DE69628959T2

DE69628959T2 - Stabilisierte Zusammensetzungen von Reverser Transkriptase und RNA Polymerase für Nukleinsäureamplifikation

Info

Publication number: DE69628959T2
Application number: DE69628959T
Authority: DE
Inventors: Nancy Lau Liu San Diego SHEN; Daniel Louis San Diego Kacian; James Garfield San Diego Putnam; William Michael San Diego DAVIS
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2016-02-10
Also published as: AU699590B2; ATE244759T1; ES2202387T3; AU4916796A; US5614387A; EP0726310A1; US5556771A; WO1996024664A1; JP3282819B2; EP0726310B1; KR19980702110A; DE69628959D1; US5834254A; CA2210584A1; JPH10503383A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Gebiete Molekularbiologie, Nukleinsäureamplifikation und stabilisierte biologische Zusammensetzungen im Allgemeinen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine stabile lyophilisierte Enzymzusammensetzung, die ein oder mehrere Nukleinsäurepolymerasen enthält.
Hintergrund der Erfindung
Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) sind große lineare Makromoleküle, die aus kovalent verknüpften Nukleotiduntereinheiten zusammengesetzt sind. Die DNA liegt gewöhnlich in einer „doppelsträngigen" Form vor, in welcher die zwei DNA-Ketten durch Wasserstoffbindung in einer antiparallelen Weise assoziiert sind. RNA existiert in der Natur gewöhnlich als eine einzelne Polynukleotidkette. Nukleotide sind Moleküle mit einem Zucker- (Desoxyribose oder Ribose) und einem stickstoffenthaltenden Basenbestandteil und sind miteinander in Nukleinsäuren gewöhnlich durch eine Phosphodiesterverknüpfung verbunden. Es gibt fünf gängige stickstoffenthaltende Basen. Drei werden sowohl in der DNA als auch in der RNA gefunden. Dies sind Adenin (A), Guanin (G) und Cytosin (C). Die anderen zwei, Thymin (T) und Urazil (U) sind für die DNA und die RNA jeweils spezifisch.
Die meiste (wenn nicht die gesamte) genetische Information eines jeden Organismus wird von einer Generation zur nächsten in der Form von DNA oder RNA übertragen. Diese Information wird in der Sequenz der Nukleotide entlang einer einzelnen Nukleinsäurekette oder „Stranges" übermittelt, welche einen genetischen Code darstellt. Zudem hat jede der stickstoffenthaltenden Basen eines Nukleinsäurestranges die Fähigkeit zum spezifischen Wasserstoffbinden an eine oder mehrere andere stickstoffenthaltende Basen des gleichen oder eines verschiedenen Nukleinsäurestranges. Unter gewöhnlichen Umständen wasserstoffbindet somit A mit T (oder U) und C wasserstoffbindet mit G. Diese spezifische Wasserstoffbindung wird Basenpaarung genannt. Jeder der zwei Stränge in der doppelsträngigen DNA besteht aus einer Kette von Nukleotiden, in welcher die meisten oder alle der Nukleotide mit Nukleotiden des anderen Stranges basengepaart sind. In solch einem Fall bestimmt die Abfolge der Nukleotide auf einem DNA-Strang die Abfolge der Nukleotide auf dem anderen DNA-Strang. Es wird davon gesprochen, dass zwei Nukleinsäurestränge, welche „Spiegelbilder" des jeweils anderen sind, in dieser Weise vollkommen komplementär sind.
Nukleinsäuren werden in vivo durch einen Mechanismus synthetisiert, der die Tatsache ausnutzt, dass jeder Nukleinsäurestrang die Abfolge der Nukleotide eines vollkommen komplementären Stranges bestimmt. Dies trifft unabhängig davon zu, ob die gewünschte Nukleinsäure RNA oder DNA ist und ist unabhängig davon, ob die Nukleinsäure, die als eine Matrize verwendet wird, RNA oder DNA ist. Die meisten der spezifischen Mechanismen für die DNA Replikation beinhalten die Verwendung einer DNA Polymerase zum schrittweisen Hinzufügen der Nukleotide an eine 3' Hydroxylgruppe eines an den Matrizennukleinsäurestrang wasserstoffgebundenen Polynukleotidprimers. Die neu hinzugefügten Nukleotide werden durch die DNA Polymerase auf der Basis ihrer Fähigkeit zum Basenpaaren mit dem korrespondierenden Nukleotid des Matrizenstranges ausgewählt. Dieser Vorgang des Hinzufügens der Nukleotide an ein Ende eines Primers wird manchmal Primerextension genannt.
Im Unterschied zur DNA Synthese erfordert die RNA Synthese normalerweise nicht das Vorliegen eines Polynukleotidprimers. Vielmehr wird die RNA Synthese gewöhnlich durch eine RNA Polymerase vermittelt, welche ein oder mehrere spezifische Nukleotidsequenzen einer Nukleinsäurematrize erkennt. Die Region der Matrize, an welche die RNA Polymerase bindet, die als Promoter bezeichnet wird, ist gewöhnlich doppelsträngig. Nach dem Binden an den Promoter „liest" die RNA Polymerase den Matrizenstrang ab und synthetisiert einen kovalent verknüpften Polyribonukleotidstrang, der zur Matrize komplementär ist. RNA Polymerasen aus unterschiedlichen Organismen erkennen bevorzugt unterschiedliche Promotersequenzen.
DNA und RNA Polymeraseenzyme wurden aus einer Reihe diverser Organismen gereinigt. Einige dieser Enzyme, wie z. B. die E. coli DNA Polymerase I, das Klenow Fragment der DNA Polymerase I und verschiedene RNR Polymerasen werden gewöhnlich in vitro als Werkzeuge in der Molekularbiologie und der Erforschung der Biochemie von Nukleinsäuren verwendet; siehe im Allgemeinen z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, 1989).
Eine andere Verwendung für Nukleinsäurepolymerasen hat sich mit dem Aufkommen verschiedener Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation ergeben, wie z. B. der Polymerasekettenreaktion (PCR); siehe z. B. Mullis et al., US Patente Nrn. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159. In der einfachsten Form der PCR werden zwei Oligonukleotidprimer synthetisiert, wobei jeder Primer gegenüber einem Abschnitt einer Zielnukleinsäure komplementär ist, der sich in Bezug auf die Zielnukleinsäure einer Zielnukleotidsequenzregion an der 3' Stelle befindet. Jeder Primer ist zu einem oder beiden komplementären Nukleinsäuresträngen komplementär. Die Zielregion umfasst eine Nukleotidsegenzregion, die zwei Nukleinsäurestränge einer doppelsträngigen Zielnukleinsäure umfasst. Sofern diesen Primern gestattet wird, Wasserstoffbindungen mit dem Substrat einzugehen („zu hybridisieren") und eine DNA Polymerase zusammen mit Nukleotidtriphosphaten zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt wird, wird jeder hybridisierte Primer durch das Enzym in einer 5' → 3' Richtung verlängert. Das Reaktionsgemisch wird anschließend zum Aufschmelzen des Primerverlängerungsprodukt/Matrizen-Hybrids erhitzt. Die Temperatur wird erniedrigt, um eine weitere Runde der Primer/Ziel-Hybridisierung zu gestatten und weitere DNA Polymerase wird hinzugefügt, um die durch den Hochtemperaturschritt inaktivierte DNA Polymerase zu ersetzen. Durch das Wiederholen des Vorganges über eine gewünschte Anzahl von Zyklen wird die Menge der Nukleinsäuren mit der Zielnukleotidsequenz exponentiell gesteigert. Vor kurzem wurde eine thermostabile DNA Polymerase, die aus Thermus aquaticus stammt, erfolgreich im PCR Verfahren eingesetzt, um das Erfordernis der wiederholten Zugabe großer Mengen des teuren Enzyms abzumildern. Die Taq Polymerase widersteht der Inaktivierung bei 90–95°C und vermeidet somit die Notwendigkeit des wiederholten Hinzufügens des Enzyms nach jeder Runde der Strangauftrennung. Andere Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation wurden entwickelt, wie z. B. jene, die die RNA Transkription als einen Schritt im Amplifikationsvorgang verwenden. Ein solches Verfahren funktioniert durch Einbauen einer Promotersequenz in einem der Primer, die in der PCR Reaktion verwendet werden und anschließend, nach der Amplifikation durch das PCR Verfahren, durch die Verwendung der doppelsträngigen DNA als eine Matrize für die Transkription der einzelsträngigen RNA durch eine DNA-gerichtete RNA Polymerase; siehe z. B. Murakawa et al., DNA 7: 287–295 (1988).
Andere Amplifikationsverfahren verwenden multiple Zyklen der RNA-gerichteten DNA Synthese und Transkription zum Amplifizieren der Ziel-DNA oder der Ziel-RNA; siehe z. B. Burg et al., WO 8911050; Gingeras et al., WO 88/10315 (teilweise als, System der Transkriptionsamplifikation oder TAS bezeichnet); Kacian und Fultz, EPO Veröffentlichung Nr. EPO 408,295 (welche sich der gleichen Eigentümerschaft wie die vorliegende Anmeldung erfreut); Davey und Malek, EPO Anmeldung Nr. 88113948.9; Malek et al., WO91/02818. Diese Verfahren machen Gebrauch von einem Enzym, der reversen Transkriptase (RT), welche RNA oder DNA als eine Matrize für die Synthese eines komplementären DNA-Stranges verwenden kann. Einige dieser Verfahren benutzen zudem die RNAse H Aktivität als eine notwendige Komponente. Die meisten retroviralen reversen Transkriptasen, wie z. B. jene, die durch den Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) und den Avian Myeloblastosis Virus (AMV) kodiert werden, besitzen eine RNA-gerichtete DNA Polymerase, eine DNA-gerichtete DNA Polymerase Aktivität als auch eine RNAse H Aktivität. Die RNAse H Aktivität baut selektiv den RNA-Strang eines RNA : DNA Hybridnukleinsäuremoleküls ab, was somit der Amplifikationsreaktion gestattet, ohne die Notwendigkeit einer Temperaturzyklisierung voranzuschreiten.
Die Nukleinsäureamplifikation ist ein zunehmend beliebtes Mittel zur spezifischen Identifikation und/oder Amplifikation einzelner oder charakteristischer Nukleinsäuresegmente in einer Reihe von Szenarien. Die Nukleinsäureamplifikation wird demnach in der Nahrungsmittel- und in der landwirtschaftlichen Untersuchung, in der medizinischen Diagnose, in der genetischen Untersuchung des Menschen und zur Beratung, in der Archäologie und in der kriminologischen Forensik eingesetzt. Da alle diese Verfahren Enzyme benutzen, kam Verfahren zum Herstellen, Verpacken, Transportieren und Lagern großer Mengen der hochaktiven Enzyme bei der Herstellung, dem Vertrieb und dem Verkauf der Enzyme und der Kits für die Nukleinsäureamplifikation eine kritische Bedeutung zu. Für die Verfahren unter Verwendung der transkriptionsbasierten Amplifikation sind wirtschaftlich vernünftige Verfahren und Präparationen zum Lagern der aktiven Präparationen der reversen Transkriptase und der RNA Polymerase für die erfolgreiche Herstellung und den Vertrieb der Kits für die Nukleinsäureamplifikation notwendig.
