り込まれるか、またはまったく 取り込まれないように隣接および末端プライマーを設計すると、増幅した標的核 酸試料中に特定の配列が存在するかまたはしない場合にも、グリコシラーゼの標 的塩基を持つ標的鎖が切断されて２つの断片になる。 標的試料の標的鎖の増幅は、標的核酸試料の相補的な標的鎖の相補領域にア ニーリングする隣接したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行うことが可 能である。増幅過程において隣接プライマーのプライマー伸長を行うと、5'から 3'方向に前駆体ヌクレオチドおよび修飾前駆体ヌクレオチドが取り込まれる結果 となる。増幅過程において隣接プライマーの伸長によって生成される増幅ＤＮＡ 鎖は、本明細書中において”標的鎖”と呼ぶ。増幅過程においてもうひとつのプ ライマー（本明細書中で”末端プライマー”と呼ばれている）の伸長によって生 成される増幅ＤＮＡ鎖は、本明細書中において”相補的な標的鎖”と呼ぶ。標的 試料の相補的な標的鎖の増幅は、標的核酸試料の標的鎖の相補領域にアニーリン グする末端オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行うことが可能である。増 幅過程における末端プライマーのプライマー伸長を行うと、5'から3'方向に前駆 体ヌクレオチドおよび修飾前駆体ヌクレオチドが取り込まれる結果となる。標的 配列の両方の鎖の増幅は、隣接および末端プライマーを両方用いて行うことが可 能である。ＰＣＲ過程において、繰返し増幅サイクルを行う。この場合の増幅断 片の大きさは、標的核酸試料の鎖に隣接および末端プライマーがアニーリングす る位置によって決まる。 標的試料における候補座位の突然変異のような特定の配列の検出のためには 、隣接プライマーが候補座位に近接した場所にあり、それにより増幅過程のあい だ、伸長する隣接プライマーへの最初の修飾前駆体ヌクレオチド取込みの位置が 、候補座位に特定の配列が存在するかいないかに従って候補座位または候補座位 の末端の場所になるように、増殖用プライマーを設計する。候補座位の修飾前駆 体ヌクレオチドの取込み位置が望ましい場所であった場合に、プライマー内の塩 基すべてが、プライマー配列に相補的な新規に合成されたＤＮＡ中へのかぎとな る修飾前駆体ヌクレオチドではなくむしろヌクレオチドの優先的な取込みが促進 されるようにプライマーを設計する（鍵となる修飾前駆体ヌクレオチドとは、特 定の配列の存在の有無により、候補座位に取り込まれるべき修飾前駆体ヌクレオ チドをいう。）。例えば、ｄＵＴＰが修飾塩基ヌクレオチドである場合には、シ トシン、グアニン、チミン、イノシンまたはプライマー配列に相補的な新規に合 成されたＤＮＡ中へのウラシル残基の取込みを妨げる修飾塩基（ウラシル以外） によってアデニンを置換するようにプライマーを合成する。ｄＩＴＰが修飾塩基 ヌクレオチドである場合には、グアニン、チミン、アデニン、ウラシルまたはプ ライマ一配列に相補的な新規に合成されたＤＮＡ中へのイノシン残基の取込みを 妨げる修飾塩基（イノシン以外）によってシトシンを置換するようなプライマー を合成する。標的差の候補座位での切断に加えて、プライマー内の特定の点での 切断が望ましいものである場合には、１つまたはそれ以上のグリコシラーゼ基質 塩基がプライマー内の決まった単一または複数の位置に存在するようにプライマ ーを合成する。増幅過程の後に適切なグリコシラーゼでプライマーを処理すると 、単一または複数の特定の位置でプライマーが切断される結果となる。このよう にプライマーを設計すると、候補座位の特定の配列の存在の有無を示唆する標的 鎖の特定の断片 の検出が促進され、望む場合には検出過程で妨害しないような大きさにプライマ ーを小さくできる。 適切には、本発明にしたがって増幅方法を使用する場合には少なくともひと つのプライマーを標識する。増幅過程に先立ってプライマーのうちひとつを標識 しておくと、増幅した標的鎖または相補鎖のみを検出することが可能である。プ ライマーの標識は、プライマーを合成するあいだまたは合成した後にプライマー に放射性物質、蛍光、または検出可能なリガンドを添加することを含むさまざま な方法で行うことが可能である。増幅過程において、標識した前駆体ヌクレオチ ド（すなわち、放射性標識した前駆体ヌクレオチド、または蛍光または検出可能 なリガンド基に結合した前駆体ヌクレオチド）を使用すると、取り込まれた標識 を持つ標的鎖および相補的な標的鎖およびグリコシラーゼによる切断過程によっ て得られたＤＮＡ断片の検出が促進される。銀染色または臭化エチジウム染色の ようなＤＮＡ染色方法により、断片を分離した後に増幅した標的核酸試料のグリ コシラーゼによる切断の結果生じたすべての断片の検出が促進される。あるいは 、標的鎖および相補的な鎖およびグリコシラーゼによる切断の結果として得られ た断片の検出は、適切な核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用して行うこ とが可能である。 修飾塩基は候補座位に存在する塩基を化学的に修飾することによって導入す ることが可能である。 特定のＤＮＡグリコシラーゼ酵素によって認識されるように特定の化学物質 でＤＮＡを処理することで、存在する塩基を修飾するいくつかの方法が存在する 。例えば、メチルニトロソウレアのようなアルキル化試薬でＤＮＡを処理すると 、アルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼで認識され切除されるＮ3-メチルアデニ ンおよびＮ3-メチルグアニンを含むいくつかのアルキル化塩基が生じる。二硫化 ナトリウムでＤＮＡを処理すると、ＤＮＡのシトシン残基の脱アミノ化が起こり ＤＮＡ内にウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより切断することができるウラシル 残基を形成する。 従って、先行技術の知識では、増幅した標的核試料の候補座位に存在する塩 基は、化学的手法によりグリコシラーゼで認識可能な基質に変換可能である。例 えば、候補座位に存在するシトシンは、容易にウラシルに変換できるので、増幅 した試料は候補座位でのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ切断を受けやすくなる。 シトシンではなくて5-メチルシトシンを含むような隣接プライマーを合成した場 合、5-メチルシトシンが脱アミノ化されるとウラシル残基ではなくてチミン残基 を生じるので、プライマーはウラシルＤＮＡグリコシラーゼによる切断に耐性と なりうる。 好ましくは、修飾塩基はＤＮＡグリコシラーゼ酵素により切除（または切断 ）される。 従って、適切には増幅過程の後に、増幅標的試料中に存在するグリコシラー ゼの基質塩基を認識して放出させる適切なＤＮＡグリコシラーゼ酵素で増幅産物 を処理し、結果として増幅した標的核酸試料にプリンやピリミジンがない部位が 生じる。 修飾前駆体抜くレオ利度がｄＵＴＰである場合、グリコシラーゼの基質塩基 であるウラシルが増幅した標的核酸試料に生じうる。試料にウラシルＤＮＡグリ コシラーゼを添加すると、試料からウラシルが放出する。修飾前駆体ヌクレオチ ドがｄＩＴＰである場合、グリコシラーゼの基質塩基であるヒポキサンチンが増 幅した標的核酸試料に生じる。試料にアルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼを添 加すると、試料からヒポキサンチンが放出する。増幅した標的核酸試料からグリ コシラーゼの基質塩基が放出されると、ウラシルの場合にはピリミジンではない 部位およびヒポキサンチンの場合にはプリンではない部位が生じる。 増幅した標的核酸中の候補座位の特定の配列の有無の結果、増幅標的核酸試 料の標的鎖をグリコシラーゼを介して切断することによって、固定化法による検 出もまた可能となる。この場合、通常隣り合ったプライマーであるプライマーの 一つが、固体マトリックスへの標的鎖の固定を可能にする結合した「捕獲」試薬 を用いて合成される。プライマーは、修飾された前駆体ヌクレオチドが増幅され た核酸試料中の候補座位のみに取り込まれるように設計される。