ES2202387T3 - Composiciones estabilizadas de transcriptasa inversa y rna polimerasa para amplificacion de acidos nucleicos. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN COMPOSICIONES DE ENZIMAS ESTABILIZADAS PARA SU USO EN LA AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS. LAS COMPOSICIONES SON ADECUADAS PARA LA ESTABILIZACION DE UNA O MAS ENZIMAS EN UNA FORMULACION ESTABILIZADA, SIMPLE. COMPOSICIONES ADICIONALES INCORPORAN UNA MEZCLA DE ENZIMAS ESTABILIZADAS, SECAS JUNTO CON LOS CO-FACTORES NECESARIOS Y SUBSTRATOS DE ENZIMAS EN UN CONTENEDOR SIMPLE PARA SU USO DESPUES DE LA REHIDRATACION. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA HACER Y UTILIZAR LAS COMPOSICIONES DE ENZIMAS ESTABILIZADAS Y EQUIPOS PARA LA AMPLIFICACION DE ACIDO NUCLEICO QUE INCORPORA LAS COMPOSICIONES PRESENTADAS.

Description

Composiciones estabilizadas de transcriptasa inversa y RNA polimerasa para amplificación de ácidos nucleicos.

Ambito de la invención

Esta invención se refiere en general a los campos de biología molecular, amplificación de ácidos nucleicos y composiciones biológicas estabilizadas. En particular la presente invención se refiere a una composición estable de enzimas liofilizadas que contiene una o más polimerasas de ácido nucleico.

Antecedentes de la invención

El ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) son grandes macromoléculas lineales compuestas de subunidades de nucleótidos unidas covalentemente. El ADN se encuentra habitualmente en una forma de "doble cadena" en la cual están asociadas dos cadenas de ADN de una manera antiparalela mediante enlaces de hidrógeno. El ARN existe habitualmente en la naturaleza en forma de una única cadena de polinucleótidos. Los nucleótidos son moléculas que tienen un azúcar (bien sea la desoxirribosa, o bien la ribosa) y un grupo o base nitrogenada, y habitualmente están conectadas entre sí en los ácidos nucleicos mediante uniones fosfodiéster. Existen cinco bases nitrogenadas comunes. Tres se encuentran tanto en el ADN como en el ARN: éstas son la adenina (A), guanina (G) y citosina (C). Las otras dos, la timina (T) y el uracilo (U) son específicas del ADN y el ARN respectivamente.

La mayor parte de (si no toda) la información genética de cada organismo se transmite de una generación a la siguiente en forma de ADN o ARN. Esta información la lleva consigo la secuencia de nucleótidos a lo largo de una cadena única de ácido nucleico o "cadena", la cual constituye un código genético. Además cada una de las bases nitrogenadas de una cadena de ácido nucleico tiene la capacidad de unirse específicamente al hidrógeno con una o más bases nitrogenadas de la misma o diferente cadena de ácido nucleico. Así pues, en condiciones habituales, A se une a través del hidrógeno con T (o U), y C se une a través del hidrógeno con G; esta unión específica a través del hidrógeno, recibe el nombre de par de bases. En el ADN de doble cadena, cada una de las dos cadenas está formada por una cadena de nucleótidos en la cual la mayor parte de todos los nucleótidos están emparejados por las bases con nucleótidos de la otra cadena. En este caso, el orden de los nucleótidos en una cadena del ADN determina el orden de los nucleótidos de la otra cadena del ADN. Dos cadenas de ácido nucleótido que son imágenes especulares una de la otra de esta manera, se dice que son perfectamente complementarias.

Los ácidos nucleicos se sintetizan in vivo mediante un mecanismo basado en el hecho de que cada cadena de ácido nucleico dicta el orden de los nucleótidos de una cadena perfectamente complementaria; esto es verdad tanto si el ácido nucleico que se desea es ARN o ADN, e independientemente de si el ácido nucleico que va a emplearse como molde es RNA o DNA. La mayor parte de los mecanismos específicos para la replicación del ADN implican el empleo de una ADN polimerasa para añadir secuencialmente nucleótidos al grupo hidroxilo 3' de un cebador polinucleótido unido a través de hidrógenos a la cadena del ácido nucleico del molde. Los nucleótidos recién añadidos están escogidos por la ADN polimerasa en base a su capacidad de emparejar por sus bases con el correspondiente nucleótido de la cadena del molde. Este proceso de adición de nucleótidos a un extremo de un cebador es llamado algunas veces como extensión del cebador.

A diferencia de la síntesis del ADN, la síntesis del ARN no requiere normalmente la existencia de un cebador polinucleótido. Antes bien, la síntesis del ARN está inducida habitualmente por una ARN polimerasa que reconoce una o más secuencias específicas de nucleótidos de un molde de ácido nucleico. La región del molde a la cual se une la ARN polimerasa, llamada promotor, es habitualmente de doble cadena. Después de unirse al promotor, la RNA polimerasa "lee" la cadena del molde y sintetiza una cadena de polirribonucleótidos covalentemente unidos, complementaria al molde. La ARN polimerasa de diferentes organismos reconoce preferentemente diferentes secuencias de promotores.

Las enzimas ADN y ARN polimerasa han sido purificadas de un cierto número de diversos organismos. Algunas de esta enzimas tales como p. ej., la ADN polimerasa I de E. coli, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, y varias ARN polimerasas se emplean habitualmente in vitro como herramientas en biología molecular e investigación bioquímica del ácido nucleico. Ver en general p. ej., Sambrook y col, Molecular Cloning: A Laboratory Manual("Clonación molecular: un manual de laboratorio")(2ª edición, Cold Spring Harbor Press 1989).

Otro empleo para las polimerasas de ácido nucleico ha surgido con la aparición de varios métodos de amplificación del ácido nucleico, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ver p. ej., Mullis y col., patentes U.S. n^{os} 4.683.195, 4,683.202 y 4.800.159. En la forma más simple de PCR se sintetizan dos cebadores oligonucleótidos, cada cebador, complementario a una región de un ácido nucleico diana posicionado en el lado 3' con respecto al ácido nucleico diana, de una región diana de una secuencia de nucleótidos. Cada cebador es complementario a una de las dos cadenas del ácido nucleico complementario; la región diana comprende una región de secuencias de nucleótidos que abarca ambas cadenas del ácido nucleico de un ácido nucleico diana de doble cadena. Cuando se permite que estos cebadores se unan con el substrato a través de enlaces hidrógeno ("hibridar"), y se añade una ADN polimerasa a la mezcla de reacción junto con nucleótido trifosfatos, cada cebador hibridado se extiende mediante la enzima en la dirección 5' \rightarrow 3'. La mezcla de reacción se calienta a continuación para fundir el híbrido, producto de extensión del cebador : molde, la temperatura se disminuye para permitir otra ronda de hibridación cebador/diana, y se añade más ADN polimerasa para reemplazar la ADN polimerasa inactivada por el paso de temperatura elevada. Repitiendo el proceso un número deseado de ciclos, la cantidad de ácidos nucleicos que contienen la secuencia diana de nucleótidos aumenta exponencialmente. Más recientemente, se ha empleado con éxito en el método PCR una ADN polimerasa termoestable, derivada del Thermus aquaticus con objeto de disminuir la necesidad de una adición repetida de grandes cantidades de las costosas enzimas. La Taq polimerasa resiste la inactivación a 90-95ºC, obviando de esta forma la necesidad de repetidas adiciones de enzima después de cada ronda de separación de la cadena.

Se han inventado otros métodos de amplificación del ácido nucleico, como p. ej., los que emplean la transcripción de la ARN como un paso en el proceso de amplificación. Este método funciona mediante la incorporación de una secuencia de un promotor a uno de los cebadores empleados en la reacción PCR y, a continuación, después de la amplificación mediante el método PCR, empleando el ADN de doble cadena como un molde para la transcripción del ARN monocatenario mediante una RNA polimerasa inducida por ADN, ver p. ej., Murakawa y col., ADN 7:287-295 (1988).

Otros métodos de amplificación emplean ciclos múltiples de síntesis de ADN inducida por ARN, y transcripción para amplificar los ADN o ARN dianas, ver p. ej., Burg y col., patente WO 89/1050; Gingeras y col., patente WO 88/10315 (algunas veces llamado sistema de amplificación por transcripción o TAS); Kacian y Fultz, Publicación EPO nº EPO 408.295 (la cual disfruta de propiedad común con la presente solicitud); Davey y Malek, solicitud EPO nº 88113948.9; Malek y col., patente WO 91/02818). Estos métodos utilizan una enzima, la transcriptasa inversa (RT), la cual puede emplear ARN o ADN como un molde para la síntesis de una cadena complementaria de ADN. Algunos de estos métodos utilizan también la actividad celular ARNasa H como un componente esencial. La mayoría de transcriptasas inversas retrovirales tales como las codificadas por el virus de Moloney de la leucemia del ratón (MMLV) y el virus de la mieloblastosis avícola (AMV), poseen una ADN polimerasa inducida por ARN, una actividad ADN polimerasa inducida por ADN, así como también una actividad ARNasa H. La actividad ARNasa H degrada selectivamente la cadena de ARN de una molécula de ácido nucleico híbrido ARN:ADN, lo cual permite que tenga lugar la reacción de amplificación sin necesidad del ciclo de temperaturas.

La amplificación del ácido nucleico es una herramienta cuya popularidad aumenta para la identificación específica y/o ampliación de segmentos de ácido nucleico únicos o característicos en diferentes ámbitos. Así p. ej., la amplificación del ácido nucleico se emplea en análisis de alimentos y ensayos agrícolas, diagnósticos médicos, análisis y consultas de genética humana, arqueología y medicina forense criminal. Debido a que todos estos métodos utilizan enzimas, los métodos de producción, envasado, transporte y almacenamiento de grandes cantidades de enzimas altamente activas se ha convertido en una cuestión de importancia crítica en la manufactura, marketing y venta de enzimas y kits para la amplificación del ácido nucleico. Específicamente, para métodos que emplean la amplificación basada en la transcripción, los métodos y preparaciones comercialmente aceptables para el almacenamiento de preparaciones activas de transcriptasa inversa y ARN polimerasa, son necesarios para la manufactura y marketing con éxito de kits para la amplificación del ácido nucleico.