Das übliche Verfahren zum Stabilisieren der reversen Transkriptase und von RNA Polymeraseenzymen (als auch vieler weiterer Enzyme, die in der molekularbiologischen Forschung verwendet werden) besteht in der Lagerung einer flüssigen Präparation jedes Enzyms in einer Lösung, die 50% (v/v) Glyzerol und ein reduzierendes Agens, wie z. B. Dithiothreitol (DTT) oder β-Mercaptoethanol (βME) enthält, bei –20°C. Dieses Verfahren konserviert die Aktivität der Enzyme für viele Monate bei geringem Verlust der Aktivität. Im Gegensatz dazu gehen die Enzymaktivitäten leicht verloren, wenn die Enzyme bei Raumtemperatur oder bei 4°C gelagert werden. Diese Präparationen werden von einem Enzymvertreiber im Allgemeinen in Trockeneis zum Endverbraucher versendet. Verluste von 30% oder mehr der Enzymaktivität sind bei derartigen Transporte wegen des Einfrierens und Auftauens der Enzympräparation üblich. Diese Enzyme werden getrennt formuliert und vertrieben.
Ein Verfahren zum Einlagern und Versenden der reversen Transkriptase und der RNA Polymerase ohne die Notwendigkeit des Kühlens würde die Notwendigkeit des gekühlten Transportes und/oder Verfahren zur Lagerung in der Kälte, wie z. B. Trockeneis, Feuchtpackungen, Trockenpackungen oder Styropurschaumstoff-Versandcontainer vermeiden. Solche Verfahren würden zudem kostengünstiger sein, da die Fertigungsgemeinkosten, die mit diesem Verfahren zum Bewahren der Enzymaktivität verbunden sind, unnötig werden würden. Die Verfahren zum Lagern der Enzyme, die der Enzympräparation gestatten würden, ein begrenztes Ausgesetztsein gegenüber höheren Temperaturen zu tolerieren, würden die Verluste bei der Enzymaktivität vermeiden, welche daraus resultieren könnten, dass sich die Enzympräparation auf einem Verladedock oder in einem Lkw während des Versands befindet. Solch ein Verfahren würde gut reproduzierbar sein. Überdies würde eine derartige Präparation, wenn die Enzyme in einem einzelnen Container in einer Form bereitgestellt werden könnten, die kompatibel zu ihrer gedachten Verwendung ist (wie z. B. in einer Formulierung, die alle oder die meisten der irgendwie notwendigen Kofaktoren und Substrate enthält), wirtschaftlicher herzustellen und angenehmer zu verwenden sein.
Gefriertrocknen (Lyophilisieren) wurde zum Konservieren von Nahrungsmitteln, biologischen Membranen, ganzer Zellen (siehe z. B. American Society for Microbiology, Manual of Methods for General Bacteriology 210–217 (1981)), und biologischer Makromoleküle, einschließlich von Enzymen, verwendet. Die Lyophilisierung beinhaltet die Entfernung von Wasser aus einer gefrorenen Probe durch Sublimieren bei vermindertem Druck. Das Sublimieren ist der Vorgang, durch welchen ein Feststoff verdampft wird, ohne die flüssige Phase zu durchlaufen.
Die theoretischen Aspekte des Lyophilisierens sind komplex. Es ist anzunehmen, dass, wenn eine biologische Substanz, wie z. B. ein Protein in einer wässrigen Lösung vorliegt, das Molekül durch eine Hydratationsschale umgeben ist, die Wassermoleküle umfasst. Diese Hydratationsschale stabilisiert das Protein und hilft, dessen Aktivität zu bewahren. Wenn das Wasser entfernt wird, werden die reaktiven Gruppen des Proteins, welche normalerweise durch die Hydratationsschale maskiert sind, für die Reaktion miteinander frei, wodurch neue, im Wesentlichen irreversible Bindungen ausgebildet werden. Diese Bindungen können die native Konformation des Proteins deformieren. Zudem können neue hydrophobe/hydrophile Wechselwirkungen in der Abwesenheit von Wasser auftreten, welche zudem die Konformation des Proteins deformieren können. Da die dreidimensionale Konformation vielen Proteinen eine biologische Aktivität verleiht, kann die Deformation der Konformation die biologischen Aktivitäten nach dem Trocknen verändern. Durch den gleichen Mechanismus kann ein Kreuzverknüpfen und die Aggregation der Proteine auftreten.
Das Einfrieren der Proteinprobe vor dem Trocknen hilft, das Ausmaß der konformativen Deformation aufgrund des Trocknens zu vermindern. Die reduzierte Ausgangstemperatur hilft, wegen des Entzugs der Energie für die Reaktionspartner, ungewollte Reaktionen zwischen den reaktiven Gruppen der Aminosäuren auf ein Minimum zu beschränken. Während des Vorliegens in einem gefrorenen Zustand besitzt das Protein zur gleichen Zeit, weniger sterische Freiheit, als wenn es in Lösung vorliegt und ist weniger anfällig für eine starke konformative Veränderung.
Die vollständig getrockneten Lyophilisate neigen jedoch dazu, eine kürzere „Regal-" oder Lagerzeit aufzuweisen, als das bei unvollständig getrockneten Lyophilisaten der Fall ist, die noch einen geringen Prozentsatz an Wasser enthalten. Solche unvollständig getrockneten Lyophilisate müssen häufig bei Temperaturen gelagert werden, die nicht höher als etwa 4–10°C sind und sind noch in der Lage, inaktivierende chemische Reaktionen einzugehen, welche nicht möglich sein würden, wäre kein Wasser vorhanden. Während die "Regalzeit" vieler nicht vollständig getrockneter lyophilisierter biologisch aktiver Proteine somit länger ist als jene, welche vollständig getrocknet sind, ist es dennoch erforderlich, die Präparation zu kühlen, um die Aktivität aufrecht zu erhalten. Auch in diesem Fall ergibt sich ein Aktivitätsverlust in derartigen Präparationen über einen relativ kurzen Zeitraum. Überdies werden einige Enzyme, wie z. B. Diphosphofruktokinase, in Gegenwart eines Kälteschutzmittels nach der Lyophilisierung vollständig inaktiviert, unabhängig davon, ob die Präparation vollständig getrocknet ist oder nicht. Siehe z. B. Carpenter et al., Cryobiology 25: 372–376 (1988).
Wie hier verwendet, ist der Ausdruck „Kälteschutzmittel" gedacht, eine Verbindung oder Zusammensetzung wiederzugeben, die dazu neigt, die Aktivität einer biologisch aktiven Substanz während des Einfrierens, Trocknens und/oder der Rekonstitution der getrockneten Substanz zu schützen.
Der Ausdruck „stabilisierendes Agens" hat die Bedeutung eines Agens, welches, wenn es zu einem biologisch aktiven Material hinzugefügt wird, den Verlust der biologischen Aktivität des Materials über die Zeit verhindern oder verzögern wird, im Vergleich wenn das Material in Abwesenheit eines stabilisierenden Agenz gelagert wird.
Eine Vielzahl von Kälteschutzmittelzusätzen wurde für die Verwendung als Arzneimittelträger verwendet oder vorgeschlagen, um zu helfen, die biologische Aktivität zu konservieren, wenn die biologischen Materialien, einschließlich besonderer Proteine, getrocknet werden. Clegg et al., Cryobiology 19: 106–316 (1982) haben die Rolle von Glyzerol und/oder Trehalose bei der Fähigkeit der Zysten der Salzwassergarnele Artemia nach dem Austrocknen lebensfähig zu bleiben, untersucht. Carpenter et al., Cryobiology 24: 455–464 (1987) berichten, dass die Disaccharide Maltose, Saccharose, Laktose und Trehalose eine Rolle bei der Steigerung der Stabilisierung der Aktivität der Phosphofruktokinase in einer gereinigten Enzympräparation spielen können, die der Lufttrocknung unterzogen wurde. Die EPO Veröffentlichung Nr. 0431882 A2 offenbart eine stabilisierte Präparation gereinigter alkalischer Phosphatase, welche derivatisiert wurde und anschließend in der Gegenwart von Mannitol oder Laktose lyophilisiert wurde. Die EPO Veröffentlichung Nr. 0091258 A2 offenbart ein Verfahren zur Stabilisierung des Tumornekrose-Faktors (TNF) durch Lagerung oder Lyophilisierung des gereinigten Proteins in der Gegenwart eines stabilisierenden Proteins, wie z. B. humanes Serumalbumin, Gelatine, humanes γ-Globulin oder Lachs-Protaminsulfat. Das US Patent Nr. 4,451,569 offenbart die Verwendung von Pentosen, Zuckeralkoholen und einigen Disacchariden zur Stabilisierung der Aktivität gereinigter Glutathionperoxidase. Die stabilisierte Zusammensetzung kann gefriergetrocknet sein und anschließend bei Temperaturen unterhalb 20°C gelagert werden. Die EPO Veröffentlichung Nr. 0448146 A1 diskutiert stabilisierte, lyophilisierte Gonadotropin Präparationen, die ein Dicarbonsäuresalz enthalten. Die Präparation kann weiterhin ein Disaccharid enthalten, wie z. B. Saccharose oder Trehalose. Roser, Biopharm., 47–53 (September 1991) diskutiert die Konservierung der biologischen Aktivität verschiedener biologischer Moleküle, die bei Umgebungstemperatur getrocknet wurden, unter Verwendung von Trehalose. Die PCT Veröffentlichung Nr. WO 87/00196 berichtet über die Stabilisierung monoklonaler Antikörper und der alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm durch Lufttrocknung in Gegenwart von Trehalose. Die PCT Veröffentlichungen WO 89/00012 und WO 89/06542 diskutieren die Verwendung von Trehalose zum Konservieren einiger Nahrungsmittel und der Antigenizität lebender Viruspartikel. Die EPA Veröffentlichung 02270799 A1 berichtet über die Stabilisierung von rekombinantem β-Interferon in der Formulierung, die ein stabilisierendes Agens enthält, wie z. B. ein Detergens oder Glyzerol . Die Zusammensetzungen können zudem verschiedene Zucker umfassen, einschließlich Saccharose und Trehalose, Zuckeralkohole und Proteine als auch zusätzliche stabilisierende Agenzien. Am meisten ist Dextrose unter diesen bevorzugt.
Es wurde herausgefunden, dass einige dieser Zusätze die „Regalzeit" eines biologisch aktiven Materials um viele Monate oder mehr verlängern, wenn diese bei Raumtemperatur in einer im Wesentlichen wasserfreien Form gelagert werden. Die Wirksamkeit, die Geeignetheit oder die Überlegenheit eines besonderen potentiellen Zusatzes hängt jedoch von der chemischen Zusammensetzung des biologisch aktiven Materials ab, welches gedacht ist, stabilisiert zu werden. Im Falle eines Proteins können diese Faktoren, ohne darauf beschränkt zu sein, die Aminosäuresequenz des Proteins und seine sekundäre, tertiäre und quartäre Struktur einschließen. Ob eine spezielle Zusammensetzung bei der Konservierung der biologischen Aktivität eines besonderen biologisch aktiven Materials funktionieren wird, kann somit nicht a priori vorhergesagt werden.