この増幅過程は 標識前駆体ヌクレオチドの存在下で実施され、候補座位の末端（3'）に位置する 伸長した隣接プライマー中に標識が取り込まれる。増幅した標的鎖の固定化は、 増幅した標的鎖を、捕獲試薬と特異的に結合する分子を持つ固体マトリックスと 共にインキュベートすることによって達成される。次に、変性剤で洗浄し、固定 化されない全ての物質を切除することによって、相補的標的鎖の切除が行われる 。グリコシラーゼの基質塩基が候補座位に存在する場合、グリコシラーゼ媒介性 切断反応によって、標的鎖の標識された部分の遊離が起きる。遊離した断片の切 除および遊離したまたは固定化されたままである標識のレベルの測定によって、 候補座位における特定の配列の存在の有無が示される。または、標的鎖の標識化 が望ましくない場合、特定の核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出 が行われ得る。このようなプローブは、完全な固定化された標的鎖、グリコシラ ーゼ媒介性切断反応の後で遊離した標的鎖の部分、または切断反応後に残存する 標的鎖の部分を検出するように、容易に設計することができる。 このグリコシラーゼ媒介性切断反応によって、変異部位の周辺のＤＮＡ配列 が知られている限り、いかなる標的試料中の候補座位のいかなる特定の配列の検 出も可能である。増幅反応に適したプライマーを設計するためには、候補座位の 両側の少なくとも15から20ヌクレオチドの配列情報が必要である。 現在まで、修飾塩基を認識するＤＮＡグリコシラーゼ酵素の使用は、増幅さ れた標的核酸試料中の候補座位における特定の配列の検出に直接的に用いられて はいない。 グリコシラーゼ媒介性切断反応の主な適用は、前述の固定化法によって、候 補座位における特定の配列の有無を検出することがそれによって可能になること である。 適した「捕獲」試薬の一つはビオチンである。即ち、標的鎖の固定化を引き 起こすように、固体マトリックスに被覆または結合したストレプトアビジンへの 標的鎖の固定化を可能にする、ビオチンが結合したプライマーの一つが適切に合 成される。特定の配列が候補座位に存在する、または存在しない場合に修飾前駆 体ヌクレオチドが候補座位の標的鎖にのみ取り込まれるようにプライマーを設計 する。 適当には、前駆体ヌクレオチドの一つも標識される。上記で示したように、 増幅過程は好ましくは標識前駆体ヌクレオチド（例えばα-Ｐ³²ｄＮＴＰ、蛍光 ｄＮＴＰ、またはジゴキシゲニンｄＮＴＰ）の存在下で実施され、その結果伸長 した隣接プラ イマーに標識が取り込まれる。また、標識前駆体ヌクレオチドを目標のプライマ ーおよび候補座位の末端（3'）にのみ取り込むことができるように、即ち標識前 駆体ヌクレオチドが候補座位と隣接プライマーとの間に取り込まれ得ないように 、捕獲基を有するプライマーも設計する。 好ましくは、非塩基部位のリン酸結合がアルカリ処理または他の化学処理、 熱処理および酵素による処理から選択される処理によって切断される。 ＤＮＡグリコシラーゼの働きによるグリコシラーゼ基質塩基の遊離に続く非 塩基部位切断による鎖切断反応は、本明細書ではグリコシラーゼ媒介性切断と呼 称する。候補座位における特定の配列の有無によって、増幅された標的核酸試料 中の候補座位への修飾前駆体ヌクレオチドの取り込みが起きるかどうかが決定す る。即ち、修飾前駆体ヌクレオチドが候補座位に取り込まれる場合、グリコシラ ーゼ媒介性切断反応によって候補座位において標的鎖の切断が起き、この切断部 位は伸長した隣接プライマーの3'末端に最も近い切断部位でありうる。修飾前駆 体ヌクレオチドが候補座位に取り込まれない場合、修飾前駆体ヌクレオチドが取 り込まれる候補座位の末端の最初の部位において、伸長した隣接プライマーの3' 末端に最も近い切断部位での切断が起きうる。即ち、グリコシラーゼ媒介性切断 の後で伸長した隣接プライマーの観察される長さから、候補座位における特定の 配列の有無が診断可能であると考えられる。 好ましい処理は高温アルカリ、または非プリンまたは非ピリミジン部位を特 異的に切断する酵素（例えば大腸菌エンドヌクレアーゼIV）による。これらの処 理のいずれも、非プリンまたは非ピリミジン部位を5'側で完全に切断する。グリ コシラーゼ基質塩基が増幅された標的鎖中の候補座位に一つだけ存在する場合、 グリコシラーゼ媒介性切断反応によって標的鎖は一つの部位でのみ切断され、二 つの断片鎖を生じる。用いられるプライマー配列の設計操作によって、標的鎖上 の候補座位に加えて、標的および/または相補鎖のいかなる望まれる部位にグリ コシラーゼ基質塩基を有する産物を増幅することも可能となり、グリコシラーゼ によって切断された増幅標的核酸試料のその後の解析が容易となる。 候補座位における特定の配列の有無によって、グリコシラーゼ基質塩基が標 的鎖の候補座位に取り込まれるかどうかが決定される。即ち、これは候補座位に 特定の配列が存在するか否かによる増幅された標的鎖のグリコシラーゼ媒介性切 断反応によって異なる診断用切断パターンを産生する。また、プライマーは、特 定の配列が候補座位に存在する場合にグリコシラーゼ基質塩基が標的鎖に存在し ないようにも設計し得る。このような場合、標的鎖はグリコシラーゼ媒介性切断 に対して耐性である。 増幅標的核酸試料のグリコシラーゼ媒介性切断による産物/切断パターンは 、現行のＤＮＡ長決定法（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロース ゲル電気泳動、または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））によって決 定され得る。 即ち、本発明に従って増幅法が用いられた場合の伸長した隣接プライマーの 大きさは、変性後に現行のＤＮＡ長決定法（例えば変性ポリアクリルアミドゲル 電気泳動）によって決定され得る。増幅過程における標識された前駆体ヌクレオ チドまたはＤＮＡ染色法の利用が、増幅された標的核酸試料のグリコシラーゼ媒 介性切断によって生じる全ての断片の検出を容易にしたのに対して、増幅過程に 先立つ隣接プライマーの標識化は、切断された伸長した隣接プライマーのみの検 出を容易にする。 用いられる修飾塩基は好ましくはウラシルまたはヒポキサンチンである。 即ち、好ましい修飾前駆体ヌクレオチドはｄＵＴＰおよびｄＩＴＰであり、 これらはＤＮＡに取り込まれた場合にそれぞれグリコシラーゼ基質塩基のウラシ ルおよびヒポキサンチンを生じる。修飾された前駆体ヌクレオチドのｄＵＴＰは 、塩基ウラシルとリン酸化糖分子からなるリン酸化糖塩基である。修飾された前 駆体ヌクレオチドｄＩＴＰは、塩基ヒポキサンチンとリン酸化糖分子からなるリ ン酸化糖塩基である。ＤＮＡ中のウラシルは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ ＵＤＧ）によって特異的に認識され、ＤＮＡから遊離される。また、ウラシルＤ ＮＡグリコシラーゼはＤＮＡ中に存在するある種の他のウラシル関連塩基を認識 する。ヒポキサンチンは、アルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＤＧ）によ って特異的に認識され、ＤＮＡから遊離される。この酵素はまた、ＤＮＡ中のＮ 3メチルアデニン、Ｎ3メチルグアニン、Ｏ2メチルシトシンおよびＯ2メチルチミ ンを認識し遊離させる。前駆体ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ 、および前駆体ヌクレオチド ｄＵＴＰを用いた標的ＤＮＡ配列の増幅は、チミンがウラシルに置換された増幅 ＤＮＡを生じる。増幅過程において、ウラシルは新しく合成されるＤＮＡ鎖の鋳 型ＤＮＡ鎖のアデニン残基に相補的な部位に取り込まれる。前駆体ヌクレオチド ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、および修飾前駆体ヌクレオチドｄＩＴＰの 存在下での標的ＤＮＡ配列の増幅は、グアニンが優先的にヒポキサンチンに置換 された増幅ＤＮＡを生じる。他の前駆体ヌクレオチドが限定されていない場合、 増幅過程において、ヒポキサンチンは鋳型ＤＮＡ鎖の反対側シトシンに対して取 り込まれる。 いかなる源からのいかなるＤＮＡまたはＲＮＡも標的試料として用い得る。 好ましくは、標的核酸試料はＤＮＡである。