El método habitual de estabilización de las enzimas transcriptasa inversa y ARN polimerasa (así como muchas otras enzimas empleadas en investigación en biología molecular) consiste en el almacenamiento de una preparación líquida de cada enzima en una solución que contiene 50% (v/v) de glicerina y un agente reductor tal como el ditiotreitol (DTT) o \beta-mercaptoetanol (\betaME) a -20ºC. Este método preserva la actividad de las enzimas durante muchos meses con pequeña pérdida de la actividad. En cambio, las actividades de las enzimas se pierden fácilmente cuando las enzimas se almacenan a temperatura ambiente o a 4ºC. Estas preparaciones se transportan generalmente desde el proveedor de la enzima al usuario final, en hielo seco; pérdidas del 30% o más de la actividad de la enzima son habituales en este transporte debido al congelado y descongelado de la preparación de la enzima. Estas enzimas se formulan y suministran separadamente.

Un método de almacenamiento y transporte de la transcriptasa inversa y la ARN polimerasa sin necesidad de refrigeración obviaría la necesidad de un transporte refrigerado y/o de métodos de almacenamiento en frío tales como el hielo seco, envases humidificados, envases secos, o envases de espuma de estireno para el transporte. Estos métodos serían también más económicos, dado que los gastos generales de producción asociados con estos métodos de mantenimiento de la actividad enzimática serían innecesarios. Los métodos de almacenamiento de enzimas que permitieran que la preparación de las enzimas tolerara una exposición dentro de ciertos límites a altas temperaturas, eliminaría las pérdidas de actividad de la enzima que podrían producirse en el caso de que la preparación de la enzima esté durante el embarque sobre un muelle de carga o en un camión. Este método tendría que ser altamente reproducible. Además si las enzimas pudieran suministrarse en un envase único en una forma compatible con el empleo que se desea (por ejemplo en una formulación conteniendo toda o la mayor parte de cualquiera de los cofactores y substratos), dicha preparación sería más económica de fabricar y más conveniente para emplear.

El secado por congelación (liofilización) ha sido empleado para la conservación de alimentos, membranas biológicas, células completas (ver p. ej., American Society for Microbiology, Manual of Methods for General Bacteriology ("Sociedad Americana de Microbiología, Manual de Métodos de Bacteriología General") 210-217 (1981), y macromoléculas biológicas que incluyen las enzimas. La liofilización implica la eliminación del agua de una muestra congelada por sublimación a presión reducida. La sublimación es el proceso por el cual un sólido se evapora sin pasar por el estado líquido.

Los aspectos teóricos de la liofilización son complejos. Se piensa que cuando una substancia biológica como p. ej., una proteína está en solución acuosa la molécula está rodeada por una cubierta de hidratación que comprende moléculas de agua, esta cubierta de hidratación estabiliza la proteína y ayuda a mantener su actividad. Cuando el agua se elimina, los grupos reactivos de la proteína que normalmente están enmascarados por la cubierta de hidratación quedan en libertad de reaccionar unos con otros, formando así nuevos enlaces esencialmente irreversibles. Estos enlaces pueden distorsionar la primitiva conformación de la proteína. También pueden tener lugar nuevas interacciones hidrofóbicas/hidrofílicas en ausencia del agua lo cual puede distorsionar también la conformación de la proteína. Dado que la conformación tridimensional de muchas proteínas confiere una actividad biológica, la distorsión de la conformación puede alterar las actividades biológicas durante el secado. Por el mismo mecanismo, puede tener lugar el reticulado y la agregación de proteínas.

La congelación de la muestra de proteína antes del secado ayuda a reducir el grado de distorsión conformacional debido al secado. La disminución de la temperatura inicial ayuda a mantener en un mínimo las reacciones no deseadas entre los grupos reactivos aminoácidos al privar de energía a los reactantes. Al mismo tiempo, en un estado congelado la proteína tiene menos libertad estérica que cuando está en solución y es menos propensa a un cambio conformacional grande.

Sin embargo, los liofilizados completamente secos tienden a tener una "vida útil" o vida de almacenamiento más corta que la que tienen los liofilizados incompletamente secados conteniendo todavía un bajo porcentaje de agua. Estos liofilizados secados incompletamente deben almacenarse a menudo a temperaturas no más altas de aproximadamente 4-10ºC, y son todavía capaces de experimentar la inactivación de reacciones químicas lo cual no sería posible si el agua no estuviera presente. Así, mientras la vida útil de muchas proteínas biológicamente activas liofilizadas incompletamente secas, es necesario todavía refrigerar la preparación con el fin de mantener la actividad. Incluso así, existe una pérdida de actividad en dichas preparaciones durante un período de tiempo relativamente corto. Además, algunas enzimas tales como la fosfofructoquinasa, se inactivan completamente después de la liofilización en ausencia de un crioprotector, independientemente de si la preparación está completamente seca o no. Ver p. ej., Carpenter y col., Cryobiology 25:372-376 (1988).

Como se emplea en la presente, el término "crioprotector" significa un compuesto o composición que tiene tendencia a proteger la actividad de una substancia biológicamente activa durante la congelación, secado y/o reconstitución de la substancia seca.

El término "agente estabilizante" significa un agente que cuando se añade a un material biológicamente activo, previene o retrasa la pérdida de actividad biológica del material con el tiempo, comparativamente a cuando el material se almacena en ausencia del agente estabilizante.

Se han empleado o propuesto diferentes aditivos crioprotectores para emplear como excipientes para ayudar a preservar la actividad biológica cuando se secan materiales biológicos, incluyendo proteínas particulares. Clegg y col., Cryobiology 19;106-316 (1982) han estudiado el papel de la glicerina y/o la trehalosa en la capacidad de los quistes del camarón Artemia de la salmuera de permanecer viables después de la desecación. Carpenter y col., Cryobiology 24: 455-464 (1987), informa que los disacáridos maltosa, sacarosa, lactosa y trehalosa pueden jugar un papel en el aumento de la estabilización de la actividad de la fosfofructoquinasa en una preparación de enzima purificada sometida al secaje por aire. La publicación EPO nº 0431882A2, describe una preparación estabilizada de fosfatasa alcalina purificada que había sido derivatizada y a continuación liofilizada en presencia de manitol o lactosa. La publicación EPO nº 0091258A2, describe un método para estabilizar el factor de necrosis tumoral (TNF) mediante el almacenamiento o liofilización de la proteína purificada en presencia de una proteína estabilizante, tal como la albúmina de suero humano, gelatina, globulina \gamma humana, o sulfato de protamina de salmón. La patente U.S. nº 4.451.569 describe el empleo de pentosas, alcoholes de azúcar y algunos disacáridos para estabilizar la actividad de la peroxidasa de glutatión purificada. La composición estabilizada puede secarse por congelación y a continuación almacenarse a temperatura por debajo de 20ºC. La publicación EPO nº 0448146A1 describe preparaciones de gonadotropina liofilizada, estabilizadas, que contienen una sal de un ácido dicarboxílico. La preparación puede contener además un disacárido tal como la sacarosa o la trehalosa. Roser, Biopharm, 47-53 (Septiembre 1991) describe la preservación de la actividad biológica de varias moléculas biológicas secadas a temperatura ambiente empleando la trehalosa. La publicación PCT nº WO87/00196 informa la estabilización de anticuerpos monoclonales y la fosfatasa alcalina de intestino de ternera en el secaje con aire en presencia de trehalosa. Las publicaciones PCT WO89/00012 y WO89/06542 describen el empleo de la trehalosa para preservar algunos alimentos y la antigenicidad de partículas de virus vivos. La publicación EPO 02270799A1 informa la estabilización del \beta-interferón recombinante en una formulación que contiene un agente estabilizante tal como un detergente o glicerina. Las composiciones pueden comprender además varios azúcares que incluyen la sacarosa y la trehalosa, alcoholes de azúcar, y proteínas como agentes estabilizantes adicionales; entre los mismos, el más preferido es la dextrosa.

Se ha descubierto que algunos de estos aditivos prolongan la vida útil de un material biológicamente activo hasta muchos meses o más, cuando se almacenan a temperatura ambiente en una forma esencialmente deshidratada. Sin embargo, la efectividad, idoneidad o superioridad de un aditivo particular prospectivo depende de la composición química del material biológicamente activo que se pretende estabilizar; en el caso de una proteína estos factores pueden incluir sin limitarlos a, la secuencia de aminoácidos de la proteína y su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria. Así pues, no es predecible a priori si una composición particular funcionará para conservar la actividad biológica de un material biológicamente activo particular.

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Además, si una proteína se liofiliza, los factores adicionales, incluyendo sin limitar a, la composición del tampón, la velocidad de congelación, la cantidad de presión negativa, las temperaturas inicial, operativa y final de liofilización y la longitud del procedimiento de liofilización, son importantes en la determinación de la estabilidad y vida útil de la proteína activa.

Algunas proteínas son conocidas por tener múltiples actividades enzimáticas. Así, las enzimas transcriptasa inversa retrovirales tales como las derivadas del virus Moloney de la leucemia del ratón (MMLV-RT) tienen una actividad DNA polimerasa inducida por ADN, una actividad ADN polimerasa inducida por ARN y una actividad ARNasa H. Aunque estas actividades están contenidas en la misma enzima, las condiciones para la preservación de cualquiera de estas actividades en una preparación seca no aseguran que una o las dos actividades restantes de la enzima serán también preservadas en las mismas condiciones.

Además, cuando una aplicación particular requiere que cuando el balance de las actividades específicas relativas de las tres actividades de la transcriptasa inversa permanezca similar después de la reconstitución, al balance de estas actividades antes del secado, como en el sistema de amplificación del ácido nucleico basado en la transcripción de Kacian & Fultz, ver más arriba (el cual posee la común propiedad de la presente solicitud y se incorpora a la presente como referencia), un método particular de preservación puede trastornar el delicado balance de estas actividades enzimáticas, haciendo que la enzima sea inapropiada para esta utilización. Así pues, si la actividad ARNasa H de la enzima se preserva más que la actividad de la ADN polimerasa inducida por ARN, el complejo de iniciación ARN : ADN puede ser degradado antes de que pueda empezar la síntesis del ADN.

Puesto que una composición crioprotectora dada, que es efectiva para la preservación a largo plazo de una actividad enzimática dada, no es claramente efectiva o superior cuando se aplica a otra actividad enzimática, enzimas diferentes requieren a menudo protectores completamente diferentes para la estabilización de la actividad. Como consecuencia, entre las preparaciones de enzimas liofilizadas elaboradas comercialmente, todas o la mayoría contienen solamente una única enzima seca en una formulación cuya finalidad es la de preservar la actividad de aquella enzima específica.

