JP2006504399A - Ｄｎａ操作のための方法および組成物 - Google Patents

Ｄｎａ操作のための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、望ましい長さと配列構造を有する一重鎖伸長をポリヌクレオチド分子上に生成させる方法および組成物を提供する。一重鎖伸長を形成させる方法には以下の要件が含まれる：互いに所定の距離の位置に所定の方向性を有する少なくとも１つの切込みサイトと少なくとも１つの制限サイトを含むカセットの使用；または切込み剤で切込みが作られる修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチド分子内に導入させるプライマー依存性増幅。本発明が提供する方法および組成物は、ポリヌクレオチド分子に部位特異的変異を導入することを含むＤＮＡ配列の操作、および最適ベクターのようなレシピエント分子へのポリヌクレオチド分子または繋ぎ合せたポリヌクレオチド分子セットのクローニングのために利用することができる。

Description

（関連出願）
本出願は２００２年４月１２日出願の米国特許仮出願第６０／３７２，３５２号、２００２年４月１５日出願の米国特許仮出願第６０／３７２，６７５号および２００２年１０月２４日出願の米国特許仮出願第６０／４２１，０１０号の優先権を主張するもので、それらの出願は参照として本明細書に取り込まれる。
本発明は、標的ＤＮＡ分子の望ましい配列を単一の実験形式でクローニングおよび／または操作するための組成物および方法に関する。
従来技術において、ＤＮＡの操作およびクローニングの方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によるＤＮＡの増幅、制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断、組換え分子を作るための会合が挙げられる。これらの技術の限界は：ＤＮＡに特定の操作をするための適切な制限サイトがないために、それがＤＮＡ配列の望ましい位置を利用する実験的困難を生むこと；これはベクター適合性分子の収率が低いために、ポリメラーゼの鋳型非依存末端転移酵素活性でできる増幅生成物の３’−末端の非鋳型性ヌクレオチドを挿入することに起因する（Ｃｌａｒｋ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１６：９６７７−９６８６（１９８８））；および増幅したフラグメントの末端とレシピエント分子の末端の不適合により、ベクターへのフラグメントの効率的挿入或いは２個以上のＰＣＲ生成物の相互融合が出来なくなることなどである。ポリメラーゼの末端転移酵素活性によって生じる３’ヌクレオチドの付加は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使ったＰＣＲ生成物の末端研磨により解決できる（Ｈｅｍｓｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１７：６５４５−６５５１（１９９８））。或いは、３’末端に非鋳型性アデニンを有するＰＣＲ生成物をクローニングするために、特別に調製した３’−チミジン（Ｔ）突出を有するベクターを使うことができる（Ｍａｒｃｈｕｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１９：１１５４（１９９０））。しかし、平滑末端挿入もＴ／Ａ突出挿入も非効率的であり、上記の方法ではベクター内に挿入するフラグメントの方向性を制御することはできない。
ベクターの自家連結の背景を除いてＤＮＡの平滑末端挿入の効率を改善しようとする試みとして、自家連結ベクター分子内に再生したＳｍａＩサイトをＳｍａＩ制限エンドヌクレアーゼで切断してＳｍａＩ−直鎖状ベクターへ挿入することが挙げられる（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２：２８−３０（１９９２））。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州、米国）のＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔクローニングシステムに希有切断の制限酵素ＳｒｆＩが同様の目的で使われている。上記の方法は、もしＰＣＲ生成物の内部に１箇所でもＳｍａＩまたはＳｒｆＩサイトが含まれていたり、或いはＤＮＡベクターに挿入した後にそのサイトが再生される場合には効果がない。
別のクローニング法として、違った制限サイトを増幅プライマーの５’−末端に付加して、増幅中にそれらのサイトがＰＣＲ生成物の中に組込まれるようにし、増幅したＤＮＡ区分を調整する方法がある（Ｓｃｈａｒｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：１０７６−１０７８（１０８６））。ＰＣＲ生成物とベクターＤＮＡを同じ制限エンドヌクレアーゼによって切断すると、ＤＮＡリガーゼによって連結できる対応の一重鎖末端が生成する。しかし、この方法には次の様ないくつかの欠点がある。１）プライマーに導入された制限サイトがＰＣＲ生成物内のどこかにある場合、その内部のサイトもまたエンドヌクレアーゼ消化中に切断され、完全長のＰＣＲ生成物のクローニングが抑えられる。２）多くの制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡフラグメントの末端に近いサイトを効率よく切断できないため（Ｋａｕｆｍａｎ、ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：３０４−３０６（１９９２））、特定の制限エンドヌクレアーゼによる効率的切断を確実にするには、さらに３〜６ヌクレオチドをプライマーの５’末端に付加する必要がある。３）多くの制限エンドヌクレアーゼは増幅反応中の特定の成分によって阻害される。例えば、或る制限エンドヌクレアーゼは一重鎖ＰＣＲプライマーによって阻害されるので、制限エンドヌクレアーゼ消化の前にもう1段のＰＣＲ生成物の精製ステップが必要となる。４）制限エンドヌクレアーゼが作る末端は、しばしば自己補完的であるため、結果として、会合反応中に副産物を作り目的生成物の収量を大幅に低減させる。
これらの制限を克服するため、制限エンドヌクレアーゼ無しでＰＣＲ生成物に一重鎖末端を作ることのできる技術がいくつか報告されている。米国特許出願第０９／７３８，４４４号には、フラグメントを相補的末端と特異的に連結する一重鎖伸長を作るために、切込み（nicking）エンドヌクレアーゼが使われることが述べられている。
ＡｃｃＩおよびＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ末端と相補的な一重鎖末端はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの有する３'→５’エキソヌクレアーゼ活性によって生成される（Ｓｔｏｋｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１８：４２９０（１９９０））。ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰだけの存在下では、エキソヌクレアーゼ活性はＧおよびＣヌクレオチドの除去だけに限定され、その結果ＡｃｃＩおよびＸｍａＩで切断したプラスミドベクターにサブクローニングするのに必要な一重鎖末端が作られる。ＰＣＲ生成物の会合に依存しないクローニング（ＬＩＣ−ＰＣＲ）（Ａｓｌａｎｉｄｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１８：６０６９−６０７４（１９９０））と呼ばれる技術においては、標的ＤＮＡは、シトシンを欠く５’末端にさらに１２ヌクレオチドを有するプライマーによって増幅される。その結果、３’末端のＰＣＲ生成物はグアニンを欠く１２ヌクレオチド配列が側面に接する。ＰＣＲ生成物をｄＧＴＰの存在下でＴ４ ＤＮＡポリメラーゼに付随する３'→５’エキソヌクレアーゼで処理して、３’末端の配列を最初のｄＧＭＰ残基に到達するまで除去し、斯くして、１２ヌクレオチドの５’末端一重鎖伸長が残される。しかし、この技術の欠点は、クローニングのために適合する１２ヌクレオチドの５’一重鎖伸長を有する特殊なベクターが必要なことである。このようなベクターの調製は、標的フラグメントの増幅に使う末尾と相補的な１２ヌクレオチド末尾を有するプライマーでベクター全体を増幅し、続いて増幅したベクターをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して相補的な１２ヌクレオチド長の一重鎖伸長を作る。ＬＩＣ−ＰＣＲを改変した技術が報告されており、そこでは、特定の塩基のない特異的な配列がプラスミドベクターに組込まれ、制限消化工程によるベクター増幅ステップの代替をする（Ｈａｕｎ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：５１５−５１８（１９９２）；Ｋｕｉｊｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１１２：１４７−１５５（１９９２）；Ｃｏｏｎｙ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：３０−３３（１９９８））。
上記の方法の欠点は、ＰＣＲ生成物をエキソヌクレアーゼ操作する前に、残存するｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシド−３−リン酸）を除く必要があることである。この技術の利用は少なくとも１ヌクレオチドが欠けた配列に限定され、さらに、ＤＮＡ操作のために使う非特異的エキソヌクレアーゼは、回収した組み替え体分子のベクターと生成物の接合位置で配列の再配置を引起こす可能性がある。
一重鎖の張出しまたは伸長は、プライマー配列中に非塩基性残基の１，３−プロパンジオールを組込むことによって、ＰＣＲ反応中に作られる。これはＤＮＡ合成を終了させる効果を有する（Ｋａｌｕｚ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２２：４８４５（１９９４））。ＰＣＲ反応中に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは複製不可成分のところで停止し、プライマーの一部分を一重鎖として残す。１，３−プロパンジオールも生体内のＤＮＡ複製を阻害するので、バクテリア宿主の修復機構としては、得られた組換え体分子内に不要な配列の再編を起こす可能性がある複製不可成分は除去する必要がある。
ＤＮＡ修復酵素のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を使った遺伝子のクローニングおよび操作について報告がある（Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎらの米国特許第５，１３７，８１４号、Ｂｅｒｎｉｎｇｅｒの米国特許第５，２２９，２８３号、ＮｉｓｓｏｎらのＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１２０−１２３（１９９１）、ＲａｓｈｔｃｈｉａｎらのＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２：１２４−１３０（１９９２）、ＢｏｏｔｈらのＧｅｎｅ １４６：３０３−３０８（１９９４）、ＲａｓｈｔｃｈｉａｎのＣｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：３０−３６（１９９５））。ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）は一重鎖または２本鎖ＤＮＡ中のウラシルの障害を認識して、デオキシリボース部と塩基との間のＮ−グリコシル結合を切断し、進行不能部分を残す。ＰＣＲ反応中、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはデオキシウリジン（Ｕ）障害の反対側にデオキシアデノシンを挿入する。標的ＤＮＡとクローニングベクターは、ｄＵＭＰを含有する末尾を５’末端につけたプライマーで増幅される。続くＵＤＧグリコシラーゼ処理で、増幅生成物の末端に複数の進行不能サイトを生じさせる。増幅生成物の修飾部分および（同じ方法で作った）相補的末端を含んでいるベクターの重鎖を解離させることにより再会合し、バクテリア宿主の修復機構により生体内で除去される突き出しの一重鎖フラップを有するた組換え体産物が得られる。ｄＵ含有プライマーを用いる単一プライマー増幅（ＳＰＡ）によるｃＤＮＡのクローニングが米国特許第５，３３４，５１５号に述べられている。
ＵＤＧはホスホジエステル基幹を切断しないため、重鎖解離の効率はＰＣＲ生成物の５’末端内にあるｄＵＭＰ残基の数に大きく依存する。従って、ＤＮＡ二重鎖の２本の鎖を効率的に解離させるためには、ＰＣＲプライマーの５’尻尾の少なくとも３分の１がｄＵＭＰから成らなければならない（米国特許第５，１３７，８１４号、米国特許第５，２２９，２８３号）。この方法のもう１つの欠点は、ＵＤＧ処理したＰＣＲフラグメントのサブクローニングに適切な相補的な伸長と、側面を接する直鎖状のベクターを得るために、ＰＣＲにより完全なプラスミドベクターが増幅されなければならないことである。
ＵＤＧグリコシラーゼは、ＰＣＲフラグメントにＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ様の結合性末端を作るためにも使われており、それはＳａｃＩで直鎖状にしたベクターにクローニングするのに適している（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：３２８−３３２（１９９２）；Ｗａｔｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２３：８５８−８６２（１９９７））。しかし、この技術には、ＰＣＲ生成物をＳａｃＩサイトにしかクローニング出来ないという厳しい制限がある。この方法の他の欠点は、ＳａｃＩ様の結合性のある末端が自己補完的であることで、そのため、会合に際して種々の不必要な福産物が出来てしまい、この技術はＰＣＲ生成物のクローニング以外のＤＮＡ操作にはあまり使われない。
ＰＣＲ生成物に一重鎖の張り出しをつくる化学的な方法には、ｒＵＭＰまたはｒＣＭＰのようなリボヌクレオチドを含有するＰＣＲプライマーが使われる（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：５１７−５２０（２００２）；Ｊａｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，３５８，７１２号）。増幅後、ＰＣＲ生成物のデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を加水分解するために、ランタン（Ｌａ３＋）またはルテチウム（Ｌｕ３＋）などの希土類金属イオン（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：５１７−５２０（２００２））または水酸化ナトリウム（Ｊａｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，３５８，７１２）で処理する。欠点はＰＣＲプライマーがコスト高であること、さらにベクターＤＮＡがサブクローニングに適する対応の末端を作るためにリボヌクレオチドを含有するプライマーを使ってＰＣＲで調製しなければならないことである。
上記のＰＣＲを基盤としたサブクローニング技術の或るものは部位特異的ＤＮＡ突然変異のためにも使うことができる。しかし、その適用は特定の変更を残りのコード配列を崩壊させることなく導入できる場合に限られる。例えば、適切な制限サイトが変異の標的となるヌクレオチド配列の近傍にある場合に目的の変異を導入するためには、ＰＣＲを基盤にしたオリゴヌクレオチド標的の部特異的突然変異法が通常的に使われ、変異したＰＣＲフラグメントは制限エンドヌクレアーゼ消化を用いて野生型配列の位置に導入される（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１６：７３５１−７３６７（１９８８））。しかし、自然に生じる適切な制限サイトを得ることが出来ない場合は、内部に変更を導入するためにさらに実験的処理を行う必要がある。
別のＰＣＲ依存の突然変異法は“メガプライマー（ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ）”の使用である。メガプライマーは長い二重鎖ＤＮＡで、変性、会合および全長伸展させることがしばしば困難である。従って、この方法は、メガプライマーが数百塩基対以上に長い場合に問題のあることが知られている（Ｋａｍｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１７：５４０４（１９８９）；Ｓａｒｋａｒ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８：４０４−４０７（１９９０）；Ｓａｒｋａｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０：４９３７−４９３８（１９９２）；Ｌａｎｄｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９６：１２５−１２８（１９９０）；Ｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５４：１５７−１７８（１９９７）；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：４３８−４４２（１９９７）；Ｃｏｌｏｓｉｍｏ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６：８７０−８７３（１９９９））。
“オーバーラップ伸長”ＰＣＲと呼ばれる別なＰＣＲ依存の部位特異的突然変異法が報告されている（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１６：７３５１−７３６７（１９８８）；Ｈｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７７：５１−５９（１９８９））。最初の２つのＰＣＲ反応で、重複（オーバーラップ）した２つのＤＮＡフラグメントが作られ、その両者は共に重複配列部分に変異原性プライマーを経由して導入された同じ変異を有する。次に、これらのフラグメントを一緒にして変性させ、再会合させて、オーバーラップ配列を経由した複素二重鎖産物を作る。再会合した複素二重鎖産物では、３’側の重複したそれぞれの鎖が相補的鎖伸長のためのプライマーとして働く。拡張した実物大の融合体は外来のプライマーを使った第２ラウンドのＰＣＲで増幅される。しかし、オーバーラップ伸長法は煩雑であり、多くの実際的な利用においては幾つかの理由により効率的ではない。つまり、変異原性のプライマーを除去するために、中間ＰＣＲ生成物の精製が必要であること、２回の全工程ＰＣＲが必要であり、これが不必要な変異を誘導する可能性を増大させること、重複領域を超えたヘテロ分子会合の効率は、フラグメントの実物大の相補的ストランドが存在することにより著しく低下することなどである。
部位特異的突然変異およびクローニングのための単一ＰＣＲを基盤とした方法があれば、生体外ＤＮＡ操作に伴う全ての問題が解決するように見える。多様なＤＮＡ操作、例えば、いかなる望ましい位置にある標的ＤＮＡ分子の連結、付加、削除またはヌクレオチド区分の変換などをも成し遂げることのできる単一戦略が望まれる。
本発明の１つの態様として、望ましい長さと配列構造を有する一重鎖の伸長をポリヌクレオチド分子上に生成させる方法を提供する。その方法には以下のステップが含まれる；１つのカセットをポリヌクレオチド分子中の所定の部位へ挿入する；カセット中の切込みサイトに特異的な切込みエンドヌクレアーゼおよびカセット中の制限サイトに特異的な制限エンドヌクレアーゼによってポリヌクレオチド分子を切断する；切込みサイトと制限サイトの間の切断されたポリヌクレオチド分子を解離させ、望ましい長さと配列構造を有する一重鎖の伸長を生成させる。
上記の方法に加えて、本発明のもう１つの態様はカセットである。該カセットはポリヌクレオチド分子中に挿入できる２本鎖ＤＮＡを含んでおり、制限サイトから約５０ヌクレオチド未満の位置に切込みサイトを有する。カセット中にある制限サイトはポリヌクレオチド分子中には存在しない。
上記実施態様の特定の例において、方法にはカセットの使用が包含され、そのカセットは以下のサイトを含む；３’または５’の左側または右側に一重鎖伸長生成のための切込みサイトおよび制限サイト；または左側および右側に３’または５’ 一重鎖伸長を生成するために切込みサイトによってどちら側の側面にも接する１つの制限サイト；２つの一重鎖伸長を生成するための、２つの切込みサイトの間に位置した２つの制限サイト。切込みサイトと制限サイト間の配列によって一重鎖伸長生成物の長さと構造が決まる。一重鎖伸長産物は約２０ヌクレオチド以下の長さが好ましい。カセット内に２つの制限サイトがある例においては、制限サイト間にスペーサー配列を入れることができる。ある条件下でスペーサーがマーカーをコードし、そして、カセットが挿入されるポリヌクレオチドが、分子宿主細胞内で複製できるレシピエント分子であることが望ましいところのコード配列に基づいてスペーサー領域が選択されてよい。スペーサー配列は、カセットを挿入したレシピエント分子で形質転換された宿主細胞内でどのレシピエント分子がカセットを有しているか、どのレシピエント分子はカセットが無いかまたは損傷したカセットを有しているかを判定する手段を提供する。
上記実施態様の別の例として、カセットは、カセット内の制限サイトから上流（左側）または下流（右側）の位置に、切込みエンドヌクレアーゼにより２本のうちの最初の鎖（上の鎖）または２本のうちの二番目の鎖（下の鎖）を切るのに適切な配向性を有する切込みサイトを含む。２つの切込みサイトがあるカセットでは、それらは互いに逆方向になる。
上記実施態様の別の例として、レシピエント分子はベクターでよく、そのベクターはｐＮＥＢ２０５Ａ，ｐＮＥＢ２００Ａ、ｐＮＥＢ２１０Ａ、およびｐＵＣ−ＴＴから選択できる。
本発明のもう１つの実施態様として、切込み剤は２種以上の酵素の混合物を含んでおり、少なくともそれら酵素の１つがＤＮＡグリコシラーゼおよび少なくともそれら酵素の１つが一重鎖切断酵素である。切込み剤はポリヌクレオチド分子から修飾されたヌクレオチドを切除する働きがある。
上記実施態様の特定の例において、切込み剤中の少なくとも１つの一重鎖切断酵素は、修飾ヌクレオチドが切除された後で、ポリヌクレオチド分子に５’リン酸を生じさせる。この活性はさらに一重鎖切断酵素のＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼおよびＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼの使用によって例示される。代わってさらに、切込み剤は少なくとも１つの一重鎖切断酵素を含み、該酵素によって例えばＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼを使って、修飾されたヌクレオチドを切除した後でポリヌクレオチド分子に３’ＯＨを生じさせる。
上記の修飾されたヌクレオチドにはデオキシウリジン（Ｕ），８−オキソ−グアニンまたはデオキシイノシンが含まれる。これらの修飾されたヌクレオチドを切除できる切込み剤の例には、たとえば、デオキシウリジン（Ｕ）切除のためには、ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼと混合したＵＤＧグリコシラーゼ；ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼと混合したＵＤＧグリコシラーゼ；ＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼと混合したＵＤＧグリコシラーゼ；ＵＤＧグリコシラーゼ、ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼ、ＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼの混合物；８−オキソ−グアニンおよびデオキシウリジン（Ｕ）切除のためには、ＵＤＧグリコシラーゼ、ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼおよびＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼと混合物；ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼと混合したＵＤＧグリコシラーゼ；デオキシイノシン切除のためには、ＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼと混合したＡｌｋＡグリコシラーゼまたはＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼと混合したＡｌｋＡグリコシラーゼが挙げられる。特定の例においては、切込み剤に含まれるグリコシラーゼと一重鎖切断酵素の活性の比率は約２：１である。
本発明のもう１つの実施態様では、ポリヌクレオチド分子上に望ましい長さと構造を有する一重鎖伸長を生成させる方法を提供する。その方法には次のステップが含まれる；ポリヌクレオチドの特定の位置へ修飾ヌクレオチドを挿入する；切込みと側面を接する末端配列を作るために、ポリヌクレオチド上の修飾ヌクレオチドの位置を切込み剤で切断する；望ましい長さと配列構造を有する一重鎖伸長を生成させるために末端配列を解離する。
実施態様の特定の例において、ポリヌクレオチド分子は標的分子のプライマー対依存ＤＮＡ増幅の産物である。さらに、プライマー対中の各々のプライマー、或いはプライマー対中の１つのプライマーは修飾ヌクレオチドを含むことができる。ポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長の構造は２本目のポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長と相補的な構造であっても良い。
本発明のもう１つの実施態様では、標的分子内に部位特異的突然変異を作る方法が提供される。この態様は、標的分子を増幅するために２組のプライマーを選択することであり、１番目のプライマー対は１番目の増幅生成物を作り、２番目のプライマー対は２番目の増幅生成物を作る。各プライマー対の内の１つのプライマーには修飾ヌクレオチドが含まれ、それらプライマーの配列は５’末端で相補的である。これらプライマーの１つまたは両方の相補的または非相補的な５’配列には突然変異が随意に含まれ、そこで標的分子に対しての相補性が決まる。次に、標的分子は２つのプライマー対を使って増幅され、２つのポリヌクレオチド分子が形成される。これらのポリヌクレオチド分子の修飾ヌクレオチドのところに切込み剤を使って切込みが入れられる。次に、ポリヌクレオチド分子は切込みと５’末端の間が解離され、２本のポリヌクレオチド分子上に互いに相補的な３’一重鎖伸長が形成される。１本のポリヌクレオチド分子は相補的な一重鎖伸長を介して再会合し、部位特異的突然変異を有する標的分子が形成される。