Falls ein Protein lyophilisiert wird, sind überdies weitere Faktoren, einschließlich – ohne darauf beschränkt zu sein – die Pufferzusammensetzung, die Geschwindigkeit des Einfrierens, die Menge des negativen Druckes, die Ausgangs-, Betriebs- und Endlyophilisierungstemperaturen und die Dauer des Lyophilisierungsvorganges, für die Bestimmung der Stabilität und der „Regalzeit" des aktiven Proteins bedeutsam.
Es ist bekannt, dass einige Proteine mehrfache enzymatische Aktivitäten aufweisen. Die retroviralen reversen Transkriptaseenzyme, wie z. B. jene, die aus dem Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV-RT) stammen, haben dabei eine DNA-gerichtete DNA Polymerase Aktivität, eine RNA-gerichtete DNA Polymeraseaktivität und eine RNAse H Aktivität. Während diese Aktivitäten in dem gleichen Enzym vorhanden sind, stellen die Bedingungen für die Konservierung einer dieser Aktivitäten in einer getrockneten Präparation nicht sicher, dass eine oder beide der verbleibenden Enzymaktivitäten unter den gleichen Bedingungen gleichfalls konserviert werden.
Falls eine spezielle Anwendung erfordert, dass das Gleichgewicht der relativen spezifischen Aktivitäten der drei Aktivitäten der reversen Transkriptase nach der Rekonstitution gegenüber dem Gleichgewicht dieser Aktivitäten vor dem Trocknen ähnlich erhalten bleiben, wie in dem auf der Transkription basierenden System der Nukleinsäureamplifikation von Kacian & Fultz, supra (welche sich der gemeinsamen Eigentümerschaft mit der vorliegenden Anmeldung erfreut und unter Bezugnahme hier einbezogen wird), kann ein gegebenes Konservierungsverfahren das empfindliche Gleichgewicht dieser enzymatischen Aktivitäten umkippen, wodurch das Enzym für eine derartige Verwendung ungeeignet wird. Der RNA : DNA Initiationskomplex kann somit, wenn die RNAse H Aktivität des Enzyms stärker konserviert ist, als die RNA-gerichtete DNA Polymeraseaktivität, abgebaut werden, bevor die DNA Synthese beginnen kann.
Da eine gegebene Kälteschutzmittelzusammensetzung, die für die Langzeitkonservierung einer gegebenen enzymatischen Aktivität wirksam ist, nicht eindeutig wirksam oder überlegen ist, wenn diese auf eine andere enzymatische Aktivität angewandt wird, erfordern unterschiedliche Enzyme häufig völlig unterschiedliche Schutzmittel für die Aktivitätsstabilisierung. Alle oder die meisten der kommerziell hergestellten lyophilisierten Enzympräparationen enthalten, als ein Ergebnis dessen, nur ein einzelnes, in einer Formulierung getrocknetes Enzym und sind an die Konservierung der Aktivität jenes spezifischen Enzyms angepasst.
WO-A-93/00807 offenbart ein Verfahren zur Stabilisierung von Biomaterialien während der Lyophilisierung, das eine Lösung einschließt, die einen Zucker und ein Polyvinylpyrrolidon als stabilisierende Agenzien und RNA-Polymerase/reverse Transkriptase als individuelle Proteine als Teil der gefrierzutrocknenden Zusammensetzung enthält. Diese Lehre im Stand der Technik macht jedoch keinen Vorschlag, ein Gemisch von RNA Polymerase und reverser Transkriptase oder irgendeine andere Zusammenstellung von Proteinen gemeinsam zu lyophilisieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf Zusammensetzungen und Kits gerichtet, die getrocknete Formulierungen der reversen Transkriptase und der RNA Polymerase umfassen, die in der Lage sind, bei Raumtemperatur über längere Zeitabschnitte ohne erhebliche Verluste der enzymatischen Aktivitäten gelagert zu werden. Diese Formulierungen umfassen vorzugsweise Präparationen der retroviralen reversen Transkriptase und/oder der aus Bakteriophagen abgeleiteten RNA Polymerase. Die Formulierungen umfassen bevorzugter die reverse Transkriptase, die aus dem Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV-RT) stammt und die RNA Polymerase des Bakteriophagen T7 in einem Kälteschutzmittelträger. Noch bevorzugter ist die Erfindung auf einzelne Container gerichtet, die getrocknete Formulierungen umfassen, die sowohl die MMLV-RT als auch die T7 RNA Polymerase in einem oder mehreren Kälteschutzmittelträger enthalten. Am bevorzugtesten ist die Erfindung auf einzelne Container gerichtet, die getrocknete Formulierungen umfassen, die die MMLV-RT und die T7 RNA Polymerase, ein oder mehrere Kälteschutzmittelträger, die entweder Trehalose oder Polyvinylpyrrolidon (PAP) oder beide umfassen, Nukleotidtriphosphate und Metallionen und Kofaktoren, die für die enzymatischen Aktivitäten notwendig sind, umfassen, worin, nach der Rekonstitution des stabilisierten Lyophilisats und der Zugabe einer Zielnukleinsäure und eines oder mehrerer geeigneter Primer, die Formulierung in einer bequemen und kostengünstigen Form für die Nukleinsäureamplifikation ohne die Notwendigkeit einer umfangreichen Behandlung vorliegt. Gegebenenfalls kann eine derartige Formulierung Primer für die Initiation der Nukleinsäuresynthese enthalten. Schließlich ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Erzeugung und zur Verwendung der getrockneten, oben beschriebenen Formulierungen gerichtet.
Die reverse Transkriptase und RNA Polymeraseenzyme sind wichtige Agenzien in den transkriptionsvermittelten Nukleinsäureamplifikationsverfahren, wie z. B. jenen, die in Burg et. al., supra; Gingeras et al., supra, (teilweise als System der Transkriptionsamplifikation oder als TAS bezeichnet); Kacian und Fultz, supra; Davey und Malek, EPO Anmeldung Nr. 88113948.9 und Malek et. al., PCT Veröffentlichung Nr. WO 91/02818) beschrieben werden. Derartige Verfahren werden zunehmend bedeutsam in Bereichen, wie z. B. der forensischen und medizinischen Diagnostik, wo die Stabilität der Amplifikationsreagenzien über die Zeit eine signifikante Rolle bei den Herstellungskosten, dem Vertrieb und der Verwendung der Produkte, bei den die Nukleinsäureamplifikation zum Einsatz kommt, spielt.
Der Anmelder hat ein Verfahren und eine getrocknete Formulierung für die Konservierung der DNA-gerichteten Polymerase, der RNA-gerichteten DNA Polymerase und der RNAse H Aktivitäten der reversen Transkriptase erfunden. Es wurde herausgefunden, dass das gleiche Verfahren und die gleiche Formulierung für die Konservierung der RNA Polymerase Aktivität geeignet sind. Überdies hat der Anmelder überraschenderweise herausgefunden, dass beide Enzyme und alle vier enzymatischen Aktivitäten als eine getrocknete Formulierung in einem einzelnen Container ohne signifikanten Verlust irgendeiner der vier Aktivitäten über einen erheblichen Zeitraum, sogar nach verlängerter Inkubation bei hoher Temperatur, stabilisiert und konserviert werden können.
Ein Aspekt des vorliegenden Verfahrens umfasst das Bereitstellen einer aktiven gereinigten reversen Transkriptase mit einem Kälteschutzmittelträger, der ein nicht reduzierendes Disaccharid (bevorzugt Saccharose oder Trehalose) oder Polyvinylpyrrolidon (PAP) oder eine Menge eines Gemisches dieser Verbindungen umfasst, die wirksam sind, als ein Agens zu agieren, zum Schutz und zur Konservierung der DNA-gerichteten DNA Polymerase, der RNA-gerichteten DNA Polymerase und der RNAse H Aktivitäten der reversen Transkriptase nach dem Trocknen des Enzyms durch Verfahren, wie z. B. – ohne darauf beschränkt zu sein – der Lyophilisierung einer Lösung, die die reverse Transkriptase und das Kälteschutzmittel enthält.
In einem zweiten Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein Verfahren zum Stabilisieren und zum Konservieren der aktiven gereinigten RNA Polymerase, bevorzugt der T7 RNA Polymerase, in einer wasserfreien Form aus, die im Wesentlichen bei Raumtemperatur für mehr als 90 Tage stabil ist. In diesem Aspekt wird die RNA Polymerase in der Gegenwart von Metallsalzen, wie z. B. jenen, die Mg⁺⁺ oder Zn⁺⁺, ein oder mehrere schützende und stabilisierende Agenzien enthalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus nicht reduzierenden Disacchariden, bevorzugt Trehalose und Polyvinylpyrrolidon (PAP) und einem reduzierenden Agens, wie z. B. N-Acetyl-L-Cystein (NALC). Während der Anmelder nicht durch eine Theorie eingeschränkt werden möchte, glaubt er, dass das reduzierende Agens hilft, die Inaktivierung des Enzyms durch Oxidation irgendwelcher Cysteinreste, die in dem Enzym vorliegen, zu verhindern. In diesem Aspekt behält die RNA Polymerase, bevorzugt nach dem Aussetzen der wasserfreien Formulierung einer Temperatur von 45°C für mindestens 30 Tage oder von 35°C für mindestens 61 Tage, mindestens 70% ihrer ursprünglichen Aktivität.
In einem anderen Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine einzelne getrocknete Formulierung aus, die ein Gemisch der reversen Transkriptase (bevorzugt MMLV-RT), der RNA Polymerase (bevorzugt T7 RNA Polymerase), eine Menge eines Kälteschutzmittelträgers (bevorzugt Trehalose und/oder Polyvinylpyrrolidon), die wirksam ist, die enzymatischen Aktivitäten der getrockneten Enzyme zu schützen, Nukleotidtriphosphate, notwendige Kofaktoren, gegebenenfalls Oligonukleotidprimer und ein reduzierendes Agens, bevorzugt eine Thiolverbindung, enthält.
In noch einem anderen Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung eine Komponente eines Kits für die Amplifikation und die spezifische Identifikation von Nukleinsäuren, die zu einer oder mehreren phylogenetischen Gruppierungen von Organismen gehören, z. B. für die spezifische Detektion eines oder mehrerer Spezies innerhalb eines Genus oder einer oder mehrerer Gattungen innerhalb einer Familie. Die Erfindung stellt eine rekonstituierbare getrocknete Formulierung bereit, die eine reverse Transkriptase, eine RNA Polymerase, Ribonukleotidtriphosphate, Desoxyribonukleotidtriphosphate, Zink- und/oder Magnesiumsalze und ein reduzierendes Agens in einem einzelnen Gefäß umfasst. Die Amplifikationsprimer und eine wässrige Rekonstitutionslösung können als eine oder mehrere zusätzliche getrennte Komponenten des Kits geliefert werden. Alternativ können die Amplifikationsprimer in der getrockneten Formulierung enthalten sein. Zielsequenzspezifische Nukleinsäurehybridisierungstestsonden und irgendwelche gewünschte nicht markierte Helfer-Oligonukleotide können in die getrocknete Formulierung einbezogen sein oder in einem separaten Reagens bereitgestellt werden. Nach der Rekonstitution der getrockneten Formulierung und der Zugabe der Oligonukleotidprimer (sofern diese nicht bereits vorliegen), wird das Gemisch mit einer teilweise oder vollständig einzelsträngigen Zielnukleinsäure in Kontakt gebracht. Wenn die Zielnukleinsäure Nukleotidsequenzen aufweist, die zu einem Primer(n) (oder zu dem Primerbestandteil eines Promoter-Primers(n)) komplementär sind, wird die Reaktion nach der Inkubation des Reaktionsgemisches bei einer Temperatur, die für die Nukleinsäureamplifikation ausreichend ist, voranschreiten.