La patente WO-A-93 00807 describe un método para la estabilización de biomateriales durante la liofilización incluyendo una solución que contiene un azúcar y polivinilpirrolidona como agentes estabilizantes y ARN polimerasa/transcriptasa inversa como proteínas individuales para formar parte de la composición que va a liofilizarse. Sin embargo esta técnica anterior no proporciona ninguna sugestión para co-liofilizar una mezcla de ARN polimerasa y transcriptasa inversa, ni cualquier otro juego de proteínas.

Resumen de la invención

La presente invención tiene por finalidad composiciones y kits que comprenden formulaciones secas de transcriptasa inversa y ARN polimerasa capaces de ser almacenadas a temperatura ambiente por períodos prolongados de tiempo sin una substancial pérdida de sus actividades enzimáticas. De preferencia, las formulaciones comprenden las preparaciones de transcriptasa inversa retroviral y/o ARN polimerasa de bacteriófago. Con mayor preferencia, las formulaciones comprenden la transcriptasa inversa derivada del virus Moloney de la leucemia del ratón (MMLV-RT) y la ARN polimerasa del bacteriófago T7 en un excipiente crioprotector. Incluso con mayor preferencia, la invención va dirigida a los envases únicos que comprenden formulaciones secas que contienen tanto la MMLV-RT como la ARN polimerasa de T7 en uno o más excipientes crioprotectores. Con mayor preferencia, la invención va dirigida a envases únicos que comprenden formulaciones secas que contienen la MMLV-RT y la ARN polimerasa de T7, uno o más excipientes crioprotectores que comprenden uno cualquiera o ambos trehalosa y polivinilpirrolidona (PAP), nucleótido trifosfatos, y iones metálicos y co-factores necesarios para dichas actividades enzimáticas, después de la reconstitución del liofilizado estabilizado y la adición de un ácido nucleico diana y uno o más cebadores apropiados, la formulación está en una forma conveniente y con un coste razonable para la amplificación del ácido nucleico sin necesidad de una excesiva manipulación. Opcionalmente, esta formulación puede contener cebadores para la iniciación de la síntesis del ácido nucleico. Finalmente, la presente invención va dirigida a métodos para elaborar y utilizar las formulaciones secas descritas más arriba.

Las enzimas transcriptasa inversa y ARN polimerasa son agentes importantes en los métodos de amplificación del ácido nucleico basados en la transcripción, tales como los descritos en Burg y col., ver más arriba; Gingeras y col., ver más arriba, (alguna veces llamado sistema de amplificación por transcripción o TAS); Kacian y Fultz, ver más arriba; Davey y Malek, solicitud EPO nº 88113948.9 y Malek y col., publicación PCT nº WO91/02818). Estos métodos son cada vez más importantes en campos como la medicina forense y el diagnóstico médico, en donde la estabilidad de los reactivos de amplificación en el tiempo es una consideración significativa en el coste de la elaboración, marketing y empleo de productos que utilizan la amplificación del ácido nucleico.

El solicitante ha descubierto un método y una formulación seca para la preservación de las actividades de la ADN polimerasa inducida por ADN, la ADN polimerasa inducida por ARN, y la ARNasa H de la transcriptasa inversa. El mismo método y formulación se ha descubierto que son adecuados para la preservación de la actividad ARN polimerasa. Además, la solicitante ha descubierto sorprendentemente que las dos enzimas y las cuatro actividades enzimáticas pueden ser estabilizadas y preservadas como una formulación seca en un envase único sin pérdida significativa de ninguna de las cuatro actividades durante un substancial período de tiempo, incluso después de una prolongada incubación a alta temperatura.

Un aspecto del presente método comprende la provisión de una transcriptasa inversa purificada activa con un excipiente crioprotector que comprende un disacárido no reductor (de preferencia sacarosa o trehalosa, o la polivinilpirrolidona (PAP), o una cantidad de una mezcla de estos compuestos efectiva para actuar como un agente de protección y preservación de las actividades de la ADN polimerasa inducida por ADN, la ADN polimerasa inducida por ARN y la ARNasa H de la transcriptasa inversa después del secado de la enzima por métodos tales como, sin limitar a, la liofilización de una solución que contiene la transcriptasa inversa y el crioprotector.

En un segundo aspecto, la invención presenta un método para la estabilización y preservación de la ARN polimerasa purificada activa, de preferencia la ARN polimerasa de T7, en una forma deshidratada substancialmente estable a temperatura ambiente para más de 90 días. En este aspecto, la ARN polimerasa se seca en presencia de sales metálicas, tales como las que contienen Mg^{++} o Zn^{++} uno o más agentes estabilizantes protectores seleccionados del grupo formado por disacáridos no reductores, de preferencia la trehalosa y la polivinilpirrolidona (PAP), y un agente reductor, tal como la n-acetil-L-cisteína (NALC). Aunque no desea limitarse a la teoría, la solicitante cree que el agente reductor ayuda a prevenir la inactivación de la enzima a través de la oxidación de algunos residuos de cisteína presentes en la enzima. En este aspecto, la ARN polimerasa conserva por lo menos el 70% de su actividad original, de preferencia después de la exposición de la formulación deshidratada a una temperatura de 45ºC por lo menos 30 días o 35ºC por lo menos 61 días.

En otro aspecto, la invención presenta una única formulación seca que contiene una mezcla de transcriptasa inversa (de preferencia MMLV-RT), ARN polimerasa (de preferencia ARN polimerasa de T7), una cantidad de un excipiente crioprotector (de preferencia trehalosa y/o polivinilpirrolidona) efectiva para preservar las actividades enzimáticas de las enzimas secas, nucleótido trifosfatos, co-factores necesarios, cebadores oligonucleótidos opcionales y un agente reductor, de preferencia un compuesto tiol.

Todavía en otro aspecto, la presente invención comprende un componente de un kit para la amplificación e identificación específica de ácidos nucleicos pertenecientes a uno o más agrupaciones filogenéticas de organismos, por ejemplo, para la detección específica de una o más especies dentro de un género o uno o más géneros dentro de una familia. La invención proporciona una formulación seca reconstituible que comprende una transcriptasa inversa, una ARN polimerasa, ribonucleótido trifosfatos, desoxirribo-nucleótido trifosfatos, sales de zinc y/o magnesio, y un agente reductor en un único envase. Los cebadores de la amplificación y una solución para la reconstitución acuosa puede suministrarse como uno o más componentes separados adicionales del kit. Alternativamente, los cebadores de la amplificación pueden estar comprendidos en la formulación seca. Sondas para el ensayo de hibridación del ácido nucleico específico de la secuencia diana y cualesquiera oligo-nucleótidos de ayuda sin marcar deseados, pueden incluirse en la formulación seca o suministrarse en un reactivo separado. Después de la reconstitución de la formulación seca y adición de los cebadores oligonucleótidos (si es que no los hay ya presentes), la mezcla se pone en contacto con un ácido nucleico diana, parcial o totalmente monocatenario. Si el ácido nucleico diana tiene secuencias nucleótidas complementarias al (a los) cebador(es) (o la porción de cebador de un(os) cebador(es)-promotor(es)), la reacción tendrá lugar por incubación de la mezcla de reacción a una temperatura suficiente para la amplificación del ácido nucleico.

En otro aspecto, la invención comprende un liofilizado único que contiene una combinación de transcriptasa inversa (de preferencia MMLV-RT), ARN polimerasa (de preferencia ARN polimerasa de T7), un excipiente crioprotector, nucleótido trifosfatos, co-factores necesarios y un agente de reducción, de preferencia conteniendo un grupo tiol. El liofilizado puede transportarse y almacenarse sin necesidad de refrigeración, y puede resistir una exposición transitoria a elevadas temperaturas, por ejemplo, sin limitación, 55ºC durante 30 días, sin una disminución significativa de la actividad enzimática.

Por "nucleótido trifosfatos" se entienden los ribo- o desoxirribonucleótido trifosfatos y derivados de los mismos, capaces de servir como substratos para una ARN polimerasa y una ADN polimerasa, de preferencia una transcriptasa inversa, respectivamente. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, nucleótidos con metilo (u otro alquilo) y/o grupos sulfuro incorporados a la base nitrogenada (habitualmente adenina, timina o uracilo, citosina y guanina), el grupo ribosa o desoxirribosa, o el grupo fosfato.

Por "nucleótido" se entiende una subunidad de ácido nucleico que comprende una base nitrogenada única (habitualmente adenina, timina o uracilo, citosina y guanina), un grupo azúcar (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosfato. Como se emplea en la presente, el término se refiere tanto a los ribo- o desoxirribonucleótido trifosfatos no incorporados, como a las subunidades de nucleótidos unidos covalentemente de una cadena de oligonucleótido o de ácido nucleico, en función del contexto de utilización.

Descripción detallada de la invención

La presente invención comprende métodos para la estabilización de actividades enzimáticas de las enzimas ADN polimerasa y ARN polimerasa mediante la eliminación del disolvente de una solución que contiene una o más de estas enzimas en presencia de un crioprotector, o de un agente estabilizante "en gran cantidad". Este crioprotector incluye los sacáridos, particularmente los disacáridos no reductores, y polímeros solubles en agua que tienen grupos electro-positivos y/o electronegativos disponibles para la unión con hidrógeno con la enzima. Crioprotectores particularmente preferidos son los disacáridos sacarosa y trehalosa y el polímero polivinilpirrolidona (PAP).

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La presente invención se refiere también a composiciones estabilizadas que comprenden una ADN polimerasa desecada, una ARN polimerasa desecada, o una mezcla desecada que contiene una ADN polimerasa y una ARN polimerasa. Enzimas preferidas que comprenden estas composiciones son las transcriptasas inversas y las polimerasas ARN de bacteriófago; enzimas particularmente preferidas son la transcriptasa inversa retroviral del virus Moloney de la leucemia del ratón y la ARN polimerasa del bacteriófago T7.

Un método preferido de desecación de la ADN polimerasa y la ARN polimerasa de la presente invención, consiste en la liofilización. En este proceso, se congela una solución que contiene la enzima, se aplica el vacío a la solución de enzima congelada, y el disolvente se elimina de la preparación por sublimación, dejando como residuos los solutos.