上記実施態様の１例において、プライマーの修飾ヌクレオチドに隣接した５’末端の配列は、標的分子に対して非相補的であると特徴付けられる。他の例において、２つのプライマー対の夫々からの１つのプライマーは開始配列と５’末端領域の間に１つの修飾ヌクレオチドを有しており、その点に関し、開始配列は標的分子に対して相補的であり、２つのプライマーの修飾ヌクレオチドに隣接した５’末端領域は互いに相補的である。
さらに、少なくとも１つのプライマー上の修飾ヌクレオチドは開始配列と５’末端領域の接合部に位置することができる。あるいは、少なくとも１つのプライマー上の修飾ヌクレオチドは５’配列と開始配列に隣接した挿入配列の間に位置することができる。もう１つの配置では、それぞれのプライマー上の開始配列が介在配列で分割された標的分子上の配列を補完することができる。
前記の部位特異的変異は１個以上のヌクレオチドの変更または挿入ヌクレオチド配列である。
本発明のもう１つの実施態様において、ＤＮＡ鋳型の開始に適切なオリゴヌクレオチドは、５’にＧＧＡＧＡＣＡＵ、ＧＧＧＡＡＡＧＵ，ＡＣＧＡＧＡＣＵ、ＡＣＣＡＧＡＣＵおよびＧＧＧＧＧ（８−ｏｘｏ−Ｇ）から選択される配列を有し、ＤＮＡ鋳型の５’末端と同じ配列に隣接する。
本発明のもう１つの実施態様において、複数の直鎖状ポリヌクレオチド分子を連結して１つの分子を形成させる方法を提供する。その方法には複数のポリヌクレオチド分子それぞれの一端または両端に、前記のカセットを用いて一重鎖伸長を生成させることが含まれる。生成物は、１本のポリヌクレオチド分子に別のポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長に対して相補的な少なくとも１個の一重鎖伸長が含まれる。その結果、複数のポリヌクレオチド分子が連結して、１つの分子が形成される。
もう１つの実施態様において、複数の直鎖状ポリヌクレオチド分子を連結して１つの分子を形成する方法を提供する。この方法は、上記のプライマー依存性増幅法を使って、複数のポリヌクレオチドの１つまたは両方の末端に一重鎖伸長を形成させることから成る。生成物には、１本のポリヌクレオチド分子に、別のポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長に対して相補的な少なくとも１個の一重鎖伸長が含まれる。その結果、複数のポリヌクレオチド分子が連結して、１つの分子が形成される。
本発明のもう１つの実施態様において、標的分子をレシピエント分子に挿入する方法を提供する。その方法は、カセット内のサイトが切断された後、レシピエント分子の末端に第１と第２の一重鎖伸長を形成させることから成る。一重鎖伸長はプライマー依存性増幅により標的分子上に形成される。標的分子の１つの末端に付いた一重鎖伸長は、レシピエント分子上の第１の一重鎖伸長と相補的である。そして標的分子のもう一方の末端はレシピエント分子上の第２の一重鎖伸長と相補的であり、その結果として標的分子とレシピエント分子が結合し、１つの標的分子ができる。
上記実施態様の特定の例において、標的分子は複数のポリヌクレオチドの連結の産物か、またはエクソンのような個別に保存されたＤＮＡドメイン（機能領域）に相当する。さらに、レシピエント分子上の第１および第２の一重鎖伸長は同一配列でも違った配列でも良い。
本発明の１つの実施態様において、切込み剤および直鎖状ベクターから成るキットを提供する。そのキットにはさらにＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４Ｄ ＮＡリガーゼまたは少なくとも１つの配列決定プライマーを加えることができる。
本発明の１つの実施態様において、上記実施態様に従って作られた一重鎖伸長を経て、標的分子が挿入されたレシピエント分子を有する宿主細胞を提供する。
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書および付属する特許請求の範囲に使用される以下の用語の定義は下記の通りである。それらの定義は、用語が使用されている文脈が特に要求しない限り適用されるべきである。
本明細書において使用される用語「一重鎖伸張」は、ポリヌクレオチド分子の二重鎖領域から伸張される一重鎖領域を表す。
用語「ポリヌクレオチド分子」は、一重鎖または二重鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、もしくはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを意味する。ポリヌクレオチド分子は、いかなる長さでもあり得、オリゴヌクレオチド、プラスミド、染色体ＤＮＡ，二重鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、増幅ＤＮＡ断片およびその他の天然に存在するまたは合成の二重鎖核酸を包含する。
用語「プライマー」は、標的分子のポリメラーゼ依存性増幅用の基質を形成するオリゴヌクレオチド配列を意味し、ここで、少なくともオリゴヌクレオチド配列の一部は、二重鎖標的ポリヌクレオチド分子の一つの鎖の前もって選択されている配列に相補的である。オリゴヌクレオチド配列は、標準的技術を使って合成的に調製される。
本明細書で使われる用語「標的分子」は、操作のために選択されたポリヌクレオチド分子、例えばＤＮＡの一部を意味する。
本明細書で使われる用語「レシピエント分子」は、宿主細胞中で複製されることができる二重鎖ポリヌクレオチド分子を包含する。
本明細書で使われる用語「線状化した（linearized）ベクター」は、線状（linear）の形態またはその他いずれの非環状のＤＮＡに変換されたレシピエント分子をも意味する。
本明細書で使われる用語「組換え分子」は、少なくとも二つの標的分子から構成されたポリヌクレオチド分子を意味する。この用語は、また、レシピエント分子に挿入された標的分子の複製が宿主細胞中で起こるように、レシピエント分子および少なくとも一つの標的分子から構成された環状ポリヌクレオチド分子を包含する。
用語「宿主細胞」は、限定なしに、哺乳類、昆虫、酵母、細菌またはその他の生物からの細胞を包含する、どのような真核生物または原核生物をも意味する。
用語「特異的切込み［特異的に切込みを入れる］」は、選択された位置でのポリヌクレオチド分子内のホスホジエステル結合の加水分解を意味する。特異的切込みの後では、ポリヌクレオチド分子は、もはや、選択された位置で連続的に共有結合で連結しない。
用語「選択された位置」は、修飾ヌクレオチドであり得る、少なくとも一つのヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド分子またはプライマー中の特異的配列を意味する。
用語「カセット」は、二重鎖核酸を意味する。カセットは、配列特異的切込みエンドヌクレアーゼによって認識される少なくとも一つの配列特異的切込み部位、および配列特異的制限エンドヌクレアーゼによって認識される少なくとも一つの配列特異的制限部位の、前もって選択された組合せを含有する。カセットの切込みおよび制限部位は、限定された配列によって互いに分離されており、相互的に順序づけられ配列されている。カセットの最小配置におけるカセットの境界は、図１９−２２に示すように、切込み部位および制限部位の一つによって、または二つの切込み部位の位置によって決定される。しかしながら、カセットの境界は、最小配置の外側の非必須ヌクレオチド配列を取込んで伸張することができる。
用語「修飾ヌクレオチド」は、天然に生じる非修飾ヌクレオチド、すなわちｄＡ、ｄＴ、ｄＧおよびｄＣから化学的に区別し得るヌクレオチドを意味する。修飾ヌクレオチドは、さらに、非修飾ヌクレオチドの代わりにポリヌクレオチド分子に取込まれる能力によって特徴付けられる。
用語「切込み剤」は、配列特異的標的を認識し、そのような配列特異的標的に対し規定された関係内において、または関係においてホスホジエステル結合のところの標的に切れ目をいれることの両方を行うことができる試薬を意味する。標的は、少なくとも一ヌクレオチドを含み、そのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。
用語「人工の」は、特定の目的を達成するためにインビトロで結合した試薬または分子を意味する。
用語「包含する」は、非限定的であることを意図する。
用語「ＤＮＡグリコシラーゼ」は、ポリヌクレオチド分子からヌクレオチドの修飾された窒素を含むヘテロ環式成分の除去を引起すグリコシラーゼ活性を有するいかなる酵素も意味する。
用語「一重鎖切断酵素」は、（ｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ、リアーゼもしくはＡＰ部位が形成された後にホスホジエステル結合を切断するその他の酵素、または（ｉｉ）修飾ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド分子中の一重鎖領域において直接切断する酵素を意味する。
下記に記載するのは、規定された長さの一重鎖伸張の生成に関する方法および組成物、およびポリヌクレオチド分子中の組成である。ここに特定の文献を提示していない分子生物学的技術の何れも、ＳａｍｂｒｏｏｋのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２００１（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ）において提供されるプロトコールに従って達成できるであろう。
本発明の本実施態様に従ってポリヌクレオチド分子上で生成される一重鎖伸張は、その長さおよびヌクレオチド配列に関して正確な設計によって特徴づけられる。ポリヌクレオチド分子の一重鎖伸張は、ここに記載される方法の実施態様に従って製造することができる最大の長さに特別の限定がなく、いかなる望ましい長さにもすることもできる。しかしながら、実際には、一重鎖伸張の長さは、相補鎖から自己解離する能力に従って選択される。従って、一重鎖伸張の好ましい長さは、約２０ヌクレオチドよりも大きくなく、好ましくは約１４ヌクレオチドより少ない。本明細書で記載される使用のためには、一重鎖伸張の長さは、少なくとも約５ヌクレオチドであるべきである。
カセットを使用した一重鎖伸張の生成
ポリヌクレオチド分子中で一重鎖を伸張する工程は、ポリヌクレオチド分子にカセットを先ず挿入することを包含する。カセットは、例えば、制限エンドヌクレアーゼクローニング法またはＰＣＲ増幅を用いていかなるポリヌクレオチド分子にも挿入することができる。
切込みエンドヌクレアーゼおよび制限エンドヌクレアーゼの選択された組合せと共にカセットを含有するポリヌクレオチド分子の切断により、望ましい長さと組成の少なくとも一つの一重鎖伸張が生成される。一つまたはそれ以上の切込みエンドヌクレアーゼは、一核酸鎖のカセットのみに特異的に切込みを入れる。一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼは、両核酸鎖のカセットを切断する。カセット内では、一つまたはそれ以上の制限部位に関する一つまたはそれ以上の切込み部位の位置および配向によって、一重鎖伸張の配向および長さが決定される。選択された数のヌクレオチドを切込み部位と制限部位の間に挿入することによって、長さを随意に変えることができる。
一重鎖伸張のヌクレオチド組成は、カセット中に存在する切込み部位および制限部位のヌクレオチド配列に依存する。一重鎖伸張の組成に顕著な寄与は、各切込み部位および制限部位の間に挿入された可変ヌクレオチド配列に由来する。実際、実務家は、カセット中に挿入するための公知の部位から最も便利は切込み部位および制限部位を決め、望ましいヌクレオチド組成を有する一重鎖伸張を得るための部位の間にヌクレオチド配列の長さおよび組成を必要に応じて作製する。
開裂したポリヌクレオチド分子の一端または両端、および二本の３’または５’末端のいずれかに一重鎖伸張が生成するように、カセットを設計することができる。これは、カセットの制限部位に関する切込み部位の選択的配向によって達成することができる。切込みエンドヌクレアーゼが、二重鎖切込み部位の一重鎖のみを切断するので、部位の配向性によって、上部鎖と下部鎖のどちらに切込みが入れられるかが決まる。切込みによって接した末端配列は、切込みが制限エンドヌクレアーゼによって引起こされた二重鎖破壊の近くに導入されるので、相補鎖から自己解離する。自己解離の後、ポリヌクレオチド分子は、どの鎖が切込みを入れられるかに従って５’かまたは３’一重鎖伸張のいずれかに接して残される。
ポリヌクレオチド分子での一重鎖伸張の生成用カセットの設計には柔軟性がある。この柔軟性は、接した制限部位に関する切込み部位の順序、配向および間隔を整えるために利用できる選択の自由から生じる。カセットの好ましい長さは、５ヌクレオチドより大きい。二つの制限部位の間にスペーサー領域が存在する場合は、カセットの長さに上限はない。一制限部位のみが存在する場合は、切込みを入れられていない鎖から自己解離する末端の切込みが入った鎖の能力によってカセットの長さでの上限が決定される。
一般的な上記内容について、ここにより詳細に記載する。図１−６にカセットの望ましい配置を例示する。
図１、２および５は、ポリヌクレオチド分子の選択された部位に３’または５’一重鎖伸張をつくるためにどのようにカセットが設計されるかを示している。図１は、切込み部位が制限部位の上流にあり、下部配列の切込みを許容する配向にあるカセットを示している。制限エンドヌクレアーゼおよび切込みエンドヌクレアーゼによる、カセットを含有するポリヌクレオチド分子の重複消化によって、ポリヌクレオチド分子の左端断片の３’一重鎖伸張が生成する。代わりに、切込み部位が、制限部位の下流に位置し、上部鎖の切込みを提供するように逆になると、ポリヌクレオチド分子の右端断片上に３’一重鎖伸張が生じ得る（図２）。同様に、５’一重鎖伸張を、右または左断片上に生成させることができる（図５）。
図３、４および６は、どのようにして、望ましい長さおよび組成の一重鎖伸張を、ポリヌクレオチド分子の両末端上に生成するように設計することができるかを示している。従って、カセットは、一つの制限部位のいずれかの側（図３）に、または、同じ（図４）かまたは異なる（図６）二つの制限部位のいずれかの側に位置する二つの逆配向する切込み部位を包含して、二つの一重鎖伸張を生成する。図３および４に示したカセットは、同じ切込みエンドヌクレアーゼの二つの切込み部位を示す：部位Ａおよび逆の部位Ａの両方が、切込みエンドヌクレアーゼＡによって認識され、部位が逆配向であるゆえに切込みが反対側の鎖に入れられる。また、二つの別個の切込みエンドヌクレアーゼによって認識され切込みを入れられる、二つの同じでない切込み部位も使用可能である。同様に図４および６のカセットは、認識配列が一重鎖伸張を生成するための望ましいヌクレオチド組成を提供することを前提とした、二つの同じでない制限部位を包含している。例えば、図５および６は、切込みエンドヌクレアーゼＣのための切込み部位および制限エンドヌクレアーゼＤのための制限部位を含有するカセットを示しているが、図１ないし４においては、部位ＡおよびＢが示されている。
図３に示すようなカセットは、付加的なスペーサー配列を含むように修飾することができる（図６）。制限エンドヌクレアーゼおよび切込みエンドヌクレアーゼでの切断により、スペーサー配列が除去され、図３におけると同じ一重鎖伸張が生成する。カセットにスペーサー配列を導入する利点は、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を提供することである。選択マーカーの存在によって、形質転換した宿主細胞において切断と非切断カセットの間の区別が可能になる。選択マーカーの例としては、トキシン、薬剤耐性因子、酵素、抗原、蛍光およびケミルミネセンスマーカーおよびｓｉＲＮＡが挙げられる。
切込み部位は、切込みエンドヌクレアーゼによって特異的に認識され、切込みを入れられるいかなる配列をも包含している。切込み部位の配列は、そこでエンドヌクレアーゼが結合する配列およびそこでそれが開裂する配列を包含し、それが認識部位の内側であっても、または認識部位の外側であってもよい。認識部位の内側または認識部位から離れたところに切込みを入れるどのような切込みエンドヌクレアーゼでも使うことができる。例としては、ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ↓を認識し切込みを入れる切込みエンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢＩ；ＣＣ↓ＴＣＡＧＣを認識し切込みを入れるＮ．ＢｂｖＣＩＢ；ＧＣ↓ＴＧＡＧＧを認識し切込みを入れるＮ．ＢｂｖＣＩＡ；ＧＧＡＴＣＮＮＮＮ↓を認識し切込みを入れるＮ．ＡＩｗＩ；およびＧＣ↓ＴＮＡＧＧを認識し切込みを入れるＮ．Ｂｐｕ１０Ｉ（米国特許第６，３９５，５２３号およびＥＰＯ特許特許第１１７６２０４号）がある。例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２６２７３および米国特許出願第０９／７３８，４４４号において考察されている方法によるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの修飾に由来する、どのような切込みエンドヌクレアーゼの使用も、本明細書に包含される。
制限部位は、制限エンドヌクレアーゼによって特異的に認識されるいかなる配列をも包含している。制限部位は、そこでエンドヌクレアーゼが結合する配列、そして、そこでそれが開裂する配列を包含し、それが認識部位の内側であっても、または認識部位の外側であってもよい。制限エンドヌクレアーゼの例には、ＲＥＢＡＳＥＴＭ（ｗｗｗ。ＮＥＢ．ｃｏｍ）に挙げられている制限エンドヌクレアーゼのいずれも包含される。
望ましい長さおよび組成の一重鎖伸張がつくられるポリヌクレオチド分子は、さらに環状ベクターおよび線状分子、例えばゲノムＤＮＡまたはＤＮＡの断片、を含むレシピエント分子を包含する。別のポリヌクレオチド分子に対して一重鎖伸張に相補性であるポリヌクレオチド分子上で一重鎖伸張を使用すると、二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド分子が結合して単一分子が形成される。例えば、相補的一重鎖伸張を使って標的ＤＮＡ分子をレシピエント分子に挿入することができる。
レシピエント分子に対する一重鎖伸張は、はじめにカセットをレシピエント分子に挿入することによって形成することができる。次いで、制限エンドヌクレアーゼと切込みエンドヌクレアーゼの適当な組合せでカセットが切断され、両端に望ましい長さと組成の一重鎖伸張を有する線状化レシピエント分子が形成される。
３’または５’一重鎖伸張を有するレシピエント分子は、相補的一重鎖伸張を有するポリヌクレオチド分子（標的分子）の挿入を許容し、組換え分子を形成する。組換え分子は、形質転換宿主細胞中で複製することができる。
望ましい長さおよび組成の一重鎖伸張を有する線状化レシピエント分子の生成は、実施するのは簡単であり、そして利点を有しており、以下を包含する：（ａ）一重鎖伸張は、どのような望ましい長さ、すなわち制限エンドヌクレアーゼで切断されてつくられるものよりも長くてもよい；（ｂ）一重鎖伸張は、非自己相補性であるように設計することができる、すなわち、レシピエント分子末端が形質転換可能な環状ＤＮＡを形成するよう再会合しないために、互いに相補性ではない；および（ｃ）各々の一重鎖伸張は、独特のヌクレオチド配列を担持するように設計され、それによって挿入された標的分子の配向の制御ができるようになる。異なった３’一重鎖伸張を形成するよう設計されたカセットを含有するレシピエント分子の例としては、実施例Ｉおよび図１９−２２および図２７において提供され、プラスミドベクターｐＮＥＢ２００Ａ、ｐＮＥＢ２０５Ａ、ｐＮＥＢ２１０ＡおよびｐＵＣＴＴを包含する（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。
特に、ベクターｐＮＥＢ２０５Ａ中のカセット（図１９）は、一重鎖ＸｂａＩ制限部位によって分離された二つのＮ．ＢｂｖＣＩＢ切込み部位を担持している。Ｎ．ＢｂｖＣＩｂおよびＸｂａＩ部位は、上記の特異的酵素によるレシピエント分子の消化が、両末端に８ヌクレオチド長の一重鎖伸張、ＧＧＧＡＡＡＧＴ−３’およびＧＧＡＧＡＣＡＴ−３’によって接された線状化ベクターを提供するように配列されている。ベクターｐＮＥＢ２００Ａ中のカセット（図２０）は、二つのＸｂａＩ制限部位によって分離された二つのＮ．ＢｓｔＮＢＩ切込み部位を担持している。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩおよびＸｂａＩ部位は、上記の特異的酵素によるレシピエント分子の消化が、両末端に８ヌクレオチド長の一重鎖伸張、ＡＣＧＡＧＡＣＴ−３’およびＡＣＣＡＧＡＣＴ−３’によって接された線状化ベクターを提供するように配列されている。ベクターｐＮＥＢ２１０Ａ中のカセット（図２１）は、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位によって分離された二つのＮＢｂｖＣＩＢ切込み部位を担持している。Ｎ．ＢｂｖＣＩＢ、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位は、上記の特異的酵素によるレシピエント分子の消化が、一末端にＧＧＧＧＧＧ−３’の６ヌクレオチド長の一重鎖伸張および別の末端にＧＧＡＧＡＣＡＴ−３’の８ヌクレオチド長の一重鎖伸張によって接された線状化ベクターを提供するように配列されている。ベクターｐＵＣＴＴ中のカセット（図２２）は、二つのＢａｍＨＩ制限部位によって分離された二つのＮ．ＢｂｖＣＩＢ切込み部位を担持している。Ｎ．ＢｂｖＣＩＢおよびＢａｍＨＩ部位は、上記の特異的酵素によるレシピエント分子の消化が、両末端に６グアニンの３’一重鎖伸張によって接された線状化ベクターを提供するように配列されている。
カセットの特異的な例が、一重鎖伸張を生成するために上記のように提供されるが、種々の制限部位および／または切込み部位を、同じ一重鎖伸張を生成するために使用することができる。例えば、ＢｓｐＨＩ（Ｔ↓ＣＡＴＧＡ）またはＢｓｐＥＩ（Ｔ↓ＣＣＧＧＡ）またはＢｃｌＩ（Ｔ↓ＧＡＴＣＡ）またはＢｓｒＧＩ（Ｔ↓ＧＴＡＣＡ）のいずれかの制限部位を、図２０に示したのと同じ一重鎖伸張を生成ために、ＸｂａＩ部位と置換することができる。Ｎ．ＡｌｗＩまたはＮ．ＢｂｖＣＩＡの切込み部位が、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩまたはＮ．ＢｂｖＣＩＢ部位のいずれかの代わりの部位用に使用することができる。制限部位および切込み部位の選択は、結果として起こる一重鎖伸張の使用目的を考慮する場合にのみ制約を受ける。
切込み剤を使用した一重鎖伸張の生成
上記の３’一重鎖伸張の生成とは別の方法としては、プライマーが特異的部位に修飾ヌクレオチドを含有している、標的分子のプライマー依存性増幅が含まれる。増幅産物は、修飾ヌクレオチドにおいて特異的に切込みを入れる切込み剤で処理される。相補鎖から切込みされた一重鎖末端の解離によって、一重鎖伸張が生成する。プライマー依存的増幅の例としては以下を包含する：ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、鎖置換増幅法（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ）、転写介在増幅法（ＴＭＡ）およびリガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）。
増幅断片に挿入された修飾ヌクレオチドの使用は、以下の利点を提供する：（ａ）特異的切込み部位の長さを一ヌクレオチドと同じくらい短くできる；（ｂ）標的分子の前もって選択された位置に修飾ヌクレオチドを挿入することができ、切込みに対し独特な標的を表す；および（ｃ）多くの異なった型の修飾ヌクレオチド以外の個々の修飾ヌクレオチドを、同じかまたは数種の異なった標的内の数個の位置の各々に挿入することができ、その結果、複数の独特の特異的切込み部位を創成する。
標的分子に挿入するための修飾ヌクレオチドの例としては、デオキシウリジン（Ｕ）、８−オキソ−グアニン（８ｏｘｏＧ）、５，６ジヒドロチミン、チミングリコール、ウラシルグリコール、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルウラシル、７−メチルアデニン、７−メチルグアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、その他を包含する。標的分子の選択された位置への修飾ヌクレオチドの挿入は、当業者に周知の技術によって達成することができ、ポリヌクレオチド分子の化学的または酵素的合成法のいずれかを包含する［Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ３４３：３３−３７（１９９０）；Ｐｕｒｍａｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：７２−７８（１９９４）；Ｈｏｒｌａｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６３２９−６３３３（１９９５）；Ｌｕｔｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２４：１３０８−１３１３（１９９６）；Ｚｈａｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：３９６９−３９７３（１９９７）；Ｈｉｌｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２６：１１４４−１１４９（１９９８）；Ｌｉｕら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２６：１７０７−１７１２（１９９８）；Ｂｅｒｄａｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３６３−３６７（１９９８）；Ｐｕｒｍａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１００２６−１００３５（１９９８）；Ｌｕｔｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２７：２７９２−２７９８（１９９９）；Ｄｕａｒｔｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２７：４９６−５０２（１９９９）；Ｐｕｒｑｕｉｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：８５１６−８５２３（１９９９）；Ｋａｍｉｙａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２８：１６４０−１６４６（２０００）；Ｄｕａｒｔｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２８：１５５５−１５６３（２０００）］。