増幅反応のためには、ＲＮＡは 先ず逆転写によってｃＤＮＡに変換される。特定の配列は全てのまたは一部の標 的核酸試料の候補座位に存在し得るか、または標的核酸中に存在しないこともあ り得る。標的核酸試料は候補座位における特定の配列の有無に関してホモ接合体 またはヘテロ接合体であり得、これは前述の先行技術のいくつかを超える本発明 の方法の長所の一つである。 本発明の方法に従って使用することができるＤＮＡは一本鎖、ホモ二本鎖ま たはヘテロ二本鎖であり得る。 特定の先行技術の方法と比較して本発明の有する長所のいくつかは以下の通 りである。 候補座位における点、挿入または欠失型変異による起こり得る全ての配列変 異を同定するために最少二つのグリコシラーゼが必要とされ、一つのグリコシラ ーゼが12すべての起こり得る変異のうち10個を検出するために用いられ得るとい う点で、本発明は制限酵素解析法を超える利点を有する。 切断産物の長さを測定するために大型ＤＮＡシークエンシング型ゲルを必要 とせず、標的核酸中の特定の配列の有無を検出するために必要な切断産物の数が 少ないという点で、本発明による方法は、ＤＮＡシークエンシングよりも著しく 迅速である。通常、野生型のＤＮＡ断片に加えてもう一つの別のＤＮＡ断片が出 現するか否かが、標的核酸中の特定のＤＮＡ配列の有無を診断するのに十分であ りうる。候補座位における特定の配列の有無を検出するために、ＤＮＡシークエ ンシングに比べ、異なる長さの複数のＤＮＡ断片の解読が必要である。本発明に よる方法によって、固定化された標的核酸からＤＮＡ断片が遊離するか否かを決 定することによって、候補座位における特定の配列の有無の検出が可能となる。 これはＤＮＡシークエンシングによっては可能ではない。 本発明による方法にはまた、ウラシル競合法に対して顕著な改善点も見られ る。標的核酸試料に導入された修飾ヌクレオチドが事前選択された全ての部位に 導入されるという点で、本発明による方法はウラシル競合法とは異なる（ウラシ ル競合法においては、ウラシルは増幅される分子中にランダムに、低いレベルで 取り込まれる）。また、本発明による方法では、導入された修飾ヌクレオチドは 特定のＤＮＡ前駆体を置換する（ウラシル競合法においては、正常なヌクレオチ ドに対してある割合の修飾ヌクレオチドが用いられる）。ウラシル競合法に対す る本発明による方法の他の利点は、本発明による方法は有意に迅速であり、切断 産物の長さを測定するために大型ＤＮＡシークエンシング型ゲルを必要とせず、 検出される必要のある切断産物の数が少ないちうことである。通常、野生型のＤ ＮＡ断片に加えてもう一つのＤＮＡ断片が出現するか否かが、標的核酸中の特定 のＤＮＡ配列の有無を診断するのに十分でありうる。ウラシル競合法に対して、 特定の候補座位におけるウラシル残基を検出するために、異なる長さの複数のＤ ＮＡ断片の解読が必要である。本発明による方法によって、固定化された標的核 酸からＤＮＡ断片が遊離するか否かを決定することによって、候補座位における 特定の配列の有無の検出が可能となる。これはウラシル競合法によっては可能で はない。 ミスマッチヌクレオチドグリコシラーゼの利用に対する本発明の方法の利点 は、ホモ接合体またはヘテロ接合体な状態での特定の配列（変異またはその他） の有無を検出するために外部プローブが必要でないことである。本発明の方法で は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼのような特定のグリコシラーゼが一本鎖ＤＮ Ａに作用し、一本鎖ＤＮＡについて調査することができる。さらに、本発明に従 って用いられる修飾塩基はそれらを認識するグリコシラーゼ酵素によって効率的 に認識され切除される。即ち、外部プローブの提供が不要であり、ハイブリダイ ゼーション過程が不要であり、一本鎖ＤＮＡを用いることができ、大量の試料の 処理を迅速・簡便に達成し得るという点で、本発明は概説されたミスマッチ切断 法 に対して著しい利点を有する。 最後に、候補座位において野生型または変異型配列のどちらが存在するかを 決定するために一つの増幅反応のみが必要であるという点において、本発明の方 法はＡＲＭＳ法に対して著しい利点を有する。ＡＲＭＳ法の対合条件は厳密でな くてはならず、したがって多くの場合に転用が困難であり、調査される各変異ご とに最適化されなければならない。それに対して、本発明の方法は確立されてお り、容易に最適化され、大量の試料の処理が可能である。 図面の簡単な説明 図1は、実施例1に記載される過程Ａ）の模式図である。 図2は、実施例1に記載される過程Ｂ）の模式図である。 図3は、実施例2に記載される過程の模式図である。 図4は、実施例3に記載される過程の模式図である。 図5は、実施例4に記載される過程の模式図である。 図6は、実施例5に記載される過程の模式図である。 図7は、実施例6に記載される過程の模式図である。 図8は、実施例7に記載される過程の模式図である。 図9は、実施例8に記載される過程の模式図である。 本発明の実施態様 本発明は以下の実施例によってさらに例示される。 実施例1 悪性過温症を引き起こす、ヒト骨格リアノジン受容体遺伝子（ＲＹＲ1）の 位置1021におけるＧからＡの塩基置換変異の、変異についてヘテロ接合体である 患者での存在を検査するために、本発明による方法が用いられた。工程の流れを 図1に示した。この場合、標的核酸は悪性過温症の患者から抽出されたＤＮＡで あり、候補座位はヒトＲＹＲ1遺伝子のヌクレオチド1021であり、目的は患者の ＲＹＲ1対立遺伝子のいずれかの候補座位にＧ：ＣまたはＡ：Ｔの特定の配列が 存在 するかどうかを決定することであった。図1に示す下部鎖は標的鎖であり、候補 座位におけるＴ（Ｕ）ヌクレオチドの有無が決定された。上部鎖は相補標的鎖で ある。 実施例においては、正常対立遺伝子は正常な配列を有するＲＹＲ1対立遺伝 子を指し、変異対立遺伝子は位置1021に変異配列を有するＲＹＲ1対立遺伝子を 指す。変異部位の周囲のＤＮＡ配列は図1に示し、変異部位は太字の大文字で示 す。 Ａ）候補座位領域の標的核酸配列および隣接および末端プライマーの配列（ プライマーは標準ヌクレオチド（ｄＧ、ｄＡ、ｄＴおよびｄＣ）を含む）は図1 に示す。6ピコモルの隣接プライマーは1ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ、 適当な緩衝液および1ｕＣｉ γ³²Ｐ ＡＴＰ（3000Ｃｉ/ｍｍｏｌ）と共に37℃30 分にインキュベートすることによって末端標識された。標的核酸試料は以下のよ うにＰＣＲで増幅された：ＰＣＲの反応混合液は罹患者から得た200ngのゲノム ＤＮＡ、0.2ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ、1.5ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ₂、50ｍＭ ＫＣｌ、10ｍＭ Tns-ＨＣＩ(ｐＨ9.0）、0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ-1 00、6ピコモルの各プライマーを総体積19μｌ中に含む。反応液は次に等量のミ ネラルオイルを重層され、ホットスタートＰＣＲ（反応液は1ユニットのＴａｑ ポリメラーゼ（総体積20μｌ）の添加に先だって5分94℃で熱された）が行われ た。94℃60秒、59℃60秒、72℃60秒の30サイクルをサーモサイクラー中で行い、 続いて水溶性反応液を別のチューブに回収した。増幅された標的核酸を含む反応 混合液は次に、増幅工程で伸長しなかったプライマーを消化するためにエキソヌ クレアーゼＩで処理された。これは、0.5ユニットのエキソヌクレアーゼＩとと もに2μｌのＰＣＲ反応液を37℃30分でインキュベートすることによって達成さ れた。エキソヌクレアーゼは次に反応液を80℃15分インキュベートすることによ って熱処理失活された。 次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（0.05ユニット）を添加し、室温で30分 インキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理に続いて、増幅産物中 に生じた非プリンまたは非ピリミジン（ＡＰ）部位を、ＮａＯＨを最終濃度0.25 Ｍに加え、混合液を95℃15分熱することによって完全に切断した。