In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung ein einzelnes Lyophilisat, das eine Kombination der reversen Transkriptase (bevorzugt MMLV-RT), der RNA Polymerase (bevorzugt T7 RNA Polymerase), eines Kälteschutzmittelträgers, von Nukleotidtriphosphaten, der erforderlichen Kofaktoren und eines reduzierenden Agens, das bevorzugt eine Thiolgruppe enthält, enthält. Das Lyophilisat kann ohne die Notwendigkeit einer Kühlung transportiert und gelagert werden und kann dem vorübergehenden Ausgesetztsein gegenüber erhöhten Temperaturen widerstehen, z. B. – ohne darauf beschränkt zu sein – 55°C für 30 Tage ohne signifikante Verminderung der Enzymaktivität.
Mit „Nukleotidtriphosphaten" sind Ribo- oder Desoxyribonukleotidtriphosphate und Derivate dieser gemeint, welche in der Lage sind, jeweils als Substrate für eine RNA Polymerase und eine DNA Polymerase, bevorzugt eine reverse Transkriptase, zu dienen. Derartige Derivate können – ohne darauf beschränkt zu sein – Nukleotide mit Methyl- (oder anderen Alkyl-) und/oder Schwefelgruppen einschließen, die an der stickstoffenthaltenden Base (gewöhnlich Adenin, Thymin oder Urazil, Cytosin und Guanin), der Ribose oder dem Desoxyribosebestandteil oder der Phosphatgruppe angefügt sind.
Mit „Nukleotid" ist eine Nukleinsäureuntereinheit gemeint, die eine einzelne stickstoffenthaltende Base (gewöhnlich Adenin, Thymin oder Urazil, Cytosin und Guanin), einen Zuckerbestandteil (Ribose oder Desoxyribose) und eine Phosphatgruppe umfasst. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke sowohl auf nichteingebaute Ribo- oder Desoxyribonukleotidtriphosphate als auch auf die kovalent verknüpften Nukleotiduntereinheiten eines Oligonukleotids oder eines Nukleinsäurestranges, in Abhängigkeit zu ihrer Verwendung im Kontext.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beinhaltet Verfahren zur Stabilisierung der enzymatischen Aktivitäten von DNA Polymerase- und RNA Polymeraseenzymen durch das Entfernen des Lösungsmittels aus einer Lösung, die eine oder mehrere dieser Enzyme enthält, in der Gegenwart eines Kälteschutzmittels oder eines stabilisierenden „sperrigen Agens". Derartige Kälteschutzmittel schließen Saccharide, insbesondere nicht reduzierende Disaccharide und wasserlösliche Polymere mit elektropositiven und/oder elektronegativen Gruppen, die für das Wasserstoffbinden an das Enzym verfügbar sind, ein. Insbesondere bevorzugte Kälteschutzmittel sind die Disaccharide Saccharose und Trehalose und das Polymer Polyvinylpyrrolidon (PAP).
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem stabilisierte Zusammensetzungen, die eine getrocknete DNA Polymerase, eine getrocknete RNR Polymerase oder ein getrocknetes Gemisch, das sowohl eine DNA Polymerase als auch eine RNA Polymerase enthält, umfasst. Bevorzugte Enzyme, die von diesen Zusammensetzungen umfasst werden, sind reverse Transkriptasen und RNA Polymerasen aus Bakteriophagen. Insbesondere bevorzugte Enzyme sind die retrovirale reverse Transkriptase aus dem Moloney Murine Leukemia Virus und die RNA Polymerase aus dem Bakteriophagen T7.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Trocknen der DNA Polymerase und der RNA Polymerase der vorliegenden Erfindung ist mittels des Lyophilisierens. In diesem Verfahren wird eine Lösung, die das Enzym enthält, gefroren, ein Vakuum an die gefrorene Enzymlösung angelegt und das Lösungsmittel aus der Präparation durch Sublimierung unter Zurücklassen der gelösten Stoffe entfernt. Die vorliegende Erfindung zeichnet sich zudem durch eine Zusammensetzung für die Replikation einer oder mehrerer spezifischer Nukleinsäuresequenzen aus, welche eine getrocknete Präparation einer DNA Polymerase (bevorzugt einer reversen Transkriptase), einer RNA Polymerase, Nukleotidtriphosphate und Kofaktoren, die für die Enzymaktivität notwendig sind, einschließt. Die getrocknete Präparation kann zudem Amplifikationsprimer für die spezifische Replikation der Zielnukleotidsequenz und/oder Hybridisierungstestsonden und Helfer enthalten. Die getrocknete Zusammensetzung wird bevorzugt durch Lyophilisieren hergestellt.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind über einen längeren Zeitraum, auch bei der Lagerung bei hohen Temperaturen, stabil. Derartige Zusammensetzungen sind somit beim Versand und der Lagerung kommerzieller Präparationen dieser Enzyme und von Kits für die Nukleinsäureamplifikation, die diese Enzyme enthalten, nützlich.
Beispiele
Es ist zu verstehen, dass die folgenden Beispiele dazu gedacht sind, die verschiedenen gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen und in keiner Weise derer. Umfang zu beschränken. Ebenfalls ist die Offenbarung einer Ausführungsform keine Aussage, dass andere Ausführungsformen der Erfindung nicht existieren können, welche wirksamer sind, um ein oder mehrere Ziele zu erreichen, welche gedacht sind, durch die vorliegende Erfindung angesprochen zu werden.
Beispiel 1: Lyophilisierung der reversen Transkriptase und der RNA Polymerase
Die in diesem und den folgenden Beispielen verwendete reverse Transkriptase war entweder eine rekombinante Noloney Murine Leukemia Virus reverse Transkriptase, die im E. coli Stamm 1200 exprimiert und aus einer Zellpaste gereinigt wurde oder eine kommerziell verfügbare, gereinigte MMLV-RT Präparation, die von United States Biochemicals, Cleveland, Ohio erhalten wurde. Die Enzympräparation wurde bei –20°C in einem Lagerpuffer gelagert, der 20–50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 0,1 mM Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA), 1,0 mM Dithiothreitol (DTT), 0,01 (V/V) TERGITOL NP^® –40 (TERGITOL NP^® ist ein eingetragener Handelsname der Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.) oder 0,1% (V/V) TRITON^® X-100 (TRITON^® ist ein eingetragener Handelsname der Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.) und 50% (V/V) Glyzerol enthält. Gereinigte T7 RNA Polymerase wurde von Epicentre Technologies, Madison, WI erhalten. Das Enzym wurde vor der Dialyse in 50% (V/V) Glyzerol, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 1,0 mM DTT, 0,1 mM EDTA und 0,1% (V/V) TRITON^® X-100 gelagert. Dieses Enzym wurde zudem bei –20°C vor der Dialyse gelagert.
Drei Enzympräparationen wurden in der Präparation für die Lyophilisierung dialysiert. Die erste Präparation enthielt 324.012 Einheiten der MMLV-RT, die in einem Puffer verdünnt waren, der 20 mM HEPES ([2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-Ethanesulfonsäure]) (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 2 mM NALC, 0,1 mM Zinksulfat, 0,2 M Trehalose und Wasser enthielt. Das Endvolumen betrug 720 μl. Dieses wurde gegen 250 ml des gleichen Puffers (Trehalose-Puffer) über 6 Stunden bei 4°C dialysiert. Die Dialysemembranen wurden durch Kochen in 2% (m/V) Natriumbicarbonat und 10 mM EDTA (pH 8,0), dann in 10 mM EDTA (pH 8,0) und schließlich in deionisiertem Wasser für jedes Mal 10 Minuten präpariert. Die Membranen wurden anschließend vor der Verwendung gründlich mit deionisiertem Wasser abgespült. Der Dialysepuffer wurde gegen das gleiche Volumen frischen Puffers ausgetauscht und die Dialyse wurde für weitere 10 Stunden fortgesetzt. Der Puffer wurde erneut ausgetauscht und die Dialyse wurde für weitere 3 Stunden fortgesetzt. Das Endvolumen betrug 655 μl.
Die zweite Präparation enthielt 144.000 Einheiten der T7 RNA Polymerase in 720 μl. Diese wurde gegen Trehalosepuffer nach dem gleichen Fahrplan und in den gleichen Volumina wie die reverse Transkriptasepräparation dialysiert. Das Endvolumen betrug 1270 μl.
Die dritte Präparation enthielt sowohl die reverse Transkriptase als auch die RNA Polymerase. 324.012 Einheiten der reversen Transkriptase und 144.000 Einheiten der RNA Polymerase wurden zu einem Endvolumen von 1440 μl kombiniert. Dieses wurde gegen drei gleiche Volumina des Trehalosepuffers nach dem gleichen Fahrplan wie die anderen zwei Präparationen dialysiert. Das Endvolumen des Dialysats betrug 1975 μl.
Nach der Dialyse wurde jede Präparation in zwölf gleichen Aliquots auf Röhrchen aufgeteilt. Jedes Röhrchen enthielt 27.000 Einheiten der reversen Transkriptase, 12.000 der T7 RNA Polymerase oder beide Enzyme in diesen Mengen. Die Röhrchen wurden in einen programmierbaren Virtis Modell Lyophilisator 101-SRC mit einem FCP-III Kontrollsystem gesetzt. Die Röhrchen wurden auf –40°C in etwa 5 Minuten abgekühlt. Die Lyophilisierung wurde durch Absenken des Druckes auf –180 Torr eingeleitet. Das Vakuum wurde während des Lyophilisierungsprotokolls konstant gehalten. Die Temperatur wurde anschließend linear auf –10°C während der folgenden 2 Stunden angehoben und bei dieser Temperatur für die nächsten 6 Stunden gehalten. Die Temperatur wurde anschließend linear auf 10°C während der nächsten Stunde angehoben und bei 10°C für 4 Stunden gehalten. Die Temperatur wurde erneut linear auf 25°C während der nächsten 30 Minuten angehoben und bei 25°C für die folgenden 10,5 Stunden gehalten. Der Druck wurde anschließend auf den atmosphärischen Druck unter Zuführung von trockenem Stickstoff zurückgeführt und die Röhrchen wurden unter Stickstoff vor ihrer Entfernung aus dem Lyophilisator verschlossen. Die Röhrchen wurden anschließend bei 25°C für 22 Tage gelagert.
Nach der Lagerungsperiode wurden die lyophilisierten Enzympräparationen in einem Rekonstitutionspuffer (0,01 (V/V) TRITON^® X-100, 41,6 mM MgCl₂, 1 mM ZnC₂H₃O₂, 10% (V/V) Glyzerol, 0,3% (V/V) Ethanol, 0,02 (m/V) Methylparaben und 0,01 (m/V) Propylparaben) rekonstituiert und auf ihre Fähigkeit untersucht, die Nukleinsäureamplifikation zu unterstützen.