一実施態様において、少なくとも一修飾ヌクレオチドを含有する一重鎖オリゴヌクレオチドを、化学合成を含む手段でインビトロ合成することができる。化学的に合成されたオリゴヌクレオチド分子を、標的分子における配列の増幅用のプライマーとして使用することができる。実施態様の一態様において、５’末端に近接したプライマー配列に修飾ヌクレオチドを挿入することができる、例えば、修飾ヌクレオチドは、５’末端から２ないし２０ヌクレオチドの距離に挿入することができる。修飾ヌクレオチドの上流のプライマー配列の５’末端は、標的分子の配列に必ずしも会合する必要はない；代わりに、別のポリヌクレオチド分子の５’領域に相補的である注文設計した配列を含有することができる。このような状況で修飾ヌクレオチドの下流のプライマー配列は、プライマー配列の３’末端に標的分子をコピーする酵素的伸張を可能ならしめる標的分子の選択された領域に対して相補的である。プライマー設計のその他で考慮することは、例えば、プライミング配列の長さおよび融解温度のようなもので、当業者に周知である［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」ｐｐ．８．１３−８．１６（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．］。
少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含有するプライマー配列が、別の方法ではそのような修飾ヌクレオチドを欠くことになる酵素的ＤＮＡコピー法の複数回転によって、例えばプライマー伸張法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）依存性ＤＮＡ増幅法または鎖置換増幅法（ＳＤＡ）のようなその他のプライマー依存増幅手段によって、二重鎖標的分子に挿入されることになる。プライマー伸張または増幅のいずれかの方法および条件は、周知技術である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第５，３３３，６７５号、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ｐｐ．８．４−８．２９（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）。好ましくは、ＤＮＡコピー反応で利用されるＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも、産物分子の５０％に修飾ヌクレオチドの反対側に正しいヌクレオチドを挿入するものである。標的分子ではないが、プライマー配列は、増幅した分子の５’末端を決定するため、増幅後の標的分子は、少なくとも一端において付加配列によって伸張され、そして標的配列と付加配列の間の結合部に修飾ヌクレオチドを担持している。
増幅された標的分子は、修飾ヌクレオチド特異的切込み剤を用いて、修飾ヌクレオチドの位置に特異的に切込みを入れることができる。修飾ヌクレオチドが標的分子の５’末端に近接して挿入されると、切込みによって接された５’末端一重鎖領域は、少なくとも一つの３’一重鎖伸張と接した二重鎖標的分子を置き去りにして相補鎖から解離する。
修飾ヌクレオチドの位置での標的分子の特異的切込みは、物理的、化学的または酵素的手段またはそのような開裂手段の組合せを用いて、挿入された修飾ヌクレオチドにすぐ近いホスホジエステル結合の一またはそれ以上を選択的に開裂することによって達成することができる。
自然界は、ポリヌクレオチド分子に多数の障害に累積的に対応する広範な種類の酵素を産生してきた。そのような障害のいくつかは、修飾ヌクレオチドをもたらし、種々の酵素は、それらの修復にかかわっている。例えば、ＤＮＡ Ｎグリコシラーゼは、ヌクレオチドの修飾窒素含有複素環式成分を切り出し、ＡＰエンドヌクレアーゼは、塩基脱落（ＡＰ）部位に近接したホスホジエステル結合を開裂し、ＤＮＡグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼはこれら両者の機能を達成する。本発明のいくつかの実施態様においては、増幅されたＤＮＡ断片で一重鎖伸張を生成するのに使用する切込み剤を形成するために、特異性を有する修飾ヌクレオチドの修飾複素環式塩基を切断することができる酵素が、種々の不自然な組合せで選択された。
修復酵素の例としては、以下が包含される：
（Ａ）ＤＮＡ Ｎグリコシラーゼは、以下の酵素およびヒト同族体を包含する高級真核生物における同族体を包含する：ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ（ＡｌｋＡ）（ＮａｋａｂｅｐｐｕらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１３７２３−１３７２９（１９８４）、ＶａｒｓｈｎｅｙらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７７７６−７７８４（１９８８）、ＶａｒｓｈｎｅｙらのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：４０５５−４０６１（１９９１））。さらにＤＮＡ ＮグリコシラーゼはＴａｇＩグリコシラーゼおよびＭＵＧグリコシラーゼを包含する（ＳａｋｕｍｉらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１５７６１−１５７６６（１９８６）、ＢａｒｒｅｔらのＣｅｌｌ９２：１１７−１２９（１９９８））。
（Ｂ）ＡＰエンドヌクレアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉのエンドヌクレアーゼＩＶおよびヒト同族体ｈＡＰ１を包含する高級真核生物における同族体を包含する（ＬｊｕｎｇｑｕｉｓｔのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２８０８−２８１４（１９７７）、ＬｅｖｉｎらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：８０６６−８０７１（１９８８）、ＳａｐｏｒｉｔｏらのＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５１４１−５１４５（１９８８）、ＲｏｂｓｏｎらのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５５１９−５５２３（１９９１）、ＤｅｍｐｌｅらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１１４５０−１１４５４（１９９１）、ＢａｒｚｉｌａｙらのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２３：１５４４−１５５０（１９９５））。
Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶおよびその同族体は、ＤＮＡを第２のホスホジエステル結合で切断し傷害するが、その傷害は以下のいずれのものから選択してもよい：デオキシイノシン、デオキシウリジン（Ｕ）、ＡＰサイト、塩基−ミスマッチ、およびループ、ヘアピン、ＦｌａｐおよびシュードＹ ＤＮＡ構造（ＹａｏらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０７７４−３０７７９（１９９７）、ＨｅらのＭｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４５９：１０９−１１４（２０００））。
（Ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼは、選択された修飾ヌクレオチドを切除し、以下の酵素およびヒト同族体を包含する高級真核生物におけるその同族体を包含する：
（ｉ）酸化型ピリミジンを特異的に認識し除去することのできる酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＥｎｄｏＶＩＩＩ）、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩ（ＮＴＨ）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＮＴＧ１およびＮＴＧ２）およびヒト（ｈＮＴＨ１）中の同族体を包含する（ＭａｚｕｍｄｅｒらのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１１１９−１１２６（１９９１）、ＪｉａｎｇらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２２３０−３２２３９（１９９７）、ＨａｒｒｉｓｏｎらのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２６：９３２−９４１（１９９８）、ＳｅｎｔｕｒｋｅｒらのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２６：５２７０−５２７６（１９９８）、
（ｉｉ）酸化型プリンを特異的に認識し除去することのできる酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉＦＡＰＹ−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）およびそのヒト同族体ｈＯＧＧ１およびｈＯＧＧ２を包含する（Ｂｏｉｔｅｕｘ ＥＭＢＯ Ｊ．６：３１７７−３１８３（１９８７）、ＢｏｉｔｅｕｘらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３９１６−３９２２（１９９０）、ＲａｄｉｃｅｌｌａらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：８０１０−８０１５（１９９７）、ＶｉｄａｌらのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９：１２８５−１２９２（２００１）、および
（ｉｉｉ）ＵＶ誘発シクロブタンピリミジンダイマーに特異的な酵素は、Ｔ４エンドＶを包含する（ＧｏｒｄｏｎらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０４７−１２０５０（１９８０）、ＳｅａｗｅｌｌらのＪ．Ｖｉｒｏｌ．３５：７９０−７９６（１９８０））。
本発明のある種の別の実施態様は、特定の修飾ヌクレオチドを認識し修飾塩基（特異的成分）を切除する望ましい効果を有する少なくとも一つの酵素、および脱塩基ヌクレオチド（切込み成分）に接したホスホジエステル結合を選択的に切断する少なくとも一つの酵素を包含する成分の混合物を形成することによって、修復酵素の特異的機能性を利用している。特異的に修飾されたヌクレオチドにおいて切込みをいれられた特異的ホスホジエステル結合の機能を達成する混合物の特異性は、特異的成分が切込み成分の機能を達成することができない、またはその逆である、個々の成分の機能的特異性とは異なっている。一般的に、切込み剤中の切込み成分については特異的成分の活性が、少なくとも２：１であるべきである。
特異的機能を有し、ＡＰ部位切込み機能を欠いている酵素の例としては、ＤＮＡ Ｎグリコシラーゼが包含される。切込み機能を有し、特異的機能を欠いている酵素の例としては、ＡＰエンドヌクレアーゼが包含される。人工切込み剤は、ＤＮＡ ＮグリコシラーゼとＡＰエンドヌクレアーゼを組合せることによって、例えば、ＵＤＧグリコシラーゼとＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼ、またはＡｌｋＡグリコシラーゼとＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼを組合せることによって創成することができ、修飾ヌクレオチドにおいて一重鎖切断を達成することができる。
修飾ヌクレオチドで一重鎖切断を達成するために切込み剤中でどのような成分を組合せるべきかの選択は、（ａ）切除されるべき修飾ヌクレオチドの型（なぜなら、これは特異的成分の選択を決定するからである）および（ｂ）切込み成分の選択に影響する修飾ヌクレオチドの切除後切込みを入れる位置に望まれる鎖末端の型に基づいている。
例えば、ＡｌｋＡグリコシラーゼおよびＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼを含む人工切込み剤は、デオキシイノシンに特異性を有しており、切込みを入れた位置において、５’末端デオキシリボースリン酸（開裂した糖）および３’ヒドロキシ基をもたらす切込み活性を有している。
デオキシウリジン（Ｕ）のところで切込みを入れ、切込みを入れた位置において、５’で開裂した糖および３’ヒドロキシ基を生成するために、特異的成分としてＵＤＧグリコシラーゼおよび切込み成分としてＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼを含有する人工切込み剤が創成される。
ある種の条件下では、上記した５’で開裂した糖の代わりに、切込みを入れる位置に５’リン酸を生成することが望ましい。従って、切込み剤は、上記した特異的成分を有するが、切込みを入れる位置に５’リン酸を残す切込み成分を有するように処方される。この切込み活性を有する切込み成分の例としては、ＥｎｄｏＶＩＩＩＤＮＡグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼまたはＦＰＧ ＤＮＡグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼのような、切込みを入れた位置に５’リン酸および３’リン酸を生成するＤＮＡグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼのリアーゼ活性を包含する。従って、デオキシイノシンのところで標的分子に切込みを入れるための新しく処方された切込み剤は、ＡｌｋＡグリコシラーゼおよびＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡｐリアーゼまたはＦＧＰグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼから成るものである。代わりに、デオキシウリジン（Ｕ）のところで標的分子に切込みを入れるために新しく処方された切込み剤は、ＵＤＧグリコシラーゼおよびＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡｐリアーゼまたはＦＧＰグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼの組合せを包含することになる。
ある種の条件下においては、上記した特異的成分を使用して切込みを入れた位置に５’リン酸および３’ヒドロキシ基を形成することが望ましい。例えば、ＵＤＧグリコシラーゼ、ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼおよびＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼの組合せによって、切込みを入れた位置に一ヌクレオチドギャップを生成し、５’リン酸および３’ヒドロキシを残して、デオキシウリジン（Ｕ）のところの標的分子に特異的に切込みを入れる人工切込み剤が創生される。
本発明のある種の実施態様において、二つまたはそれ以上の位置で標的分子に連続的に切込みを入れるために、修飾ヌクレオチドの異なった型が複数の選択された位置に挿入される。例えば、デオキシウリジン（Ｕ）、８−オキソ−グアニンおよびデオキシイノシンが、標的分子の選択された位置に挿入される。単一の切込み剤が、挿入された修飾ヌクレオチドに従った一つ以上の特異的成分を包含するように処方される。代わりに、別々の切込み剤が処方され、連続的に標的分子に適用される。例えば、デオキシウリジンおよびデオキシ８−オキソ−グアニンの位置に選択的に切込みを入れるＡｌｋＡおよびＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼは、デオキシウリジン（Ｕ）のところに選択的に切込みを入れるＵＤＧ及びＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼを含有する切込み剤と組合せまたは連続的に使用される。
本発明の実施態様は、共に切込みの位置に５’リン酸を残して、デオキシウリジン（Ｕ）のところで標的分子に特異的に切込みを入れるＵＳＥＲTM酵素、およびデオキシウリジン（Ｕ）および８−オキソ−グアニンの両者のところで標的分子に特異的に切込みを入れるＵＳＥＲTM酵素２として表される二つの新しい切込み剤の調製を示す実施例ＩＩによってさらに例示される。
応用
本明細書に記載された方法の優れた特徴は、ＤＮＡ操作単独または併用の広範な実施を可能にする方法の普遍性および柔軟性である。これらの方法はその普遍性および柔軟性ゆえに、多数の操作を実行する骨の折れる段階的な実験を必要とする、制限エンドヌクレアーゼ依存性クローニングあるいは操作のような従来のシステムと区別される。
本方法のいくつかの使用例としては、以下のものが包含される：
Ａ）ＰＣＲ産物の方向性を有するクローニング（図７に例示）；
Ｂ）ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の置換、挿入、欠失または融合を包含する部位特異的突然変異誘発（図８−１２に例示）；
Ｃ）複数の中間断片からの標的分子の組立て（図１３−１５に例示）；
Ｄ）多数の標的分子のレシピエント分子への方向性のある組立て（図１６に例示）；
Ｅ）公知配列の境界の外側での染色体性／環境性ＤＮＡクローニング（染色体歩行）（図１７に例示）；
Ｆ）公知配列の境界を越えてｃＤＮＡのクローニングを含む、ｃＤＮＡライブラリーの構築（図１８に例示）；および
Ｇ）上記応用の同時使用（図３５−３７に例示）。
Ａ）ＰＣＲ産物の方向性を有するクローニング
相補性一重鎖伸張は、線状化したレシピエント分子およびＰＣＲ産物で発生させることができ、ここで各々の伸張によって、他と会合してコンピテント宿主細胞に導入することができる組換え分子が製造できる（図７）。
（１）レシピエント分子での一重鎖伸張の発生は、線状化されたレシピエント分子の各末端に望ましい長さおよび組成の３’一重鎖伸張をつくるカセットを担持したレシピエント分子の構築を包含する（上記で考察）。
（２）ＰＣＲ断片での一重鎖伸張の生成は、上記したようにＰＣＲ断片の選択された位置に特異的修飾ヌクレオチドを挿入し、特異的切込み剤で修飾ヌクレオチドにおいて断片に切込みを入れ、そして切込みを入れた５’末端オリゴヌクレオチドを相補鎖から解離して、望ましい長さおよび組成の一重鎖伸張を有する断片をつくることを包含する。
これらプライマーは、望ましい標的に会合しない５’末端でヌクレオチド配列を担持してもよい。これら５’配列は、プライマー配列において修飾ヌクレオチドＸによって置換されている末端３’ヌクレオチドを除いて、線状化レシピエント分子上の一重鎖伸張と同じになるように選択される（図７）。修飾ヌクレオチドの下流と、プライマー配列は、ポリメラーゼによって伸張が可能になるように標的分子特異的配列に相補性である。
標的配列の増幅は、そのようなプライマーの対を用いて実行される。増幅後、標的分子の各末端は付加した配列によって伸張される。
得られた増幅産物は、修飾ヌクレオチドの位置においてＤＮＡを特異的に認識し切込みを入れる切込み剤で処理される。ホスホジエステル結合の破損後、切込みを越えた５’末端一重鎖領域は、３’一重鎖伸張によって接された標的分子を残して、相補鎖から解離される。生成した３’一重鎖伸張は設計的に、線状化レシピエント分子の一重鎖伸張に相補性であるため、互いに混合されたとき、線状化レシピエント分子と標的分子は、組換え分子中に組込まれる（図７）。一重鎖伸張は、安定した組換え分子をつくるに充分に長く設計することができるので、連結反応によるＤＮＡ分子の共有結合形成は必ずしも必要ではない。次いで、組換え分子を、形質転換によってコンピテント宿主細胞に導入することができ、複製することができる。
図２６は、独特の一重鎖伸張がどのようにして、線状化ベクターｐＮＥＢ２０５Ａ上で相補性３’一重鎖伸張に会合する標的分子切込みられるかを示すものである（実施例ＩＡ参照）。これは、標的ＤＮＡの増幅のための修飾ヌクレオチドとしてデオキシウリジンを含有する一対のプライマーを用い、デオキシウリジン（Ｕ）で切込みするためのＵＳＥＲTM酵素（実施例ＩＩ参照）を使用することによって達成された。
図２６Ａは、５’末端で特異的８ヌクレオチド長伸張を有し、ベクターｐＮＥＢ２０５Ａ（図１９）の一重鎖伸張に同じになるように選択された、ただし３’チミンをデオキシウリジン（Ｕ）に置換したプライマーを示す。天然のｄＮＴＰｓの存在下でＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、両端に８塩基対まで伸張した、そして標的分子配列と共に各接合部にプライマー由来の単一のＵを含有する、二重鎖の分子をもたらすＵの対であるアデニンを取込む（図２６Ｂ）。
図１６Ｂにおいて、ＵＳＥＲTM酵素で切込みされた後で、末端の一重鎖７ヌクレオチドは、長さが８ヌクレオチドの３’一重鎖伸張によって接された標的分子を残して標的分子から解離する。レシピエント分子、（ｐＮＥＢ２０５Ａ）およびＵＳＥＲTM酵素処理標的分子は、相補性３’一重鎖伸張によって組換え分子に組込まれる。伸張の長さのゆえに、ライゲーションは必要でない。このコンストラクトは化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するのに使用された。
本出願は、さらに、ウラシル伸張によるＰＣＲ産物の直接的クローニング用のキットの調製を示す実施例ＩＩＩによって例示される。本方法の効率は、実施例ＩＶによりさらに例示されており、平均して、線状ベクターｐＮＥＢ２０５Ａ２０ｎｇ当たり望ましい１０5個の組換え体を得ることができ、そして９４−９５％のクローニング効率が、ＰＣＲ産物濃度の範囲内で達成される（宿主細胞受容能が２×１０7ｃ．ｆ．ｕ．／μｇＤＮＡのとき）ことを示している。
Ｂ）部位特異的突然変異：ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の置換、挿入、欠失または融合
望ましい長さおよび組成の相補性一重鎖伸張を、少なくとも二つのポリヌクレオチド分子の端で生成させることができる。次いで、ポリヌクレオチド分子を一重鎖伸張を経て会合し単一標的分子を形成する（図８）。この方法は、実際に標的分子のいかなる位置におけるいかなるＤＮＡセグメントの部位特異的突然変異、欠失、挿入、遺伝子融合または置換のような、広範囲のＤＮＡ操作の基本を形成しており、また、上記で同時に行われたどのような組合せの多数のＤＮＡ断片からの標的分子の組立てにも応用することができる。
図８において、ポリヌクレオチド分子は標的分子として同定されており、その標的分子は、プライマー対（Ｐ１／Ｐ４）およびプライマー対（Ｐ２／Ｐ３）と呼ばれている増幅プライマーの二つの異なったセットを利用する別々の増幅反応において、二つの重複している中間断片として増幅される。
Ｐ１およびＰ２プライマーは、標的分子の反対の鎖を増幅する別々の増幅反応において使用されているが、２ないし２０ヌクレオチドのような短いヌクレオチド配列によって互いに重複している。それに加えて、各重複プライマーは、３’部位に重複領域が接している一つの修飾ヌクレオチドを含有している。Ｐ１およびＰ２プライマーの開始部位（priming site）、および、それによるＰ１およびＰ２プライマーにより共有されている重複配列の選択は、どこで標的分子の望ましい操作が行われるかに依存している。望ましい操作を達成するための前もって決定されている配列の変更は、プライマーＰ１およびＰ２配列に取込まれる。
外側のプライマーＰ３およびＰ４は、標的分子の完全な所望領域の増幅を可能ならしめる位置で標的分子を増幅開始させる。外側のプライマーの特徴については、組立てた標的分子のレシピエント分子へのサブクローニングを後で記載する際により詳細に考察する。
標的分子増幅は、プライマーの両セットを用いて実行され、完成時には、両方の増幅された断片が、重複配列の同一コピーを担持している。ただし、一方の断片は重複の上部鎖に修飾ヌクレオチドを含有し、他方の断片は重複の下部鎖に修飾ヌクレオチドを含有している点では異なる［図８（ｂ）］。
増幅断片上での一重鎖伸張の生成は、修飾ヌクレオチド特異的切込み剤を使用して修飾ヌクレオチドに切込みを入れることによって達成される。二つの断片上に生成した一重鎖伸張は、互いに相補性である。なぜなら、それらは重複配列から創成されたからである。それによって、増幅した中間断片は、方向性を有して組立てられ、完全長標的分子を生成し、その後ライゲーションによって共有結合で結合される［図８（ｄ）］。ライゲーションは、組立てられた標的分子が解離するのを防ぐ。一般的にライゲーションは、標的分子が、制限エンドヌクレアーゼに基づいたクローニング方法のような、従来のサブクローニング方法をとる場合にのみ必要である。
この方法の利点は、以下を包含する副産物を避けることができる点である：（ａ）一重鎖伸張は、二回対称軸を含有していないので、増幅した断片はそれ自体で組立て／ライゲートすることはできない；（ｂ）単一のヌクレオチド／ギャップであるので、修飾ヌクレオチド除去の後で遊離する短いオリゴヌクレオチドは親の鎖に戻ることはできない；および（ｃ）標的断片を増幅するために使用されたプライマーはリン酸化されないからである。他の配向の増幅された断片のライゲーションは可能でない。代わりに、５’リン酸が、修飾ヌクレオチドの切除の位置に例外的に生成される。それゆえに、ＤＮＡリガーゼの基質だけが提供される。
例えば、公知の制限エンドヌクレアーゼを基本にしたクローニング法を使って選択されたレシピエント分子に完全長標的分子を含んで組立てられた最終産物をサブクローニングすることができる。この目的のために、外側のプライマーＰ３およびＰ４が、独特の制限部位を含有するように設計される。次いで、標的断片の組立てが達成された後、完全長産物が制限エンドヌクレアーゼで消化され（それに対する部位がプライマーＰ３およびＰ４配列に取込まれていた）、その後、同じかまたは適合性のある制限エンドヌクレアーゼで前もって切断されたレシピエント分子にこの産物が連結される。プライマーＰ３およびＰ４への代替アプローチについては、以下の（ｄ）に記載される。このプロトコールにおいて、ライゲーションは、操作された断片が制限エンドヌクレアーゼ依存クローニングステップを必要としないレシピエント分子に直接組立てられるので、使用されない。
上記の一般的な方法には多くの応用があり、そのいくつかを以下に記載する。
（ａ）ヌクレオチド置換を包含する部位特異的突然変異を、例えば、図９に模式的に図示した方法に従って達成することができる。ここで、重複プライマーＰ１およびＰ２は、標的分子に特異的ヌクレオチド変化を導入する目的のために設計されている。
望ましいヌクレオチド変化は、図９Ａに示すように重複配列内または図９Ｂに示すようにいずれかのプライマーの重複配列の下流のどちらかに導入することができる。増幅の間に、これらのヌクレオチド変化が、中間標的断片に容易に取込まれる。得られた中間断片を切込み剤で処理し、修飾ヌクレオチドを除去し、相補性一重鎖伸張を生成させることによって、標的断片を引続いて組立てることが可能となる。しかしながら、再構成された完全長標的分子は、新しく導入さえたヌクレオチド変化を担持しているので親の標的分子とは異なっている。次いで、組立てられた変異した標的分子は、選択したクローニングプロトコールに従ってサブクローニングされる。この方法の詳細な作業実施例は、実施例ＶおよびＶＩならびに図３２に示されている。
上記の方法では、開始部位は標的分子の配列に沿ってどこにでも選択することができるので、標的分子のいかなる位置にも実際に部位特異的突然変異を達成することが可能となる。