La presente invención presenta también una composición para la replicación de una o más secuencias particulares de ácido nucleico que incluyen una preparación desecada de una ADN polimerasa (de preferencia una transcriptasa inversa), una ARN polimerasa, nucleótido trifosfatos, y co-factores necesarios para la actividad enzimática. La preparación desecada puede contener también los cebadores para la amplificación para la replicación específica de la secuencia de nucleótidos diana y/o las sondas del ensayo de hibridación y auxiliares. De preferencia, la composición desecada se prepara por liofilización.

La composición de la presente invención es estable durante un período prolongado incluso si se almacena a altas temperaturas. Tales composiciones son pues de utilidad para transportar y almacenar preparaciones comerciales de estas enzimas y de kits para la amplificación de ácidos nucleicos que contienen dichas enzimas.

Ejemplos

Debe entenderse que se pretende que los ejemplos siguientes ilustren varias versiones actualmente preferidas de la presente invención, y no limiten de ninguna manera el ámbito de la misma. Ni tampoco la descripción de una versión es la representación de que no pueden existir otras versiones de la invención que sean más efectivas para lograr uno o más de los objetivos que se pretende alcanzar por la presente invención.

Ejemplo 1 Liofilización de la transcriptasa inversa y la ARN polimerasa

La transcriptasa inversa empleada en este y en los ejemplos siguientes fue una transcriptasa inversa recombinante del virus Moloney de la leucemia del ratón, expresada en una cepa de E. coli 1200 y purificada a partir de una pasta de células, o bien una preparación comercialmente disponible de MMLV-RT purificada, procedente de United States Biochemicals, Cleveland, Ohio. La preparación de la enzima se almacenó a -20ºC en un tampón de almacenamiento que contenía 20-50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M de NaCl, 0,1 mM de ácido etilendiamintetracético (EDTA), 1,0 mM de ditiotreitol (DTT), 0,01% (v/v) de TERGITOL NP®-40 (TERGITOL® es una marca comercial registrada de Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.) o 0,1% (v/v) de TRITON® X-100 (TRITON® es una marca comercial registrada de Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.), y 50% (v/v) de glicerina. La ARN polimerasa T7 purificada se obtuvo de Epicentre Technologies, Madison, WT. Antes de la diálisis se almacenó la enzima en 50% (v/v) de glicerina, 50 mM de Tris.HCl (pH 7,5), 0,1M de NaCl, 2,0 mM de DTT, 0,1 mM de EDTA y 0,1% (v/v de TRITON® X-100. Esta enzima se almacenó también a -20ºC antes de la diálisis.

Se dializaron tres preparaciones de enzimas en preparación para la liofilización. La primera preparación contenía 324,012 unidades de MMLV-RT diluida en un tampón que contenía 20 mM de HEPES (ácido [2-hidroxietil]piperazin-N'-[2-etansulfónico]) (pH 7,5), 0,1 M de NaCl, 0,1 mM de EDTA, 2 mM de NALC, 0,1 mM de sulfato de zinc, 0,2 M de trehalosa y agua. El volumen final fue de 720 \mul. Este se dializó frente a 250 ml del mismo tampón (tampón de trehalosa) durante 6 horas a 4ºC. Las membranas de diálisis se prepararon hirviendo en 2% (p/v) de bicarbonato de sodio y 10 mM de EDTA (pH 8,0), a continuación en 10 mM de EDTA (pH 8,0) y finalmente en agua desionizada durante 10 minutos cada vez. Las membranas fueron a continuación lavadas a fondo con agua desionizada antes de emplearlas. El tampón de diálisis se cambió con el mismo volumen de tampón recién preparado y se continuó la diálisis durante 10 horas más. El tampón se cambió de nuevo y se continuó otras 3 horas. El volumen final fue de 655 \mul.

La segunda preparación contenía 144.000 unidades de ARN polimerasa de T7 en 720 \mul. Esta se dializó frente a tampón de trehalosa con el mismo programa y en los mismos volúmenes que en la preparación de la transcriptasa inversa. El volumen final fue de 1270 \mul.

La tercera preparación contenía tanto la transcriptasa inversa como la ARN polimerasa; se combinaron 324.012 unidades de transcriptasa inversa y 144.000 unidades de ARN polimerasa hasta un volumen final de 1440 \mul. Este se dializó frente a 3 volúmenes iguales de tampón de trehalosa con el mismo programa que las otras dos preparaciones. El volumen final del dializado fue de 1975 \mul.

Después de la diálisis, cada preparación se dividió en 12 alícuotas iguales en viales. Cada vial contenía 27.000 unidades de transcriptasa inversa, 12.700 unidades de ARN polimerasa de T7 o ambas enzimas en estas cantidades. Los viales se colocaron en un liofilizador modelo Virtis 101-SRC programable con un sistema de control FCP-III. Los viales fueron enfriados a -40ºC en aproximadamente 5 minutos. La liofilización empezó disminuyendo la presión a
-180 Torr; el vacío se mantuvo constante durante el protocolo de liofilización. La temperatura se aumentó a continuación en una forma lineal hasta -10ºC durante las siguientes 2 horas y se mantuvo a esta temperatura durante las próximas 6 horas. A continuación la temperatura se aumentó linealmente hasta 10ºC durante la próxima hora, y se mantuvo a 10ºC durante 4 horas. La temperatura se aumentó de nuevo linealmente hasta 25ºC durante los próximos 30 minutos y se mantuvo a 25ºC durante las siguientes 10,5 horas. A continuación se restableció la presión atmosférica con la introducción de nitrógeno seco, y los viales se sellaron en atmósfera de nitrógeno antes de sacarlos del liofilizador. A continuación los viales se almacenaron a 25ºC durante 22 días.

Después de un período de almacenamiento, las preparaciones de enzima liofilizadas se reconstituyeron en tampón de reconstitución (0,01% (v/v) de TRITON® X-100, 41,6 mM de MgCl_{2}, 1 mM de ZnC_{2}H_{3}O_{2}, 10% (v/v) de glicerina, 0,3% (v/v) de etanol, 0,02% (p/v) de metilparabenzoato, y 0,01% (p/v) de propilparabenzoato) y se ensayó su capacidad para soportar la amplificación del ácido nucleico.

Las mezclas de reacción de 90 \mul de volumen total, se prepararon conteniendo 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 17,5 mM, 2 mM de espermidina, 25 mM de KCl, 2 mM de cada uno de dATP, dCTP, dTTP y dGTP, 2,5 mM de CTP y UTP, 6,5 mM de ATP y GTP, 5 mM de DTT, 0,44 \mul de una solución de 675 \mug por ml de un promotor-cebador (SEQ ID NO: 1) con una región de unión diana complementaria a una región de una cadena del gen 10 del bacteriófago T7, 0,3 \mul de una solución de 451 \mug por ml de un cebador (SEQ ID NO: 2) con una región de unión diana complementaria a la otra cadena del gen 10 del bacteriófago T7, cien copias del ácido nucleico diana del gen 10 de T7, y agua. El ARN diana del gen 10 de T7 era un transcripto de sentido (+) de un fragmento de restricción del gen 10 de T7 procedente de un plásmido, derivado del plásmido pGEMEX-1 (Promega Corporation, Madison, WI). El transcripto de ARN purificado estaba presente en una concentración de 0,61 picomoles/\mul. Se añadieron cien copias del ácido nucleico diana a cada tubo. Cada tubo se recubrió también con una capa de 200 \mul de aceite mineral para impedir la evaporación de la muestra durante el ensayo.

Se incubaron todos los tubos a 95ºC durante 5 minutos y se dejaron enfriar a temperatura ambiente antes de la adición de la enzima reconstituida como se describe más arriba; aunque este paso no es necesario cuando el ácido nucleico diana es ARN o ADN monocatenario en lugar de ADN de doble cadena, un paso inicial de calentamiento ayuda a fundir cualesquiera regiones de ARN intramolecular unidas a hidrógeno. A los tubos experimentales que contenían las preparaciones de enzima liofilizadas separadamente se les añadió a continuación 10 \mul de una solución que contenía 400 unidades de ARN polimerasa de T7 y, o bien 600 o bien 900 unidades de MMLV-RT liofilizada; las ARN polimerasa de T7 y la MMLV-RT coliofilizadas estaban presentes a concentraciones de 400 unidades y 900 unidades por 10 \mul, respectivamente. Los tubos fueron incubados a 37ºC durante 3 horas.

La cantidad de ácido nucleico amplificado producido durante la reacción, se determinó empleando el ensayo homogéneo de protección descrito en Arnold y Nelson, patente U.S. nº 5.283.174 (la cual posee la copropiedad con la presente solicitante, y la cual se incorpora a la presente como referencia); para una persona experta en la técnica será evidente que están disponibles en la técnica, muchos otros sistemas y métodos de ensayo para la detección de un ácido nucleico diana, como p. ej., empleando sondas marcadas radioactivamente.

La reacción de amplificación finalizó con la adición a cada tubo de 100 \mul de un tampón de hibridación que contenía 200 mM de succinato de litio (pH 5,2), 17% (p/v) de laurilsulfato de litio, 3 mM de EDTA (ácido etilendiamin tetracético) y 3 mM de EGTA ([ácido etilenbis(oxietileni-trilo)]-tetraacético) y una sonda marcada con éster de acridinio (SEQ ID NO: 3) complementaria al ARN transcripto del gen 10 de T7. Los tubos se incubaron a 60ºC durante 20 minutos. El éster de acridinio asociado con la sonda sin hibridar se hidrolizó añadiendo 300 \mul de 182 mM de NaOH, 600 mM de ácido bórico y 1% (v/v) de TRITON® X-100 y los tubos se incubaron a 60ºC durante 5 minutos. Se midió la quimioluminiscencia remanente con un luminómetro después de la adición de 200 \mul de 1% (v/v) de H_{2}O_{2} en HNO_{3} 0,4N seguido inmediatamente de una alcalinización de la solución con la inmediata adición de (200 \mul) de NaOH 1M. Los resultados se expresan en unidades de luz relativas (RLU), las cuales son una medida del número de fotones emitidos por la marca quimioluminiscente. Los resultados figuran en la tabla 1 a continuación.