Reaktionsgemische mit 90 μl Gesamtvolumina wurden hergestellt, die 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 17,5 mM, 2 mM Spermidin, 25 mM KCl, jeweils 2 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP, 2,5 mM CTP und UTP, 6,5 mM ATP und GTP, 5 mM DTT, 0,44 μl einer Lösung von 675 μg pro ml eines Promoterprimers (SEQ ID Nr: 1) mit einer Zielbinderegion, die komplementär zu einer Region eines Stranges des Gens 10 des Bakteriophagen T7 ist, 0,3 μl einer Lösung von 451 μg pro ml eines Primers (SEQ ID Nr: 2) mit einer Zielbinderegion, die komplementär zum anderen Strang des Gens 10 des Bakteriophagen T7 ist, einhundert Kopien der T7 Gen 10 Zielnukleinsäure und Wasser enthielt. Die T7 Gen 10 Ziel-RNA war ein Transkript im (+) Sinn eines auf einem Plasmid vorliegenden T7 Gen 10 Restriktionsfragmentes, das aus dem Plasmid pGEMEX-1 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) stammt. Das gereinigte RNA Transkript lag in einer Konzentration von 0,61 picomol/μl vor. Einhundert Kopien der Zielnukleinsäure wurden zu jedem Röhrchen hinzugefügt. Jedes Röhrchen wurde zudem mit 200 μl Mineralöl zum Verhindern des Verdampfens der Probe während des Tests überschichtet.
Sämtliche Röhrchen wurden bei 95°C für 5 Minuten inkubiert und es wurde ihnen gestattet, vor der Zugabe des oben beschriebenen rekonstituierten Enzyms auf Raumtemperatur abzukühlen. Obwohl dieser Schritt nicht notwendig ist, wenn die Zielnukleinsäure RNA oder eine einzelsträngige DNA und keine doppelsträngige DNA ist, hilft ein anfänglicher Erhitzungsschritt jegliche Regionen intramolekularer RNA Wasserstoffbindung aufzuschmelzen. Zu den die separat lyophilisierten Enzympräparationen enthaltenden Experimentierröhrchen wurden anschließend 10 μl einer Lösung gegeben, die 400 Einheiten der T7 RNA Polymerase und entweder 600 oder 900 Einheiten der lyophilisierten MMLV-RT enthielten. Die gemeinsam lyophilisierte T7 RNA Polymerase und MMLV-RT lagen jeweils in Konzentrationen von 400 Einheiten und 900 Einheiten pro 10 μl vor. Die Röhrchen wurden bei 37°C für 3 Stunden inkubiert.
Die Menge an amplifizierter Nukleinsäure, die während dieser Reaktion gebildet wurde, wurde unter Verwendung des homogenen Schutztests bestimmt, der in Arnold und Nelson, US Patent Nr. 5,283,174 (welches sich der gemeinsamen Eigentümerschaft mit der vorliegenden Anmeldung erfreut und welches unter Bezugnahme hierin einbezogen ist) beschrieben wird. Es wird dem Fachmann verständlich sein, dass viele andere Testsysteme und Verfahren zum Detektieren einer Zielnukleinsäure, wie z. B. unter Verwendung radioaktiv markierter Sonden, im Stand der Technik verfügbar sind.
Die Amplifikationsreaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl eines Hybridisierungspuffer, der 200 mM Lithiumsuccinat (pH 5,2), 17% (m/V) Lithiumlaurylsulfat, 3 mM EDTA (Ethylendiamin-Tetraessigsäure) und 3 mM EGTA ([Ethlyen-bis-(oxyethylenitrilo)]-tetraessigsäure)) und eine mit Akridiniumester markierte Sonde (SEQ ID Nr: 3), die zum T7 Gen 10 RNA Transkript komplementär ist, enthält, in jedem der Röhrchen gestoppt. Die Röhrchen wurden bei 60°C für 20 Minuten inkubiert. Der Akridiniumester, der mit der nicht hybridisierten Sonde assoziiert ist, wurde durch die Zugabe von 300 μl 182 mM NaOH, 600 mM Borsäure und 1% (V/V) TRITON^® X-100 hydrolysiert und die Röhrchen wurden bei 60°C für 5 Minuten inkubiert. Die verbliebene Chemiluminiszenz wurde in einem Luminometer nach der Zugabe von 200 μl von 1% (V/V) H₂O₂ in 0,4 N HNO₃ und der unmittelbar sich anschließenden Alkalisierung der Lösung durch die sofortige Zugabe von (200 μl) 1 M NaOH gemessen. Die Ergebnisse werden in relativen Lichteinheiten (RLU) wiedergegeben, welche ein Maß für die Anzahl der durch die Chemiluminiszenzmarkierung emittierten Photonen ist. Die Ergebnisse werden unten in der Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Diese Ergebnisse indizieren, dass die gemeinsam lyophilisierte MMLV-RT und T7 RNA Polymerase die Amplifikation der Gen 10 Ziel-RNA wirkungsvoller bewerkstelligen, als in Reaktionsgemischen mit Enzympräparationen, die entweder mit einer flüssigen Enzympräparation des anderen Enzyms kombiniert sind oder wo beide Enzyme nicht lyophilisiert wurden. Im Vergleich mit den flüssigen Enzymen ergab sich keine signifikante Verminderung in der Fähigkeit einer der lyophilisierten Enzympräparationen, die Amplifikation zu katalysieren. Die Ergebnisse zeigen somit auch, dass jedes Enzym durch die Lagerung in einem getrockneten Zustand in der Gegenwart von Trehalose, entweder allein oder zusammen, effektiv stabilisiert werden kann. Da die Nukleinsäure-amplifikation unter diesen Bedingungen von der Gegenwart aller drei enzymatischen Aktivitäten der reversen Transkriptase (RNA-gerichtete DNA-Polymerase, DNA-gerichtete DNR-Polymerase und RNAse H) abhängt, ist der Test ein nachhaltiger Hinweis darauf, dass sowohl diese Aktivitäten durch das vorliegende Verfahren effektiv stabilisiert werden als auch das die Aktivitäten in solch einer Weise koordiniert erhalten bleiben, dass die Nukleinsäureamplifikation gefördert wird.
Weitere Experimente zeigten, dass die reverse Transkriptase unter ähnlichen Bedingungen in der Gegenwart von Saccharose eher als von Trehalose lyophilisiert werden kann. Trehalose schien der Saccharose als ein Kälteschutzmittelstabilisierendes Agens leicht überlegen zu sein. (Siehe Beispiel 6.)
Lyophilisierung der reversen Transkriptase und der T7 RNA-Polymerase in Gegenwart eines nichtionischen Detergens
Die reverse Transkriptase und die RNA-Polymerase wurden gemeinsam in Gegenwart eines nichtionischen Detergens dialysiert und lyophilisiert, um zu versuchen, die Ausfällung von Protein während des Lyophilisierungsvorganges zu minimieren, um die enzymatische Aktivität während der Dialyse der Enzyme zu bewahren. Sechs Dialysegemische wurden hergestellt, die 0%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2% und 0,5% TRITON^® X-102 in einem Dialysepuffer enthielten. Der Dialysepuffer enthielt 20 mM HEPES, 0,1 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 5 mM NALC, 0,1 mM Zinkacetat und 0,2 M Trehalose. Das Endvolumen eines jeden Dialysegemisches betrug 250 ml. 467 μl von jedem Puffer wurden mit 46 μl MMLV-RT (2900 Einheiten/ μl) und 74 μl T7 RNA-Polymerase (800 Einheiten/μl) zu einem Ausgangsvolumen für jedes Dialysat von 587 μl vereinigt. Die Proben wurden gegen 60 ml des entsprechenden Puffers bei 4°C mit dreimaligem Austausch des gleichen Volumens des Puffers dialysiert. Im Anschluss an den dritten Pufferaustausch wurde ein Präzipitat in den Proben beobachtet, die 0%, 0,01% und 0,05% TRITON^® X-102 enthielten. Kein derartiges Präzipitat wurde in den Proben gesehen, die 0,1%, 0,2% oder 0,5% TRITON^® X-102 enthielten.
Nach der Dialyse wurde das Volumen eines jeden Dialysates gemessen und die sich danach eingestellten Enzymkonzentrationen berechnet. Jede Probe wurde auf vier Gefäße aufgeteilt, wobei jedes Gefäß 24.750 Einheiten der MMLV-RT und 11.000 Einheiten der T7 RNA-Polymerase enthielten. Die Lyophilisierung wurde wie oben ausgeführt. Die Erscheinung der Detergens-enthaltenden Lyophilisate war nach dem Trocknen nicht von den Lyophilisaten unterscheidbar, die in der Abwesenheit von TRITON^® X-102 hergestellt wurden. Im Anschluss an die Lyophilisierung wurden die Gefäße bei 4°C und 55°C für 32 Tage gelagert.
Die Wirkung des nichtionischen Detergens auf die Aktivität der Enzyme wurde in einem Amplifikationstest unter Verwendung des T7 Gene 10 Amplifikationssystems überprüft. Jede lyophilisierte Enzympräparation wurde im Rekonstitutionspuffer rehydratisiert. 900 Einheiten der MMLV-RT und 400 Einheiten der T7 RNA Polymerase wurden in jedem Reaktionsgemisch getestet. Die RNA Gen 10 Transkripte (100 Kopien pro Reaktion) wurden als Zielnukleinsäure verwendet. Der Test wurde, wie oben beschrieben, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben wurde, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in RLU wiedergeben.
Tabelle 2
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein nichtionisches Detergens, wie z. B. TRITON^® X-102, die Bildung eines Proteinpräzipitates nach der Dialyse der MMLV-RT oder der T7 RNA-Polymerase wirksam verhindern kann. Die Ergebnisse zeigen zudem, dass TRITON^® X-102 keine negative Auswirkung auf die Amplifikation der Ziel-Nukleinsäure hat und sogar dahingehend fungieren kann, die Enzymaktivitäten verstärkt zu stabilisieren, wenn die lyophilisierten Enzyme eine Zeit lang bei erhöhten Temperaturen gelagert werden. Das Detergens ruft keine Verstärkung der Lumineszenz im Hintergrund in diesem Test hervor. Diese Ergebnisse zeigen zudem, dass sogar die in Abwesenheit eines Detergens lyophilisierte Probe (Probe B) in etwa so aktiv bleibt, wie die nicht lyophilisierten Enzyme. Die Ergebnisse indizieren zudem, dass die lyophilisierte Enzympräparation keine nachweisbare Verschlechterung in der Aktivität erfährt, wenn die lyophilisierte Enzympräparation bei erhöhter Temperatur für einen längeren Zeitraum gelagert wird.
Für den Fachmann wird klar werden, dass diese Ergebnisse unmittelbar dazu anregen, dass andere nicht ionische Detergenzien, wie z. B. – ohne darauf beschränkt zu sein – Detergenzien, der BRIJ-Reihe, die TWEEN-Reihe, andere Detergenzien der TRITON-Reihe und der TERGITOL-Reihe, wie oben angegeben, leicht auf ihre Fähigkeit überprüft werden können, die getrockneten Proteine ohne nachteilige Wirkung auf die Enzymaktivität in einem löslichen Zustand während der Lyophilisierung aufrecht zu erhalten.