（ｂ）ヌクレオチド配列挿入は、上記の一般的方法を使用して達成することができる。重複プライマーＰ１およびＰ２をヌクレオチドの配列挿入を達成するためにどのように設計できるかの例が、図１０に模式的に図示されている。重複プライマーＰ１およびＰ２は、特異的プライマーの合成に使用されるオリゴヌクレオチド合成の限界内であれば、どのような目的長さのヌクレオチド配列でも挿入するように設計できる。望ましい設計のヌクレオチド配列を、標的分子のどのような望ましい設計位置にでも挿入できる。
図１０に示したように、標的分子に存在しないヌクレオチド挿入配列の何れをも、重複プライマーＰ１およびＰ２の５’末端に導入できる。図１０Ａに示したように、重複領域は全部の付加配列、または図１０Ｂに示したように付加配列の５’末端部分のいずれからでも作製できる。中間標的断片は増幅の間に、この付加配列によって伸張され、重複配列の同じコピーによって接される。結果として得られた増幅産物は、切込み剤で処理されて、修飾ヌクレオチドのところで切込みを入れられ、相補性一重鎖伸張を形成し、それによって完全長標的分子への中間標的断片に続いて組立てが行われる。組み立てられた完全長標的分子は挿入配列を含有し、以下の選択されたクローニングプロトコールによってクローン化することができる。この方法は、実際に標的分子のいかなる位置にも導入される独特の制限部位またはポリリンカー配列のような任意のヌクレオチド配列断片となり得る。
（ｃ）ヌクレオチド配列の欠失は、上記の一般的方法を用いて達成することができる。ヌクレオチド配列欠失を達成するために、どのような重複プライマーＰ１およびＰ２が設計されるかの例がは、図１１に模式的に図示されている。重複プライマーＰ１およびＰ２は、標的分子から特別なヌクレオチド配列断片を正確に欠失する目的に設計できる。
重複プライマーＰ１およびＰ２は、標的欠失領域に正確に隣接した標的分子上の離れた位置で開始し得る。プライマーの５’末端は、共通の重複配列を共有していなければならない。この重複を形成するために、一つのプライマーの５’末端が、別のプライマーの５’末端に逆相補性である付加配列によって補充される。増幅の間、二つの増幅断片の一つがこの付加配列によって伸張される。付加配列は別の増幅断片の５’末端に同一であるから、二つの距離の標的断片は今や共通の重複領域を共有することになる。結果として起こる中間標的断片が、切込み剤で処理され、修飾ヌクレオチドが除去され、相補性一重鎖伸張が形成されることによって標的断片の以後の組立てが可能となる。結果として起こる標的分子配列は、正確に除去されたヌクレオチド配列セグメントが欠失している。組立てられた突然変異誘発性の標的分子は、選択されたクローニングプロトコールによってサブクローニングされる。
上記（ｂ）および（ｃ）の応用については、二つの制限部位の創成およびベクターｐＵＣ１９から１８ｂｐセグメントの欠失を示す実施例ＶおよびＶＩＩＩおよび図３３によって、さらに例示する。
（ｄ）ヌクレオチド配列融合は、上記の一般的方法を使用して達成することができる。ヌクレオチド配列融合を達成するためにどのようにして重複プライマーＰ１およびＰ２が、設計できるかを、図１２に模式的に示す。重複プライマーＰ１およびＰ２は、二つの区別された標的分子を正確に合体するように所望するときに設計することができる。
二つの別個の標的分子の間での共通重複領域を創成するために、重複プライマーの一つが、他の重複プライマーの５’配列に逆相補性である付加的配列によって補充される。５’末端の相補性重複配列を除いて、二つのプライマーは、それぞれの標的にプライマーを開始させることができる３’領域を有することで区別される。増幅反応は随意に、二つの異なった鋳型を用いて実行することができる（図１２）。二つの標的分子の一つが、増幅の間に５’末端で付加配列によって伸張される。付加配列は、他の標的分子の５’末端に同一であるので、二つの別々の標的分子は、今や共通重複領域を共有することになる。結果として得られた標的分子は、切込み剤で処理されて修飾ヌクレオチドで切込みされ、別々の標的分子の組立てが可能な、再会合することができる相補性一重鎖伸張を形成する。ライゲーションすると、二つの標的分子は、相補性一重鎖伸張を通して正確に結合される。キメラ完全長産物は、選択のクローニングプロトコールに従ってサブクローニングすることができる。
この方法の利点は、望まれていないヌクレオチドを最終コンストラクトに導入することなく、実際的にどのような望ましい位置ででも二つの標的分子の融合を作り出す機会を提供することである。この応用については、さらに、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶＩＩＩおよびＭｘｅインテインの遺伝子融合の構築を示した実施例によって例示する（実施例ＶおよびＶＩＩＩおよび図３４参照）。
Ｃ）複数の中間断片からの標的分子の組立て
図１３−１５は、標的分子を二つ以上の中間断片から正確に組立てることを望むときに設計される、重複プライマーＰ１およびＰ２の模式図を示している。
例えば、重複プライマーの多数の対は、プライマーの第一の対が、標的分子ＡおよびＢの予期した結合部を横切って重複し、プライマーの第二の対が標的分子ＢおよびＣの予期した結合部を横切って重複ように設計することができる（図１３）。重複プライマーの個々の対を設計する原理は、上記図１２において概述したのと類似している。そこでは５’末端の一つのプライマーは、他のプライマーの５’末端に逆相補性である重複プライマーによって補充されている。各々の重複が独特の配列を含有しているので、個々のＰＣＲ断片に生成した一重鎖伸張は、一つの最終的な組合せにおいてのみ結合することができる、例えば、標的Ａ、ＢおよびＣは組合せＡＢＣにのみ組み立てられるであろう。
本発明の実施態様の利点は、その方法が一実験ステップにおいて多数のＤＮＡ操作を達成する手段を提供することである。重複プライマーの各セットは、そのような操作を実行するために必要な前もって選択されたヌクレオチド配列変化を担持することができる。このことは、さらに、ｈｉｎｃＩＩＱ１３８Ａ突然変異遺伝子の構築を示している実施例ＩＸに例示されており、それは同時に、この遺伝子のＭｘｅインテインとの遺伝子融合の構築、および全体をｐＴＸＢ１ベクターのプロモーター領域への挿入によって達成された（実施例ＶおよびＩＸ、図３５を参照）。
第一および最後の標的の予期した結合部を横切って重複するプライマーの追加の対を設計することによって、環状分子が生成され得る。例えば、レシピエント分子を多数の中間成分から創成することができる（図１４）。
重複プライマーの各対が隣のエキソンの予期した結合部を横切って重複している重複プライマーの多数の対を設計することによって、真核生物の遺伝子がゲノムＤＮＡから直接組立てられる（図１５）。この戦略を、さらに、サイレント突然変異が同時に実行されてヒトゲノムＤＮＡからｈＡＰ１遺伝子の組立てを示す実施例によって例示する（実施例Ｘ；図３６を参照）。
Ｄ）多数の標的分子のレシピエント分子への直接的組立て
図１６は、どのようにして多数の標的分子のレシピエント分子への直接的組立てを達成することができるかの模式的図解を示している。
例えば、多数の中間断片を組立てるために、重複プライマーの対が、上記（Ｂ）または（Ｃ）に従って設計される。しかしながら、外側のプライマーは、制限部位をコードする代わりに、その５’末端で担持するように、上記（Ａ）で記載されたように、そのようなレシピエント分子と適合性のあるヌクレオチド配列が設計される。これによって、組み立てられた完全長標的分子の外側の末端が、線状化レシピエント分子上で一重鎖伸張に会合することができ、一実験段階で形質転換し得る組換え分子の創成が可能となる。
従来技術の制限エンドヌクレアーゼを基本としたクローニングの方法論と比較して、この方法の利点は、以下を包含する：（ａ）各一重鎖伸張は、独特のパリンドローム配列を有しており、それによって増幅された標的断片および線状化レシピエント分子は望ましい組換え分子に方向性を有して組立てられる；（ｂ）連結による共有結合は、一重鎖伸張が安定な組換え分子を産生するのに充分なほど長くできるので、必要がないであろう；（ｃ）制限消化、ゲル精製およびベクター／挿入ライゲーションの時間のかかる操作が省略される；および（ｄ）多数の標的分子操作およびクローニングが一実験フォーマットで同時に実行することができる。
本発明は、さらに、ポリメラーゼ遺伝子の変異中間断片の線状化ｐＮＥＢ２０５Ａベクターへの方向性を有する組立てによる９oＮｍＶ９３Ｑポリメラーゼ突然変異体を示す実施例ＸＩおよび図３７によって例示される。
Ｅ）公知配列の境界の外側への染色体による／環境によるＤＮＡクローニング
図１７は、公知配列の境界の外側のＤＮＡをクローニングするための戦略の模式図を示す。その方法は、レシピエント分子において一重鎖伸張に相補性の一重鎖伸張を生成することに基づいている。第一のステップにおいて、一重鎖フランキング配列のライブラリーが、公知の領域での一プライマーとの線状増幅によって生成する。増幅された一重鎖フランキング配列の未知の末端に開始部位を導入するために、ｄＣＴＰおよびターミナルトランスフェラーゼを使用して３’末端にホモオリゴマーシトシンが末端につながれる。次のステップで、末端につながれた一重鎖フラグメントが、５’末端にベクター適合性配列を担持している一対のプライマーを用いて増幅される。標的分子の未知の領域に会合する一つのプライマーは、ポリグアニン配列から成り、５’末端から６番目の位置に修飾ヌクレオチド、例えば８−オキソグアニンを担持している。また、標的分子の公知の領域に会合する５’領域の別のプライマーは、結合部に５つのグアニンを担持し、かつ８−オキソグアニンによって補充されている。
次いで、結果として得られる二重鎖断片のライブラリーが、ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ、またはＵＳＥＲＴＭ酵素２（実施例ＩＩ参照）で処理される。ここで酵素または試薬は、８−オキソグアニンのところを認識し切込みを入れて、６個のシトシンから成る同一の３’一重鎖伸張によって接されたライブラリーに各断片を脱離する。そして、標的断片が組換え分子に組み立てるために６個のグアニン残基からなる一重鎖伸張を担持するレシピエント分子が使用され、かくして組換え分子のライブラリーを生成する。線状レシピエント分子の構築および調製が、実施例Ｉおよび図２２に記載されている。次いで、組換え分子のライブラリーは、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換に取り掛かれる。
さらに本出願は、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ＮＥＢ＃５４５由来のスーパーインテグロン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の公知配列の３’側に、未知のゲノムセグメントのクローニングを示している実施例ＸＩＩによって例示されている。
Ｆ）ｃＤＮＡライブラリーの構築
図１８は、総ＲＮＡ試料からのｃＤＮＡライブラリーの構築戦略を表した模式図を示す。第一鎖合成は、逆転写酵素および５’末端から６番目の位置に８−オキソグアニンを有するヘキサグアニン５’末端を含有するオリゴｄＴプライマーを用いて、総ＲＮＡからの一重鎖ｃＤＮＡ産物のライブラリーを生成する（図１８におけるプライマー１）。次いで、ｄＣＴＰおよびターミナルトランスフェラーゼを用いて一重鎖ｃＤＮＡ産物の３’末端にホモオリゴマーシトシン末端が加えられる。第二鎖合成は、５’末端から６番目の位置に８−オキソグアニンを有するポリｄＧプライマーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼＩで実行される（図１８のプライマーＰ３およびＰ４）。
図１８において、両プライマーは、５’末端に近接した修飾ヌクレオチドとして８−オキソグアニンを有する５’末端ヘキサグアニン配列を含有している。しかしながら、プライマー１は、完全にポリチミン配列から成り、デオキシウリジンを担持していてもよい。
結果として得られる二重鎖ｃＤＮＡ断片のライブラリーを、８−オキソグアニンおよび所望によりデオキシウリジン（Ｕ）の所で切込みを入れ、３’一重鎖伸張によって接されたライブラリーに各断片を残す、適当な切込み剤で処理することができる。次いで、適合性一重鎖伸張を担持するレシピエント分子を、組換え分子に標的断片を組み立てるのに使用することができる。レシピエント分子の例は、実施例ＩＣおよび実施例ＩＤにおいて提供される。次いで、組換えｃＤＮＡクローンのライブラリーを、コンピテント宿主細胞に形質転換することができる。
本発明は、以下の実施例によって、さらに例証される。実施例は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、それによって制限されると解釈されるべきではない。
上記および以下に挙げた文献を、参考までに本明細書に載せる。
望ましい長さと構造の３’一重鎖伸長を有するレシピエント分子。
望ましい長さと構造の独特な３’一重鎖伸長を有する直鎖状ＤＮＡベクターについて、ｐＮＥＢ２０５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ｐＮＥＢ２００Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ｐＮＥＢ２１０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）およびｐＵＣ−ＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を以下に示す方法で作製した（図１９−２２）。これらベクターは全て多重クローニングサイトへのカセットの挿入によってｐＮＥＢ１９３ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ カタログ ２００２−２００３、ｐ．３１８）から誘導されたものである（図２７Ａおよび２７Ｂ）。直鎖状ベクターそれぞれに形成される一重鎖伸長は、ベクター末端が再会合し、形質転換しやすい環状ＤＮＡが形成される問題を避けるため、およびベクターに挿入されるいかなる標的分子の配向性も制御すべく、互いに相補的でないように設計した。
Ａ）直鎖状ベクターｐＮＥＢ２０５Ａの生成
２つの逆方向のＮ．ＢｂｖＣＩＢ切込みサイト（ＣＣ↓ＴＣＡＧＣ）および１つのＸｂａＩ制限サイト（Ｔ↓ＣＴＡＧＡ）を含むカセット５’ＧＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）をｐＮＥＢ１９３プラスミドの多重クローニングサイトに挿入した。新しいコンストラクトをｐＮＥＢ２０５Ａと表記した（図１９、２７ＡおよびＢ）。
ｐＮＥＢ２０５Ａプラスミドを直鎖状にし、８−ヌクレオチドの３’一重鎖伸長を次のようにして作製した（図１９および２７Ｃ）。すなわち、２００μＬのＮＥバッファー＃４（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭのジチオスレイトールおよび１００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）に溶かした１０μｇのｐＮＥＢ２０５Ａプラスミドを１００ユニットのＸｂａＩを用いて３７℃で１８時間消化した。ＸｂａＩで切断されたＤＮＡを含む反応液に２０ユニットのＮ．ＢｂｖＣＩＢを加え、さらに３７℃で１時間インキュベートした。ベクターｐＮＥＢ２０５ＡのＤＮＡをフェノール−クロロフォルム抽出で精製した後、アルコール沈殿させ、１００μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。
Ｂ）直鎖状ベクターｐＮＥＢ２００Ａの生成
２つのＸｂａＩ制限サイト（Ｔ↓ＣＴＡＧＡ）および２つの逆方向のＮ．ＢｓｔＮＢＩ切込みサイト（５’−ＧＡＧＣＴＮＮＮＮ↓）を含むカセット５’ＡＣＧＡＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＡＧＡＧＴＣＴＧＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）をｐＮＥＢ１９３プラスミドの多重クローニングサイトに挿入した。新しいコンストラクトをｐＮＥＢ２００Ａと表記した（図２０）。
ｐＮＥＢ２００Ａプラスミドを直鎖状にし、８−ヌクレオチドの３’一重鎖伸長を次のようにして作製した（図２０）。すなわち、２００μＬの切込み用バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール）に溶かした８μｇのｐＮＥＢ２００Ａプラスミドを１００ユニットのＮ．ＢｓｔＮＢＩを用いて５５℃で１時間消化した。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩで切込みを入れたＤＮＡを含む反応液に１００ユニットのＸｂａＩを加え、さらに３７℃で１時間インキュベートした。直鎖状ベクターｐＮＥＢ２００ＡのＤＮＡをフェノール−クロロフォルム抽出で精製した後、アルコール沈殿させ、５０μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０，０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。
Ｃ）直鎖状ベクターｐＮＥＢ２１０Ａの生成
２つの逆方向のＮ．ＢｂｖＣＩＢ切込みサイト（ＣＣ↓ＴＣＡＧＣ）、１つのＢａｍＨＩ制限サイト（Ｇ↓ＧＡＴＣＣ）および１つのＸｂａＩ制限サイト（Ｔ↓ＣＴＡＧＡ）を含むカセット５’ＧＣＴＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をｐＮＥＢ１９３プラスミドの多重クローニングサイトに挿入した。新しいコンストラクトをｐＮＥＢ２１０Ａと表記した（図２１）。
ｐＮＥＢ２１０Ａプラスミドを直鎖状にし、６−ヌクレオチドの３’一重鎖伸長を直鎖状にしたプラスミドの１つの末端に、８−ヌクレオチドの３’一重鎖伸長を他の末端に次のようにして作製した（図２１）。すなわち、２００μＬのＮＥバッファー＃４（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭのジチオスレイトールおよび１００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）に溶かした１０μｇのｐＮＥＢ２１０ＡプラスミドＤＮＡを１００ユニットのＸｂａＩおよび１０ユニットのＢａｍＨＩを用いて３７℃で２時間、２重に消化した。直鎖状になったＤＮＡを含む反応液に２０ユニットのＮ．ＢｂｖＣＩＢを加え、さらに３７℃で１時間インキュベートした。ベクターｐＮＥＢ２１０ＡのＤＮＡをフェノール−クロロフォルム抽出で精製した後、アルコール沈殿させ、１００μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ のＥＤＴＡ）に再懸濁した。
Ｄ）直鎖状ベクターｐＵＣ−ＴＴの生成
２つの逆方向のＮ．ＢｂｖＣＩＢ切込みサイト（ＣＣ↓ＴＣＡＧＣ）、および２つのＢａｍＨＩ制限サイト（Ｇ↓ＧＡＴＣＣ）を含むカセット５’ＧＣＴＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）をｐＮＥＢ１９３プラスミドの多重クローニングサイトに挿入した。新しいコンストラクトをｐＵＣ−ＴＴと表記した（図２２）。
ｐＵＣ−ＴＴプラスミドを直鎖状にし、６−ヌクレオチドの３’一重鎖伸長を次のようにして作製した（図２２）。すなわち、２００μＬのＮＥバッファー＃４（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭのジチオスレイトールおよび１００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）に溶かした１０μｇのｐＵＣ−ＴＴプラスミドＤＮＡを、１０ユニットのＢａｍＨＩを用いて３７℃で２時間消化した。直鎖状になったＤＮＡを含む反応液に２０ユニットのＮ．ＢｂｖＣＩＢを加え、さらに３７℃で１時間インキュベートした。ベクターｐＵＣ−ＴＴのＤＮＡをフェノール−クロロフォルム抽出で精製した後、アルコール沈殿させ、１００μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。
デオキシウリジン（Ｕ）に特異的な人工切込み剤の調製
この実施例では２本鎖ＤＮＡ分子のデオキシウリジンに切込みを入れ、ヌクレオチドの溝を生じさせて切込み位置に５’リン酸および３’リン酸を残す２つの人工切込み剤、ＵＳＥＲＴＭ酵素およびＵＳＥＲＴＭ酵素２の調製について説明する。それぞれの人工切込み剤は２つの成分で構成される。ＵＳＥＲＴＭ酵素はＵＤＧ ＤＮＡグリコシラーゼとＥｎｄｏＶＩＩＩ ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼを含み、一方、ＵＳＥＲＴＭ酵素２はＵＤＧ ＤＮＡグリコシラーゼとＦＰＧ ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼを含む。人工切込み剤の１活性単位は、１０μＬの反応バッファーに溶かした１０ｐｍｏｌ（ピコモル）のデオキシアデニンと対を成す１個のデオキシウリジンを含有する３４マー（ｍｅｒ）の２本鎖オリゴヌクレオチドを３７℃、１５分間で切断が完了するのに必要な量の個別成分を有するものと定義した。従って、１つの人工切込み剤を作るための混合物中の成分の最適な比率は単位の定義に基づいて決められる。
ＵＤＧグリコシラーゼの活性単位の定義（ＵＤＧグリコシラーゼ活性の１ユニットはデオキシウラシルを含有する２本鎖ＤＮＡから１分間に６０ｐｍｏｌのウラシルを放出することを触媒する酵素量と定義されている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇ ２００２−２００３， ｐ．１１２））のに基づいて、１ユニットの人工切込み剤を調製するのに必要なＵＤＧの量を理論的に計算すると０．０１１ユニットとなる。しかし、人工切込み剤中のこの成分の量は、進行不能サイトの切断速度に関連して低下するウラシル塩基の放出速度を上げたいという要望によって変動する。従って、実際の人工切込み剤１ユニット中のＵＤＧ成分の量は、理論的な必要量より少なくとも２倍から１００倍高くなり、ＵＤＧ濃度は例えば０．０２２から１．０ユニットまでに増加する。
ＵＳＥＲＴＭ酵素およびＵＳＥＲＴＭ酵素２の切込み剤１ユニットに必要な、それぞれの第２の成分であるＥｎｄｏＶＩＩＩまたはＦＰＧの最適量は次のようにして決定した。
基質の調製：１個のデオキシウリジンを含有する２本鎖オリゴヌクレオチド基質（図２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８））は次のようにして調製した。すなわち、５μＭの１６番目に１個のデオキシウリジン（Ｕ）を含有する３'および５’を蛍光標識した３４マー（ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチドと、５μＭのデオキシウリジン（Ｕ）の反対側にデオキシアデニンを含有する非標識の相補的なオリゴヌクレオチドを混合して全量を１ｍＬにし、１００℃で１０分間インキュベートした。混合液を徐々に室温まで冷却し、２本鎖オリゴヌクレオチドを生成させた。
ＵＳＥＲ ＴＭ 酵素：種々の量（３．９〜２５０ｎｇ）のＥｎｄｏＶＩＩＩ蛋白質を０．２ユニットのＵＤＧと予め混合し、その混合液について１０μＬの反応バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、 １０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ）中での３７℃１５分間における１０ｐｍｏｌ基質の完全切断を検定した。反応は等容量の９５％フォルムアミド、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロムフェノールブルー、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ１１を添加して停止させ、生成物は１５％尿素変性ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバド，カリフォルニア州、米国）上で解析した。図２４の活性測定結果は、０．２ユニットのＵＤＧ存在下で少なくとも３１．２５ｎｇのＥｎｄｏＶＩＩＩで基質の完全消化が起こることを示している。従って、この実施例の結果として、１ユニットのＵＳＥＲＴＭ酵素は０．２ユニットのＵＤＧと少なくとも３１．２５ｎｇのＥｎｄｏＶＩＩＩ蛋白質を混合することによって調製できる。
ＵＳＥＲ ＴＭ 酵素２：種々の量（１８．１３〜４３００ｎｇ）のＦＰＧ蛋白質を０．１ユニットのＵＤＧと予め混合し、その混合液について１０μＬの反応バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、 １０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ）中での３７℃１５分間における１０ｐｍｏｌの基質の完全切断を検定した。反応は等容量の９５％フォルムアミド、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロムフェノールブルー、１０ｍＭの ＥＤＴＡ、ｐＨ１１を添加して停止させ、生成物は１５％尿素変性ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバド，カリフォルニア州、米国）上で解析した。図２５の活性測定結果は、０．１ユニットのＵＤＧ存在下で少なくとも１４５ｎｇのＦＰＧで基質の完全消化が起こることを示している。従って、この実施例の結果として、１ユニットのＵＳＥＲＴＭ酵素２は０．１ユニットのＵＤＧと、少なくとも１４５ｎｇのＦＰＧを混合することによって調製できる。
標的分子をｐＮＥＢ２０５Ａベクターにクローニングするためのプロトコルおよびキット。
この実施例ではデオキシウリジンを含有するプライマーを用いてＤＮＡ増幅した後の標的分子のクローニングについて説明する（図２６Ａおよび２６Ｂ）。増幅生成物を切込み剤のＵＳＥＲＴＭ酵素（実施例２を参照）で処理して独自の３’一重鎖伸長を作り、それが次に相補的な３’一重鎖伸長を有する直鎖状のベクターｐＮＥＢ２０５Ａ（実施例１のＡ）を参照）と会合する。この方法は制限エンドヌクレアーゼの切断に依存しないし、標的生成物をベクターに挿入するためにＤＮＡリガーゼを必要としない。
ここで提供するキットは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと図２６Ａおよび２６Ｂに明記したようなウラシル含有のプライマーを使って増幅された標的分子を利用するためのものである。
キットには、実施例１のＡ）で説明したような既に直鎖状になっていて一重鎖伸長を有するクローニング用ベクターｐＮＥＢ２０５Ａ、及び１０回のＰＣＲクローニング反応に十分な切込み剤ＵＳＥＲＴＭ酵素が用意されている。このキットにはさらに、５０回の配列決定反応に十分な配列決定用プライマー及び使用説明書が備えられている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ビバリー、マサチューセッツ州、米国）。
キットの構成材リスト：
直鎖状ベクターｐＮＥＢ２０５Ａ、１０μＬ（０．１μｇ／μＬ）
ＵＳＥＲＴＭ酵素、１０μＬ（１ｕｎｉｔ／μＬ）、
配列決定用プライマー：
Ｍ１３／ｐＵＣ 配列決定用プライマー（−４７）
（５'−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１））、５０μＬ（３．２ｐｍｏｌ／μＬ）、