次に反応液は Ｔｒｉｓ塩基を最終濃度30ｍＭに加えることによって中性化された。 等量のホルムアミドロード用色素（90％ホルムアミド、0.025％ブロモフェ ノールブルー、0.025％キシレンシアノール）を試料に加え、ついで85℃5分熱さ れた。試料全量は次に20％変性（7Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲルにロードし 、試料中の切断産物の長さ解析のために400ボルト3から4時間、電気泳動を行っ た。電気泳動後、-70℃で12時間、ゲルを直接Ｘ線写真フィルムに感光させるこ とによってオートラジオグラフィーを行った。標識されたオリゴヌクレオチドの セット（2Omer、22mer、24mer）をマーカーとして用いた。オートラジオグラフ ィーによる産物の解析によって、二つの切断産物がほぼ等量存在することが示さ れた。本明細書で以下に記載されるように、正常な遺伝子に対応する一つの産物 は22ヌクレオチド（n）の長さであり、二つ目の産物は変異型遺伝子に対応し、2 0nの長さであった。 20n産物はウラシル残基が標的鎖の位置1021に取り込まれた場合にのみ生じ るものであった。即ち、20n断片を検出することは位置1021にＴ残基が存在する ことを示す。正常な対立遺伝子においては、最初に取り込まれるウラシルは位置 1019になるはずであり、その結果22nの産物を生じるはずである。即ち、22n断片 の検出は位置1021にＴ残基が存在しないことを示し、位置1019にＴ残基が存在す ることを示す。20nおよび22n産物の両者ともほぼ等量検出され、標的核酸がＧ10 21Ａ変異に関してヘテロ接合体である個人由来であることが示唆された。患者が 正常なホモ遺伝子型であれば、22n産物のみが検出されるはずである。患者が疾 病のホモ接合体であれば、20n産物のみが検出されるはずである。20n産物に対す る22n産物の相対的強度から、標的核酸試料中の正常および変異対立遺伝子の相 対的レベルを決定することができる。これは、特定の正常および変異対立遺伝子 間のレベルに大きな差異があり得る複合した試料を解析するためにとくに有用で ある。 Ｂ）プライマーの3'末端が位置1023、1024または1025に位置し、プライマー が適切な最適長を維持する（5'末端を適切に調整することによる）ような、隣接 プライマーの再設計が可能である。例えば、隣接プライマーが5'方向に3ヌクレ オチド移動した場合、プライマー配列は5'-ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＡＡ ＧＣＡ ＣＡ Ｇ ＴＧＡ ＣＴ-3'となる。即ち、変異対立遺伝子からは23n産物が生じ、正常対 立遺伝子からは25n産物が生じる。隣接プライマーの長さは20nであるため、利用 されなかったプ ライマーを切除する必要はない。この変更は図2に示す。 実施例2 いくつかの場合、候補座位における特定の配列の有無を示すグリコシラーゼ 切断産物間に大きいおよび/または明らかな長さの差異が存在するように本発明 による増幅プライマーを設計するのが有利である。これは、隣接プライマーおよ び候補座位の末端の、グリコシラーゼが認識する基質塩基の取り込み部位が変更 するように、プライマーの一方または両方を変更することによって達成され得る 。これは、新しく合成されるＤＮＡ中のグリコシラーゼ基質塩基の取り込みを促 進する残基のいくつかまたは全てが、グリコシラーゼ基質塩基の取り込みを促進 しないヌクレオチドによって置換されるように、プライマーを合成することによ って達成され得る。 本実施例で利用される方法は、末端プライマーが後ろから2番目の3'位置(位 置1019)にイノシン残基を持つように合成され、利用されなかったプライマーを 切除するためのエキソヌクレアーゼ処理が行われない(この場合には不用である ため)こと以外は、実施例1に記載されたものと全く同様である。即ち、標的鎖の 増幅の間にウラシルではなくシトシン残基が新しく合成されるＤＮＡの反対側の 位置1019に取り込まれる。その結果、増幅産物のグリコシラーゼ媒介性切断の結 果、変異対立遺伝子由来の23n断片および正常対立遺伝子由来の28n断片が生じる (図3に示す)。 候補座位の末端のウラシル残基を取り込むと考えられる部位における余分な または全てのウラシル残基の取り込みを、ウラシル残基が候補座位に存在する場 合に標的鎖の切断が候補座位でのみ起きる程度まで阻害することによって、大き い差異が達成され得る。相補標的鎖上の隣接プライマーの反対側のウラシル残基 を取り込むと考えられる部位における余分なまたは全てのウラシル残基の取り込 みを阻害するために、同じ方法もまた用いることができる。 実施例3 塩基とＤＮＡ骨格間のＮ-グリコシド結合の切断によって、ＤＮＡから塩基 が 遊離し、その結果非プリンまたは非ピリミジン部位（ＡＰ部位）が生じる。ＡＰ 部位の3'側のホスホジエステル結合はアルカリに対して不安定であり、中性ｐＨ でもβ-脱離による切断も受けやすい。即ち、ＡＰ部位を有するＤＮＡ試料のア ルカリまたは熱処理によって、ＤＮＡ骨格のホスホジエステル結合が切断され、 その結果5'リン酸基を有するＤＮＡ末端および3'リン酸化デオキシリボースを有 する末端が生じる。続く3'末端リン酸化デオキシリボースの切除は、酵素エキソ ヌクレアーゼIIIンドヌクレアーゼIV処理を含む様々な方法によって達成し得る 。一つまたはそれ以上のＡＰ部位を有する増幅されたＤＮＡ断片を、ウラシルＤ ＮＡグリコシラーゼ切断の後に、95℃15分熱することによって、ＡＰ部位を切断 し、3'末端リン酸化デオキシリボースを有するまたは有さない産物がほぼ同じ割 合で生じることを観察した。この選択的な切断は、グリコシラーゼ媒介性切断反 応産物の正確な検出を促進するために用いられ得る。 実施例2の方法が繰り返されたが、増幅された標的核酸のウラシルＤＮＡグ リコシラーゼ処理に続いて、反応液を95℃15分熱することによって増幅産物中に 生じたＡＰ部位を切断し、ＮａＯＨが添加されないために反応液を中性化する必 要がないことが異なる。実施例1に記載した手順の完了に続いて、オートラジオ グラフィーの解析によって、4つの切断産物（28n産物および、28n産物＋3'末端 リン酸化デオキシリボースである、約1ヌクレオチド長い産物（28n＋）、および 23n産物および、23n産物＋3'末端リン酸化デオキシリボースである、約1ヌクレ オチド長い産物（23n＋））がほぼ等量、および利用されなかった標識プライマ ーが見られた。この変更は図4に示す。 23nおよび23n＋産物は、ウラシル残基が標的鎖の位置1021に取り込まれた場 合にのみ生じるものであった。即ち、23nおよび23n＋断片の検出は、位置1021に おけるＴ残基の存在を示す。正常対立遺伝子においては、最初に取り込まれるウ ラシルは位置1016であり、28n産物を生じるはずである。即ち、28nおよび28n＋ 産物の検出は、位置1021におけるＴ残基の不在および位置1019におけるＴ残基の 存在を示す。本実施例においては、23n、23n＋、28nおよび28n＋産物はほぼ等量 で検出され、標的核酸がＧ1021Ａ変異に関してヘテロ接合体である個人由来であ ることが示唆された。利用されないプライマーよりも3'末端リン酸化デ オキシリボース一つ長い断片の出現が候補座位における特定配列の有無を示す場 合に、条件が容易に設計され得るため、この方法は多重式の方法にとって特に有 用である。 実施例4 標的核酸試料の標的鎖中の候補座位の特定配列のグリコシラーゼ媒介性切断 によって、固相あるいは固定化技術を用いた切断産物の検出も可能となる。本発 明のこの特徴によって、大量の試料の処理が可能となり、時間のかかるゲル電気 泳動解析の利用が回避される。いかなる候補座位も、本技術によって特定の配列 の有無に関して調査され得る。この適用の主な分野は、標的試料中の遺伝子変異 の検出および特定の生物の同定にある。 本実施例および実施例5および6は、以下の分野の両者における適用を説明す る。 