TABLA 1

Comparación de enzimas liofilizadas almacenadas a 25ºC
durante 22 días con enzimas sin liofilizar
	ARN diana	Control negativo
	600 unidades de	900 unidades de	600 unidades de	900 unidades de
	MMLV_RT y	MMLV_RT y	MMLV_RT y	MMLV_RT y
	400 unidades de	400 unidades	400 unidades	400 unidades
	T7 polimerasa	T7 polimerasa	T7 polimerasa	T7 polimerasa
MMLV-RT	321329	428872	1868	5630
líquida y ARN
polimerasa T7
líquida
MMLV-RT	301253	463561	1681	1684
liofilizada y
ARN polimerasa
T7 líquida
MMLV-RT	549204	343582	1366	1545
líquida y ARN
polimerasa T7
liofilizada
MMLV-RT	415080	493779	1352	1374
liofilizada y
ARN polimerasa
T7 liofilizada
(liofilizadas
separadamente)
MMLV-RT y	677531	654359	1376	1296
ARN polimerasa	(900 unidades de		(900 unidades de
T7,	MMLV-RT)		MMLV-RT
co-liofilizadas

Estos resultados indican que la MMLV-RT y la ARN polimerasa de T7 co-liofilizadas, ocasionan la amplificación del gen 10 del ARN diana, más efectivamente que en las mezclas de reacción con cualquier preparación de enzimas emparejada con una preparación de enzima líquida de la otra enzima, o cuando ambas enzimas están sin liofilizar. No se observa ninguna disminución significativa en la capacidad de cualquiera de las preparaciones de enzima liofilizadas para catalizar la amplificación comparada con las enzimas líquidas. Así pues, los resultados demuestran también que cada enzima puede estabilizarse eficazmente mediante almacenamiento en un estado seco en presencia de trehalosa, bien sola o bien conjuntamente. Debido a que la amplificación del ácido nucleico en estas condiciones depende de la presencia de todas los tres actividades enzimáticas de la transcriptasa inversa (ADN polimerasa inducida por ARN, ADN polimerasa inducida por ADN, y ARNasa H), el ensayo es una indicación efectiva tanto de que estas actividades son efectivamente estabilizadas por el presente método, como de que las actividades permanecen coordinadas de tal manera que se promueve la amplificación del ácido nucleico.

Experimentos adicionales mostraron que la transcriptasa inversa puede ser liofilizada en presencia de sacarosa mejor que con trehalosa en condiciones similares; la trehalosa parece ser ligeramente superior a la sacarosa como agente estabilizante crioprotector (ver ejemplo 6).

b. Liofilización de la transcriptasa inversa y la ARN polimerasa de T7 en presencia de un detergente no iónico

La transcriptasa inversa y la ARN polimerasa fueron co-dializadas y liofilizadas en presencia de un detergente no iónico con el fin de conseguir una mínima precipitación de proteína durante el proceso de liofilización aunque manteniendo la actividad enzimática en la diálisis de las enzimas. Se prepararon seis mezclas de diálisis que contenían 0%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2% y 0,5% de TRITON® X-102 en un tampón de diálisis. El tampón de diálisis contenía 20 mM de HEPES, 0,1 M de NaCl, 0,1 mM de EDTA, 5 mM de NALC, 0,1 mM de acetato de zinc y 0,2 M de trehalosa. El volumen final de cada mezcla de diálisis fue de 250 ml. Cuatrocientos sesenta y siete microlitros de cada tampón se combinaron con 46 \mul de MMLV-RT (2900 unidades/\mul) y 74 \mul de ARN polimerasa de T7 (800 unidades/\mul) para un volumen de partida de cada dializato de 587 \mul. Las muestras se dializaron frente a 60 ml del correspondiente tampón a 4ºC con tres cambios del mismo volumen de tampón. Después del tercer cambio de tampón, se observó un precipitado en las muestras que contenían 0%, 0,01%, y 0,05% de TRITON® X-102; no se observó ningún precipitado en las muestras que contenían 0,1%, 0,2% ó 0,5% de TRITON® X-102.

Después de la diálisis, se midió el volumen de cada dializado y se ajustaron las concentraciones calculadas de enzima de acuerdo con los mismos. Cada muestra se dividió en 4 viales, conteniendo cada vial 24.750 unidades de MMLV-RT y 11.000 unidades de ARN polimerasa de T7. La liofilización se efectuó como más arriba. La aparición del liofilizado conteniendo detergente después del secado fue indistinguible en el liofilizado preparado en ausencia de TRITON® X-102. Después de la liofilización, los viales se almacenaron a 4ºC y 55ºC durante 32 días.

El efecto del detergente no iónico sobre la actividad de las enzimas se dictaminó en un ensayo de amplificación empleando el sistema de amplificación del gen 10 de T7. Cada preparación de enzima liofilizada se rehidrató en tampón de reconstitución; 900 unidades de MMLV-RT y 400 unidades de ARN polimerasa de T7 se ensayaron en cada mezcla de reacción. Se emplearon transcriptos del gen 10 de RNA (100 copias por reacción) como ácido nucleico diana. El ensayo se efectuó como se ha descrito más arriba con excepción de lo indicado expresamente de otra forma. Los resultados están expresados en RLU.

TABLA 2

Estabilidad de enzimas liofilizadas después de 32 días de
almacenamiento en presencia de detergente
	Almacenamiento a 4ºC	Almacenamiento a 55ºC
Muestra*	ARN diana (duplicados)	Sin diana	ARN diana (duplicados)	Sin diana
A	1612901	1317601	1543
B	1151828	1146113	1700	791757	320417	1701
C	1286845	1219888	1544	1190527	905066	1690
D	1215264	1205790	1513	1251635	1388493	1513
E	1208586	1418260	1545	1245880	1052251	1591
* Muestra A = Enzimas sin liofilizar almacenadas a -20ºC.
\hskip2mm Muestra B = Enzimas liofilizadas en 0% de TRITON® X-102.
\hskip2mm Muestra C = Enzimas liofilizadas en 0,1% de TRITON® X-102.
\hskip2mm Muestra D = Enzimas liofilizadas en 0,2% de TRITON® X-102.
\hskip2mm Muestra E = Enzimas liofilizadas en 0,5% de TRITON® X-102.

Estos resultados demuestran que un detergente no iónico como p. ej., el TRITON® X-102 puede prevenir con efectividad la formación de un precipitado de proteína después de la diálisis de MMLV-RT o de la ARN polimerasa de T7. Los resultados muestran también que el TRITON® X-102 no tiene un efecto perjudicial después de la amplificación del ácido nucleico diana, y puede incluso actuar para mejorar la estabilidad de las actividades de la enzima con el tiempo cuando las enzimas liofilizadas se almacenen a elevadas temperaturas. El detergente no ocasiona un aumento del fondo luminiscente en este ensayo. Estos resultados demuestran también que incluso la muestra liofilizada en ausencia de detergente (muestra B) permanece aproximadamente en forma activa como las enzimas no liofilizadas. Los resultados indican además que cuando la preparación de enzima liofilizada se almacena a elevada temperatura durante un prolongado período de tiempo, la preparación de enzima liofilizada no experimenta ninguna disminución detectable de la actividad.

Será evidente para una persona experta en la técnica que estos resultados sugieren inmediatamente que pueden investigarse fácilmente otros detergentes no iónicos tales como, sin limitar a, detergentes de la serie BRIJ, la serie TWEEN, otros detergentes de la serie TRITON, y la serie TERGITOL, como se ha indicado más arriba para detectar su capacidad para mantener las proteínas secas en un estado soluble durante la liofilización sin tener un efecto adverso sobre la actividad de la enzima.

Ejemplo 2 Co-liofilización de la transcriptasa inversa y la ARN polimerasa con los reactivos de la amplificación

Se mantuvieron preparaciones de las enzimas transcriptasa inversa del virus Moloney de la leucemia del ratón, y la ARN polimerasa de T7, a -20ºC en un tampón de almacenamiento que contenía 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M de NaCl, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 0,01% (v/v) de NP®-40 o 0,1% (v/v) de TRITON® X-100 y 50% (v/v) de glicerina antes del secado.

En la preparación para la liofilización, se combinaron 3 x 10^{6} unidades de MMLV RT y 1,3 x 10^{6} unidades de polimerasa de T7 (2,5 ml de cada preparación), y se dializaron frente por lo menos a 50 volúmenes de un tampón que contenía 20 mM de HEPES (pH 7,5), 5 mM de NALC, 0,1 mM de EDTA, 0,1 mM de acetato de zinc, 0,2% (v/v) de TRITON® X-102, y 0,2 M de trehalosa empleando membranas de diálisis con una separación de pesos moleculares de 12.000 daltons a 2-8ºC con tres cambios del mismo volumen de tampón durante por lo menos 8 horas entre cada cambio de tampón.

Veinte mililitros de la preparación de enzima dializada, se combinaron con 60 ml de un reactivo de amplificación que contenía 10,0 mM de espermidina, 250 mM de imidazol/150 mM de ácido glutámico (pH 6,8), 99 mM de NALC, 12,5% (p/v) de PAP, 12,5 mM de cada rCTP y rUTP, 31,2 mM de cada rATP y rGTP, y 10,0 mM de cada dCTP, dGTP, dATP y dTTP (ratio de volumen 6:2). Experimentos adicionales han mostrado que los reactivos pueden combinarse en un ratio de volumen 7:1 (reactivo de amplificación para la preparación de la enzima) sin resultados significativamente diferentes. Teóricamente, la preparación de la enzima dializada y el reactivo de amplificación pueden combinarse en proporciones iguales; la determinación de un ratio apropiado de reactivo de amplificación respecto a la enzima está dentro de la capacidad del experto en la técnica.

La composición final de la formulación, enzima combinada: reactivo de amplificación, antes de la liofilización fue de: 2,7 x 10^{6} unidades de MMLVRT y 1,2 x 10^{6} de polimerasa de T7, 6 x 10^{6} unidades de cada enzima, 5,0 mM de HEPES (pH 6,8 a 7,0), 0,025 mM de EDTA, 0,025 mM de acetato de zinc, 10,0 mM de espermidina, 187,5 mM de imidazol, 112,5 mM de ácido glutámico, 75,6 mM de NALC, 0,05% (v/v) de TRITON® X-102, 9,4% (p/v) de PAP (peso molecular medio 40.000 daltons), 0,05 M de trehalosa, 9,4 mM de cada rCTP y rUTP, 23,4 mM de cada rATP y rGTP y 7,5 mM de cada dCTP, dGTP, dATP y dTTP.