Beispiel 2: Gemeinsame Lyophilisierung der reversen Transkriptase und der RNA-Polymerase mit Amplifikationsreagenzien
Die reverse Transkriptase des Moloney Murine Leukemie Virus und die T7 RNA-Polymerase Enzympräparationen wurden bei –20°C in einem Lagerpuffer aufbewahrt, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,01% (V/V) NP^®-40 oder 0,1% (V/V) TRITON^® X-100 und 50% (V/V) Glyzerol vor dem Trocknen enthielt.
In der Präparation für die Lyophilisierung wurden 3 × 10⁶ Einheiten der MMLV-RT und 1,3 × 10⁶ Einheiten der T7 Polymerase (2,5 ml von jeder Präparation) vereinigt und gegen mindestens 50 Volumina eines Puffers dialysiert, der 20 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM NALC, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM Zinkacetat, 0,2% (V/V) TRITON^® X-102 und 0,2 M Trehalose enthielt, unter Verwendung von Dialysemembranen mit einem Molekularausschlussgewicht von 12.000 Dalton bei 2–8°C unter dreimaligem Austausch des gleichen Volumens an Puffer über mindestens 8 Stunden zwischen jedem Pufferaustausch.
Zwanzig Milliliter der dialysierten Enzympräparation wurden mit 60 ml eines Amplifikationsreagenzes vereinigt, das 10,0 mM Spermidin, 250 mM Imidazol/150 mM Glutaminsäure (pH 6,8), 99 mM NALC, 12,5 (m/V) PAP, jeweils 12,5 mM rCTP und rUTP, jeweils 31,2 mM rATP und rGTP und jeweils 10,0 mM dCTP, dGTP und dTTP (6 : 2 Volumenverhältnis) enthielt. Zusätzliche Experimente zeigten, dass die Reagenzien in einem 7 : 1 Volumenverhältnis (Amplifikationsreagenz zu Enzympräparation), ohne sich signifikant unterscheidende Ergebnisse, kombiniert werden können. Theoretisch können die dialysierte Enzympräparation und das Amplifikationsreagenz in gleichen Anteilen kombiniert werden. Die Bestimmung eines geeigneten Verhältnisses von Amplifikationsreagenz zu Enzym liegt ohne weiteres in der Fähigkeit des Fachmanns.
Die Endzusammensetzung der kombinierten Formulierung von Enzym : Amplifikationsreagenz vor der Lyophilisierung war: 2,7 × 10⁶ Einheiten der MMLVRT und 1,2 × 10⁶ Einheiten der T7 Polymerase, 6 × 10⁶ Einheiten von jedem Enzym, 5,0 mM HEPES (pH 6,8 bis 7,0), 0,025 mM EDTA, 0,025 mM Zinkacetat, 10,0 mM Spermidin, 187,5 mM Imidazol, 112,5 mM Glutaminsäure, 75,6 mM NALC, 0,05 (V/V) TRITON^® X-102, 9,4% (m/V) PAP (ungefähres Molekulargewicht 40.000 Dalton), 0,05 M Trehalose, jeweils 9,4 mM rCTP und rUTP, jeweils 23,4 mM rRTP und rGTP und jeweils 7,5 mM dCTP, dGTP, dATP und dTTP.
Achthundert Mikroliter der vereinigten Präparation von Enzym Amplifikationsreagenz (im Folgenden Enzym : Amplifikations reagenz) wurden in jedes einzelne Glasgefäß zur Lyophilisierung (ungefähr 39.000 Einheiten der gesamten Enzyme pro Gefäß) gegeben. Die Lyophilisierung wurde, wie aus Beispiel 1 folgt, durchgeführt. Nach der Lyophilisierung wurden die Gefäße anschließend, wie in den folgenden Beispielen angegeben, behandelt.
Beispiel 3: Test auf die Am lifikationsaktivität des lyophilisierten Reagenzes
Frisch lyophilisierte Präparationen der reversen Transkriptase, der RNA Polymerase und des Amplifikationsreagenzes wurden bei 25°C, 35°C und 45°C für unterschiedliche Zeiten, die von 3 bis 61 Tagen reichten, inkubiert. Alle Gefäße wurden identisch aus der gleichen Präparation hergerichtet. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die die lyophilisierten Reagenzien enthaltenden Gefäße der erhöhten Temperatur entzogen und bei –30°C gelagert bis die letzten Proben eingesammelt wurden. Die Beispiele, die die „Null-" Zeit für jede Temperatur repräsentieren, wurden bei –30°C für den gesamten Zeitraum des Experimentes gelagert.
Wenn die Gefäße des letzten Zeitpunkts eingesammelt wurden, wurden alle Proben in 1,5 ml des rekonstituierenden Reagenzes (0,01% (V/V) TRITON^® X-102, 41,6 mM MgCl₂, 1 mM ZnC₂H₃O₂, 10 (V/V) Glyzerol, 0,3% (V/V) Ethanol, 0,02% (m/V) Methylparaben und 0,01% (m/V) Propylparaben) rehydratisiert und der Inhalt eines jeden Gefäßes wurde auf die Fähigkeit hin untersucht, die Nukleinsäureamplifikation zu bewirken.
Die Aktivität in einem Modellsystem zur Amplifikation wurde in der folgenden Weise in diesem Beispiel gemessen. Jedes Amplifikationsreaktionsgemisch enthielt 500 Kopien eines doppelsträngigen DNA-Restriktionsfragmentes aus einem Plasmid, das ein Teil Hepatitis B Virusgenom als Zielnukleinsäure enthielt (ein pUC-Plasmid, das ein 2,6 kb Fragment des Hepatitis B Virusgenoms enthielt). Die Ziel-DNA wurde in entweder 20 μl Wasser oder menschlichem Serum verdünnt. Die Negativ-Kontrollen wurden in der gleichen Weise, jedoch ohne die Ziel-DNA, hergestellt. Diese wurde zu 20 μl eine 2X Primerlösung hinzugefügt. Die Endzusammensetzung dieser Lösung war 0,1 N KOH, 17,5 mM EGTA, 25 mM Imidazol, 25 mM Glutaminsäure, 0,025% (m/V) Phenolrot und 0,3 μM von jedem der zwei Primer in einem Gesamtvolumen von 40 μl. Der erste Primer ((-) Sinn) bestand aus einer 3' Ziel-Bindenukleotidsequenzregion, die komplementär zum (+) Sinn-Strang der Ziel-DNA ist und eine 5' nicht komplementäre Region war strangabwärts zu einer 5' nicht komplementären Region mit der Nukleotidsequenz des Primers für die T7 RNA-Polymerase gelegen. Der zweite Primer ((+) Sinn) hatte eine Nukleotidsequenz, die aus einer Ziel-Binderegion besteht, die komplementär zum anderen ((-) Sinn) DNA-Strang ist.
Jedes 40 μl Reaktionsgemisch wurde bei etwa 95°C inkubiert, um die doppelsträngige Ziel-DNA zu denaturieren. Die Reaktion wurde anschließend auf Raumtemperatur für 5 min abgekühlt und mit 10 μl eines Puffers neutralisiert, der 330 mM Imidazol und 200 mM Glutaminsäure enthielt. Wäre die Ziel-Nukleinsäure RNA und nicht DNA gewesen, wäre dieser Denaturierungsschritt nicht notwendig gewesen.
Fünfzig Mikroliter eines jeden rekonstituierten Enzym Amplifikationsreagenzes wurden zu 50 μl des denaturierten, neutralisierten DNA-Reaktionsgemisches gegeben, welches anschließend bei 37°C für 3 Stunden inkubiert wurde. Jede Reaktion wurde durch die Zugabe von 20 μl (40 Einheiten) RNAse-freier DNAse I gestoppt.
Die relative Amplifikation eines jeden rekonstituierten Enzym : Amplifikationsreagenz wurde unter Verwendung des homogenen Schutztestes (HPA) bestimmt, der in Arnold & Nelson, U.S. Patent Nr. 5,283,174 beschrieben wird. Es wird vom Fachmann verstanden werden, dass andere Testverfahren, die andere Nachweismittel verwenden, wie z. B. radioaktive Markierungen, verwendet werden können. Jede Amplifikationsreaktion wurde zu 100 μl einer Lösung aus 10 mM Lithiumsuccinat (pH 5,0), 2% (m/V) Lithiumlaurylsulfat, 1 mM Mercaptoethansulfonsäure, 0,3% (m/V) PAP-40, 230 mM LiOH, 1,2 M LiCl, 20 mM EGTA, 20 mM EDTA, 100 mM Bernsteinsäure (pH 4,7) und 15 mM 2,2'-Dipyridyl-disulfid, welche ungefähr 75 Femtomol (fmol) einer Akridiniumester-markierten Oligonukleotidsonde ((+) Sinn) enthielt, die so ausgestaltet war, dass sie gegenüber den amplifizierten RNA-Amplikons komplementär ist, gegeben. Jedes Röhrchen wurde gemischt, bei 60°C für 20 Minuten inkubiert und anschließend gestattet, abzukühlen. Jedes Reaktionsgemisch wurde zu 300 μl einer Lösung gegeben, die 0,6 M Natriumborat (pH 8,5), 1% (V/V) TRITON^® X-100 und 182 mM NaOH enthielt und es wurde für 6 Minuten bei 60°C inkubiert, um die Markierung zu zerstören, die nicht mit der hybridisierten Sonde assoziiert war.
Die Reaktionsgemische wurden für 5 Minuten gekühlt und die verbliebene Chemiluminiszenz wurde in einem Luminometer (LEADER^® Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) nach einer automatischen Injektion von 200 μl 0,1% (V/V) H₂O₂, 0,1 mM Salpetersäure, unmittelbar gefolgt durch eine Injektion von 1,0 N NaOH, gemessen. Die Menge des anschließend emittierten Lichtes wird in relativen Lichteinheiten (RLU) angegeben. Unter diesen Bedingungen war das Hintergrundniveau der Lichtemission etwa in dem Bereich von 2000 bis 4000 RLU.
Die Ergebnisse wurden aufgezeichnet und für jede Lagertemperatur (25°C, 35°C und 45°C), wie unten angegeben, tabelliert. Jede Probe wurde dreifach getestet und gemittelt. Dieses Mittel wurde zum graphischen Aufzeichnen der Daten für jede Temperatur verwendet. 1 entspricht der Tabelle 3, 2 der Tabelle 4 und 3 der Tabelle 5.
Diese Daten zeigen, dass das zusammen lyophilisierte Enzym Amplifikationsreagenz, das in Übereinstimmung mit dem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, alle vier der enzymatischen Aktivitäten bewahrt (RNA-gerichtete DNA-Polymerase, DNA-gerichtete DNA-Polymerase und RNAse H und RNA-Polymerase), die für das Erreichen der Nukleinsäureamplifikation gemäß dem verwendeten Transkriptions-vermittelten Amplifikationsverfahren erforderlich sind. Zusätzlich indizieren die Daten, dass es keinen bemerkenswerten schädigenden Einfluss auf die Nukleotidtriphosphate oder irgendeine andere Komponente des Amplifikationsreagenzes gibt, wenn das Reagenz zusammen mit der reversen Transkriptase und der RNA-Polymerase lyophilisiert wird.