標的核酸が悪性過温症患者から抽出したＤＮＡであり、候補座位がヒトＲＹ Ｒ1遺伝子のヌクレオチド1021であり、目的が患者のＲＹＲ1対立遺伝子の一方ま たは両方の候補座位にＡ:Ｔ塩基対が存在するか決定することであるという点で 、実施例1で用いられたものと同様の方法が用いられた。手順は図5に示す。この 場合、下部鎖は「標的鎖」であり、上部鎖は「相補鎖」である。標的鎖上の候補 座位におけるＴ(Ｕ)ヌクレオチドの有無が決定された。 隣接プライマーが5'末端をビオチニル化され、末端プライマーにおいて全て のＡ残基がイノシンに置換された点以外は、用いた隣接および末端プライマーは 実施例1で用いたものと同様である。Ａ残基の置換の結果、候補座位にＡ:Ｔ塩基 対が存在した場合、増幅された標的鎖は一つのウラシル残基を含むのみであった 。即ち、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ媒介性切断による標的鎖の切断は、ウラ シル残基が存在した場合には一つの位置（1021）でのみ起こりえた。そのため、 この場合における増幅された標的鎖の切断は、標的核酸試料の位置1021における Ａ:Ｔ塩基対の存在を示す。 隣接プライマーは合成中は5'端をビオチニル化された。標的核酸試料は以下 のようにＰＣＲによって増幅した：ＰＣＲの反応混合液は罹患者の200ngのゲノ ムＤＮＡ、0.2ｍＭ ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＵＴＰ、lｕＣｉ α³² Ｐ ｄＣＴＰ）（3000Ｃｉ/ｍｍｏｌ）、1.5ｍＭ ＭｇＣｌ₂、50ｍＭ ＫＣｌ、 10ｍＭ Tns-ＨＣＩ（ｐＨ9.0）、0.01％ＴｎｔｏｎＸ-100、6ピコモルの各プラ イマーを総体積9μｌ中に含む。反応混合液は次に等量のミネラルオイルを重層 され、ホットスタートＰＣＲ（反応混合液は1ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ 総体積25μｌ）の添加に先だって5分80℃で熱された）が行われた。94℃60秒、5 9℃60秒、72℃60秒の30サイクルをサーモサイクラー中で行った。 1μｌの水溶性ＰＣＲ反応液を、20μｌのストレプトアビジン被覆磁性ビー ズ（Ｄｙｎａｌ（登録商標）beads）および19μｌの滅菌水を含むチューブＡと ラベルしたチューブに加え、室温で10分インキュベートすることによって産物の 固定化を行った。次にチューブは磁石スタンド中に置かれ、ビオチン標識ＰＣＲ 産物の結合したビーズはチューブの片側に蓄積される。取り込まれない標識およ び利用されない末端プライマーおよびヌクレオチド三リン酸を含む上清を切除し 、ＰＣＲ増幅ＤＮＡを捕捉したビーズは10ｍＭ Tris-ＨＣｌ (ｐＨ7.5)、1ｍ Ｍ ＥＤＴＡおよび1ＭＮａＣｌを含む緩衝液で数回洗浄した。増幅ＤＮＡは次に40 μｌの0.1Ｍ ＮａＯＨを加えることによって変性した。上清中の相補鎖を切除し 、標的鎖はストレプトアビジン被覆磁性ビーズに結合したままであった。ビーズ は40μｌの0.1Ｍ ＮａＯＨで再度洗浄し、次に前述の緩衝液で洗浄した。固定化 された標的鎖は次に0.05ユニットのウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理し、ア ルカリを最終濃度0.25ＭのＮａＯＨになるように加えることによってＡＰ部位で 切断した。遊離物質は次にチューブＢとラベルした別のチューブに移され、シン チレーション測定によって³²Ｐの存在をモニターした。切断された固定化ＰＣＲ 産物を含むチューブも、³²Ｐの存在に関してモニターした。 シンチレーション測定による³²Ｐの存在をモニターすることによって、ウラ シルＤＮＡグリコシラーゼ切断後に約半数の放射性物質がチューブＢに遊離する ことを示した。これは、固定化されたＰＣＲ産物の約半数が、候補座位にＵ残基 が存在するために切断されたことを示した。即ち、標的試料はＲＹＲ1遺伝子の 位置1021のＡ:Ｔ塩基対に関してヘテロ接合体であることが結論づけることがで きた。 実施例5 固定化を伴うグリコシラーゼ媒介性切断が、Mycobacterium tuberculosis複 合体の病原生物の存在を検出するために用いられた。 ＭＰＢ70遺伝子はMycobacterium tuberculosis複合体生物中に特異的に見ら れ、複合体の存在を検出するためにＰＣＲまたは他の方法によるＭＰＢ70遺伝子 の検出が首尾良く用いることができるいくつかの報告が公開された。本実施例に おいては、ＰＣＲ産物中に一つのＵおよび標識が取り込まれるように、ＭＰＢ70 遺伝子の一部の特異的増幅が実施された。即ち、産物の固定化の後にウラシルＤ ＮＡグリコシラーゼによる切断を行うことによって、容易に検出され得る標識産 物が遊離するはずである。 図6に示すように、プライマーが囲む標的鎖の被増幅部位がいくつかのグア ニン、シトシン、あるいはアデニン、および一つのウラシルを含むように、ＭＰ Ｂ70遺伝子の一部を増幅するように特異的プライマーを設計した。これを達成す るために、反対側の標的鎖にウラシルが取り込まれないように末端プライマーを 設計した。捕獲試薬を有する隣接プライマーおよび標識ヌクレオチド前駆体を用 いた増幅の後、増幅された標的鎖を固定化し、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼに よって切断した。即ち、標的鎖の標識断片がこの過程によって遊離し、容易に検 出できた。 より特定的には、本実施例の目的は、隣接プライマーの伸長の間に取り込ま れた位置496のウラシル残基の切断をモニターすることによってＭＰＢ70の増幅 断片（ヌクレオチド472-540）の存在を検出することであった。ＭＰＢ70遺伝子 中のＧＣＡに富む配列（標的鎖）をｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＩＰおよびｄＡＴ Ｐを用いて増幅するようにプライマーを設計した。イノシン（あるいはミスマッ チ）がアデニンに置換し、増幅産物の標的鎖中に存在する唯一のウラシルが位置 496であるように、末端プライマーを設計した。隣接プライマーは5'末端をビオ チニル化した。候補座位領域の標的核酸配列および隣接プライマーと末端プライ マーの配列を図6に示す。 標的核酸試料は以下のようにＰＣＲによって増幅した：ＰＣＲの反応混合液 は 罹患者の200ngのゲノムＤＮＡ（またはＭＰＢ70遺伝子のＰＣＲによって増幅さ れた領域を200倍希釈したもの1μｌ）、0.2ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ およびｄＵＴＰ、１μＣｉα³²Ｐ ｄＣＴＰ（3000Ｃｉ/ｍｍｏｌ）、1.5ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂、50ｍＭ ＫＣｌ、10ｍＭ Tris-ＨＣｌ (ｐＨ9.0)、0.1％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-100、6ピコモルの各プライマーを総体積9μｌ中に含む。反応混合液は次に20 μｌのミネラルオイルを重層され、ホットスタートＰＣＲ（反応混合液は1ユニ ットのＴａｑポリメラーゼ（総体積10μｌ）の添加に先だって5分94℃で熱され た）を行った。94℃60秒、58℃60秒、72℃60秒の30サイクルをサーモサイクラー 中で行い、続いて水溶性反応混合液が別のミクロチューブに回収された。 1μｌの水溶性ＰＣＲ反応液を、20μｌのストレプトアビジン被覆磁性ビー ズ（Dynal beads）および19μｌの滅菌水を含むチューブＡとラベルしたチュー ブに加え、室温で10分インキュベートすることによって産物の固定化を行った。 次にチューブは磁石スタンド中に置かれ、ビオチン標識ＰＣＲ産物の結合したビ ーズはチューブの片側に蓄積される。取り込まれない標識および利用されない末 端プライマーおよびヌクレオチド三リン酸を含む上清を切除し、ＰＣＲ増幅ＤＮ Ａを捕捉したビーズは10ｍＭ Tris-ＨＣｌ （ｐＨ7.5）、1ｍＭ ＥＤＴＡおよび 1Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で数回洗浄した。増幅されたＤＮＡは次に40μｌの0. 1Ｍ ＮａＯＨを加えることによって変性された。