Ｍ１３／ｐＵＣ 逆方向配列決定用プライマー（−４８）
（５'−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２））、５０μＬ（３．２ｐｍｏｌ／μＬ）、
使用説明書（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ビバリー、マサチューセッツ州、米国）
使用説明書には提供した試薬およびその他の特定されたものを使って、どのようにして標的分子の複製を作るかが書かれている。例えば、説明書には次のようなことが書かれている：
（ａ）増幅
標的分子の増幅はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとプライマー対を使って達成されるが、ここで使われるプライマー対の各プライマーは標的分子と相補的な配列を有し、さらに直鎖状ベクターの一重鎖伸長と適合性の良い５’末端配列を有している（図２６Ａ）。ベクター内の標的分子の配向性は、プライマー間のベクター特異的５’末端配列を交換することにより反対向きにすることができる。
もしも標的分子がアンピシリン耐性遺伝子を有する環状プラスミドの１部であるなら、形質転換可能な元のプラスミドの形をしたＰＣＲ生成物の混入を避けるため、プラスミドを直鎖状にすることを勧める。好ましくは、平滑末端を作る制限エンドヌクレアーゼでプラスミドを消化する、そして／または、幾つかのサイトが増幅される標的分子内でなくプラスミドの幹鎖内に含まれる。
（ｂ）増幅したＤＮＡの切断と組立て反応
切込み剤（ＵＳＥＲＴＭ酵素）は試験した全てのＰＣＲバッファー及び一般に使われる他の種々のバッファー中で活性があることを確認した（表１）。（ａ）に述べた方法で作られた増幅生成物（ＰＣＲフラグメント）は分子あたり２個のウラシル残基を含んでいる（図２６Ｂ（ｂ））。ＵＳＥＲＴＭ酵素の１活性ユニット（実施例２を参照）は５ｐｍｏｌの増幅ＤＮＡに切込みを入れることができる。これを質量濃度に換算すると、５ｐｍｏｌのＤＮＡは１００ｂｐ（塩基対）長のＤＮＡ０．３３μｇに、または１０００ｂｐ長のＤＮＡ３．２９μｇに相当する。
２０ｎｇ（０．０１１ｐｍｏｌ）の直鎖状ベクターｐＮＥＢ２０５Ａを満たすためには、０．１１ｐｍｏｌ以上のＵＳＥＲＴＭ酵素処理ＰＣＲフラグメントを挿入することが望ましい。ＰＣＲ増幅フラグメントの一部は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼがフラグメントの３’末端に余分な塩基を付加するため、ベクター上の伸長との適合性が良くない可能性がある。これらの鋳型に依存しない塩基の最大付加量を考慮して、ベクターの少なくとも３倍以上のＰＣＲフラグメント濃度を使うことによって挿入効率を高めることができる。例えば、ベクター０．０１１ｐｍｏｌ（２０ｎｇ）に対して０．０３３ｐｍｏｌ以上のＰＣＲ生成物が使われる。
従って、組立て部品の混合物には、１０μＬのＰＣＲ試料、１μＬの直鎖状ｐＮＥＢ２０５Ａ及び１μＬのＵＳＥＲＴＭ酵素（１ユニット）が含まれ、ＰＣＲ生成物中のウラシルの位置に切込みを作るために、それを３７℃１５分間インキュベートする。次に、室温で１５分間インキュベートすることにより相補的な伸長同士が会合し組換え体分子が形成される（図２６Ｂステップ（ｅ））。
共有的に結合した組換え体分子を得るために、組立て反応液にＴ４ＤＮＡリガーゼを加えることができる。もし、その組換え体を電気穿孔またはさらに他の操作に使うなら、この方法が望ましい。必要に応じて、１μＬの１０倍濃度のＴ４ ＤＮＡリガーゼバッファーと１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを、３７℃１５分間インキュベートし、さらに室温で１５分間インキュベートした後、組立て反応液に添加する。
（ｃ）クローニング法の完成
（ｂ）の組立て反応液２〜１２μＬ中で会合してできた組換え体分子は、化学受容性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換に用いられる。次に、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有のＬＢプレート、または青−白で選別するために、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）及び０．０１ｍｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌ含有のＬＢプレートのどちらかで形質転換細胞を平板培養した。青−白選別を用いると、組換え体分子の入った形質転換細胞は白色のコロニーを形成するが、非修飾のベクターが入った形質転換細胞は青色のコロニーを形成する。
挿入された標的分子の配列は、上のキット構成材リストに載っている配列決定用プライマーを用いた配列決定で検証することができる。
（ｄ）サブクローニング
標的分子は、必要に応じて、ｐＮＥＢ２０５Ａの多重クローニングサイト（ＭＣＳ）内にある種々の独特な制限サイトを使って、他の発現ベクターにサブクローニングすることができる（図２７Ｂ及び２７Ｃ）。多重クローニングサイト（ＭＣＳ）は４個の独特な８−塩基制限サイト（ＡｓｃＩ，ＰａｃＩ，ＰｍｅＩおよびＳｂｆＩ用）を挿入サイトの横側に有するている。
望みの制限サイトがｐＮＥＢ２０５Ａの多重クローニングサイト（ＭＣＳ）内にない場合は、例えば、ＰＣＲプライマーがデオキシウリジン（Ｕ）と開始配列の間にその制限サイトに対応する挿入が含まれるように設計することによって、以下に示すように、標的分子内にそのようなサイトを容易に作り出すことができる。
左側プライマー：５’−[ＧＧＡＧＡＣＡＵ＋（制限サイト）＋開始配列]
右側プライマー：５’−[ＧＧＧＡＡＡＧＵ＋（制限サイト）＋開始配列]
標的分子を別の発現ベクターのＡＴＧコドンに直接サブクローニングするためには、ＮｄｅＩサイトを使うことができる。このサイトは左側プライマー内でＡＴＧコドンがウラシル残基の下流に付くと自動的にできる（５’ＧＧＡＧＡＣＡＵＡＴＧ・・・）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。
Figure 2006504399
クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）のｐＮＥＢ２０５Ａベクターへのクローニング
実施例３で説明した方法を使い、ｃａｔ（Ｃｍｒ）遺伝子をｐＧＰＳ２．１プラスミドの９５０ｂｐフラグメントとして、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び下に示すプライマーを用いて増幅した。
左側プライマー：５’−ＧＧＡＧＡＣＡＵＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）
右側プライマー：５’−ＧＧＧＡＡＡＧＵＧＧＡＴＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）
５０μＬの反応液には、５μＬの１０倍濃度ＧｅｎＡｍｐ ＰＣＲバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスター・シティ、カリフォルニア州、米国）、２０ｎｇのｐＧＰＳ２．１ＤＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、２００μＭのｄＮＴＰｓ、０．２μＭのそれぞれのプライマーおよび２ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。ｃａｔ遺伝子は、下記のサイクリング・プロトコルを使って、８、９、１０、１１、１３、１６、２０、２５および３０サイクル増幅した。
９４℃ ５分
９４℃ ３０秒
５５℃ １分 １サイクル
７２℃ ４０秒
７２℃ ５分
１０μＬ（ＰＣＲ反応容量の２０％）サンプル中のＰＣＲ生成物の量をゲル電気泳動で評価し（図２８）、それぞれ５、１０、１７、４５、８２、１６４、２１５、３４６または３９０ｎｇと推定した。
１０μＬの各ＰＣＲサンプルを、１μＬ（２０ｎｇ）の直鎖状ベクターｐＮＥＢ２０５Ａおよび１μＬ（１ユニット）のＳＥＲＴＭ酵素と混合した。反応液は、デオキシウラシル残基で切断するために３７℃で１５分間インキュベートし、さらに相補的な伸長を会合させるために室温で１５分間インキュベートした。
５０μＬの化学受容性大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２２６７細胞（細胞受容能２ｘ１０７ｃ．ｆ．ｕ．／μｇ ｐＮＥＢ２０５Ａ）を３μＬの組立て反応液で形質転換した。形質転換細胞の選択は、３ｘ２５μＬの転換反応液（全形質転換反応液容量は１．５ｍＬ）をＡｍｐ，ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを添加したＬＢプレートの平板培養で行った。３７℃１８時間後に白色（組換え体）および青色（ベクターのバックグラウンド）のコロニー数を計測した。クローニング効率は、全形質転換細胞数に対する白色コロニー数の割合を計算して求めた。ｃａｔ遺伝子のｐＮＥＢ２０５Ａへのクローニング結果を図２９および図３０に示した。
標的分子操作のためのプロトコル及びキット
この実施例では、いかに多様なＤＮＡ操作が行われるか、例えば部位特異的突然変異、標的分子の融合、消去、挿入または標的分子のあらゆる位置にあるＤＮＡ区分の置換、複数のＤＮＡフラグメントから標的分子の組立て、修飾ヌクレオチド（Ｘ）としてデオキシウリジンを使用した上記応用のあらゆる同時的組合せ（図８〜１５）などについて説明する。
標的分子は複数の重複フラグメント生成により増幅される。標的分子の隣接した２つのフラグメントの間に重複領域を作るために、増幅プライマーを、５’末端領域に１個のデオキシウリジンがある重複配列で、それが３’側で側面を接するように設計した（図３１）。
図３１に示したプライマーのデザインは、さらに特定の望ましいＤＮＡ操作ができるようにするため、重複配列の位置またはその近傍に配列変更の修飾を行うことができる（図９〜１５）。増幅後、配列変更は増幅されるＰＣＲフラグメント内に取込まれる。隣接するフラグメントは共通の重複領域で側面を接するが、１つのフラグメントは重複領域の上部の鎖（ストランド）上にデオキシウリジン（Ｕ）を含んでいるのに対し、他のフラグメントは重複領域の下部の鎖（ストランド）上にデオキシウリジン（Ｕ）を含んでいる。次に、ＵＳＥＲＴＭ酵素によるデオキシウリジン（Ｕ）残基の切除によって隣接するフラグメントの接合点に一重鎖伸長が作られる。互いに隣接するように設計されたフラグメントから作られた一重鎖伸長は、重複配列で構成されているので互いに相補的である。フラグメントに方向性を有するように組立てることによって、配列変更を含んだ標的分子の全長を作り出すことができる。
この実施例の特色は論理的なプロトコルであり、試薬と以下の（ａ）〜（ｄ）に提供するような適切なプロトコルから成るキットを使って、どの様にしてすべてのＤＮＡを既定の方法（図３２〜３７）で変更できるのかを説明している。
（ａ）プライマーの設計
標的分子は図３１に示したように複数のプライマー対を使って増幅させ得る。重複プライマーのＰ１およびＰ２は、５’末端の２〜２０ヌクレオチドが互いに重複しているが、標的分子上の反対対側のＤＮＡ鎖を開始させる。開始サイトは標的分子配列上の操作点またはその近傍に選択できる。重複プライマーの両方で、重複配列の側面に接する３’ヌクレオチドはデオキシウリジン（Ｕ）にすることができる。好ましくは、重複しているヌクレオチド配列は２つ折の対称軸を有せず、自己相補性がないことである。操作点における標的ＤＮＡの配列が重複のための適切な開始配列を提示しないところでは、配列変更を導入し、必要なＡまたはＣを、例えば、第３位の縮重コドンに入れることができる。
プライマーＰ３およびＰ４の配列は、独特な制限サイトを有する標的分子の配列を補完しており、続く組立てられた標的分子のクローニングに使われる。代わりに、独特の制限サイトをＰ３およびＰ４プライマーの５’末端に導入しても良い。
（ｂ）増幅
標的分子は、（Ｐ１＋Ｐ３）および（Ｐ２＋Ｐ４）のプライマー対を使った別々のＰＣＲ反応における２つの重複フラグメントとして、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使って増幅することができる。増幅の結果は２つのフラグメントで、各々のフラグメントの１つの末端は所定の位置（分断サイト）に出来ている。分断サイトでは、各ＰＣＲフラグメントは、反対側のＤＮＡ鎖にウラシルがある場合を除き、重複した同一のコピーによって側面を接している（図８）。ＰＣＲフラグメントは好ましくは精製して、濃度を０．１〜１．０μＭに調整する。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは増幅したＰＣＲフラグメントの３’末端に鋳型に依存しないヌクレオチドを導入するため、正確で効率的なＤＮＡ操作を行うためにはＰＣＲフラグメントの末端研磨を勧める。末端研磨は次のようにして行うことができる：
５０μＬの反応液調整のために、１０ｐｍｏｌ以下のＰＣＲフラグメントを５μＬの１０倍濃度Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー、１μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬのＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノウ）フラグメント（Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ）と混合し、水を加えて最終の体積を５０μＬとする。混合液は、非鋳型性の３’ヌクレオチドを除去するために３７℃で１０分間インキュベートし、続いてさらに８０℃で２０分間インキュベートしてクレノウ・フラグメントを失活させる。
（ｃ）切込み剤を用いた３’一重鎖伸長の生成
３’一重鎖伸長の研磨ＰＣＲフラグメント上への生成は、ＵＳＥＲＴＭ酵素を用い、デオキシウリジン（Ｕ）の３'側および５’側のＰＣＲフラグメントに切込みをいれて生じた短いオリゴヌクレオチドを解離させ、１つの鎖上の５’リン酸と側面を接したフラグメントおよびもう片方の鎖上の３'一重鎖伸長に側面を接したフラグメントを形成させることによって行われる。切込みは、（ｂ）の５０μＬの反応液に１ユニット（１μＬ）のＵＳＥＲＴＭ酵素（実施例２を参照）を追加し３７℃で１５分間インキュベートすることによって入れることができる。
ＰＣＲフラグメントに分子あたり２個のウラシルがある場合は、上に規定した反応条件下では、ＵＳＥＲＴＭ酵素の１活性ユニットで５ｐｍｏｌ以下のＰＣＲ生成物に切込みを入れることができる。
（ｄ）組立て反応
（ｃ）に述べた相補的一重鎖伸長を有する個々のＰＣＲフラグメント調製物を、等モル量で混合する。１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼをＰＣＲフラグメントの混合液に添加し、室温で３０分間インキュベートしてＰＣＲフラグメントを会合させる。つぎに、会合反応液の１／２０量を取出しアガロースゲル上で泳動させ会合効率を調べる。もし会合収率が満足できるようなら、８０℃で２０分間加熱してＴ４ＤＮＡリガーゼを失活させる。
等モル量のＰＣＲフラグメントを使用すると、最大の収率で会合したフラグメントが得られ、このことは２個より多いフラグメントの会合の場合に特に重要である。さもないと主体でないフラグメントが最終生成物の形成を制限することになる。しかし、或る場合には、ヌクレオチド組成および／または一重鎖伸長の長さとＰＣＲフラグメントの大きさの多様性があるので、最終会合生産物が最大収量となる濃度比を、大量の会合反応を行う前に試験的な会合反応で最適化することができる。
（ｅ）会合生成物の最適ベクターへのクローニング
会合生成物は、外側のＰ３およびＰ４プライマーに組込まれた配列を認識する適切な制限エンドヌクレアーゼで消化され、同一または相当する制限エンドヌクレアーゼであらかじめ切断してある最適ベクターに、ゲル精製および標的フラグメントの会合を含む従来のプロトコルを使ってクローニングされる。代わりに、実施例３および４に従って、会合生成物をベクターに導入することができる。
本実施例では、図８〜１５に明記したような操作を受けたＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを適切に扱うための試薬およびプロトコルを含むキットを供する。下記のキットには１０回の反応に十分な試薬類が含まれている。
キットの成分表
１０倍Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ用バッファー、５００μＬ；
１０ｍＭ ｄＮＴＰ溶液、１００μＬ；
ＤＮＡポリメラーゼＩ，ラージ（クレノウ）フラグメント，２０μＬ（５ユニット／μＬ）；
ＵＳＥＲＴＭ酵素、１０μＬ（１ユニット／μＬ）；
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、２０μＬ（４００ユニット／μＬ）；
使用説明書
便宜上、反応中のバッファー交換を無くすため、キット内の全ての酵素類はＴ４ ＤＮＡリガーゼバッファー中で働くように調整してある。
ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼの部位特異的突然変異
２つのプライマー対、Ｐ１／Ｐ４およびＰ２／Ｐ３、の設計とそのｈｉｎｃＩＩＲエンドヌクレアーゼ遺伝子修飾への使用を図３２に示した。プライマーＰ１ではコドンＣＡＡの代わりにコドンＴＴＴをコードさせた。ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の４２０ｂｐおよび３８０ｂｐのフラグメントをＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとそれぞれのプライマー対であるＰ１／Ｐ４およびＰ２／Ｐ３を使って増幅した。それぞれのＰＣＲ反応液の総量は１００μＬずつ６本である。増幅の後、６個の同一反応のＰＣＲ生成物をまとめ、フェノール・クロロフォルム抽出およびアルコール沈殿で精製した後、５０μＬのＴＥバッファーに溶解した。ＤＮＡ濃度の決定はゲル電気泳動で行い、それぞれのＰＣＲフラグメントは０．２ｍｇ／ｍＬと推定された。２つの５０μＬスケールの反応を次のように準備した：
３８０ｂｐまたは４２０ｂｐのＰＣＲフラグメント、２５μＬ（〜２０ｐｍｏｌ）
１０倍濃度 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー、５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１μＬ
Ｍｉｌｌｉ−ＱＴＭ 水、１８μＬ
クレノウ・フラグメント、１μＬ（５ユニット）
反応液を３７℃で１０分間インキュベートし平滑末端を有するＰＣＲフラグメントを作った。クレノウ・フラグメントは８０℃で２０分間インキュベートして失活させた。１μＬ（１ユニット）のＵＳＥＲＴＭ酵素をそれぞれの反応液に添加した後、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、反応液を氷上で保存した。
試験的会合反応：１μＬの各ＰＣＲフラグメントを７μＬの１倍Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファーと混合した後、１μＬ（４０ユニット）のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加して室温で３０分間インキュベートした。会合反応物を１μＬのＵＳＥＲＴＭ酵素処理したフラグメントと平行して電気泳動させ、会合効率を評価した（図３２（ｅ））。
大量会合反応：２０μＬの各ＰＣＲフラグメントを一緒にし、１μＬ（４００ユニット）のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加して室温で３０分間インキュベートした。２μＬを分取し、電気泳動で検定して会合効率を評価した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは８０℃で２０分間インキュベートして失活させた。会合反応混合物はＮｄｅＩおよびＳａｐＩ制限酵素で消化した。完全なｈｉｎｃＩＩＲ／Ｑ１３８Ｆ遺伝子を有する７８０ｂｐのＮｄｅＩ−ＳａｐＩフラグメントをアガロースゲルから精製し、ＮｄｅＩ−ＳａｐＩで解裂させた脱ホスホリル化ｐＴＸＢ１ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ビバリー、マサチューセッツ州、米国）にクローニングした。
独特な制限サイトの挿入およびｐＵＣ１９ベクターＤＮＡからの２８ｂｐ区分の削除
２つのプライマー対、Ｐ１／Ｐ４およびＰ２／Ｐ３、の設計と、制限サイトの挿入およびｐＵＣ１９から一つの配列の削除におけるそれらの使用を図３３に示した。ｐＵＣ１９上の開始プライマーのＰ１およびＰ２は削除される１８ｂｐの配列で隔てられている。６ｂｐ長の重複領域を作るために、Ｐ１およびＰ２プライマーの５’末端に６ヌクレオチドの挿入配列を補足し、これが同時にＢｓｒＧＩおよびＡｖｒＩＩ制限サイトを作り出している。ｐＵＣ１９の２つのフラグメント（６１０ｂｐおよび８１０ｂｐ）はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとそれぞれプライマー対のＰ１／Ｐ４およびＰ２／Ｐ３を使って増幅させた。同じ１００μＬのＰＣＲ反応を６系列実施した。増幅後、ＰＣＲ生成物を（それぞれのフラグメントに分けて）一緒にし、フェノール・クロロフォルム抽出およびアルコール沈殿により精製した後、５０μＬのＴＥバッファーに溶解した。６１０ｂｐのＰＣＲフラグメントの濃度は０．１５ｍｇ／ｍＬ（０．３８ｐｍｏｌ／μＬ）であり、８１０ｂｐフラグメントの濃度は０．３ｍｇ／ｍＬ（０．５７ｐｍｏｌ／μＬ）であった。末端研磨反応（１００μＬ）を次のように準備した：
Ｍｉｌｌｉ−ＱＴＭ 水、６２μＬ
６１０ｂｐフラグメント、１５μＬ（５．７ｐｍｏｌ）
８１０ｂｐフラグメント、１０μＬ（５．７ｐｍｏｌ）
１０倍濃度Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー、１０μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２．０μＬ
クレノウ・フラグメント、１．０μＬ（５ユニット）
ＰＣＲフラグメントの末端を研磨するため、反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。その後８０℃で２０分間インキュベートしてクレノウ・フラグメントを失活させた。次に、１．０μＬのＵＳＥＲＴＭ酵素を反応混合物に添加して３７℃１５分間インキュベートし、続いて１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加して室温で３０分間インキュベートした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは８０℃で２０分間インキュベートして失活させた。会合反応混合物から分取した１０μＬを、ＢｓｒＧＩまたはＡｖｒＩＩで消化した後ゲル電気泳動で検定し、１４２０ｂｐの会合生成物内に新たに導入されたそれら制限サイトの存在を確認した（図３５Ｂを参照）。特異なＢｓｒＧＩおよびＡｖｒＩＩサイトを有する１４２０ｂｐの会合生成物をＢｓａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、生じた１３８０ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから精製した後、ＢｓａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した脱ホスホリル化ｐＵＣ１９にサブクローニングした。
Ｅ．ｃｏｌｉ エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ−Ｍｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ遺伝子融合体の構築
２つのプライマー対、Ｐ１／Ｐ４およびＰ２／Ｐ３、の設計と、エンドヌクレアーゼ遺伝子構築におけるそれらの使用を図３４に示した。Ｐ１およびＰ２プライマーの７ヌクレオチド長の重複配列には、ＥｎｄｏＶＩＩＩ遺伝子の最後の２ヌクレオチドおよびＭｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ遺伝子の最初の５ヌクレオチドが含まれる。８００ｂｐのＥｎｄｏＶＩＩＩ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉのゲノム（染色体）ＤＮＡからＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとプライマー対のＰ２／Ｐ３を用いて増幅させた。２６５ｂｐのＭｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ遺伝子の５’末端フラグメントはｐＴＸＢ１からＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとプライマー対のＰ１／Ｐ４を用いて増幅させた。それぞれのＰＣＲの増幅反応は１００μＬずつ６本のチューブで行った。
増幅後、ＰＣＲ生成物はＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，スタジオ・シティー、カリフォルニア州、米国）を用いて精製した。ＰＣＲフラグメントの濃度は、ゲル電気泳動から計算した結果、８００ｂｐフラグメントが０．１ｍｇ／ｍＬ（０．２ｐｍｏｌ／μＬ）であり、２６５ｂｐのＰＣＲフラグメントが０．０５ｍｇ／ｍＬ（０．３ｐｍｏｌ／μＬ）であった。４０μＬスケールの反応を次のように準備した：
Ｍｉｌｌｉ−ＱＴＭ 水、４μＬ
８００ｂｐフラグメント、１０μＬ（２ｐｍｏｌ）
２６５ｂｐフラグメント、２０μＬ（６ｐｍｏｌ）
１０倍濃度Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー、４μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．０μＬ
クレノウ・フラグメント、１．０μＬ（５ユニット）
ＰＣＲフラグメントの濃度比としては、１０６５ｂｐの会合生成物に元の８００ｂｐのＰＣＲフラグメントが混入するのを避けるため、１：３を選択した。反応混合物は、ＰＣＲフラグメントの末端を研磨するため３７℃で１０分間インキュベートした。クレノウ・フラグメントを８０℃で２０分間インキュベートして失活させた。次に、１．０μＬのＵＳＥＲＴＭ酵素を反応混合物に添加して３７℃１５分間インキュベートし、続いて１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加して室温で３０分間、会合反応を進めた。会合反応混合物から分取した２μＬをゲル電気泳動で検定した（図３６Ｂを参照）。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは８０℃で２０分間インキュベートして失活させた。
Ｍｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ遺伝子の５’末端とＥｎｄｏＶＩＩＩ遺伝子の融合物から成る１４２０ｂｐの会合生成物を、ＮｄｅＩおよびＡａｔＩＩで切断し、ゲル精製し、ＮｄｅＩとＡａｔＩＩで切断した脱ホスホリル化ｐＴＸＢ１ベクターにサブクローニングした。