Ochocientos microlitros de la preparación, enzima combinada : reactivo de amplificación, (a partir de ahora, reactivo de enzima:amplificación), se colocaron en cada vial de vidrio individual para la liofilización (aproximadamente 39.000 unidades del total de enzimas por vial). La liofilización se efectuó como en el ejemplo 1. Después de la liofilización los viales se trataron a continuación como se indica en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 3 Ensayo de la actividad de amplificación del reactivo liofilizado

Preparaciones liofilizadas recién preparadas de transcriptasa inversa, ARN polimerasa y reactivo de amplificación, se incubaron a 25ºC, 35ºC y 45ºC con diferentes tiempos oscilando de 3 a 61 días. Todos los viales se prepararon idénticamente a partir de la misma preparación. En los tiempos indicados los viales que contenían los reactivos liofilizados se retiraron de las temperaturas elevadas y se almacenaron a -30ºC hasta que las últimas muestras fueron recogidas. Las muestras que representaban el tiempo "cero" para cada temperatura, se almacenaron a -30ºC durante todo el período de tiempo experimental.

Cuando se hubieron recogido los viales del último período de tiempo, se rehidrataron todas las muestras con 1,5 ml de reactivo de reconstitución (0,01% (v/v) de TRITON® X-102, 41,6 mM de MgCl_{2}, 1 mM de ZnC_{2}H_{3}O_{2}, 10% (v/v) de glicerina, 0,3% (v/v) de etanol, 0,02% (p/v) de metil parabenzoato, y 0,01% (p/v) de propil parabenzoato) y se ensayaron los contenidos de cada vial para determinar la capacidad de ocasionar la amplificación del ácido nucleico.

La actividad en un sistema modelo de amplificación se midió de la siguiente manera en este ejemplo. Cada mezcla de reacción de amplificación contenía 500 copias de un fragmento de restricción de ADN de doble cadena de un plásmido que contenía parte del genoma del virus de la hepatitis B como ácido nucleico diana (un plásmido PUC que contenía un fragmento de 2,6 kb del genoma del virus de la hepatitis B). El ADN diana se diluyó en 20 \mul de agua o bien de suero humano. Se hicieron controles negativos de la misma manera, pero sin el ADN diana. Este se añadió a 20 \mul de una solución del cebador 2X; la composición final de esta solución fue de 0,1N de KOH. 17,5 mM de EGTA, 25 mM de imidazol, 25 mM de ácido glutámico, 0,025% (p/v) de rojo de fenol, y 0,3 \muM de cada uno de los dos cebadores en un volumen total de 40 \mul. El primer cebador (sentido (-)) consistía en una secuencia 3' de nucleótidos de unión a la diana, secuencia complementaria a la cadena de sentido (+) del ADN diana, y una región 5' no complementaria situada más abajo a partir de una región no complementaria que tenía la secuencia de nucleótidos del promotor para la ARN polimerasa de T7. El segundo cebador (sentido (+)) tenía un secuencia de nucleótidos que consistía en una región de unión a la diana, región complementaria a la otra cadena del ADN (sentido (-)).

Cada mezcla de reacción de 40 \mul se incubó aproximadamente a 95ºC para desnaturalizar el ADN diana de doble cadena. La reacción se enfrió a continuación a temperatura ambiente durante 5 minutos y se neutralizó con 10 \mul de un tampón que contenía 330 mM de imidazol y 200 mM de ácido glutámico. En caso de que el ácido nucleico diana fuera de ARN en lugar de ADN, este paso de desnaturalización no sería necesario.

Cincuenta microlitros de cada enzima reconstituida: se añadió reactivo de amplificación a 50 \mul de la mezcla desnaturalizada de la mezcla de reacción de ADN neutralizado, el cual se incubó a continuación a 37ºC durante 3 horas. Cada reacción se terminó mediante la adición de 20 \mul (40 unidades) de ADNasa I exenta de ARNasa.

La amplificación relativa de cada enzima reconstituida : reactivo de amplificación, se determinó empleando el ensayo de protección homogénea (HPA) descrito en Arnold & Nelson, patente U.S. nº 5.283.174; los expertos en la técnica deben comprender que pueden emplearse otros métodos de ensayo empleando diferentes medios de detección, tales como marcas radioactivas. A cada reacción de amplificación se añadieron 100 \mul de una solución de 10 mM de succinato de litio (pH 5,0), 2% (p/v) de laurilsulfato de litio, 1 mM de ácido mercaptoetansulfónico, 0,3% (p/v) de PAP-40, 230 mM de LiOH, 1,2 M de LiCl, 20 mM de EGTA, 20 mM de EDTA, 100 mM de ácido succínico (pH 4,7) y 15 mM de disulfuro de 2,2'-dipiridilo conteniendo aproximadamente 75 femtomoles (fmoles) de una sonda oligonucleótido marcada con éster de acridinio (sentido (+)) diseñada para ser complementaria a los amplicones de ARN amplificado. Cada tubo se mezcló, se incubó a 60ºC durante 20 minutos, y a continuación se dejó enfriar. A cada mezcla de reacción se añadieron 300 \mul de una solución que contenía 0,6 M de borato de sodio (pH 8,5), 1% (v/v) de TRITON® X-100 y 182 mM de NaOH y se incubó durante 6 minutos a 60ºC para destruir la marca no asociada con la sonda de hibridación.

Las mezclas de reacción se enfriaron durante 5 minutos, y la quimioluminiscencia remanente se midió en un luminómetro (LEADER® Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) después de una inyección automática de 200 \mul 0,1% (v/v) de H_{2}O_{2}, 0,1 mM de ácido nítrico, seguido inmediatamente por una inyección de 1,0 N de NaOH. La cantidad de luz subsiguientemente emitida, se expresa en unidades de luz relativa (RLU). En estas condiciones, el nivel de fondo de la emisión de luz osciló desde aproximadamente 2000 a 4000 RLU.

Los resultados se registraron y tabularon para cada temperatura de almacenado (25ºC, 35ºC y 45ºC) como se indica más adelante. Cada muestra se ensayó por triplicado y se calculó la media. Esta media se empleó para indicar en una gráfica los datos para cada temperatura. La figura 1 corresponde a la tabla 3, la figura 2 a la tabla 4 y la figura 3 a la tabla 5.

TABLA 3

Estabilidad de la enzima liofilizada : reactivo de amplificación. Temperatura de almacenamiento 25ºC
Días de almacenamiento	0	11	16	20	30	40	61
Reactivos sin ADN diana	2053	1911	1524	2188	1851	1548	1972
(RLU)	2130	1590	1561	1990	1847	1726	1655
	2148	1752	2037	1606	1923	2382	1538
RLU media	2110	1751	1707	1928	1874	1885	1722
Reactivos con ADN diana	1562029	2105440	1248988	2129935	1927067	1417883	1486111
(RLU)	1756224	1903081	1509929	2363198	1422699	1601071	1290950
	1070164	1492458	1944566	1922529	1274124	1889588	1210344
RLU media	1462806	1833659	1567828	2138554	1541297	1636181	1329135
Reactivos en suero humano,	8437	2904	2660	3044	2919	2465	2946
ningún ADN diana (RLU)	3902	2893	2993	3152	2971	3089	3473
	3534	3003	2768	2951	2379	2958	3686
RLU media	5291	2933	2807	3049	2756	2837	3368
Reactivos en suero humano,	1955525	2282336	2282171	1760428	2034705	1936366	1643624
con ADN diana (RLU)	2255411	2204415	1860043	1992765	2101999	1770109	1762360
	2282281	2206778	1903519	2093235	2064041	1811820	1622750
RLU media	2164406	2231176	2015244	1948809	2066915	1839432	1676245

TABLA 4

Estabilidad de la enzima liofilizada/reactivo de amplificación. Temperatura almacenamiento 35ºC
Días de almacenamiento	0	3	9	16	21	50	61
	2429	17989	1768	1878	2378	1430	1559
Reactivos sin ADN diana (RLU)	2203	1775	1649	1919	2330	1411	1566
	1996	1891	1840	2043	1995	1338	1692
RLU media	2209	7218	1752	1947	2234	1393	1606
reactivos con ADN diana (RLU)	1173260	2310573	2186899	1559681	1876363	1458120	1366068
	1580018	2136598	2119044	1385165	1919833	1932847	1443874
	1389614	2303010	1568334	1632416	1979406	1343433	1421081
RLU media	1380964	2251060	1958092	1525754	1925201	1578133	1410341
Reactivos sin ADN diana (RLU)	4819	3298	3608	3575	2912	3074	3836
	4779	9577	3200	3535	3422	3044	4160
	24541	3349	3114	3712	3151	3027	3901
RLU media	11380	5408	3307	3607	3162	3048	3966
Reactivos en suero humano,	1946881	2228745	2233566	2087936	1984355	2255784	1873070
con ADN diana (RLU)	2158003	2289829	2303812	2163922	2192597	2147927	1789954
	2110796	2286956	2179206	2152655	2121658	2087549	2049762
RLU media	2071893	2268510	2238861	2134838	2099537	2163753	1904262

TABLA 5

Estabilidad de la enzima liofilizada/reactivo de amplificación. Temperatura de almacenamiento 45ºC
Días de almacenamiento	0	6	11	16	33
	2508	1613	1687	2626	1594
Reactivos sin ADN diana (RLU)	2250	1872	1781	2027	1596
	2159	1903	2206	2056	1661
RLU media	2306	1796	1891	2236	1617
Reactivos con ADN diana (RLU)	1431296	1097084	975001	1320113	1017853
	1329706	949892	758705	939417	1368153
	1288191	798877	1242188	972442	1015174
RLU media	1349731	948618	991965	1077324	1133727
Reactivos en suero humano,	3554	3375	3011	3068	3183
ningún ADN diana (RLU)	3109	4452	3119	3559	3115
	4239	2960	3382	3381	2826
RLU media	3634	3596	3171	3336	3041
Reactivos en suero humano,	1663770	1850263	1691590	1691372	1615426
con ADN diana (RLU)	1677985	1868747	1684565	1709387	1913706
	1747637	2016609	1646303	1765393	1799445
	1696464	1911873	1674153	1722051	1776192

Estos datos muestran que la enzima co-liofilizada : reactivo de amplificación, preparada de acuerdo con el método aquí descrito conserva las cuatro actividades enzimáticas (ADN polimerasa inducida por ARN, ADN polimerasa inducida por ADN, ARNasa H, y ARN polimerasa, necesarias para lograr la amplificación del ácido nucleico de acuerdo con el método empleado de amplificación inducido por transcripción. Adicionalmente, los datos indican que no existe ningún efecto perjudicial digno de mención sobre los nucleótido trifosfatos o cualquier otro componente del reactivo de amplificación cuando el reactivo se co-liofiliza con transcriptasa inversa y ARN polimerasa.