上清中の相補鎖を切除し、標的 鎖はストレプトアビジン被覆磁性ビーズに結合したままであった。ビーズは40μ ｌの0.1Ｍ ＮａＯＨで再度洗浄し、次に前述の緩衝液で洗浄した。固定化された 標的鎖は次に0.05ユニットのウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理し、アルカリ を最終濃度0.25ＭのＮａＯＨになるように加えることによってＡＰ部位で切断し た。遊離物質は次にチューブＢとラベルした別のチューブに移し、シンチレーシ ョン測定によって³²Ｐの存在をモニターした。切断した固定化ＰＣＲ産物を含む チューブも、³²Ｐの存在に関してモニターした。 シンチレーション測定による³²Ｐの存在をモニターすることによって、ウラ シルＤＮＡグリコシラーゼ切断後に放射性物質がチューブＢに遊離することを示 した。これは、固定化したＰＣＲ産物が、候補座位にＵ残基が存在するために切 断されたことを示した。即ち、標的試料はMycobacterium tuberculosis複合体に 由来すると結論づけることができた。 実施例6 異なる方法で設計された隣接プライマーを用いて反応を行った点以外は、実 施例5の方法が繰り返した。この場合、増幅の間に標的鎖にウラシルが取り込ま れないように隣接プライマーを設計した（図7に示す）。即ち、この場合、増幅 産物はウラシルＤＮＡグリコシラーゼによる切断に対して耐性であるはずであり 、標識はチューブＢに遊離しないはずである。この場合、シンチレーション測定 による³²Ｐの存在をモニターすることによって、チューブＢ中の標識はウラシル ＤＮＡグリコシラーゼによりインキュベートした後も固定化されたままであるこ とを示した。チューブＢには標識は放出されなかった。産生した疑似ＰＣＲ産物 にウラシル残基が取り込まれ、そのために標識がチューブＢに遊離すると考えら れるため、この方法は正しいＤＮＡが固定化されていることを証明するために特 に有効である。実施例5と6を組み合わせて用いることによって、調査者がMycoba cterium tuberculosis複合体の有無を高い信頼性で診断することが可能になる。 実施例７ 事前選択されたプライマーを用いた、特定の長さの特定のＤＮＡ断片の増幅 は、ＤＮＡ診断分野では診断目的のために一般的に用いられる。このような診断 法の一つの欠点は、目的の診断用産物と同じ長さの人為的な増幅産物が生じ、誤 診が起こり得るということである。即ち、信用限界値を上げる、または診断用増 幅断片が正しいことを証明する方法は、診断の正確性を改善し、増幅のみによる 診断よりも優れているため、診断分野では重要な価値を有する。 特異的なプライマーを用いた、Mycobacterium tuberculosis複合体生物中に 見られるＭＯＢ70遺伝子の特定の断片の増幅は、試料中のこれらの生物の有無を 診断するために用いられた。本実施例においては、Mycobacterium tuberculosis 複合体から特異的なプライマーを用いて増幅したＭＰＢ70遺伝子の116bpおよび1 30bp断片が正しいことを検査するために、本発明の方法が用いられた。先ず、Ｍ ＰB70遺伝子から116bpおよび130bp産物を増幅する用に、特異的プライマーおよ び Mycobacterium tuberculosis複合体ＤＮＡ試料を用いてＰＣＲを行った。116bp および130bpの増幅産物をウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって切断する場合 には、特定の大きさの断片を生じ、最初の増幅産物が正しいことを証明するよう にプライマーおよび増幅条件を設計した。 増幅方法は図8に示す。図の通り、ヌクレオチド320から436に渡るＭＰＢ70 遺伝子の116bp領域を増幅するために、プライマーＡ（5'-ggcctcggtgcagggaatgt c-3'）およびプライマーＢ（5-ccaggtttacttgcggattga-3')を選択した。また、 最初に取り込まれるウラシルがプライマーＡの3'末端の11ヌクレオチド下流であ り、プライマーＢの2ヌクレオチド下流であるようにプライマーを選択した。同 様に、ヌクレオチド551から681に渡るＭＰＢ70遺伝子の130bp領域を増幅するた めにプライマーＣおよびＤを選択した。この場合、最初に取り込まれるウラシル はプライマーＣの3'末端の26ヌクレオチド下流であり、プライマーＤの2ヌクレ オチド下流である。標識プライマーを用いてＭＰＢ70遺伝子の116bpおよび130bp を増幅し、続いてウラシルＤＮＡグリコシラーゼで切断することによって、116b p ＰＣＲ産物由来の32nおよび23n断片、および130bp ＰＣＲ産物由来の47nおよ び23n断片が生じる。 116bp産物はMycobacterium tuberculosis複合体ＤＮＡ試料から、以下のよ うにＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの反応混合液は200ngのMycobacterium tuber culosis複合体ＤＮＡ、0.2ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ 、1.5ｍＭ ＭｇＣｌ₂、50ｍＭ ＫＣＩ、10ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ9.0）、0.1％ ＴｒｉｔｏｎＸ-100、6ピコモルのプライマーＡおよびＢを総体積19μｌ中に含 む。最初の増幅反応混合液中で、γ³²ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを 用いてプライマーＡを末端標識し、第二の増幅においてプライマーＢを標識した 。反応混合液に次いで等量のミネラルオイルを重層し、ホットスタートＰＣＲ（ 反応混合液は1ユニットのＴａｑポリメラーゼ（総体積20μｌ）の添加に先だっ て5分94℃で熱された）を行った。94℃60秒、57℃60秒、72℃60秒の30サイクル をサーモサイクラー中で行い、続いて水溶性反応混合液を別のチューブに回収し た。増幅された標的核酸を含む反応混合液は次に、増幅工程で伸長しなかったプ ライマーを消化するためにエキソヌクレアーゼＩで処理した。これは、0.5ユニ ットのエキソヌクレアーゼＩとともに3μｌのＰＣＲ反 応混合液を37℃30分でインキュベートすることによって達成した。エキソヌクレ アーゼは次に反応液を80℃15分インキュベートすることによって熱処理失活され た。 次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（0.05ユニット）を上記の3μｌの反応 混合液に加え、37℃で30分インキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ 処理に続いて、増幅産物中に生じた非ピリミジン部位を、ＮａＯＨを最終濃度0. 05Ｍになるように加え、反応混合液を95℃15分熱することによって完全に切断し た。次に反応混合液はTris塩基を最終濃度30ｍＭになるように加えることによっ て中性化した。等量のホルムアミドロード用色素（90％ホルムアミド、0.025％ ブロモフェノールブルー、0.025％キシレンシアノール）を混合液に加え、85℃5 分加熱した。各混合液の5μｌは次に20％変性（7Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲ ルにロードし、試料中の切断産物の長さ解析のために400ボルト3時間、電気泳動 を行った。電気泳動後、-70℃で12時間、ゲルを直接Ｘ線写真フィルムに感光す ることによってオートラジオグラフィーを行った。 オートラジオグラフィーによる産物の解析によって、以下の切断パターンが 示された。プライマーＡが末端標識された最初の反応では32n産物が観察された 。32n産物はウラシル残基がプライマーＡの3'末端の12ヌクレオチド下流に取り 込まれた場合にのみ生じた。プライマーＢが末端標識された第二の反応では23n 産物が観察された。23n産物はウラシル残基がプライマーＢの3'末端の3ヌクレオ チド下流に取り込まれた場合にのみ生じた。 