ＨｉｎｃＩＩＲ／Ｑ１３８Ａ突然変異体の構築とｐＴＸＢ１ベクターのプロモーター領域とＭｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ遺伝子の間への同時的挿入。
突然変異体遺伝子の構築と突然変異体遺伝子のベクターへの挿入の実験的図式を図３５に示した。図３５（ａ）は望ましい生成物の略図で、本実施例の生産物である。４個のプライマー対、Ｐ１／Ｐ２，Ｐ３／Ｐ４，Ｐ５／Ｐ６およびＰ７／Ｐ８は、図３５（ｂ）に表示した通りであり、相当する３組の重複プライマー、Ｐ２／Ｐ３，Ｐ４／Ｐ５，Ｐ６／Ｐ７が含まれる。
重複プライマーのＰ２およびＰ３は、ｐＴＸＢ１ベクターのプロモーター領域とｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の５’末端の間で融合体を成している。１１ヌクレオチド長の重複配列には、ｐＴＸＢ１配列の４ヌクレオチドとｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の５’末端の最初の７ヌクレオチドが含まれている。
重複プライマーのＰ４およびＰ５には、ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の１３８番目の位置にコドン置換が導入された。プライマーＰ５では、野生型のコドンＣＡＡ（グルタミンをコード）が変異原性のアラニンをコードするコドンＧＣＴで置き換えられた。プライマーＰ４では、それに相応して、ＴＴＧ配列がＡＧＣ配列で置き換えられた。
最後の組の重複プライマー、Ｐ６とＰ７は、ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の３’末端とＭｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ遺伝子の５’末端の間で融合体を成している。９ヌクレオチド長の重複配列には、ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の３’末端の最後の４ヌクレオチドとＭｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ遺伝子の最初の５ヌクレオチドが含まれている。プライマーＰ１およびＰ８の両者は共に独特なＸｂａＩサイトとＢｓｒＧＩサイトに挟まれたｐＴＸＢ１ベクター配列を開始させる。
４つの別々のＰＣＲ反応が、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと対応するプライマー対を用いて行われた。ｐＴＸＢ１ベクターの１４０ｂｐのプロモーター領域を、プライマー対のＰ１／Ｐ２（ＰＣＲ１）およびｐＴＸＢ１プラスミドを鋳型（テンプレート）として用いて増幅した。ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の４２０ｂｐおよび３８０ｂｐフラグメントの増幅は、鋳型としての全長のｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子とそれぞれのプライマー対Ｐ３／Ｐ４（ＰＣＲ２）またはＰ５／Ｐ６（ＰＣＲ３）のいずれかを用いて行われた。Ｍｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ遺伝子の３６０ｂｐの５’末端フラグメントは、ｐＴＸＢ１ベクターからプライマー対のＰ７／Ｐ８（ＰＣＲ４）を用いて増幅させた。増幅後、各ＰＣＲフラグメントはフェノール・クロロフォルム抽出およびアルコール沈殿で精製した後、５０μＬのＭｉｌｌｉ−ＱＴＭ 水に溶解した。ＰＣＲフラグメントの濃度をＯＤ２６０の測定から計算し次の値を得た。ＰＣＲ１：０．２３ｍｇ／ｍＬ（２．９ｐｍｏｌ／μＬ）；ＰＣＲ２：０．３５ｍｇ／ｍＬ（１．３ｐｍｏｌ／μＬ）；ＰＣＲ３：０．３０ｍｇ／ｍＬ（１．２ｐｍｏｌ／μＬ）およびＰＣＲ４：０．３０ｍｇ／ｍＬ（１．３ｐｍｏｌ／μＬ）。
５０μＬスケールの反応を次のように準備した：
１０倍Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー、５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．０μＬ
クレノウ・フラグメント、１．０μＬ（５ユニット）
Ｍｉｌｌｉ−ＱＴＭ 水、２８μＬ
ＰＣＲ１，１５μＬ（４４ｐｍｏｌ）
（または、ＰＣＲ２、１５μＬ（２０ｐｍｏｌ））
（または、ＰＣＲ３、１５μＬ（１８ｐｍｏｌ））
（または、ＰＣＲ４、１５μＬ（２０ｐｍｏｌ））
ＰＣＲフラグメントの末端を研磨するため、各々の反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。クレノウ・フラグメントは８０℃で２０分間インキュベートして失活させた。４２０ｂｐおよび３８０ｂｐのｈｉｎｃＩＩＲフラグメントは分子あたり２個のウラシルを含むため、２０ｐｍｏｌの各フラグメントに完全に切込みを入れるには２ユニットのＵＳＥＲＴＭ酵素が必要である。そのため、各反応混合物に２μＬのＵＳＥＲＴＭ酵素を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、反応物を氷上に保存した。
試験的会合反応：１μＬの各ＰＣＲフラグメントを５μＬの１倍Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファーと混合した後、１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し室温で３０分間インキュベートしてＰＣＲフラグメントを会合させた。会合反応物を、１μＬのＵＳＥＲＴＭ酵素処理したフラグメントと平行して電気泳動させ、会合効率を評価した。
大量会合反応：２０μＬのＰＣＲ１、ＰＣＲ２およびＰＣＲ３フラグメントおよび４０μＬのＰＣＲ４フラグメントを一緒にし、１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加した後、会合を進めるために室温で３０分間インキュベートした。大量会合反応では、試験的会合反応において９００ｂｐの部分会合生成物の著しい蓄積が認められたので、ＰＣＲ４の濃度を２倍にした。５μＬを会合反応混合物から分取し、電気泳動で検定した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは８０℃で２０分間インキュベートして失活させた。１２７０ｂｐの会合生成物は、確実にｐＴＸＢ１のプロモーター領域と、Ｍｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ遺伝子の５’末端の間に挿入されたｈｉｎｃＩＩＲ／Ｑ１３８Ａ遺伝子を有していた。これを次にＸｂａＩおよびＢｓｒＧＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、アガロースゲルから精製した後、ＸｂａＩおよびＢｓｒＧＩで解裂させた脱ホスホリル化ｐＴＸＢ１ベクターにサブクローニングした。
サイレント突然変異と組合せたヒトゲノムＤＮＡからのｈＡＰ１遺伝子の組立て。
サイレント突然変異と組合せたｈＡＰ１遺伝子の組立ての実験的図式を図３６に示した。図３６（ａ）は、ヒトＡＰ１エンドヌクレアーゼ遺伝子のｃＤＮＡの略図である。５個のプライマー対、Ｐ１／Ｐ２，Ｐ３／Ｐ４、Ｐ５／Ｐ６、Ｐ７／Ｐ８およびＰ９／Ｐ１０は、図３６（ｂ）に表示した通りであり、それぞれ４組の重複プライマー、Ｐ２／Ｐ３、Ｐ４／Ｐ５、Ｐ６／Ｐ７、Ｐ８／Ｐ９が含まれる。
重複プライマーのＰ２およびＰ３は、ｈＡＰ１遺伝子のエクソン２とエクソン３の間の接合部を形成した。８ヌクレオチド長の重複配列には、エクソン３の５’末端内を採用した。プライマー２はエクソン２の３’末端と会合したが、５’末端に、エクソン３の５’末端と逆向きの相補性を有する２０ヌクレオチド長の配列を補足した。
重複プライマーのＰ４およびＰ５は、ｈＡＰ１遺伝子のエクソン３とエクソン４の間の接合部を形成した。９ヌクレオチド長の重複配列は、エクソン３の最後の４ヌクレオチドとエクソン４の最初の５ヌクレオチドから形成された。
重複プライマーのＰ６およびＰ７は、ｈＡＰ１遺伝子のエクソン４とエクソン５の間の接合部を形成した。９ヌクレオチド長の重複配列は、エクソン４の最後の４ヌクレオチドとエクソン５の最初の５ヌクレオチドから形成された。
重複プライマーのＰ８およびＰ９は、自然に生じるＮｄｅＩ制限サイトを排除するために、エクソン５配列内にサイレントの置換を導入した。９ヌクレオチドの重複領域内で、プライマー８はＴからＣへ、プライマー９はＡからＧへの置換があり、その結果、ＮｄｅＩサイトのＣＡＴＡＴＧがＣＧＴＡＴＣに変換された。
次に、ＮｄｅＩ制限サイトがプライマーＰ１の５’配列に組込まれ、組立てられたｈＡＰ１遺伝子のサブクローニングのための制限エンドヌクレアーゼサイトが作られた。同じ目的で、ＳａｐＩサイトがプライマー１０の５’配列に組込まれた。
５つの別々のＰＣＲ反応を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと鋳型としてヒトの全ゲノムＤＮＡを用いて行った。８０ｂｐのエクソン２をプライマー対のＰ１／Ｐ２を用いて増幅し、ＰＣＲ１と表示した生成物を得た。１８０ｂｐのエクソン３をプライマー対のＰ３／Ｐ４を用いて増幅し、ＰＣＲ２と表示した生成物を得た。２００ｂｐのエクソン４をプライマー対のＰ５／Ｐ６を用いて増幅し、ＰＣＲ３と表示した生成物を得た。８０ｂｐのエクソン５の５’末端部分をプライマー対のＰ７／Ｐ８を用いて増幅し、ＰＣＲ４と表示した生成物を得た。そして、４６０ｂｐのエクソン５の３’末端部分をプライマー対のＰ９／Ｐ１０を用いて増幅し、ＰＣＲ５と表示した生成物を得た。増幅後、各ＰＣＲフラグメントはフェノール・クロロフォルム抽出およびアルコール沈殿で精製した後、５０μＬのＭｉｌｌｉ−ＱＴＭ 水に溶解した。ＰＣＲフラグメントの濃度測定から次の値を得た。ＰＣＲ１：０．００５ｍｇ／ｍＬ（０．１０ｐｍｏｌ／μＬ）；ＰＣＲ２：０．０３ｍｇ／ｍＬ（０．２６ｐｍｏｌ／μＬ）；ＰＣＲ３：０．１０ｍｇ／ｍＬ（０．７７ｐｍｏｌ／μＬ）；ＰＣＲ４：０．０１ｍｇ／ｍＬ（０．２０ｐｍｏｌ／μＬ）；ＰＣＲ５：０．０５ｍｇ／ｍＬ（０．１７ｐｍｏｌ／μＬ）。
５０μＬスケールの反応を次のように準備した：
１０倍Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー、５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．０μＬ
クレノウ・フラグメント、１．０μＬ
ＰＣＲ１、またはＰＣＲ２、またはＰＣＲ３、またはＰＣＲ４，またはＰＣＲ５，４０μＬ（４ｐｍｏｌ）
Ｍｉｌｌｉ−ＱＴＭ 水、全量を５０μＬにする量
平滑末端のＰＣＲフラグメントにするため、各々の反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。クレノウ・フラグメントは８０℃で２０分間インキュベートして失活させた。２μＬ（２ユニット）のＵＳＥＲＴＭ酵素を各反応混合物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、反応物を氷上に保存した。
試験的会合反応（図３６（ｆ））：ＰＣＲフラグメントを次の比率（μＬ）で混合した：
ＰＣＲ１：ＰＣＲ２：ＰＣＲ３：ＰＣＲ４：ＰＣＲ５＝４：１：１：１：３
１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、室温で３０分間インキュベートして会合させた。会合反応物を、１μＬのＵＳＥＲＴＭ酵素処理したフラグメントと平行に電気泳動させて解析し、会合効率を評価した。
大量会合反応：１０倍量のＰＣＲフラグメントを試験的会合反応で示したのと同じ比率で混合し、１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加した後、会合反応を進めるために室温で３０分間インキュベートした。大量会合反応では、試験的会合反応において９００ｂｐの部分会合生成物の著しい蓄積が認められたので、ＰＣＲ４の濃度を２倍にした。５μＬを会合反応混合物から分取し、ゲル電気泳動で検定した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは８０℃で２０分間インキュベートして失活させた。
１０００ｂｐの会合生成物は、４９０ｎｔ．の位置のＮｄｅＩ制限サイトが失活して組立てられたｈＡＰ１遺伝子を有していた。次に、会合したフラグメントをＮｄｅＩおよびＢａｐＩで切断し、アガロースゲルから精製した後、ＮｄｅＩおよびＢａｐＩで解裂させた脱ホスホリル化ｐＴＸＢ１ベクターにサブクローニングした。
直鎖状ｐＮｅｂ２０５Ａベクターに突然変異ＰＣＲフラグメントを指向的に組立てることによる９ｏＮｍポリメラーゼの部位特異的突然変異。
ここで用いた部位特異的突然変異を作る実験的取組み方の概略を図３７に示した。２つのＰＣＲプライマー対は図３７に表記した通りである。重複プライマーのＰ１およびＰ２は、９３番目のコドンのＧＴＣ（バリンをコード）からＣＡＡ（グルタミンをコード）への変化を含んでいる。プライマーＰ１には２個のヌクレオチド変更がある。すなわち、ＴＣがＡＡで置換されている。プライマーＰ２には３個のヌクレオチド変更がある。すなわち、ＧＡＣがＴＵＧで置換されている。プライマーＰ３およびＰ４の５’末端には、直鎖状ｐＮＥＢ２０５Ａベクター上の一重鎖伸長（実施例２を参照）に適合性のある新たな８ヌクレオチドが補足された。９ｏＮｍポリメラーゼ遺伝子の２０４１ｂｐおよび２８７ｂｐのフラグメントは、ＴａｑＩ ＤＮＡポリメラーゼとそれぞれのプライマー対Ｐ１／Ｐ４およびＰ２／Ｐ３を用いて増幅した。それぞれのＰＣＲの反応液量は１００μＬであった。組立て反応は次のように準備した：
２８７ｂｐＰＣＲフラグメント、１μＬ（０．１ｐｍｏｌ）
２０４１ｂｐＰＣＲフラグメント、１０μＬ（０．１ｐｍｏｌ）
ｐＮＥＢ２０５Ａ 直鎖状ベクター（２０ｎｇ）、１μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２．０μＬ
ＵＳＥＲＴＭ酵素、１．０μＬ（１ユニット）
反応液は３７℃で１５分間、次に室温で１５分間インキュベートした。５０μＬのＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２２６７受容性細胞を５μＬの上記反応液で形質転換した。１００μＬ（全量１ｍＬ中から）の形質転換反応物を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレートで平板培養した。
３７℃で１８時間インキュベーションした後、２ｘ１０３個以上の形質転換細胞が得られた。このうち、６つの個別の形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを精製し、挿入物の存在を制限エンドヌクレアーゼＢｂｖＣＩによる切断で検定した。すべてのプラスミドＤＮＡが２．３ｋｂの挿入を有していたことから、９ｏＮｍポリメラーゼ遺伝子の全長がクローニングされたことが示された。６個のプラスミドのうちの５個について、突然変異領域を挟んだ配列決定を行い、すべてが所望したコドン置換（ＧＴＣからＣＡＡへ）を有していることが判明した。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＮＥＢ＃５４５由来スーパーインテグロンの３’ゲノム領域のクローニング
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＮＥＢ＃５４５（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．，ビバリー、マサチューセッツ州、米国）から得られるスーパーインテグロンの、ｃｏｎｔｉｇ Ｃ（Ｖａｉｓｖｉｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：５８７−６０１（２００１））の下流にある未知３’ゲノム領域をクローニングするために用いた方法の概略を図３８に示した。
３個のＰＣＲプライマーを設計した。プライマーＰａｌ３−１（ＧＧＡＡＣＧＧＣＡＡＴＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣＧＴＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８））を３’ゲノムＤＮＡ区分の線状増幅に用いた。
プライマーＰａｌ３−３（ＧＧＧＧＧＸＣＴＡＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、Ｘは８−オキソ−グアニンを指す）およびプライマーＧＧ−２（ＧＧＧＧＧＸＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＨＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、ＨはＡ，ＴまたはＣのいずれか、ＮはＡ，Ｔ，ＣまたはＧのいずれか、Ｘは８−オキソ−グアニンを指す）を重合せの増幅に用いた。
ｃｏｎｔｉｇ Ｃの既知３’末端の下流の一重鎖フラグメントのライブラリーは、下記のプロトコルを使って、全ゲノムＤＮＡから線状増幅により作製した。１０ｐｍｏｌのＰａｌ３−１プライマー、２００μＭのｄＮＴＰおよび２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む１００μＬのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応バッファーに溶かした１００ｎｇのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡは、下のプロトコルを使って２５サイクルの線状増幅を行った。
９４℃ ４分
９４℃ ３０秒
５７℃ １分 １サイクル
７２℃ １分
増幅後、増幅生成物をＭｉｃｒｏｃｏｎ−ＰＣＲフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国）で精製した。
シトシン末尾生成反応のため、０．２５ｍＭのＣｏＣｌ２および２ｍＭのｄＣＴＰを含むＮＥＢｕｆｆｅｒ４反応バッファー中で、１０μＬの精製した増幅生成物を２０ユニットの末端転移酵素と３７℃で１５分間インキュベートした。その後、末端転移酵素は７５℃で１０分間インキュベートして失活させた。
２本鎖生成物のライブラリーを作製するために、２μＬの末尾をつけた増幅生成物をさらに１０ｐｍｏｌのＰａｌ３−３およびＧＧ−２プライマー、２００μＭのｄＮＴＰおよび２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む１００μＬのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応バッファー中で、下記のサイクリングプロトコルに従って２５サイクルの増幅を行った。
９４℃ ４分
９４℃ ３０秒
５７℃ １分 １サイクル
７２℃ １分
７２℃ ５分
ＰＣＲ生成物を増幅したライブラリーをｐＵＣ−ＴＴに導入するため、９μＬのＰＣＲサンプルを１μＬの直鎖状ｐＵＣ−ＴＴベクターおよび１μＬ（８ユニット）のＦＰＧグリコシラーゼと混合し、３７℃で１５分間インキュベートして８−オキソ−グアニンを切断した。反応物は室温でさらに１５分間インキュベートして相補的な伸長を会合させた。
化学受容性大腸菌のＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２細胞を１０μＬの組立て反応物で形質転換した。組換え体は、形質転換反応物をアンピシリン含有ＬＢプレートを用いた平板培養で選択した。３７℃、１８時間インキュベーションして、４ｘ１０３個以上の形質転換細胞を得た。コロニーＰＣＲで選別した３２個の転換細胞のうちの２７個に０．３ｋｂから１．３ｋｂ長のばらつきのある挿入があった。最長（０．９ｋｂから１．３ｋｂ）の挿入を有する５個の個別の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、挿入領域を横切るように配列を決定した。それら全てが同じゲノムＤＮＡ区分を有しており、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＮＥＢ＃５４５スーパー・インテグロンの既知領域から３’側に位置していた。
図１は、望ましい長さおよび組成の３’一重鎖伸張が、どのようにして開裂したポリヌクレオチド分子の左側に生成するかを示す： （ａ）ポリヌクレオチド分子に挿入されたのは、境界（１３）を有し、そして矢印によって指示されたように一つの鎖上の部位Ａ内に切込みを入れる切込みエンドヌクレアーゼＡによって認識される部位Ａ、および矢印によって指示されたように両方の鎖を開裂する制限エンドヌクレアーゼＢによって認識される部位Ａの下流に位置する部位Ｂを含有するカセットであり； （ｂ）切込みエンドヌクレアーゼＡおよび制限エンドヌクレアーゼＢによって開裂されてホスホジエステル結合主鎖中に切込みを示すカセットを含有するポリヌクレオチド分子； （ｃ）解離の産物（１）、（２）および（３）で、（１）は、望ましい長さおよび組成の３’一重鎖伸張によって隣接されている開裂したポリヌクレオチド分子の左側である。 図2は、どのようにして、望ましい長さおよび組成の３’一重鎖伸張が、開裂したポリヌクレオチド分子の右側に生成するかを示す： （ａ）ポリヌクレオチド分子に挿入されたのは、境界（１３）を有し、逆配向した、部位Ｂの下流に位置している部位Ａを含有する、カセットであり； （ｂ）切込みエンドヌクレアーゼＡおよび制限エンドヌクレアーゼＢによって開裂されてホスホジエステル結合主鎖中に切込みを示すカセットを含有するポリヌクレオチド分子； （ｃ）解離の産物（４）、（５）および（６）で、（４）は、望ましい長さおよび組成の３’一重鎖伸張で隣接されている開裂したポリヌクレオチド分子の右側である。 図３は、望ましい長さおよび組成の３’一重鎖伸張が、どのようにして開裂したポリヌクレオチド分子の左側および右側の両方に得られるのかを示す： （ａ）ポリヌクレオチド分子に挿入されたのは、境界（１３）を有し、相互に関して逆に配向し、そして一つの制限エンドヌクレアーゼ部位Ｂのいずれかの側に位置する二つの切込み部位Ａを含有するカセットであり； （ｂ）切込みエンドヌクレアーゼＡおよび制限エンドヌクレアーゼＢによって開裂されてホスホジエステル結合主鎖中に切込みを示すカセットを含有するポリヌクレオチド分子； （ｃ）解離の産物（１）、（３）、（４）および（６）で、（１）および（４）は、望ましい長さおよびヌクレオチド組成の３’一重鎖伸張を有する。 図４は、３’一重鎖伸張がどのようにして、開裂したポリヌクレオチド分子の左側および右側の両方に得られるのかを示す： （ａ）ポリヌクレオチド分子に挿入されたのは、境界（１３）を有し、二つの制限部位Ｂに隣接した逆に配向している切込み部位Ａを含有するカセットである。二つの制限部位Ｂの間は、望ましい長さのスペーサー領域である（点線によって示される）； （ｂ）切込みエンドヌクレアーゼＡおよび制限エンドヌクレアーゼＢによって開裂されてホスホジエステル結合主鎖中に切込みを示すカセットを含有するポリヌクレオチド分子； （ｃ）解離の産物（１）、（３）、（４）、（６）および（７）で、（１）および（４）は、望ましい長さおよびヌクレオチド組成の３’一重鎖伸張を有し、（７）はスペーサー領域である。 図５は、望ましい長さおよび組成の５’一重鎖伸張がどのようにして、開裂したポリヌクレオチド分子の左側に生成され得るのかを示す： （ａ）二本鎖ポリヌクレオチド分子に挿入されたのは、境界（１３）を有し、部位Ｃおよび部位Ｄを含有するカセットであり、ここで部位Ｃは、矢印によって指示されたように外側の部位Ｃに切込みを入れる切込みエンドヌクレアーゼＣによって認識される。部位Ｃの下流に位置する部位Ｄは、矢印によって指示されたように両方の鎖を開裂する制限エンドヌクレアーゼＤによって認識される； （ｂ）切込みエンドヌクレアーゼＣおよび制限エンドヌクレアーゼＤによって開裂されてホスホジエステル結合主鎖中に切込みを示すカセットを含有するポリヌクレオチド分子； （ｃ）解離の産物（８）、（９）および（１０）で、（８）は、望ましい長さおよび組成の５’一重鎖伸張によって隣接されている開裂したポリヌクレオチド分子の左側である。 図６は、５’一重鎖伸張がどのようにして、開裂したポリヌクレオチド分子の左側および右側の両方に得られるのかを示す： （ａ）ポリヌクレオチド分子に挿入されたのは、境界（１３）を有し、相互に関して逆に配向し、そして一つの制限エンドヌクレアーゼ部位Ｄのいずれかの側に位置する二つの切込み部位Ｃを含有するカセットであり； （ｂ）切込みエンドヌクレアーゼＣおよび制限エンドヌクレアーゼＤによって開裂されてホスホジエステル結合主鎖中に切込みを示すカセットを含有するポリヌクレオチド分子； （ｃ）解離の産物（８）、（１０）、（１１）および（１２）で、（８）および（１１）は、望ましい長さおよびヌクレオチド組成の５’一重鎖伸張を有する。 図７は、前もって決められた配向でレシピエント分子に、どのようにして標的分子を挿入することができるかを示す： （ａ）左および右のプライマーが示され、５’末端の各プライマーは、以下の複数のヌクレオチド（Ｎ）および複数のヌクレオチド（ｎ）によって特徴づけられている：複数のヌクレオチド（Ｎ）において、Ｎは標的分子に相補性でないが、ヌクレオチド「Ｘ」以外は線状化レシピエント分子の相当する左または右の３’一重鎖伸張と同一であるヌクレオチド配列のＡ、Ｔ、ＧまたはＣの何れにも相当しており、Ｘはプライマー配列においてレシピエント分子の左および右末端の末端３’ヌクレオチドと置換し、そして切込み剤の標的である；および複数のヌクレオチド（ｎ）は、標的分子の相補鎖のヌクレオチドと複合化する； （ｂ）左および右プライマーおよび標的分子の完全な配列に相当するＤＮＡ増幅産物； （ｃ）増幅されたＤＮＡをＸに特異的な切込み剤で処理した後に産生された３’一重鎖伸張により隣接された標的分子； （ｄ）（ｃ）の標的分子の３’一重鎖伸張に相補性である３’一重鎖伸張を有するレシピエント分子； （ｅ）（ｃ）および（ｄ）の標的分子およびレシピエント分子の結合から得られる組換え産物。 図８は、相補性３’一重鎖伸張がどのようにして、標的分子における望ましい位置に生成され得るかを示す： （ａ）標的分子におけるそれぞれの位置を示すプライマー対Ｐ２／Ｐ３およびＰ１／Ｐ４の設計。ここでプライマーＰ１およびＰ２は、太い線として示した前もって選択されたヌクレオチド配列に関して互いに重複しており、前もって選択されたヌクレオチド配列は重複部の３’末端に修飾ヌクレオチドＸを包含している； （ｂ）プライマー対Ｐ２／Ｐ３およびＰ１／Ｐ４のそれぞれを使用して増幅した断片１および２と呼ばれる増幅産物、および断片１および２の向かい側の鎖の修飾ヌクレオチドの存在を有する共通の重複領域（黒で示す）を示す； （ｃ）互いに相補性である３’一重鎖伸張を有するＸに特異的な切込み剤で開裂後の断片１および２の解離産物； （ｄ）断片１および２は、その相補性３’一重鎖伸張を通して再会合される。 図９は、標的分子において部位特異的突然変異を達成するために、どのようにしてプライマー対（Ｐ２／Ｐ３およびＰ１／Ｐ４）が修飾され得るかを示している。プライマーの設計ステップのみが示される。これらのプライマーは、図８（ｂ）ないし（ｄ）に従って使用することができる。