Estos resultados muestran también que las actividades enzimáticas de la transcriptasa inversa y las actividades enzimáticas de la ARN polimerasa no se inhiben significativamente cuando la reacción de amplificación se efectúa en presencia de una muestra de complejo biológico, tal como el suero humano. Por lo tanto el reactivo de amplificación liofilizado parece ser adecuado para emplear conjuntamente con muestras tales como las que se obtienen en el marco del diagnóstico clínico.

Los datos pueden ser interpretados de varias maneras; una de los medios más útiles de interpretación utiliza una forma de la ecuación de Arrhenius para predecir la estabilidad de la composición en un tiempo incluso mayor que el realmente ensayado. La ecuación de Arrhenius se usa habitualmente por los expertos en la técnica para predecir las velocidades de las reacciones químicas y la estabilidad de varios compuestos termolábiles en función de la temperatura.

Como se utiliza en la presente, la ecuación de Arrhenius presupone una reacción de primer orden de la inactivación de la enzima (o reactivo), en la que una enzima o reactivo activos tienen una velocidad única de inactivación a una temperatura dada y un mecanismo único de inactivación a todas las temperaturas ensayadas. La ecuación utilizada por la solicitante es:

ln (k_{2}/k_{1}) = (-E_{a}/R) ((T_{2}-T_{1})/(T_{2} x T_{1}))

en donde k_{2} es igual a la constante de velocidad a la temperatura experimental (ºK), k_{1} es igual a la constante de velocidad para la reacción a la temperatura de referencia, E_{a} es igual a la energía de activación de la reacción, R es igual a la constante gaseosa (1,987 cal/ºK-moles), T_{1} es igual a la temperatura de referencia (p. ej., 298,16ºK (25ºC)), y T_{2} es igual a la temperatura experimental (expresada en ºK).

Si se supone que E_{a} es 15.000 cal/mol y las temperaturas de referencia y experimental son conocidas, entonces puede determinarse un ratio de las constantes de velocidad k_{2}/k_{1}. En el caso sencillo de que tanto las temperaturas de referencia como la experimental son 25ºC, el ratio de estas constantes es 1 ya que las constantes son idénticas. Si la temperatura experimental es de 35ºC y la temperatura de referencia es de 25ºC, el ratio previsto será de 2,27. Si la temperatura experimental es de 45ºC y la temperatura de referencia es de 25ºC, el ratio previsto será de 4,91. Empleando la misma ecuación, si la temperatura de referencia es de 5ºC y la temperatura experimental es de 45ºC, el ratio es 30,33.

Los ratios de las constantes de velocidad pueden ser considerados como el "ratio de descomposición" del tiempo experimental de almacenamiento con respecto al tiempo normal de almacenamiento, tanto si este tiempo está expresado en horas, como en días, semanas, etc. Por lo tanto si la enzima liofilizada : reactivo de amplificación pierde un 90% de su potencia original en 30 días a 45ºC, la ecuación de Arrhenius predice que a 25ºC serían necesarios 147,3 (30 x 4,91) días para lograr una disminución similar de la actividad.

Así pues, los datos demuestran que los componentes combinados de la preparación liofilizada no pierden de manera digna de tener en cuenta, su capacidad para soportar la amplificación en el "tiempo real", incluso después de 30 días a 45ºC. Además, utilizando la ecuación de Arrhenius los mismos datos predicen que los reactivos no sufrirían una significativa pérdida de actividad si el reactivo liofilizado fuera realmente almacenado durante casi 5 meses a 25ºC o durante 2,5 años (30,33 x 30 días) a 5ºC antes de su empleo.

La solicitante presenta estos métodos de análisis de datos como una ayuda para la comprensión de la presente invención, y no desea ser limitada o unida por consideraciones teóricas. La estabilidad real de las composiciones de la presente invención puede variar de las predicciones de la ecuación de Arrhenius, la cual solo proporciona una guía general para la predicción de la estabilidad de los reactivos liofilizados.

Ejemplo 4 Ensayo de la ARN polimerasa de T7, del reactivo liofilizado

La enzima liofilizada : reactivo de amplificación preparada en el ejemplo 2 se incubó a 35ºC durante 0, 3, 9, 16, 21 y 30 días. Cada uno de estos viales de tiempos puntuales dejó de incubarse a la temperatura indicada y se almacenaron a -30ºC hasta que se recogieron las últimas muestras.

Se midió la actividad de la ARN polimerasa mediante la reconstitución de cada alícuota de reactivo liofilizado en 1,5 ml de tampón de reconstitución (0,01% (v/v) de TRITON® X-100, 41,6 mM de MgCl_{2}, 1 mM de ZnC_{2}H_{3}O_{2}, 10% (v/v) de glicerina, 0,3% (v/v) de etanol, 0,02% (p/v) de parabenzoato de metilo, y 0,01% (p/v) de parabenzoato de propilo). El reactivo se diluyó a continuación a un volumen 100 veces, 200 veces y 400 veces mayor, en una solución que contenía 20 mM de HEPES (pH 7,5), 5 mM de NALC, 0,1 mM de EDTA, 0,1 mM de ZnC_{2}H_{3}O_{2}, 0,1 M de NaCl y 0,2% (v/v) de TRITON® X-102. Se preparó por separado una mezcla previa de reacción formada por 22 mM de MgCl_{2}, 7,8 mM de cada uno de ATP y GTP, 2,5 mM de cada uno de CTP y UTP, 62,5 mM de Tris (pH 7,5), 2,5 mM de espermidina y 0,5 nanomoles de un ácido nucleico diana. La diana fue un plásmido linealizado pUC T7G10 que contenía un promotor T7 posicionado inmediatamente más arriba del gen 10 del bacteriófago T7. Este plásmido se derivó del plásmido pGEMEX-1 (Promega Corporation, Madison, WI).

La mezcla previa de reacción se dividió en alícuotas de 40 \mul, y cada alícuota se incubó durante 3 minutos a 37ºC. Se añadieron diez microlitros de cada dilución de la enzima : reactivo de amplificación a los tubos calentados de la mezcla previa y se incubaron durante 20 minutos a 37ºC. Se añadieron a cada tubo cincuenta microlitros de una solución de 10 mM de succinato de litio, 2% (p/v) de laurilsulfato de litio, 1 mM de ácido mercaptoetansulfónico, 0,3% (p/v) de PAP-40, 230 mM de LiOH, 1,2 M de LiCl, 20 mM de EGTA, 20 mM de EDTA, 100 mM de ácido succínico (pH 4,7) y 15 mM de disulfuro de 2,2'-dipiridilo conteniendo aproximadamente 75 femtomoles de un éster de acridinio marcado en el gen 10 de la sonda oligonucleótido (sentido (-)) diseñado para ser complementario a los productos transcripcionales. En el paso de HPA se incluyó una muestra estándar que contenía 10 femtomoles (fmol) de ADN monocatenario complementario a la sonda del gen 10, para cuantificar la cantidad de ARN producido en las mezclas de reacción experimentales. La hibridación se efectuó esencialmente como en el ejemplo 2, excepto que los volúmenes de hibridación fueron la mitad de grandes. Después de la degradación de la marca sin hibridar, el éster de acridinio remanente se hizo reaccionar y la luz emitida se midió en un luminómetro en unidades RLU.

Los datos brutos se convirtieron en unidades de actividad de ARN polimerasa por \mul como sigue. Las RLU brutas obtenidas para la reacción de control positivo, se restaron de las RLU obtenidas en el control negativo (ningún ADN diana). Esta cifra representa la cantidad neta de luz emitida obtenida cuando 10 fmoles de ARN se encuentran en la muestra, y se expresa como RLU/fmoles de ARN. De manera similar, la RLU obtenida para cada muestra puede restarse de la luminiscencia de fondo (RLU por 20 minutos). Cuando esta cifra se divide por la cifra obtenida para el estándar (RLU por fmol de ARN), el resultado es el número de fmoles de ARN producidos en cada reacción por 20 minutos. Debido a que 1 unidad de actividad de ARN polimerasa se define como la producción de 1 fmol de ARN en 20 minutos bajo las condiciones del ensayo, esta cifra es también el número de unidades de actividad ARN polimerasa en cada 10 \mul de volumen de enzima añadida originalmente.

Los datos obtenidos de estas reacciones se indicaron en primer lugar gráficamente para cada tiempo de almacenamiento a 35ºC expresando los fmoles de ARN producidos como una función del número de microlitros de los originales 1,5 ml reconstituidos enzima : reactivo de amplificación representado en cada tubo experimental. Se describe una función lineal simple. Cuando todos los datos se hubieron trasladado a la gráfica, se trazó la línea de adaptación óptima para los datos obtenidos para cada tiempo puntual; la pendiente de esta curva se expresó como unidades de actividad polimerasa T7 por microlitro. Cuando el tiempo puntual "tiempo cero" se considera como el 100% de actividad, las unidades calculadas de ARN polimerasa T7 para cada tiempo puntual restante se expresan como tanto por ciento de actividad remanente.

La figura 4 es una gráfica del número de unidades de ARN polimerasa T7 por microlitro en la enzima liofili-
zada : reactivo de amplificación como una función del número de días de almacenamiento a 35ºC. Los resultados indican que tiene lugar poca disminución, si es que hay alguna, de la ARN polimerasa T7 durante el período de 30 días de incubación a 35ºC.

Ejemplo 5 Ensayo de la transcriptasa inversa del reactivo liofilizado

Se ensayó la actividad de la transcriptasa inversa MMLV liofilizada incubada durante 3, 9, 16, 21 y 30 días a 35ºC, como sigue: En los tiempos indicados, se retiraron viales individuales sometidos a la temperatura de incubación, y se almacenaron a -30ºC hasta que fueron retiradas las últimas muestras.