Mycobacterum tuberculosis複合体ＤＮＡ試料から、プライマーＡおよびＢ の代わりに、プライマーＣ（5'-catcctgacctaccacgtagt-3'）およびプライマー Ｄ（5'-gtcggcgttaccgaccttgag-3'）を用いる以外は、上に概説したのと全く同 じようにＰＣＲによって130bp産物を増幅した。オートラジオグラフィーによる 産物の解析によって、以下の切断パターンが示された。プライマーＣが末端標識 された反応では47n産物が観察された。47n産物はウラシル残基がプライマーＣの 3'末端の27ヌクレオチド下流に取り込まれた場合にのみ生じた。プライマーＤが 末端標識された反応では23n産物が観察された。23n産物はウラシル残基がプライ マーＤの3'末端の3ヌクレオチド下流に取り込まれた場合にのみ生じた。 ここで記載された増幅過程は、別個に標識されたプライマーを用いて記載さ れたように独立に、または一回の増幅反応に4つの標識プライマーを含む多重反 応として、行うことができる。後者の場合、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによ る切断、電気泳動、オートラジオグラフィーの後、47n、32nおよび23nの標識産 物が一つのレーンに検出される。 ＤＮＡ断片の特定の部位にウラシルが存在する確率は1/4即ち0.25である。 その部位にウラシルが存在しない確率は3/4即ち0.75である。プライマーＡの場 合、切断される前にプライマーＡは11ヌクレオチド伸長する。このような伸長が ランダムに起きる確率は、0.75¹¹=0.042である。伸長したプライマーは取り込ま れた12ヌクレオチドの部位で切断され、この部位にウラシルが存在することが示 される。その特定の部位にウラシルが存在する可能性は0.25である。即ち、11塩 基対伸長産物がランダムに生じる確率は、0.042×0.25=0.0105である。同様に、 プライマーＢが2塩基伸長する確率は0.75²×0.25=0.14である。即ち、ランダム な116bp産物が切断されて32n（21nプライマーＡの11ヌクレオチド伸長産物）お よび23n（21nプライマーＢの2ヌクレオチド伸長産物）産物を生じる確率は、0.0 105×0.14=0.0014である。プライマーＣおよびＤがそれぞれ26nおよび2n伸長す る場合の130bp産物に関する同様の計算によって、そのような伸長産物がランダ ムに生じる確率は0.000019であることが示される。両方のＰＣＲ産物を併せて考 えると、観察される産物がランダムに生じる可能性は0.000000027である。即ち 、本実施例によって、Mycobacterium tuberculosis由来のＰＣＲ産物の確認にお ける本発明の方法の適用性が示される。即ち、本発明の方法のこのような適用は 、診断または他の目的の増幅核酸の確認のための迅速で正確な方法を提供する。 実施例8 ウラシルＤＮＡグリコシラーゼが一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの両者に対し て作用するという事実によって、ウラシル残基を有する線型増幅産物の解析にお けるこの酵素の利用が可能となる。 一本鎖ＤＮＡの線型増幅によって、対数的ＤＮＡ増幅を超える著しい利点を 提供することができる場合がある。しかし、線型増幅法によって生じる一本鎖Ｄ ＮＡは二本鎖ＤＮＡと比較して一般的に迅速な解析には向かないため、線型増殖 にはいくつかの困難が存在する。例えば、一本鎖ＤＮＡは一般的に制限酵素で切 断されない。さらに、特異的プライマー対を用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲによる 対数増幅は特定の長さの二本鎖ＤＮＡ産物を産生し、長さ測定技術によって解析 されやすい。断片の5'および3'末端は順向きおよび逆向きプライマーによって定 められる。一方、ゲノムＤＮＡの線型増幅によって、定まった5'末端と不定の3' 末端を有する断片が生じる。本実施例においては、線型増幅の後に特定の長さの 一本鎖断片を生成するための、本発明の方法の利用を示す。候補座位における特 定の配列の存在んお有無を決定するために、候補座位を有する核酸断片を増幅す ることが通常必要である。多くの場合、増幅されたＤＮＡの複数の候補座位につ いて、特定の配列の存在を調査することが必要または望ましい。これは、ヒト疾 患を引き起こす遺伝子変異の検出に特に望ましい。即ち、複数の候補座位の同時 増幅とその後の候補座位の同時解析を可能にするいかなる方法も、一つの座位の 解析法に比べて有利である。複数の候補座位を有する核酸断片の増幅は、線型増 幅法または対数増幅法によって達成することができる。しかし、いくつかの独立 の方法または全長ＤＮＡシークエンシングを必要とする複数の座位の解析は、多 くの場合迅速性に制限がある。本実施例においてはまた、二つの特定の候補座位 における特定の変異の有無を同時に決定するための本方法の適用性を示す。 本発明の方法は、悪性過温症を引き起こす、ヒト骨格リアノジン受容体遺伝 子（ＲＹＲ1）の候補座位7301および7370におけるＧからＡの塩基置換変異をど ちらかの変異についてヘテロ接合体として有する二人の患者における、これらの 変異の有無を同時に検出するために用いられた。各工程の流れを図9に示す。こ の場合、標的核酸は悪性過温症の二人の患者（ＡおよびＢ）由来の骨格筋ｃＤＮ ＡからＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片である。図9に示す下部鎖が標的鎖である 。標的ＤＮＡの線型増幅において伸長したプライマーに最初に取り込まれるウラ シルの位置が変異対立遺伝子の場合には取り込まれる6番目のヌクレオチドの位 置であり、正常対立遺伝子の場合は8番目であるように、プライマーＡ（26n、5' -ggcttggattagatgcatctctggtg-3'）を設計した。最初に取り込まれるウラシルの 位置が変異対立遺伝子の場合には取り込まれる5番目のヌクレオチドの位置であ り、正常対立遺伝子の 場合は12番目であるように、プライマーＢ（28n、5'-gaattccaaggtcctccaagggca caag-3'）を設計した。どちらのプライマーも、線型増幅によって同じ方向に伸 長する。候補座位におけるＴ（Ｕ）の有無は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼに よる切断、ゲル電気泳動、オートラジオグラフィーによって決定した。標的核酸 はゲノムＤＮＡまたは増幅されたいかなるＤＮＡ部分でもあり得る。本実施例に おいては、標的核酸はcＤＮＡからＰＣＲによってＲＹＲ1遺伝子の6995から7402 領域を増幅することによって生成した。 プライマーＡおよびＢは、実施例1に記載されたようにγ³²Ｐで末端標識し た。患者ＡおよびＢ由来の標的核酸は等量のエキソヌクレアーゼI（0.5Ｕ/μｌ ）で37℃30分処理され、PCRに利用されなかったプライマーを分解した。次に80 ℃15分インキュベートすることによって、エキソヌクレアーゼを不活性化した。 この処理は、以降の工程で全ての対数増幅を防ぐために必要であった。ゲノムＤ ＮＡが標的核酸である場合、この工程は不要である。標的核酸試料1μｌは独立 に、6ピコモルの被標識プライマーＡおよびＢ、0.2ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ ＧＴＰおよびｄＵＴＰ、2ｍＭ ＭｇＳＯ₄、10ｍＭ ＫＣｌ、20ｍＭ Tris-ＨＣＩ （ｐＨ8.8）、10ｍＭ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ-100（総体積19μｌ ）と共にインキュベートした。反応混合液は次に等量のミネラルオイルを重層し 、線型増幅のためにホットスタート（反応混合液は0.5ユニットのＶｅｎｔ ＤＮ Ａポリメラーゼ（エキソ）（総体積20μｌ）の添加に先だって5分94℃で加熱し た）を行った。94℃60秒、55℃60秒、72℃60秒の30サイクルをサーモサイクラー 中で行い、続いて水溶性反応混合液を別のチューブに回収した。 