Ｘは修飾ヌクレオチドである： 図９Ａプライマー設計は、両プライマーが断片１および２の生成において使用されるとき［図８（ｂ）］、両方の増幅断片が共通した重複領域の同じ位置に突然変異体を担持するように、両Ｐ１およびＰ２プライマーの重複配列（太線で示す）中に突然変異体（黒三角形）が導入されることを包含する； 図９Ｂプライマー設計は、Ｐ１のみにＸの下流に突然変異体を導入することを包含する（黒三角）。もしＰ１およびＰ２が、断片１および２の生成に使用されるなら［図８（ｂ）］、突然変異体は、重複領域下流の断片２内に位置される。 図１０は、標的分子においてヌクレオチド配列挿入を達成するために、どのようにしてプライマー対（Ｐ２／Ｐ３およびＰ１／Ｐ４）が修飾され得るかを示している。プライマーの設計ステップのみが示される。これらのプライマーは、図８（ｂ）ないし（ｄ）に従って使用することができる。両重複プライマーＰ１およびＰ２中の開始配列（矢印で示す）は、予期した挿入の位置で正確に始まる。Ｘは修飾ヌクレオチドである： 図１０Ａプライマー設計は、挿入配列（太線で示す）に相当する５’重複領域を有するプライマーＰ１およびＰ２を包含する。Ｘは開始配列（矢印で示す）および挿入配列の間の結合部に位置する。 図１０Ｂプライマー設計は、プライマーＰ２で開始配列に隣接したその５’末端に完全な挿入配列を有するものを包含する（点線プラス太線として示す）。共通の重複を創生するために、プライマーＰ１は挿入配列の５’末端を含有している（太線で示す）。Ｐ１においては、Ｘは開始配列（矢印で示す）と重複領域の間の接合部に位置している。Ｐ２においては、Ｘは重複領域と挿入配列の残りの間に位置している。 図１１は、標的分子においてヌクレオチド配列欠失を達成するために、どのようにしてプライマー対（Ｐ２／Ｐ３およびＰ１／Ｐ４）が修飾され得るかを示している。プライマーの設計ステップのみが示される。これらのプライマーは、図８（ｂ）ないし（ｄ）に従って使用することができる。 重複プライマーＰ１およびＰ２は、各プライマーの開始配列が標的分子の標的となる欠失領域（標的分子中の点線）を越えて始まるように設計されている。共通の重複領域を生成するために、追加のヌクレオチド配列が、Ｐ１の５’末端に逆相補性であるプライマーＰ２の５’末端に包含されている。重複領域は、太線で示されている。各プライマーは、重複領域と開始配列の間の接合部に単一修飾ヌクレオチドを担持している。 図１２は、標的分子Ａおよび標的分子Ｂから融合産物を創生するために、どのようにしてプライマー対（Ｐ２／Ｐ３およびＰ１／Ｐ４）が設計され得るかを示している。プライマーの設計ステップのみが示される。これらのプライマーは、図８（ｂ）ないし（ｄ）に従って使用することができる。 重複プライマーＰ１およびＰ２は、各プライマーがそれぞれの標的分子に会合するように設計される。共通の重複領域を生成するため、追加のヌクレオチド配列が、プライマーＰ１の５’末端に逆相補正であるプライマーＰ２の５’末端に含まれている。重複領域は太線で示されている。各プライマーは、重複領域と開始配列の間の接合点にヌクレオチドＸを担持している。 図１３は、図１２のアプローチの後に、複数の中間標的分子から標的分子の組立てを達成するために、どのようにして複数のプライマー対が設計され得るかを示している。中間標的分子Ａ、ＢおよびＣのそれぞれを使用するプライマー対Ｐ１／Ｐ２、Ｐ３／Ｐ４およびＰ５／Ｐ６のために、二つの重複プライマー対、Ｐ２／Ｐ３、Ｐ４／Ｐ５が図１２において記載されたように設計される。 図１４は、図１２のアプローチの後に、複数の中間標的分子から環状標的分子の組立てを達成するために、どのようにして複数のプライマー対が設計され得るかを示している。標的分子Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのそれぞれを使用するプライマー対Ｐ１／Ｐ２、Ｐ３／Ｐ４、Ｐ５／Ｐ６およびＰ７／Ｐ８のために、四つの重複プライマー対、Ｐ２／Ｐ３、Ｐ４／Ｐ５、Ｐ６／Ｐ７およびＰ８／Ｐ１が図１２において記載されたように設計される。 図１５は、図１２および１３において示したように設計された複数のプライマー対を用いて個々のエキソンを組立てることによってｃＤＮＡをつくる代わりに、どのようにしてゲノムＤＮＡから直接真核生物遺伝子を創生するかを示している。プライマーにおいて５’共通の重複領域は太字で示されている。開始配列は矢印で示されている。 図１６は、どのようにして標的分子の協同操作およびクローニングが達成できるかを示している： （ａ）外部プライマーＰ３およびＰ４の設計は、レシピエント分子の挿入できるようになっており、重複プライマーＰ１およびＰ２の設計は、標的分子が操作できるようになっている。外部プライマーＰ３およびＰ４は、図７（ａ）に記載したようにして設計される。重複プライマーＰ１およびＰ２は、図９Ａに記載したようにして設計される。標的ＤＮＡは、プライマー対Ｐ２／Ｐ３およびＰ１／Ｐ４と共に二つの重複断片として増幅される； （ｂ）断片１および断片２として同定された増幅産物は、共通の重複領域内に新しく導入された突然変異体を含有している（黒と白の三角形）。 （ｃ）Ｘに特異的な切込み剤で切断後の断片１および２の解離産物であり、断片１および２は、両端の３’一重鎖伸張によって隣接されている。外部の伸張は、レシピエント分子の３’一重鎖伸張に相補性であるが、新しく導入された突然変異体（白い三角形）を担持している内部の伸張は互いに相補性である； （ｄ）レシピエント分子は、断片１および２の外側の３’一重鎖伸張に相補性である３’一重鎖伸張によって隣接されている； （ｅ）相補性一重鎖伸張の会合手段による、断片１および２のレシピエント分子への方向性を有する組立て。 図１７は、公知配列の境界の外側のゲノムＤＮＡ断片がどのようにしてレシピエント分子にクローニングできるかを示している： （ａ）プライマー１は、異なった長さの一重鎖ポリヌクレオチド分子をつくるために線状増幅できる公知配列の末端に近い標的ＤＮＡに特異的である； （ｂ）ポリＣ末端は、ターミナルトランスフェラーゼおよびｄＣＴＰを用いて増幅した一重鎖ポリヌクレオチド分子の３’末端に加えられる。ポリＣが末端についた一重鎖断片は、プライマー２およびプライマー３と共に増幅される。プライマー２は、開始配列と５’ポリＧ末端の間の接合部に８−オキソグアニンを有している。プライマー３は、ポリＣ末端に相補性であり、プライマー２の８−オキソグアニンの位置に相当する位置で、５’末端に近い８−オキソグアニンを含有するポリｄＧである。「Ｎ］はＡ、Ｇ、ＣまたはＴを、「Ｈ」はＡ、ＴまたはＣを示している； （ｃ）断片の５’末端から６番目の位置の８−オキソグアニンと共に増幅された産物； （ｄ）増幅したＤＮＡは、８−オキソグアニンのところでＵＳＥＲＴＭ酵素２によって切込みを入れられ、かくして、増幅産物の両端に６つのシトシンの３’一重鎖伸張を生成する； （ｅ）６個のシトシンの３’一重鎖伸張によって隣接された未知のゲノムＤＮＡで表される増幅産物が、６個のグアニンからなる３’一重鎖伸張を有するレシピエント分子に挿入される。 図１８は、どのようにしてｃＤＮＡライブラリーが、レシピエント分子の３’一重鎖伸張に相補性である３’一重鎖伸張によって隣接された二本鎖ｃＤＮＡ分子のライブラリーを生成することによってｍＲＮＡから創生できるかを示している： （ａ）ｃＤＮＡを生成するためのｍＲＮＡおよび第一鎖合成のためのプライマー。プライマー１は、ポリＴの開始配列およびその５’末端に追加されたヘキサグアニン配列を包含し、５’末端から６番目の位置のグアニンは８−オキソグアニンによって置換されている：「Ｖ」＝Ａ、ＣまたはＧ；「Ｎ］＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ；および「Ｇ＝Ｏ」は８−オキソグアニンを指す； （ｂ）ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドは、逆転写酵素（Ｍ−ＭｕＬＶ）およびプライマー１の存在下で生成される； （ｃ）ｍＲＮＡは、一重鎖ｃＤＮＡを残してＲＮａｓｅ消化によってハイブリッドから除かれる； （ｄ）ポリｄＣ末端が、ターミナルトランスフェラーゼおよびｄＣＴＰを用いて一重鎖ｃＤＮＡの３’末端に付加される。ｃＤＮＡのポリｄＣ末端に複合化されるポリｄＧ配列を包含するプライマー２が、５’末端から６番目の位置に８−オキソグアニンを有するよう設計される。「Ｈ］＝Ａ、ＴまたはＣ； （ｅ）二本鎖ｃＤＮＡがＤＮＡポリメラーゼＩおよびプライマー２を用いて生成される； （ｆ）二本鎖ｃＤＮＡが、８−オキソグアニンに切込みを入れるようにＵＳＥＲＴＭ酵素２で処理され、６シトシンの３’一重鎖伸張を生じる； （ｇ）６グアニンの３’一重鎖伸張を有するレシピエント分子が、（ｆ）で産生されたｃＤＮＡ分子と会合し、組換え分子を形成し、かくしてｃＤＮＡライブラリーを生成する。 図１９は、レシピエント分子ｐＮＥＢ２０５Ａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の設計および標的分子のクローニング用線状ベクターの生成を示す： （ａ）レシピエント分子については、カセット（配列番号１）を挿入することによって構築されたｐＮＥＢ２０５Ａと呼ばれる環状ベクターであるものがここに示されており、カセットは、ｐＮＥＢ１９３ベクターの複数のクローニング部位にあるＸｂａＩ制限部位に隣接した二つの逆に配向した切込みＮ．ＢｂｖＣＩＢ部位を含有している（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔａｌｏｇ，２００２−２００３，ｐ．３１８）。カセット内の酵素認識部位には下線を引いてあり、部位内の開裂位置は矢印によって示されている。 （ｂ）Ｎ．ＢｂｖＣＩＢおよびＸｂａＩでのｐＮＥＢ２０５Ａの消化産物（配列番号２）は、８ヌクレオチド長の３’一重鎖伸張、それぞれＧＧＧＡＡＡＧＴ−３’およびＧＧＡＧＡＣＡＴ−３’、で隣接された線状ベクターｐＮＥＢ２０５Ａである。 図２０は、レシピエント分子ｐＮＥＢ２００Ａの設計および標的分子のクローニング用線状化されたベクターの製造を示す： （ａ）レシピエント分子は、カセット（配列番号３）を挿入することによって構築されたｐＮＥＢ２００Ａと呼ばれる環状ベクターであるものがここに示されており、カセットはｐＮＥＢ１９３ベクターの複数のクローニング部位にある二つのＸｂａＩ制限部位に隣接した二つの逆に配向した切込みＮ．ＢｂｖＣＩＢ部位を含有している。カセット内の酵素認識部位は下線を引いてあり、開裂位置は矢印によって示されている。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは、認識配列の外側を切断する。 （ｂ）Ｎ．ＢｓｔＮＢＩおよびＸｂａＩでのｐＮＥＢ２００Ａの消化産物は、８ヌクレオチド長の３’一重鎖伸張、それぞれＡＣＧＡＧＡＣＴ−３’およびＡＣＣＡＧＡＣＴ−３’、で隣接された線状ベクターｐＮＥＢ２００Ａである。 図２１は、レシピエント分子ｐＮＥＢ２１０Ａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の設計および標的分子のクローニング用線状化されたベクターの製造を示す： （ａ）レシピエント分子は、カセット（配列番号４）を挿入することによって構築されたｐＮＥＢ２１０Ａと呼ばれる環状ベクターであるものがここに示されており、カセットはｐＮＥＢ１９３ベクターの複数のクローニング部位にあるＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限部位に隣接した二つの逆に配向した切込みＮ．ＢｂｖＣＩＢ部位を含有している。カセット内の酵素認識部位は下線を引いてあり、部位内の開裂位置は矢印によって示されている。 （ｂ）Ｎ．ＢｂｖＣＩＢ、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩでのｐＮＥＢ２１０Ａの消化産物（配列番号５）は、一端がＧＧＧＧＧＧ−３’の６ヌクレオチド長の３’一重鎖伸張、および他端がＧＧＡＧＡＣＡＴ−３’の８ヌクレオチド長の３’一重鎖伸張で隣接された線状ベクターｐＮＥＢ２１０Ａである。 図２２は、レシピエント分子ｐＵＣ−ＴＴ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の設計および標的分子のクローニング用線状化されたベクターの製造を示す： （ａ）レシピエント分子については、カセット（配列番号６）を挿入することによって構築されたｐＵＣ−ＴＴと呼ばれる環状ベクターであるものがここに示されており、カセットは、ｐＮＥＢ１９３ベクターの複数のクローニング部位にある二つのＢａｍＨＩ制限部位に隣接した二つの逆に配向した切込みＮ．ＢｂｖＣＩＢ部位を含有している。カセット内の酵素認識部位には下線を引いてあり、部位内の開裂位置は矢印によって示されている。 （ｂ）Ｎ．ＢｂｖＣＩＢおよびＢａｍＨＩでのｐＵＣ−ＴＴの消化産物（配列番号７）は、両端のＧＧＧＧＧＧ−３’の６ヌクレオチド長の３’一重鎖伸張で隣接された線状ベクターｐＵＣ−ＴＴである。 図２３は、人工切込み剤の活性をアッセイするために使用される、３４ｂｐのオリゴヌクレオチド二本鎖の配列（配列番号８）を示す。二本鎖の上部鎖は５’および３’の両末端に蛍光標識されており（＊）、１６番目の位置に一つのデオキシウリジン（Ｕ）を含有している。複素二重鎖の下部鎖は、ｄＵに相当する位置の向かいにデオキシアデニンを含有している。 図２４は、ＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼの至適量を、ＵＳＥＲＴＭ酵素と呼ばれる人工切込み剤を製造するためにＵＤＧグリコシラーゼとの混合物中でどのようにして決定できるのかを示している。アッセイには、図２３に示された配列を有する基質を利用する。２５０ｎｇから３．９ｎｇまでの範囲で変化するＥｎｄｏＶＩＩＩの２倍連続希釈量が、ＵＤＧグリコシラーゼの０．２単位と前もって混合され、そして基質１０ｐモルの完全切込みまでアッセイされた。レーン１は対照で、酵素処理なしの基質を示している。ＵＤＧ単独（レーン２に示す）も、ＥｎｄｏＶＩＩＩ単独（レーン３に示す）のいずれも、デオキシウリジンを含有する基質に切込みを入れることができないが、しかしＵＧＤの０．２単位およびＥｎｄｏＶＩＩＩの少なくとも３１．２５ｎｇを含有する混合物は、基質の１０ｐモルの完全切込みを生成した（レーン４−７）。ＥｎｄｏＶＩＩＩの３１．２５ｎｇより少なく含有している混合物は、部分的に消化されたのみである（レーン８−１０）。 図２５は、ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼの至適量を、ＵＳＥＲＴＭ酵素２と呼ばれる人工切込み剤を製造するためにＵＤＧグリコシラーゼとの混合物中でどのようにして決定できるのかを示している。アッセイは、図２３に示された配列を有する基質を利用する。４３００ｎｇから１９ｎｇまでの範囲で変化するＦＰＧの２倍連続希釈量が、ＵＤＧグリコシラーゼの０．１単位と前もって混合され、そして基質１０ｐモルの完全切込みまでアッセイされた。レーン１は対照で、酵素処理なしの基質を示している。ＵＤＧ単独（レーン２に示す）も、ＦＰＧ単独（レーン３に示す）のいずれも、デオキシウリジン（Ｕ）を含有する基質に切込みを入れることができないが、ＵＧＤの０．１単位およびＦＰＧの少なくとも２９０ｎｇを含有する混合物は、基質の１０ｐモルの完全切込みを生成した（レーン４−８）。ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼの２９０ｎｇより少なく含有している混合物は、部分的に消化されたのみである（レーン９−１２）。 図２６Ａは、図１９に示したように調製された線状ベクターｐＮＥＢ２０５Ａの３’伸張と相補性の３’一重鎖伸張を生成するために増幅した標的分子において使用するのに適当なプライマーのための設計戦略を示す。５’末端の左プライマーは、図１９のｐＮＥＢ２０５Ａの右伸張に同一である配列ＧＧＡＧＡＣＡＵ（配列番号９）を包含している。ただし、５’末端からの標的分子特異的配列に続くプライマー配列中のデオキシウリジン（Ｕ）により置換されている３’末端チミンを除く。５’末端の右プライマーは、図１９のｐＮＥＢ２０５Ａの左伸張に同一である配列ＧＧＧＡＡＡＧＵ（配列番号１０）を包含している。ただし、反対の鎖からの３’末端標的分子特異的配列に続くプライマー配列中のデオキシウリジン（Ｕ）により置換されている３’末端チミンを除く。 図２６Ｂは、標的分子クローニング方法の概観を示す： （ａ）標的ＤＮＡを増幅するための左プライマー（配列番号１１）および右プライマーは、図２６Ａに従って設計された； （ｂ）増幅されたＤＮＡは、ベクター適合性配列によって両端に伸張されている標的分子配列を包含している。単独のＵは、各接合部および互いに関して反対側の鎖上に生じる； （ｃ）ＵＳＥＲＴＭ酵素でデオキシウリジン（Ｕ）のところで切込みされ、切込みされた５’末端鎖の解離の後に生成した、３’一重鎖伸張を有する増幅された標的分子； （ｄ）線状ベクターｐＮＥ２０５Ａは、図１９に対して逆配向状態で示されており、ステップ（ｃ）の標的分子上の一重鎖伸張に対して相補的な３’一重鎖伸張を有する； （ｅ）ステップ（ｃ）および（ｄ）の標的分子および線状ベクターｐＮＥＢ２０５Ａの結合による組換え分子。 図２７Ａは、ｐＮＥＢ２０５Ａプラスミドの制限酵素地図を示す。ｐＮＥＢ２０５Ａは、マルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）を除いてｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇ ２００２−２００３，ｐ．３１８）またはｐＵＣ１９［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ３３：１０３−１１９（１９８５）］のいずれかと同じである。新しいＭＣＳは、ｌａｃＺα遺伝子のフレーム内にあり、α相補性を用いた挿入のスクリーニングが可能である。 図２７Ｂは、ｐＮＥＢ２０５Ａのマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）のヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。ヌクレオチド配列は、ｐＮＥＢ２０５Ａ内のＭＣＳの位置を示すために番号が付けられている。ＬａｃＺα断片のＮ末端アミノ酸配列は、それぞれのコドンの下に示されている。制限酵素部位には下線を引いてある。ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼおよび、ＢｂｖＣＩＢ切込みエンドヌクレアーゼの切断部位は、黒三角形として示されている。陰をつけた領域は、ＸｂａＩおよびＮ．ＢｂｖＣＩＢで消化後ｐＮＥＢ２０５Ａから除かれるヌクレオチド配列を示す。 図２７Ｃは、図２７Ｂに示したＭＣＳ内のＮ．ＢｂｖＣＩＢおよびＸｂａＩで消化によって創生された線状ｐＮＥＢ２０５Ａベクター上の３’一重鎖伸張の配列（配列番号１３および配列番号１４）を示す。 図２８は、（総ＰＣＲ容積５０μｌの内）増幅試料１０μｌ中のＰＣＲ増幅クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）ＤＮＡ（０．９５ｋｂ）を示す。レーン１および１２は、２−Ｌｏｇ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含有している。２から１０までのレーンは、それぞれ、ＤＮＡの５、１０、１７、４５、８２、１６４、２１５、３４６および３９０ｎｇを含有する８、９、１０、１１、１３、１６、２０、２５および３０サイクル後のＰＣＲ試料を示す。レーン１１は、線状ベクターｐＮＥＢ２０５Ａの１μｌ（２０ｎｇ）を示す。 図２９は、形質転換反応２５μｌによって産生されたコロニーの数を示す。白いコロニーは、組換え分子を担持する形質転換体を表す。青いコロニーは、非修飾ベクターを担持する形質転換体を表す。５ｎｇ（０．０００８ｐモル）から３９０ｎｇ（０．６２ｐモル）の範囲で変動する種々の量のＰＣＲ試料を、実施例ＩＩＩに記載された反応プロトコールに従って、２０ｎgの線状ｐＮＥＢ２０５Ａに組込まれた。形質転換の結果は、３回の独立した実験の平均で表している。（±）は、式：ｓ２＝Ｓ（Ｘ−Ｍ）２／（Ｎ−１）（式中、Ｘは測定値、Ｍは平均、Ｎは測定の数である）を用いて計算された、標準偏差値（ｓ）を示す。クローニング効率は、形質転換体の総数中の白いコロニーの割合を計算することによって決定された。 図３０は、ＰＣＲ産物の濃度が５０ｎｇ（０．０８ｐモル）またはそれ以上ならば、組換え体の割合は、９４％−９５％であることを示す、図２９に表された結果のグラフを示す。 図３１は、相補性３’一重鎖伸張に隣接した標的分子の中間ＰＣＲ断片を生成するためのプライマー対Ｐ２／Ｐ３およびＰ１／Ｐ４の設計戦略を示す。重複プライマーＰ１およびＰ２は、５’アデニンで開始する；（Ｎ）1-20は、重複プライマーによって共有されている重複領域を指示している、そこでは各プライマーは他の逆相補性配列を含有している。３’末端の重複配列は、反対側のプライマーの５’アデニンの向かいにあるデオキシウリジンに隣接している。デオキシウリジン（Ｕ）の下流に、これらプライマーは標的分子上にそれぞれの配列を開始する。 図３２は、コドン置換（３ヌクレオチド置換）がＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ（配列番号１６）をコードする遺伝子を導入する部位特異的突然変異を示す： （ａ）二つの重複断片としてｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の増幅のためのプライマー対Ｐ２／Ｐ３およびＰ１／Ｐ４の設計。重複領域を作製するために、アデニンで始まりチミンで終わる９ヌクレオチド配列（箱で囲んだ領域）が、突然変異の標的とされるヌクレオチド（＊でマークした）の近傍のｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の配列上に選択される。この配列は、デオキシウリジン（Ｕ）が重複配列の最後の位置に導入されていることを除いて、重複プライマーＰ１およびＰ２の５’末端に包含される。Ｕの下流のプライマーＰ１において、コドンＣＡＡは、開始用ｈｉｎｃＩＩＲ特異的配列に続いて、コドンＴＴＴによって置換されている。Ｕの下流のプライマーＰ２配列は、ｈｉｎｃＩＩＲ特異的配列に相補性である。ＮｄｅＩ部位は、プライマーＰ３の５’末端で、遺伝子工学で作り変えられており、ＳａｐＩ部位は、プライマーＰ４の５’末端で、遺伝子工学で作り変えられている； （ｂ）二つのＰＣＲ増幅断片が示されている。両断片は、９ｂｐ配列によって重複しており、反対側の鎖に単一のウラシルを含有している。左側の断片は、野生型コドンＣＡＡの代わりにコドンＴＴＴを含有している。 （ｃ）ＵＳＥＲＴＭ酵素でウラシルのところで切込みを入れられた後切込みられた互いに相補性である一重鎖伸張によって隣接されている断片； （ｄ）断片は会合され、その相補的伸張を通してＴ４ＤＮＡリガーゼで連結され、ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の修飾ヌクレオチド配列（配列番号１８）を形成する。 （ｅ）試行的ライゲーションの結果を示すアガロースゲル電気泳動。レーン１および５は、２ＬｏｇＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒを示す。レーン２は、４２０ｂｐ・ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子断片を含有するＰＣＲ試料１μｌを示す。レーン３は、３８０ｂｐ・ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子断片を含有するＰＣＲ試料１μｌを示す。レーン４は、コドンＣＡＡをコドンＴＴＴに置換した７８０ｂｐ・ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子を含有する試行ライゲーション１０μｌを示す。 図３３は、二つの独特な制限部位の挿入、およびｐＵＣ１９プラスミドから１８ｂｐ配列の欠失を示す： （ａ）プライマー対Ｐ１／Ｐ４およびＰ２／Ｐ３は、図１０Ａおよび１１に従って、以下のようにして設計される。重複するプライマーＰ１およびＰ２は、その５’末端に、ＢｓｒＧＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位の作製に必要とされる付加的６ヌクレオチド挿入配列を含有する。両プライマーにおける挿入配列は、互いに相補性であり、６番目の位置にデオキシウリジン（Ｕ）を含有している。Ｕの下流で、プライマーＰ１およびＰ２は、標的とする１８ｂｐ欠失領域を越えて正確に開始する、それぞれのｐＵＣ１９配列を開始する（配列番号１９）。プライマーＰ３は、ＢｓａＩ部位を越えてｐＵＣ１９配列を開始し、プライマーＰ４は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を越えてｐＵＣ１９配列を開始する； （ｂ）６ｂｐ重複配列を有する二つのＰＣＲ増幅断片で、各断片は、互いに関して反対側の鎖上に位置する単一のウラシルを有している； （ｃ）ＵＳＥＲＴＭ酵素でウラシルのところで切込みを入れた後に形成する互いに相補的である一重鎖伸張によって隣接されたＰＣＲ断片； （ｄ）会合および相補性一重鎖伸張をＴ４ＤＮＡリガーゼで断片を連結した産物（配列番号２０）。産物は、制限エンドヌクレアーゼＢｓｒＧ１およびＡｖｒＩＩの認識部位を保有する； （ｅ）ライゲーションの結果を示すアガロースゲル電気泳動。レーン１は、２−Ｌｏｇ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒを示す。レーン２は、６１０ｂｐおよび８１０ｂｐＰＣＲ断片を示す。各ＰＣＲ試料１μｌを組合せ、ゲル上に負荷した。レーン３は、１４２０ｂｐ連結ｐＵＣ１９断片を含有するライゲーション反応の１０μｌを示す。レーン４は、連結された１４２０ｂｐ断片が、ＢｓｒＧＩ制限エンドヌクレアーゼで切断されたものを示す。レーン５は、連結された１４２０ｂｐ断片が、ＡｖｒＩＩ制限エンドヌクレアーゼで切断されたものを示す。 図３４は、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶＩＩＩおよびＭｘｅインテインをコードする遺伝子の融合を示す： （ａ）プライマー対Ｐ１／Ｐ４およびＰ２／Ｐ３は、図１２に従って以下のように設計される。重複プライマーＰ１およびＰ２は、それぞれの遺伝子特異的配列を開始し、それらの５’末端に、デオキシウリジン（Ｕ）によって隣接された７ｂｐ重複配列を有している。７ｂｐ重複を作製するために、プライマーＰ２はその５’末端で、Ｍｘｅインテイン遺伝子の五つの５’末端ヌクレオチドによって伸張され、プライマーＰ１はその５’末端で、ＥｎｄｏＶＩＩＩ遺伝子の二つの３’末端ヌクレオチドによって伸張されている。ＮｄｅＩ部位は、プライマーＰ３の５’末端が遺伝子工学で作り変えられており、プライマーＰ４は、Ｍｘｅインテイン遺伝子のＡａｔＩＩ部位を横切って開始する； （ｂ）（ａ）に記載したように７ヌクレオチドの共通重複領域を有する二つのＰＣＲ増幅断片。両増幅産物は、各々に関して反対の鎖に位置する単一のウラシルを含有している； （ｃ）ＵＳＥＲＴＭ酵素でウラシルのところで切込みを入れた後に産生した互いに相補的である一重鎖伸張によって隣接された断片； （ｄ）会合および相補性一重鎖伸張をＴ４ＤＮＡリガーゼで断片を連結した産物。産物は二つの遺伝子の正確な融合である。 （ｅ）ライゲーションの結果を示すアガロースゲル電気泳動。Ｍｘｅインテイン遺伝子の２６５ｂｐ断片および８００ｂｐＥｎｄｏＶＩＩＩ遺伝子を含有するＰＣＲ試料１μｌを結合し、ゲル上に負荷する（レーン１）。