Diese Ergebnisse zeigen zudem, dass die enzymatischen Aktivitäten der reversen Transkriptase und der enzymatischen Aktivitäten der RNA-Polymerase nicht signifikant inhibiert werden, wenn die Amplifikationsreaktion in Gegenwart einer komplexen biologischen Probe, wie z. B. menschlichem Serum, ausgeführt wird. Folglich erscheint das lyophilisierte Amplifikationsreagenz zur Verwendung in Verbindung mit den Proben, wie z. B. jenen, die unter klinisch diagnostischen Umständen erhalten werden, geeignet zu sein.
Die Daten können auf unterschiedliche Weise interpretiert werden. Ein sinnvoller Weg der Interpretation verwendet eine Form der Arrhenius-Gleichung zur Vorhersage der Stabilität der Zusammensetzung über einen noch größeren Zeitabschnitt als der, der tatsächlich getestet wurde. Die Arrhenius-Gleichung wird üblicherweise durch den Fachmann zur Vorhersage der Geschwindigkeiten von chemischen Reaktionen und der Stabilität verschiedener thermolabiler Verbindungen als Funktion der Temperatur verwendet.
Wie hier verwendet, nimmt die Arrhenius-Gleichung eine Reaktion erster Ordnung für die Enzym- (oder Reagens-) Inaktivierung an, worin ein aktives Enzym oder Reagenz eine einzige Geschwindigkeit der Inaktivierung bei einer gegebenen Temperatur und einen einzigen Mechanismus der Inaktivierung bei allen untersuchten Temperaturen besitzt. Die durch den Anmelder verwendete Gleichung ist: ln(k2/k1) =(–Ea/R)((T2 – T1)/(T2 × T1))worin k₂ der Geschwindigkeitskonstante bei der Experimentiertemperatur (°K) entspricht, k₁ der Geschwindigkeitskonstante für die Reaktion bei einer Referenztemperatur entspricht, E_a der Aktivierungsenergie der Reaktion entspricht, R der Gaskonstante (1,987 cal/°K-mol) entspricht, T₁ der Referenztemperatur (z. B. 298,16°K (25°C)) entspricht und T₂ der experimentellen Temperatur (ausgedrückt in °K) entspricht.
Wenn E_a mit 15.000 cal/mol angenommen wird und die Referenz- und Experimentiertemperatur bekannt sind, dann kann ein Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten k₂/k₁ bestimmt werden. In dem einfachen Fall, wo sowohl die Referenz- als auch die Experimentiertemperatur 25°C sind, ist das Verhältnis dieser Konstanten 1, da die Konstanten identisch sind. Wenn die Experimentiertemperatur 35°C ist und die Referenztemperatur 25°C, wird das vorhergesagte Verhältnis 2,27 sein. Wenn die Experimentiertemperatur 45°C und die Referenztemperatur 25°C ist, wird das vorhergesagte Verhältnis 4,91 sein. Unter Verwendung derselben Gleichung, wenn die Referenztemperatur 5°C ist und die Experimentiertemperatur 45°C ist, beträgt das Verhältnis 30,33.
Die Verhältnisse der Geschwindigkeitskonstanten können als das „Verhältnis der Zersetzung" in der Lagerzeit des Experiments gegenüber der normalen Lagerzeit angesehen werden, egal ob diese Zeit in Stunden, Tagen, Wochen, etc. ausgedrückt wird. Wenn das lyophilisierte Enzym/Amplifikationsreagenz 90% seiner ursprünglichen Aktivität in 30 Tagen bei 45°C verloren hat, sagt die Arrhenius-Gleichung deshalb voraus, dass es 147,3 (30 × 4,91) Tage bei 25°C benötigen würde, damit sich die Aktivität im gleichen Ausmaß verringert.
Die Daten zeigen somit, dass die kombinierten Komponenten der lyophilisierten Präparation sogar nach 30 Tagen bei 45°C nicht in beachtenswertem Umfang ihre Fähigkeit verlieren, die Amplifikation in „realer Zeit" zu unterstützen. Unter Verwendung der Arrhenius-Gleichung sagen die gleichen Daten überdies voraus, dass die Reagenzien keinen signifikanten Verlust in der Aktivität erleiden würden, wenn das lyophilisierte Reagenz tatsächlich für beinahe 5 Monate bei 25°C oder für 2,5 Jahre (30,33 × 30 Tage) bei 5°C vor der Verwendung gelagert werden würde.
Der Anmelder präsentiert diese Verfahren der Datenanalyse als eine Hilfe zum Verständnis der vorliegenden Erfindung und wünscht nicht durch theoretische Betrachtungen eingeschränkt oder gebunden zu werden. Die tatsächliche Stabilität der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann von den Vorhersagen der Arrhenius-Gleichung abweichen, welche eine allgemeine Anleitung gegenüber den Vorhersagen der Stabilität der lyophilisierten Reagenzien bereitstellt.
Beispiel 4: T7 RNA-Polymerasetest des lyophilisierten Reagenzes
Das im Beispiel 2 hergestellte lyophilisierte Enzym Amplifikationsreagenz wurde bei 35°C für 0, 3, 9, 16, 21 und 30 Tage inkubiert. Zu jedem dieser Zeitpunkte wurden Gefäße dieser Stresstemperatur entzogen und bei –30°C gelagert, bis die letzten Proben eingesammelt wurden.
Die RNA-Polymeraseaktivität wurde durch Rekonstituieren jedes Aliquots des lyophilisierten Reagenzes in 1,5 ml des rekonstituierenden Puffers (0,01% (V/V) TRITON^® X-100, 41,6 mM MgCl₂, 1 mM ZnC₂H₃O₂, 10% (V/V) Glyzerol, 0,3% (V/V) Ethanol, 0,02 (m/V) Methylparaben und 0,01 (m/V) Propylparaben) vermessen. Das Reagenz wurde anschließend 100fach, 200fach und 400fach in einer Lösung verdünnt, die 20 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM NALC, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM ZnC₂H₃O₂, 0,1 M NaCl und 0,2 (V/V) TRITON^® X-102 enthielt. Ein Reaktionsmix, der 22 mM MgCl₂, jeweils 7,8 mM ATP und GTP, jeweils 2,5 mM CTP und UTP, 62,5 mM Tris (pH 7,5), 2,5 mM Spermidin und 0,5 nanomol einer Ziel-Nukleinsäure enthielt, wurde getrennt davon angerichtet. Die Ziel-Nukleinsäure war ein linearisiertes pUC T7G10 Plasmid mit einem T7 Promoter, der unmittelbar strangaufwärts vom Bakteriophagen T7 Gen 10 angeordnet war. Dieses Plasmid ist vom Plasmid pGEMEX-1 (Promega Corporation, Madison, WI) abgeleitet.
Der Reaktions-Prämix wurde in 40 μl Aliquots aufgeteilt und jedes Aliquot wurde für 3 Minuten bei 37°C inkubiert. 10 μl jeder Verdünnung des Enzym : Amplifikationsreagenzes wurden zu den vorgewärmten Prämix-Röhrchen hinzugefügt und für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. 50 μl einer Lösung aus 10 mM Lithiumsuccinat, 2% (m/V) Lithiumlaurylsulfat, 1 mM Mercaptoethansulfonsäure, 0,3% (m/V) PAP-40, 230 mM LiOH, 1,2 M LiCl, 20 mM EGTA, 20 mM EDTA, 100 mM Bernsteinsäure (pH 4,7) und 15 mM 2.2'-Dipyridyl-disulfid, welche ungefähr 75 Femtomol einer Acridiniumester-markierten Gen 10 Oligonucleotid-Sonde ((-) Sinn), die so ausgestaltet war, damit sie komplementär zu den transkriptionellen Produkten ist, enthielt, wurde zu jedem Röhrchen hinzugefügt. Eine Standardprobe, die 10 Femtomol (fmol) einer einzelsträngigen DNA enthielt, die zur Gen 10 Sonde komplementär war, wurde in den HPA-Schritt eingeschlossen, um die Menge der in den experimentellen Reaktionsgemischen produzierten RNA zu quantifizieren. Die Hybridisierung wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 ausgeführt, ausgenommen, dass die Hybridisierungsvolumina halb so groß waren. Im Anschluss an den Abbau der nicht hybridisierten Markierung wurde der verbliebene Akridiniumester umgesetzt und das emittierte Licht in einem Luminometer als RLU gemessen.
Die Rohdaten wurden, wie folgt, in Einheiten der RNA-Polymeraseaktivität pro μl umgewandelt. Die Roh-RLU, die für die Positiv-Kontrollreaktion erhalten wurde, wurde von der RLU abgezogen, welche in der Negativ-Kontrolle (keine Ziel-DNA) erhalten wurde. Diese Zahl repräsentiert die Nettomenge an emittiertem Licht, das erhalten wurde, wenn 10 fmol der RNA in der Probe sind und sie kann als RLU/fmol RNA ausgedrückt werden. Gleichermaßen können die RLU, die für jede Probe erhalten wurden, von der Luminiszenz des Hintergrunds (RLU pro 20 Minuten) abgezogen werden. Wenn diese Zahl durch die Zahl geteilt wird, die für den Standard (RLU pro fmol RNA) erhalten wurde, ist das Ergebnis die Zahl der fmol RNA, die in jeder Reaktion pro 20 Minuten erzeugt wurden. Da eine Einheit RNA-Polymeraseaktivität als die Produktion von einem fmol RNA in 20 Minuten unter den Testbedingungen definiert wurde, bedeutet diese Zahl zudem die Anzahl der Einheiten der RNA- Polymeraseaktivität in jedem 10 μl Volumen des ursprünglich hinzugefügten Enzyms.
Die aus diesen Reaktionen erhaltenen Daten wurden zuerst für jede Lagerzeit bei 35°C durch die Angabe der fmol der gebildeten RNA als eine Funktion der Anzahl der μl des ursprünglichen 1,5 ml rekonstituierten Enzym Amplifikationsreagenzes, die in jedem Experimentierröhrchen vertreten sind, gezeichnet. Es wurde eine einfache lineare Funktion beschrieben. Nachdem die Daten eingezeichnet wurden, wurde eine bestmöglich angepasste Linie für die zu jedem Zeitpunkt erhaltenen Daten berechnet. Der Anstieg dieser Kurve wurde in Einheiten der T7 RNA-Polymeraseaktivität pro μl ausgedrückt. Wenn der „Nullzeit" Zeitpunkt als 100% Aktivität angesehen wird, wurden die berechneten Einheiten der T7 RNA-Polymerase zu jedem verbliebenen Zeitpunkt als verbliebene prozentuale Aktivität ausgedrückt.
4 stellt einen Graph zur Anzahl der Einheiten der T7 RNA-Polymerase pro Mikroliter in dem lyophilisierten Enzym : Amplifikationsreagenz als eine Funktion der Anzahl der Tage der Lagerung bei 35°C dar. Die Ergebnisse indizieren, dass wenig, wenn überhaupt, eine Verringerung der T7 RNA-Polymerase über die 30tägige 35°C Inkubationsperiode auftritt.
Beispiel 5: Reverse Transkriptase-Test des lyophilisierten Reagenzes
Die Aktivität der lyophilisierten MMLV reversen Transkriptase, die für 3, 9, 16, 21 und 30 Tage bei 35°C inkubiert wurde, wurde wie folgt getestet. Die einzelnen Gefäße wurden der Stresstemperatur zu den angegebenen Zeiten entzogen und bei – 30°C gelagert, bis die letzten Proben eingesammelt wurden.