次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（0.05ユニット）を上の反応液５μｌに 加え、37℃で30分インキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理に続 いて、増幅産物中に生じた非ピリミジン（ＡＰ）部位を、ＮａＯＨを最終濃度0. 05Mになるように加え、混合液を95℃15分熱することによって完全に切断した。 次に反応液はTris塩基を最終濃度30ｍＭになるように加えることによって中性化 した。等量のホルムアミドロード用色素（90％ホルムアミド、0.025％ブロモフ ェノールブルー、0.025％キシレンシアノール）を試料に加え、85℃5分加熱した 。試料5μｌは次に20％変性（7Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲルにロードし、試 料中の 切断産物の長さ解析のために400ボルト3時間、電気泳動を行った。電気泳動後、 -70℃で12時間、ゲルを直接Ｘ線写真フィルムに感光させることによってオート ラジオグラフィーをが行った。 患者Ａ由来の試料の解析によって、利用されなかった26nおよび28nプライマ ーに加えて、39n、33n、31nの切断産物が見られた。この切断産物のパターンは 、患者ＡがＲＹＲ1遺伝子の候補座位7370の正常対立遺伝子に関してはホモ接合 体であり、かつＧ7301Ａ変異に関してヘテロ接合体である場合にのみ生じうるも のであつた。患者Ｂ由来の試料の解析によって、利用されなかった26nおよび28n プライマーに加えて、39n、33n、32nの切断産物が見られた。この切断産物のパ ターンは、患者ＢがＲＹＲ1遺伝子の候補座位7301の正常遺伝子に関してはホモ 接合体であり、かつＧ7370Ａ変異に関してヘテロ接合体である場合にのみ生じる ものであった。即ち、本発明の方法の適用によって、特定の変異の有無を二つの 座位について同時に解析することが可能であった。本実施例では、二つの候補座 位を調査した。本方法は、選択されるプライマーが線型増幅に働くが対数増幅は 行えない限りにおいて、ゲノムＤＮＡまたは増幅された標的ＤＮＡ中の複数の候 補座位に容易に適用され得る。 特定の長さの増幅ざれた核酸断片の生成は、感染性因子の診断または増幅さ れた核酸分子の確認に通常用いられる。本実施例においては、本発明の方法を使 用することによって、線型増幅によって特定の長さの一本鎖断片が生成した。特 定の長さの増幅断片を生成するための対数増幅ではなく線型増幅の利用が可能に なるため、これは本方法の有用な適用である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成９年７月２５日（１９９７．７．２５） 【補正内容】 「c）ＡＲＭＳ法のアニーリング条件は厳密でなければならず、したがってこの 方法を多くの場合に転用することは困難であり、また調べる各々の変異について 、最適化しなければならない。 従って、核酸診断分野において、迅速に大量の試料について候補座位の特定 の配列を検出するためのしっかりした方法が必要である。 Methods in Molecular Biology（Vol.9，1991，p51-68）においてＤＮＡ中 の多型マーカーを検出するための様々な迅速な方法が記載されている。多型は、 目的とする座位の周辺およびそれを含むＤＮＡの増幅そしてその座位におけるミ スマッチの検出により検出する。方法の一つは、ＤＮＡリン酸結合をミスマッチ の部位において切断し、それに続き修飾することを含み、そしてゲノムＤＮＡ中 の特定の多型の存在の有無を解析することを含む。その中で記載されている別の 方法は、ディフェレンシャルハイブリッド形成および／またはミス対合した塩基 対はハイブリッド形成工程中に生じたものかどうかに従属する、多型の部位に対 するオリゴヌクレオチドプライマーの伸長に依存している。これらの方法は、ゲ ノムＤＮＡ中の特定の多型の存在の有無を特定するために、ハイブリッド形成し 、あるいは増幅した産物を解析することに依存する。記載された方法は、修飾し た塩基(ＤＮＡグリコシラーゼの基質である)を増幅したＤＮＡ中に導入すること に関するものではなく、またＤＮＡフリコシラーゼによるこのような修飾塩基の 切除に関するものでもない。 発明の説明 本発明は、以下の工程を含む標的核酸試料における候補座位の特定の核酸配 列の存在の有無を迅速に検出するための方法を提供する： i）前記候補座位の中の１つまたはそれ以上のあらかじめ選択した位置へ、ＤＮ Ａ グリコシラーゼの基質である修飾塩基を導入し； ii）非塩基部位（abasic）を作成するために前記ＤＮＡグリコシラーゼにより修 飾塩基を切断し； iii）工程ii）において生じた非塩基部位(abasic)のリン酸結合を切断し；およ び iv）前記標的核酸配列中の前記候補座位における前記特定の核酸配列の存在の有 無を特定するための工程iii）の切断産物を解析すること。 本発明による方法は、単一の酵素および単一の工程がＤＮＡにおける多くの 既知の変異を検出するために使用可能である現在知られている方法よりも、顕著 な利点を提供する。従って、大量の試料も、本明細書の以下に例示するように迅 速に容易に処理可能である。」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴォーン，パトリック・マーティン アイルランド国コーク，フランクフィール ド，パークゲイト，ウエスト・アベニュー 175

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 以下の工程を含む、標的核酸試料中の候補座位（locus）における特定 の核酸配列の有無の迅速な検出方法： i）前記候補座位の事前選択された一つまたはそれ以上の位置（position）へ ＤＮＡグリコシラーゼに対する基質である修飾塩基を導入し； ii）非塩基部位（abasic）を生じるように、前記ＤＮＡグリコシラーゼにより 修飾塩基を切除（excise）し；そして iii）工程ii）で生じた非塩基部位（abasic）のリン酸結合を切断し（cleave ）； iv）前記標的核酸配列中の前記候補座位の前記特定の核酸配列の有無を同定す るために、工程iii）の切断産物を解析すること。 2. 正常なＤＮＡ前駆体ヌクレオチドおよび少なくとも一つの被修飾前駆体 ヌクレオチドを組み合わせて用いることで候補座位を増幅する、請求項1の方法 。 3. 少なくとも一つの増幅プライマーが候補座位に隣接する、請求項2の方 法。 4. 少なくとも一つのプライマーを標識する、請求項3の方法。 5. 少なくとも一つの前駆体ヌクレオチドを標識する、請求項2から4のいず れか一項の方法。 6. 化学修飾によって修飾塩基を候補座位に導入する、請求項１から５のの いずれか一項の方法。 7. ＤＮＡグリコシラーゼ酵素によって修飾塩基を切除する（excisc）、請 求項1から6のいずれか一項の方法。 8. ＤＮＡグリコシラーゼ酵素がウラシルＤＮＡグリコシラーゼである、請 求項7の方法。 9. ＤＮＡグリコシラーゼ酵素の基質を固定化する、請求項7または8の方法 。 10．アルカリで処理することによって非塩基部位のリン酸結合を切断する、 請求項１から９のいずれか一項の方法。 11．熱処理によって非塩基部位のリン酸結合を切断する、請求項1から9のい ずれか一項の方法。 12．酵素処理によって非塩基部位のリン酸結合をが切断する、請求項1から 9のいずれか一項の方法。 13．酵素が、非プリンまたは非ピリミジン部位を特異的に切断する酵素であ る、請求項12の方法。 14．修飾塩基がウラシルまたはヒポキサンチンである、請求項１から13のい ずれか一項の方法。 15．標的核酸試料がＤＮＡである、請求項1から14のいずれか一項の方法。 16．ＤＮＡが一本鎖、ホモ二本鎖、またはヘテロ二本鎖ＤＮＡである、請求 項15の方法。 17．標的核酸試料がＲＮＡである、請求項1から14のいずれか一項の方法。 18．増幅工程に先だって逆転写によってＲＮＡをｃＤＮＡに変換する、請求 項2に従属する場合の、請求項17の方法。 19．切断産物を特異的核酸プローブによるハイブリダイゼーションによって 検出する、請求項１から18のいずれか一項の方法。 20．請求項1から19のいずれか一項の方法を実施するための、試験用キット またはパック。