レーン２は、ＥｎｄｏＶＩＩＩ遺伝子の３’末端に融合したＭｘｅインテイン遺伝子断片を表す１０６５ｂｐライゲーション産物を示すライゲーション反応２μｌを示す。レーン３は２−Ｌｏｇ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒを示す。 図３５Ａ及び３５Ｂは、同時に起こる部位特異的突然変異および遺伝子融合を示す： （ａ）部位特異的突然変異および遺伝子融合の最終産物を示す。ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子配列が変えられてｈｉｎｃＩＩＱ１３８Ａ変異体を生成し、そしてｐＴＸＢ１（配列を開始２１）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）ベクターのプロモーター領域とＭｘｅインテイン遺伝子の５’末端の間に挿入される。ｈｉｎｃＩＩＲおよびＭｘｅインテイン遺伝子の開始位置は矢印で示す。星印はコドンＣＡＡからＧＣＴへの置換を導入するプライマー配列における変化したヌクレオチドの位置を示している。重複プライマー対Ｐ２／Ｐ３、Ｐ４／Ｐ５およびＰ６／Ｐ７を設計するために使用された重複領域のヌクレオチド配列は、箱の領域内に示されている。 （ｂ）プライマー対Ｐ１／Ｐ２、Ｐ３／Ｐ４、Ｐ５／Ｐ６およびＰ７／Ｐ８は、図１３に従ってＤＮＡ増幅ために設計された。重複プライマー対Ｐ２／Ｐ３（配列番号２２）、Ｐ４／Ｐ５およびＰ６／Ｐ７は、それらの５’末端に、（ａ）におけるそれぞれの箱で囲んだ領域内に示した重複配列を有し、そして重複領域の３’末端の位置にデオキシウリジン（Ｕ）を含有している。プライマーＰ１は、ｐＴＸＢ１ベクターのプロモーター領域においてＸｂａＩ部位を横断して開始し、そしてプライマーＰ８は、Ｍｘｅインテイン遺伝子のＢｓｒＧＩ部位を横切って開始する； 図３５Ｂは図３５Ａの続きであり、 （ｃ）四つのＰＣＲ増幅断片で、各々は、並んだ断片の隣と共通の重複領域を有している。ｐＴＸＢ１プロモーター領域をコードする断片は、ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の５’末端の部分と１１ｂｐ配列によって重複している；ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の５’末端部分は、ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の３’末端部分と９ｂｐ配列によって重複している；およびｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の３’末端部分は、Ｍｘｅインテイン遺伝子の５’末端部分と９ｂｐ配列に関して重複している。接合部のｈｉｎｃＩＩＲ断片は、望ましいヌクレオチド変化を有している（星印によって示した）。外側の増幅産物は、反対側の鎖上に位置した単一のウラシル残基を含有しているが、二つの中央の断片は、反対側の鎖上に位置した断片当たり二つのウラシルを含有している。 （ｄ）ＵＳＥＲＴＭ酵素でウラシルのところで切込みを入れられた後に、互いに相補性である一重鎖伸張によって隣接した断片； （ｅ）会合および相補性一重鎖伸張をＴ４ＤＮＡリガーゼで断片を連結した産物。産物は、（ａ）と同じであり、四つの断片の正確な融合である。 （ｆ）試行的ライゲーションの結果を示すアガロースゲル電気泳動。レーン１は、ｐＴＸＢ１ベクターのプロモーター領域の１４０ｂｐ断片を含有するＰＣＲ試料１μｇを示す。レーン２は、ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の４２０ｂｐ断片を含有するＰＣＲ試料１μｇを示す。レーン３は、ｈｉｎｃＩＩＲ遺伝子の３８０ｂｐ断片を含有するＰＣＲ試料１μｇを示す。レーン４は、５’末端Ｍｘｅインテイン遺伝子の３６０ｂｐ断片を含有するＰＣＲ試料１μｇを示す。レーン５は、線状に組み立てられた最終構築を表す１２７０ｂｐライゲーション産物との１０μｌの試行ライゲーション反応を示す。レーン６は、２−Ｌｏｇ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒを示す。 図３６Ａ及び３６Ｂは、部位特異的突然変異と共存する総ヒトゲノムＤＮＡからのヒトＡＰ１（ｈＡＰ１）エンドヌクレアーゼ遺伝子の組立てを示す： （ａ）エキソン２−５を有するｈＡＰ１エンドヌクレアーゼ遺伝子のｃＤＮＡ。個々のエキソンの接合部は、垂直の点線で示される。エキソン５は、ＡからＧ（星印で指示してある）のサイレント突然変異を標的とするＮｄｅＩ部位を含有する。重複プライマー対Ｐ２／Ｐ３、Ｐ４／Ｐ５、Ｐ６／Ｐ７およびＰ８／Ｐ９を設計するために使用された、重複領域のヌクレオチド配列は、箱の領域内に示されている。 （ｂ）総ゲノムＤＮＡからｈＡＰ１遺伝子の個々のエキソンの増幅のためのプライマー対Ｐ１／Ｐ２、Ｐ３／Ｐ４、Ｐ５／Ｐ６、Ｐ７／Ｐ８、およびＰ９／Ｐ１０は、以下のように設計された。重複プライマーＰ２／Ｐ３、Ｐ４／Ｐ５、Ｐ６／Ｐ７およびＰ８／Ｐ９は、（ａ）で箱の領域内に示したそれらの５’末端に重複領域を有しており、さらに重複配列の３’末端の位置にデオキシウリジン（Ｕ）を含有している。ＮｄｅＩ部位は、プライマーＰ１の５’末端が遺伝子工学で作り変えられており、ＳａｐＩ部位は、プライマーＰ１０の５’末端が遺伝子工学で作り変えられている； 図３６Ｂは図３６Ａの続きであり、 （ｃ）それぞれ隣接する断片と共通する重複領域を有する５つのＰＣＲ増幅断片。エキソン２の３’末端は、エキソン３の５’末端と重複している（配列番号２３）；エキソン３の３’末端は、エキソン４の５’末端と重複している；エキソン４の３’末端は、エキソン５の第一の部分の５’末端と重複し、その３’末端はエキソン５の第二の部分の５’末端と重複している。接合部でエキソン５の重複断片は、望ましいヌクレオチド置換（星印で示す）されている。外側の増幅産物は、反対の鎖上に位置した単一のウラシル残基を含有し、三つの中央の断片は、反対側の鎖上に断片当たり２つのウラシルを含有している。 （ｄ）ＵＳＥＲＴＭ酵素でウラシルのところで切込みを入れられた後、特定の順序で、互いに相補性である一重鎖伸張によって隣接された断片； （ｅ）会合および相補的一重鎖伸張を通してＴ４ＤＮＡリガーゼを用いた断片のライゲーションの産物。産物は、突然変異したエキソン５配列を有するｈＡＰ１遺伝子を構成する５断片の正確で順序通りの融合である； （ｆ）試行ライゲーションの結果を示すアガロースゲル電気泳動。レーン１及び８は２−Ｌｏｇ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒを示す。レーン２は、エキソン２の８０ｂｐ断片を含有するＰＣＲ試料１μｌを示す。レーン３は、エキソン３の１８０ｂｐ断片を含有するＰＣＲ試料１μｌを示す。レーン４は、エキソン４の２００ｂｐ断片を含有するＰＣＲ試料１μｌを示す。レーン５は、エキソン５の５’末端部分の８０ｂｐ断片を含有するＰＣＲ試料１μｌを示す。レーン６は、エキソン５の３’末端部分の４６０ｂｐ断片を含有するＰＣＲ試料１μｌを示す。レーン７は、ｈＡＰ１遺伝子を表す１０００ｂｐライゲーション産物との試行ライゲーション反応１０μｌを示す。 図３７は、９ｏＮｍＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２５）の突然変異断片の線状ｐＮＥＢ２０５Ａベクターへの方向性を有する組立てを示す： （ａ）プライマー対Ｐ１／Ｐ４およびＰ２／Ｐ３は、図１６に従って以下のように設計された。重複プライマーＰ１およびＰ２を設計するのに使用された重複領域のヌクレオチド配列は、箱の領域内に示されている。「＊」は、９ｏＮｍＤＮＡポリメラーゼ遺伝子において、コドンＧＴＣをＣＡＡ置換を導入するために、プライマーＰ１（配列番号２４）およびＰ２配列において変えられたヌクレオチドの位置を示している。プライマーＰ３およびＰ４はその５’末端上において、ｐＮＥＢ２０５Ａベクターの３’一重鎖伸張と一致した付加配列で補充された； （ｂ）１０ヌクレオチドの共通の領域を有する二つのＰＣＲ増幅断片（配列番号２６および２４）。重複領域内では、断片は望ましいヌクレオチド置換を有する（星印で示す）。外側の端で各断片は、ステップ（ｄ）に示したｐＮＥＢ２０５Ａ上の相当する伸張に相補的な８ヌクレオチドによって伸張されている。両増幅産物は、断片の各端および互いに関して反対側の鎖上に位置する二つのウラシル残基を含有している； （ｃ）ＵＳＥＲＴＭ酵素でウラシルのところで切込みを入れられた後で、一重鎖伸張によって隣接された断片； （ｄ）ステップ（ｃ）における断片の外側の伸張に相補性である３’一重鎖伸張によって隣接された線状ベクターｐＮＥＢ２０５Ａ； （ｅ）断片を、それらの相補的伸張を通してｐＮＥＢ２０５Ａベクターに会合することによって生成した組換え分子。 図３８は、シュードモナス・アルカリジーン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ） ＮＥＢ＃５４５（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）からｐＵＣ−ＴＴベクターへの、未知のスーパーインテグロンの３’セグメントのクローニングを示す； （ａ）プライマーＰａｌ３−１は、未知のスーパーインテグロン配列を含有する一重鎖ポリヌクレオチド分子の異なった長さのものを産生するためにＣｏｎｔｉｇＣ中のスーパーインテグロン配列を開始する； （ｂ）ポリＣ末端が、ターミナルトランスフェラーゼおよびｄＣＴＰを用いて増幅した一重鎖分子の３’末端に加えられる。次いで、ポリＣ末端を有する一重鎖断片が、プライマーＰａｌ３−３（配列番号２７）およびＧＧ−２で増幅される。プライマーＰａｌ３−３は、３’末端からおよそ６０ヌクレオチドの特異的スーパーインテグロン配列を開始し、６番目の位置に８−オキソグアニンを有する５’末端にヘキサグアニン配列を含有している。プライマーＧＧ２は、ポリｄＧであり、それはポリＣ末端に相補性であり、５’末端から６番目の位置に８−オキソグアニンを含有している。「Ｎ］：Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ；「Ｈ］はＡ、ＴまたはＣを指示する； （ｃ）両端においてヘキサグアニン配列によって隣接され、互いに関して反対の鎖上に位置している分子に二つの８−オキソグアニンを含有している二本鎖増幅産物； （ｄ）増幅産物の両端に６シトシンの３’一重鎖伸張を生成するために、８−オキソグアニンのところでＦＰＧグリコシレート／ＡＰリアーゼで切込みを入れた後の増幅産物； （ｅ）未知の配列のスーパーインテグロンを表す増幅産物が、６グアニンの３’一重鎖伸張を有する線状ｐＵＣ−ＴＴベクターに挿入され、組換え分子が生成される。

Claims (80)

  1. （ａ）カセットをポリヌクレオチド分子の所定の部位に挿入し；（ｂ）カセット内の切込みサイト（nicking site）に特異的な切込みエンドヌクレアーゼおよびカセット内の制限サイトに特異的な制限エンドヌクレアーゼによってポリヌクレオチド分子を切断し；および（ｃ）切込みサイトと制限サイト間で切断されたポリヌクレオチド分子を解離させ望ましい長さと配列構造を有する一重鎖伸長を生成させる；ことを含んで成るポリヌクレオチド分子上に望ましい長さと配列構造を有する一重鎖伸長を生成する方法。
  2. ３’または５’の左側または右側に一重鎖伸長を生成させるために、カセットが１つの切込みサイトおよび１つの制限サイトを含む、請求項１に記載の方法。
  3. カセットが、左側および右側に３’または５’ 一重鎖伸長を生成するために、切込みサイトによってどちら側の側面にも接する１つの制限サイトを含む、請求項１に記載の方法。
  4. カセットが、２つの一重鎖伸長を生成するために、２つの切込みサイトの間に位置した２つの制限サイトを含む、請求項１に記載の方法。
  5. スペーサー配列が２つの制限サイトの間に位置する、請求項４に記載の方法。
  6. スペーサー配列がマーカーをコードする、請求項５に記載の方法。
  7. マーカーが、毒素、薬剤耐性因子、酵素、抗原、蛍光物質、およびｓｉＲＮＡから選択される、請求項６に記載の方法。
  8. カセットの構造が一重鎖伸長の構造を決定する、請求項１に記載の方法。
  9. カセットが、約５ヌクレオチドを超える長さを有する、請求項１に記載の方法。
  10. 切込みサイトが、カセット内制限サイトの上流に位置し、ポリヌクレオチド分子内の２本鎖の内の第１鎖に切込みエンドヌクレアーゼで切込みを入れるのに適切な配向性を有する、請求項２に記載の方法。
  11. 切込みサイトが、カセット内の制限サイトの上流に位置し、ポリヌクレオチド分子内の２本鎖の内の第２鎖に切込みエンドヌクレアーゼで切込みをいれるのに適切な配向性を有して位置する、請求項２に記載の方法。
  12. 切込みサイトが、カセット内の制限サイトの下流に位置し、ポリヌクレオチド分子内の２本鎖の内の第１鎖に切込みエンドヌクレアーゼで切込みをいれるのに適切な配向性を有して位置する、請求項２に記載の方法。
  13. 切込みサイトが、カセット内の制限サイトの下流に位置し、ポリヌクレオチド分子内の２本鎖の内の第２鎖に切込みエンドヌクレアーゼで切込みをいれるのに適切な配向性を有して位置する、請求項２に記載の方法。
  14. ２つの切込みサイトは互いに逆向に配向している、請求項３または４に記載の方法。
  15. （ｃ）の一重鎖伸長が、約２０ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項１に記載の方法。
  16. カセット内の１個以上の切込みサイトと１個以上の制限サイトの間の所定の配列が、望ましい一重鎖伸長の構造に従って選択される、請求項８に記載の方法。
  17. ２本鎖ポリヌクレオチド分子が２本鎖ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
  18. ２本鎖ポリヌクレオチド分子が宿主細胞内で複製できるレシピエント分子である、請求項１７に記載の方法。
  19. レシピエント分子がベクターである、請求項１８に記載の方法。
  20. ベクターが、ｐＮＥＢ２０５Ａ、ｐＮＥＢ２００Ａ、ｐＮＥＢ２１０，及びｐＵＣ−ＴＴから選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 制限サイトから約５０ヌクレオチド未満に位置した切込みサイトを有し、ポリヌクレオチド分子内に挿入できる２本鎖ＤＮＡを含んで成るカセットであり、カセット内の制限サイトがポリヌクレオチド分子内には存在しないカセット。
  22. 左側または右側に、３’または５’の一重鎖伸長を生成するために、２本鎖ＤＮＡが１つの切込みサイトと１つの制限サイトを有する、請求項２１に記載のカセット。
  23. 左側および右側に、３’または５’の一重鎖伸長を生成するために、２本鎖ＤＮＡが２つの切込みサイトと１つの制限サイトを有する、請求項２１に記載のカセット。
  24. ２本鎖ＤＮＡが、２つの３'または５’の一重鎖伸長を生成するために、２つの切込みサイトの間に位置した２つの制限サイトを有する、請求項２１に記載のカセット。
  25. ２本鎖ＤＮＡが、２つの制限サイトの間にスペーサー配列を有する、請求項２４に記載のカセット。
  26. スペーサー配列がマーカーをコードする、請求項２５に記載のカセット。
  27. マーカーが、毒素、薬剤耐性因子、酵素、抗原、蛍光物質、およびｓｉＲＮＡから選択される、請求項２６に記載のカセット。
  28. ２本鎖ＤＮＡが、約５ヌクレオチド以上の長さを有する、請求項２１に記載のカセット。
  29. ２本鎖ＤＮＡが、制限サイトの上流の位置に切込みエンドヌクレアーゼで２本鎖ＤＮＡの第１鎖に切込みが入る配向性の切込みサイトを有する、請求項２２に記載のカセット。
  30. ２本鎖ＤＮＡが、制限サイトの上流の位置に切込みエンドヌクレアーゼで２本鎖ＤＮＡの第２鎖に切込みが入る配向性の切込みサイトを有する、請求項２２に記載のカセット。
  31. ２本鎖ＤＮＡが、制限サイトの下流の位置に切込みエンドヌクレアーゼで２本鎖ＤＮＡの第１鎖に切込みが入る配向性の切込みサイトを有する、請求項２２に記載のカセット。
  32. ２本鎖ＤＮＡが、制限サイトの下流の位置に切込みエンドヌクレアーゼで２本鎖ＤＮＡの第２鎖に切込みが入る配向性の切込みサイトを有する、請求項２２に記載のカセット。
  33. ２つの切込みサイトが２本鎖ＤＮＡ内で互いに逆向に配向している、請求項２３または２４に記載のカセット。
  34. ２本鎖ＤＮＡ内の１個以上の切込みサイトと１個以上の制限サイト間の配列が事前に定められたものである、請求項２８に記載のカセット。
  35. 請求項２１、２２、２３、２４及び２５に記載のカッセトのいずれかを含んで成り、宿主細胞内で複製可能なポリヌクレオチド分子。
  36. ｐＮＥ２０５Ａ、ｐＮＥＢ２００Ａ、ｐＮＥＢ２１０Ａ及びｐＵＣ−ＴＴから選択されたベクターを含んで成る、ポリヌクレオチド分子。
  37. ２種以上の酵素で少なくともそれら酵素の１つがＤＮＡグリコシラーゼおよび少なくともそれら酵素の１つが一重鎖切断酵素の混合物から成り、ポリヌクレオチド分子から修飾ヌクレオチドを切除する能力のある切込み剤。
  38. 少なくとも１つの一重鎖切断酵素が、修飾ヌクレオチドが切除された後のポリヌクレオチド分子に５’リン酸を生じさせる、請求項３７に記載の切込み剤。
  39. 一重鎖切断酵素がＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼおよびＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼから選択される、請求項３７に記載の切込み剤。
  40. 少なくとも１つの一重鎖切断酵素が、修飾ヌクレオチドを切除した後のポリヌクレオチド分子に３’ＯＨを生じさせる、請求項３７に記載の切込み剤。
  41. 一重鎖切断酵素が、ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼである、請求項４０に記載の切込み剤。
  42. 複数の一重鎖切断酵素が、修飾ヌクレオチドを切除した後のポリヌクレオチド分子に５’リン酸と３’ＯＨを生じさせる、請求項３７に記載の切込み剤。
  43. 複数の一重鎖切断酵素が、（ｉ）ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼとＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ、および（ｉｉ）ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼとＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼから選択される、請求項４２に記載の切込み剤。
  44. 修飾ヌクレオチドがデオキシウリジン（Ｕ）である、請求項３７に記載の切込み剤。
  45. 修飾ヌクレオチドが８−オキソ−グアニンである、請求項３７に記載の切込み剤。
  46. 修飾ヌクレオチドがデオキシイノシンである、請求項３７に記載の切込み剤。
  47. ２つ以上の酵素が、ＵＤＧグリコシラーゼおよびＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼである、請求項４０または４４に記載の切込み剤。
  48. ２つ以上の酵素が、ＵＤＧグリコシラーゼおよびＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼである、請求項３８、４４または４５に記載の切込み剤。
  49. ２つ以上の酵素が、ＡｌｋＡグリコシラーゼおよびＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼである、請求項４０または４６に記載の切込み剤。
  50. ２つ以上の酵素が、ＵＤＧグリコシラーゼおよびＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼである、請求項３８または４４に記載の切込み剤。
  51. ２つ以上の酵素が、ＵＤＧグリコシラーゼ、ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼおよびＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼである、請求項４２または４４に記載の切込み剤。
  52. ２つ以上の酵素が、ＵＤＧグリコシラーゼ、ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼおよびＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼである、請求項４２、４４または４５に記載の切込み剤。
  53. ２つ以上の酵素が、ＡｌｋＡグリコシラーゼおよびＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼである、請求項３８または４６に記載の切込み剤。
  54. ２つ以上の酵素が、ＡｌｋＡグリコシラーゼおよびＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼである、請求項３８または４６に記載の切込み剤。
  55. 混合物中のＤＮＡグリコシラーゼと一重鎖切断酵素の活性比率が少なくとも約２：１である、請求項３７に記載の切込み剤。
  56. （ａ）ポリヌクレオチド分子の特定の部位に修飾ヌクレオチドを挿入し；（ｂ）切込みと側面を接する末端配列を作るために、切込み剤によって修飾ヌクレオチドの位置でポリヌクレオチド分子を切断し；および（ｃ）望ましい長さと配列構造を有する一重鎖伸長を生成するために末端配列を解離する；ことを含んで成るポリヌクレオチド分子上に望ましい長さと配列構造を有する一重鎖伸長を生成する方法。
  57. ポリヌクレオチド分子が、標的分子のプライマー対依存性ＤＮＡ増幅された生成物である、請求項５６に記載の方法。
  58. プライマー対の各プライマーが修飾ヌクレオチドを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. プライマー対の１つのプライマーが修飾ヌクレオチドを含む、請求項５７に記載の方法。
  60. ポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長が、第２のポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長と相補的である、請求項５６に記載の方法。
  61. （ａ）標的分子を増幅するための２組のプライマー対を選択し、そのうちの第１のプライマー対が第１の増幅生成物を作り、第２のプライマー対が第２の増幅生成物を作る。第１および第２各々のプライマー対に含まれる１つのプライマーには修飾ヌクレオチドが含まれ、それらプライマーの配列は５’末端が互いに相補的である。これらプライマーの一つまたは両方は５’配列に任意の突然変異を含み、標的分子に対して相補的または非相補的となる；（ｂ）（ａ）の第１および第２プライマー対を用いて標的分子を増幅し、第１および第２ポリヌクレオチド分子を形成させる；（ｃ）切込み剤によって第１および第２ポリヌクレオチド分子を修飾ヌクレオチドの位置で切断する；（ｄ）第１および第２ポリヌクレオチド分子上の切込みと５’末端の間を解離させ、第２のポリヌクレオチド分子の一重鎖伸長と相補的な一重鎖伸長を、第１ポリヌクレオチド分子上に産生させる；および（ｅ）第１および第２ポリヌクレオチド分子上の互いに相補的な一重鎖伸長を介して再会合させ、部位特異的突然変異を有する標的分子を形成させる；ことを含んで成る標的分子内に部位特異的突然変異を作製する方法。
  62. 修飾ヌクレオチドに隣接する５’末端の配列が標的分子と相補的でない、請求項６１に記載の方法。
  63. 修飾ヌクレオチドが、開始配列と５’末端領域の間に位置し、開始配列が標的分子と相補的であり、修飾ヌクレオチドに隣接した当該プライマーの５’末端領域が互いに相補的である、請求項６１に記載の方法。
  64. 少なくとも１つのプライマー上の修飾ヌクレオチドが、開始配列と５’末端領域の接合部に位置する、請求項６３に記載の方法。
  65. 少なくとも一つのプライマー上の修飾ヌクレオチドが、５’配列と開始配列に隣接した挿入配列の間に位置する、請求項６３に記載の方法。
  66. それぞれのプライマー上の開始配列が、介在配列で分割された標的分子上の配列を補完する、請求項６３に記載の方法。
  67. 部位特異的変異が１個以上のヌクレオチドの改変である、請求項６３に記載の方法。
  68. 部位特異的変異が挿入ヌクレオチド配列である、請求項６３に記載の方法。
  69. ５’配列がＧＧＡＧＡＣＡＵ、ＧＧＧＡＡＡＧＵ，ＡＣＧＡＧＡＣＵ、ＡＣＣＡＧＡＣＵおよびＧＧＧＧＧ（８−ｏｘｏ−Ｇ）から選択され、標的分子の５’末端に等しい配列に隣接することを含んで成る、標的分子の開始に適切なオリゴヌクレオチド。
  70. （ａ）複数のポリヌクレオチド分子それぞれの一端または両端に、請求項１の方法を用いて一重鎖伸長を生成させ、１つのポリヌクレオチド分子上の少なくとも１個の一重鎖伸長が別のポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長と相補的であるようにする；および（ｂ）複数のポリヌクレオチド分子が連結して１つの分子を形成する；ことを含んで成る、複数の直鎖状ポリヌクレオチド分子を連結して１つの分子を形成させる方法。
  71. （ａ）複数のポリヌクレオチド分子それぞれの一端または両端に、請求項５３の方法を用いて一重鎖伸長を生成させ、１つのポリヌクレオチド分子上の少なくとも１個の一重鎖伸長が別のポリヌクレオチド分子上の一重鎖伸長と相補的であるようにする；および（ｂ）複数のポリヌクレオチド分子を連結させて１つの分子を形成する：ことを含んで成る、複数の直鎖状のポリヌクレオチド分子を連結して１つの分子を形成させる方法。
  72. （ａ）請求項１の方法を用いてレシピエント分子の第１および第２末端に、第１および第２の、互いに同じかまたは違う、一重鎖伸長を生成させる；（ｂ）請求項５３の方法を用いて標的分子の末端に、レシピエント分子上の第１および第２の一重鎖伸長と相補的な一重鎖伸長を生成させる；および（ｃ）レシピエント分子と標的分子を会合させて１つの分子を形成する；ことを含んで成る標的分子をレシピエント分子に挿入する方法。
  73. 標的分子が、請求項７１に記載の複数のポリヌクレオチド分子の連結の産物である、請求項７２に記載の方法。
  74. 複数のポリヌクレオチド分子がＤＮＡドメインを含んで成る、請求項７３に記載の方法。
  75. ＤＮＡドメインがエクソンである、請求項７３に記載の方法。
  76. 請求項３７に記載の切込み剤および直鎖状ベクターから成るキット。
  77. さらに３'→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含んで成る、請求項７６に記載のキット。
  78. さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを含んで成る、請求項７６に記載のキット。
  79. さらに少なくとも一つの配列決定プライマーを含んで成る、請求項７６に記載のキット。
  80. 請求項７２に記載の標的分子が挿入されているレシピエント分子を有する宿主細胞。
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