Cada vial se reconstituyó en 1,5 ml de tampón de reconstitución y se diluyó a un volumen 100 veces, 200 veces y 400 veces mayor, como en el ejemplo 4. Se preparó una mezcla previa por separado de la transcriptasa inversa que contenía 5 mM de MgCl_{2}, 30 mM de KCl, 0,25 mM de cada dATP, dTTP, dCTP, y dGTP, 62,5 mM de Tris (pH 7,5), 2,5 mM de espermidina, 3,75 nM de ARN diana, y 750 nM de un cebador de amplificación. El ARN diana fue el ARN transcripto del gen 10 de T7, generado en el ejemplo 4. El cebador fue un oligonucleótido de 22 bases de longitud diseñado para hibridar con una región cerca del extremo 3' del ARN diana. Se añadieron diez microlitros de cada una de las diluciones de enzima a 40 \mul de la mezcla previa de reacción sobre hielo. Las reacciones se efectuaron por incubación a 37ºC durante 15 minutos. Cada reacción se terminó con la adición de 50 \mul de una sonda de hibridación marcada con éster de acridinio. La sonda fue diseñada de forma que fuera complementaria al recién sintetizado gen 10 de ADNc.

La detección mediante HPA se efectuó como se ha descrito en el ejemplo 3. Los resultados se midieron en unidades RLU.

Este ensayo midió la actividad de la ADN polimerasa inducida por ARN, y la actividad de la ARNasa H de la transcriptasa inversa MMLV. Esta última actividad se midió indirectamente, dado que sin degradación de la cadena de ARN del híbrido ARN:ADN producido por la extensión del cebador del gen 10, la sonda no sería capaz de hibridar con el ADNc.

Una unidad de estas actividades enzimáticas combinadas se definió como la detección de 1 fmol de ADNc en 15 minutos bajo las condiciones de reacción descritas más arriba. El cálculo de las unidades de actividad de enzima que quedan en cada tiempo puntual y en cada dilución, se efectuó como en el ejemplo 4, empleando 10 fmoles del ADNc amplificado como un estándar.

La figura 5 es una gráfica del número de unidades de actividad RT por microlitro en la enzima liofilizada : reactivo de amplificación, como función del número de días de almacenamiento a 35ºC. Los resultados indican que tiene lugar poca disminución, si es que hay alguna, en la actividad RT durante los 30 días del periodo de incubación a 35ºC.

Ejemplo 6 Co-liofilización de la transcriptasa inversa y la ARN polimerasa con nucleótidos y cebadores

Los ejemplos precedentes han ilustrado la preparación y empleo de un reactivo único que contenía una preparación desecada de ARN polimerasa y transcriptasa inversa conjuntamente con nucleótido trifosfatos y co-factores necesarios para la amplificación del ácido nucleico. Será evidente a una persona experta en la técnica que, dada la capacidad de dicho reactivo de un "vial único" para la amplificación de ácidos nucleicos después de un prolongado almacenamiento a temperatura elevadas, sería fácilmente posible incluir el(los) cebador(es) de la amplificación en la preparación liofilizada de forma que se redujera el número de pasos en los métodos que emplean dicho reactivo, y reducir el número de recipientes en un kit para la amplificación del ácido nucleico de tres recipientes (por ejemplo, enzima liofilizada:reactivo de amplificación, cebadores y reactivo de reconstitución) a dos (por ejemplo, enzima liofilizada/ cebador/reactivo de amplificación y reactivo de reconstitución).

Dicha preparación es de utilidad cuando la reacción de amplificación no utiliza temperaturas que desnaturalizarían una o las dos enzimas, tal como cuando el ácido nucleico diana inicial es ARN y el método de amplificación es isotérmico, por ejemplo como se describe en Kacian & Fultz, PCT publicación nº WO91/01384 o Kacian y col., PCT publicación nº WO93/22461.

Ejemplo 7 Liofilización de la transcriptasa inversa con sacarosa

La solicitante ha descubierto también que la sacarosa (por ejemplo a una concentración de 0,2 M), puede emplearse como agente estabilizante crioprotector en la liofilización de la transcriptasa inversa; el efecto estabilizante de la sacarosa parece ser bueno; comparado con una solución líquida estándar que contenía MMLV-RT y almacenada durante el mismo período de tiempo en 50% (v/v) de glicerina a -20ºC la preparación liofilizada en 0,2 M de sacarosa mantuvo un 93% de la actividad de la preparación MMLV-RT estándar después del almacenamiento del liofilizado durante 30 días a 4ºC. Un liofilizado similarmente tratado que contenía 0,2 M de trehalosa en lugar de sacarosa mostró una media del 105% de la actividad del estándar bajo las mismas condiciones.

(I) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: GEN-PROBE INCORPORATED

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 9880 Campus Point Drive

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: San Diego

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: CA

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAIS: USA

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92121

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES DE ENZIMA ESTABILIZADAS PARA LA AMPLIACIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

FORMA DE LECTURA DEL ORDENADOR

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: Disco flexible

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: Patente liberada # 1.0, versión #1.30 (EPO)

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: NÚMERO DE LA SOLICITUD: EP

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA :

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 48 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA : lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA : NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO : NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO :

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL :

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGAG AAGTGGTCAC GGAGGTAC

\hfill

48

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA :

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 22 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA : lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA : NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO : NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO :

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL :

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CATGACTGGT GGACAGCAAA TG

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA :

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 26 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA : lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA : NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO : NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO :

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL :

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTGCTGGAGA TAAACTGGCG TTGTTC

\hfill

26

Claims (24)

1. Un método para la preparación de una composición estabilizada de enzimas en un único vial, que comprende los pasos de:

a)

preparación de una solución que contiene:

i)

una composición de enzimas activas que comprende una mezcla de una transcriptasa inversa y una ARN polimerasa, y

ii)

un agente estabilizante, el cual consiste en un disacárido no reductor o la polivinilpirrolidona,

b)

congelación de la solución a),

c)

sublimación de una fracción del disolvente de dicha solución congelada mediante la aplicación de un vacío, con lo cual se forma un liofilizado que contiene dicha composición de enzimas activas y dicho agente estabilizante.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho agente estabilizante es la trehalosa.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho disacárido no reductor es la trehalosa.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho agente estabilizante es la polivinilpirrolidona.

5. El método de la reivindicación 1, en donde dicha solución comprende también desoxirribonucleótido trifosfatos, ribonucleótido trifosfatos, sales metálicas y cofactores suficientes para permitir tanto la polimerización del ADN como la transcripción del ARN en una única solución cuando dicho liofilizado se reconstituye y combina con substratos apropiados de ácido nucleico y reactantes.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicha solución comprende además por lo menos un cebador de amplificación oligonucleótido.

7. El método de la reivindicación 5, en donde dicha composición de enzimas conserva por lo menos el 70% de su capacidad para amplificar un ácido nucleico diana cuando dicho liofilizado se almacena a temperatura ambiente durante dos meses.

8. El método de la reivindicación 5, en donde dicha composición de enzimas conserva por lo menos el 70% de su capacidad de amplificación de un ácido nucleico diana cuando dicho liofilizado se almacena a 35ºC durante dos meses.

9. El método de la reivindicación 5, en donde dicha composición de enzimas conserva por lo menos el 70% de su capacidad de amplificación de un ácido nucleico diana cuando dicho liofilizado se almacena a 45ºC durante dos meses.

10. El método de la reivindicación 5, en donde dicha composición de enzimas conserva por lo menos el 70% de su capacidad de amplificación de un ácido nucleico diana cuando dicho liofilizado se almacena a 55ºC durante dos meses.

11. Una composición producida mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

12. Una composición para la amplificación de un ácido nucleico diana, la cual contiene un único liofilizado, que tiene:

a)

una cantidad efectiva de una actividad ADN polimerasa inducida por ARN, una actividad ADN polimerasa inducida por ADN, una actividad ARNasa H, y una actividad ARN polimerasa inducida por ADN, en donde la actividad ADN polimerasa inducida por ARN, la actividad ADN polimerasa inducida por ADN y la actividad ARNasa H, están proporcionadas por una o más enzimas separadas,

b)

un agente estabilizante que consiste en un disacárido no reductor, o bien en una polivinilpirrolidona,

c)

desoxirribonucleótido trifosfatos y ribonucleótido trifosfatos,

d)

sales metálicas, y

e)

un agente reductor, en donde dicho liofilizado se reconstituye mediante la adición de un disolvente acuoso, la solución resultante amplificará una molécula monocatenaria de ARN que contiene una región secuencia de nucleótidos diana después de la adición a la solución, de dicha molécula de ARN y uno o más cebadores oligonucleótidos adecuados e incubando la solución a una temperatura suficiente para inducir dichas actividades enzimáticas.

13. La composición de la reivindicación 12 en donde dicho cebador o más de un cebador, adecuados, están contenidos en el liofilizado.

14. La composición de la reivindicación 13, que contiene además:

f)

un tampón, con la condición de que dicha composición no contenga un ácido carboxílico.

15. La composición de la reivindicación 12 ó 13, en donde dicha actividad ADN polimerasa inducida por ARN, la actividad ADN polimerasa inducida por ADN, y la actividad ARNasa H están proporcionadas por una transcriptasa inversa retroviral recombinante, y la actividad ARN polimerasa inducida por ADN está proporcionada por una ARN polimerasa de bacteriófago.

16. La composición de la reivindicación 15, en donde dicha transcriptasa inversa deriva del virus Moloney de la leucemia del ratón.

17. La composición de la reivindicación 15, en donde dicha ARN polimerasa deriva del bacteriófago T7.

18. La composición de la reivindicación 15, en donde dicho agente estabilizante es la polivinil pirrolidona.

19. La composición de la reivindicación 14, en donde dicho agente estabilizante es la trehalosa.

20. Un kit para la amplificación de un ácido nucleico, que contiene una transcriptasa inversa y una ARN polimerasa combinadas en una única formulación liofilizada juntamente con un agente estabilizante crioprotector que consiste en un disacárido no reductor, o bien en una polivinilpirrolidona, en donde después de la rehidratación de dicha formulación liofilizada y la adición del ácido nucleico diana en presencia de cebadores oligonucleótidos, se amplifican algunos o todos los ácido nucleicos diana.

21. El kit de la reivindicación 20, en donde dicha formulación liofilizada comprende además, sales metálicas y nucleótido trifosfatos.

22. El kit de la reivindicación 21, que comprende además por lo menos un cebador oligonucleótido de amplificación.

23. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde dicho agente estabilizante es la trehalosa.

24. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde dicho agente estabilizante es la polivinilpirrolidona.