Jedes Gefäß wurde in 1,5 ml Rekonstitutionspuffer rekonstituiert und wie in Beispiel 4 100fach, 200fach und 400fach verdünnt. Ein separates reverse Transkriptase Prämix-Gemisch wurde hergestellt, das 5 mM MgCl₂, 30 mM KCl, jeweils 0,25 mM dATP, dTTP, dCTP und dGTP, 62,5 mM Tris (pH 7,5), 2,5 mM Spermidin, 3,75 nM Ziel-RNA und 750 nM eines Amplifikationsprimers enthielt. Die Ziel-RNA waren die T7 Gen 10 RNA-Transkripte, die in Beispiel 4 gebildet wurden. Der Primer war ein 22 Basen langes Oligonukleotid, welcher der Länge nach so gestaltet war, dass dieser mit einer Region nahe dem 3'-Ende der Ziel-RNA hybridisiert. Zehn Mikroliter der Enzymverdünnungen wurden jeweils zu 40 μl des Reaktions-Prämixes auf Eis hinzugefügt. Die Reaktionen wurden durch Inkubation bei 37°C über 15 Minuten ausgeführt. Jede Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl einer Akridiniumestermarkierten Hybridisierungssonde gestoppt. Die Sonde war so gestaltet, damit sie zur neu synthetisierten Gen 10 cDNA komplementär ist.
Die Detektion wurde durch den HPA, wie in Beispiel 3 beschrieben, ausgeführt. Die Ergebnisse wurden in RLU gemessen.
Dieser Test maß die RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität und die RNAse H Aktivität der MMLV reversen Transkriptase. Die letztere Aktivität wird indirekt gemessen, da ohne den Abbau des RNA-Stranges des RNA : DNA-Hybrides, der durch die Verlängerung des Gen 10-Primers erzeugt wurde, die Sonde nicht in der Lage sein würde, an die cDNA zu hybridisieren.
Eine Einheit dieser kombinierten enzymatischen Aktivitäten wurde als die Detektion von 1 fmol cDNA in 15 Minuten unter den oben beschriebenen Reaktionsbedingungen definiert. Die Berechnung der Einheiten der Enzymaktivität, die zu jedem Zeitpunkt verblieben und die Verdünnung wurde wie in Beispiel 4 unter Verwendung von 10 fmol der amplifiziarten cDNA als Standard ausgeführt.
5 ist ein Graph zur Anzahl der Einheiten der RT-Aktivität pro Mikroliter in dem lyophilisierten Enzym Amplifikationsreagenz als eine Funktion der Anzahl der Tage der Lagerung bei 35°C. Die Ergebnisse indizieren, dass wenig, wenn überhaupt, eine Verringerung der RT-Aktivität über die 30tägige 35°C Inkubationsperiode auftritt.
Beispiel 6: Gemeinsame Lyophilisierung der reversen Transkriptase und der RNA-Polymerase mit Nukleotiden und Primern
Die vorhergehenden Beispiele haben die Präparation und die Verwendung eines einzelnen Reagenzes, das eine getrocknete Präparation der RNA-Polymerase und der reversen Transkriptase zusammen mit Nukleotidtriphosphaten und Kofaktoren, die für die Nukleinsäureamplifikation notwendig sind, enthielten, veranschaulicht. Dem Fachmann wird klar sein, dass in Anbetracht der Fähigkeit eines derartigen „Ein-Gefäß"-Reagenzes zum Amplifizieren von Nukleinsäuren nach einer längeren Lagerung bei erhöhten Temperaturen, es leicht möglich sein wird, den Amplifikations-Primer(n) in die lyophilisierte Präparation einzubeziehen, so dass die Anzahl der Schritte in den Verfahren, die solch ein Reagenz verwenden, vermindert wird und die Anzahl der Behältnisse in einem Kit für die Nukleinsäureamplifikation von drei (z. B. das lyophilisierte Enzym Amplifikationsreagenz, die Primer und das Rekonstitutionsreagenz) auf zwei (z. B. das lyophilisierte Enzym/Primer/Amplifikationsreagenz und das Rekonstitutionsreagenz) zu verringern.
Eine derartige Präparation ist nützlich, wenn bei oder Amplifikationsreaktion kein Gebrauch von Temperaturen gemacht wird, die ein oder beide der Enzyme denaturieren, wie z. B. wenn die Ausgangszielnukleinsäure RNR ist und das Amplifikationsverfahren ein Isothermisches ist, z. B. wie in Kacian & Fultz, PCT-Veröffentlichungsnummer WO 91/01384 oder in Kacian et al., PCT-Veröffentlichungsnummer WO 93/22461.
Beispiel 7: Lyophilisierung der reversen Transkriptase mit Saccharose
Der Anmelder hat zudem herausgefunden, dass Saccharose, z. B. in einer Konzentration von 0,2 M, als ein Kälteschutzmittelstabilisierendes Agens bei der Lyophilisierung der reversen Transkriptase verwendet werden kann. Die stabilisierende Wirkung der Saccharose scheint gut zu sein. Im Vergleich mit einer üblichen flüssigen Lösung, die MMLV-RT enthält und die für den gleichen Zeitraum in 50% (V/V) Glyzerol bei –20°C gelagert wurde, bewahrt die Präparation, die in 0,2 M Saccharose lyophilisiert wurde, im Anschluss an die Lagerung des Lyophilisates für 30 Tage bei 4°C, 93% der Aktivität der üblichen MMLV-RT-Präparation. Ein ähnlich behandeltes Lyophilisat, das im Gegensatz zur Saccharose 0,2 M Trehalose enthielt, zeigte im Mittel 105% der Aktivität des Standards unter den gleichen Bedingungen.
Sequenzliste

Claims

Ein Verfahren zum Herstellen einer stabilisierten Enzymzusammensetzung in einem einzelnen Fläschchen, das die Schritt umfasst: a) Bereitstellen einer Lösung, die umfasst i) eine aktive Enzymzusammensetzung, die ein Gemisch einer reversen Transkriptase und einer RNA Polymerase umfasst, und ii) ein stabilisierendes Agens, wobei das stabilisierende Agens aus einem nicht reduzierenden Disaccharid oder Polyvinylpyrrolidon besteht, b) Einfrieren der Lösung von (a), c) Sublimieren einer Lösungsmittelfraktion der gefrorenen Lösung durch Anlegen eines Vakuums, wodurch ein Lyopyhilisat gebildet wird, das die aktive Enzymzusammensetzung und das stabilisierende Agens umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das stabilisierende Agens aus Trehalose besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das nicht reduzierende Disaccharid Trehalose ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das stabilisierende Agens aus Polyvinylpyrrolidon besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lösung zudem Deoxyribonukleotid-Triphosphate, Ribonukleotid-Triphosphate, Metallsalze und Kofaktoren umfasst, die ausreichend sind, um sowohl die DNA-Polymerisation als auch die RNA-Transkription in einer einzelnen Lösung zu gestatten, wenn das Lyophilisat rekonstituiert und mit geeigneten Nukleinsäuresubstraten und Reaktionspartnern kombiniert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 5, worin die Lösung zudem mindestens einen Oligonukleotid-Amplifikationsprimer umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 5, worin die Enzymzusammensetzung mindestens 70% ihrer Fähigkeit behält, eine Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wenn das Lyophilisat bei Raumtemperatur für zwei Monate gelagert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 5, worin die Enzymzusammensetzung mindestens 70% ihrer Fähigkeit behält, eine Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wenn das Lyophilisat bei 35°C für zwei Monate gelagert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 5, worin die Enzymzusammensetzung mindestens 70% ihrer Fähigkeit behält, eine Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wenn das Lyophilisat bei 45°C für zwei Monate gelagert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 5, worin die Enzymzusammensetzung mindestens 70% ihrer Fähigkeit behält, eine Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wenn das Lyophilisat bei 55°C für zwei Monate gelagert wird.
Eine Zusammensetzung, erzeugt durch das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Eine Zusammensetzung für die Amplifikation einer Zielnukleinsäure, die ein einzelnes Lyophilisat umfasst, welches besitzt a) eine wirksame Menge einer RNA-gerichteten DNA-Polymeraseaktivität, einer DNA-gerichteten DNA-Polymeraseaktivität, einer RNAse H Aktivität und einer DNA-gerichteten RNA-Polymeraseaktivität, worin die RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität, die DNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität und die RNAse H Aktivität durch ein oder mehrere separate Enzyme bereitgestellt wird, b) ein stabilisierendes Agens, das entweder aus einem nicht reduzierenden Disaccharid oder Polyvinylpyrrolidon besteht, c) Deoxyribonukleotid-Triphosphate und Ribonukleotid-Triphosphate, d) Metallsalze, und e) ein reduzierendes Agens, worin, wenn das Lyophilisat durch Zugabe eines wässrigen Lösungsmittels rekonstituiert wird, die sich ergebende Lösung ein einzelsträngiges RNA-Molekül mit einem Zielnukleotid-Sequenzbereich nach Zugabe des RNA-Moleküls und eines oder mehrerer geeigneter Oliognukleotidprimer zu der Lösung und dem Inkubieren der Lösung bei einer Temperatur, die ausreichend ist, um die enzymatischen Aktivitäten zu fördern, amplifizieren wird.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin ein oder mehrere geeignete Primer von dem Lyophilisat umfasst werden.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 13, die weiter umfasst f) einen Puffer, vorausgesetzt jedoch, dass die Zusammensetzung keine Carbonsäure enthält.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder 13, worin die RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität, die DNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität und die RNAse H Aktivität durch eine rekombinante retrovirale reverse Transkriptase bereitgestellt werden und die DNA-gerichtete RNA-Polymeraseaktivität durch eine RNA-Polymerase eines Bakteriophagen bereitgestellt wird.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin die reverse Transkriptase aus dem Moloney Maus Leukämie Virus gewonnen wird.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin die RNA-Polymerase aus dem T7 Bakteriophagen gewonnen wird.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin das stabilisierende Agens Polyvinylpyrrolidon ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin das stabilisierende Agens Trehalose ist.
Ein Kit für die Amplifikation einer Zielnukleinsäure, der eine reverse Transkriptase und eine RNA-Polymerase umfasst, die in einer einzelnen lyophilisierten Formulierung zusammen mit einem Kälteschutzmittel stabilisierenden Agens, das entweder aus einem nicht reduzierenden Disaccharid oder Polyvinylpyrrolidon besteht, kombiniert sind, worin nach der Rehydratation der lyophilisierten Formulierung und der Zugabe der Zielnukleinsäure in der Gegenwart von Oligonukleotidprimern, einige oder alle der Zielnukleinsäuren amplifiziert werden.
Der Kit nach Anspruch 20, worin die lyophilisierte Formulierung weiter Metallsalze und Nukleotid-Triphosphate umfasst.
Der Kit nach Anspruch 21, der weiter mindestens einen Oligonukleotid-Amplifikationsprimer umfasst.
Der Kit nach einem der Ansprüche 20 bis 22, worin das stabilisierende Agens Trehalose ist.
Der Kit nach einem der Ansprüche 20 bis 22, worin das stabilisierende Agens Polyvinylpyrrolidon ist.