DE60123980T2

DE60123980T2 - Amplifizierung von nukleinsäuresequenzen mittels multiplex priming

Info

Publication number: DE60123980T2
Application number: DE60123980T
Authority: DE
Inventors: S. Roger New Haven LASKEN; B. Frank Guilford DEAN; John Neshanic Station NELSON
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2021-06-28
Also published as: CA2410951A1; WO2002000934A2; US20030207267A1; EP1315833A2; EP1315833B1; AU6872501A; AU2001268725B2; ATE343003T1; IL153097A0; US6323009B1; WO2002000934A3; JP2004512823A; DE60123980D1; JP4718756B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Schaffung mehrerer Replikationsgabeln bei der Rolling-Circle-Amplifikation, um höhere Ausbeuten an Amplifikationsprodukten mit quantitativen Vorteilen gegenüber früheren Rolling-Circle-Methoden zu erhalten.
Hintergrund der Erfindung
Ein Mittel, um zirkuläre Ziel-DNA-Moleküle zu amplifizieren, ist wertvoll, weil eine solchermaßen vermehrte DNA häufig für nachfolgende Methoden verwendet wird, einschließlich der DNA-Sequenzierung, Klonierung, Kartierung, Genotypisierung, der Bildung von Sonden und der diagnostischen Identifizierung.
Bisher wurden mehrere nützliche Methoden entwickelt, die eine Amplifizierung von Nukleinsäuren erlauben. Die meisten wurden auf dem Gebiet der Amplifikation von ausgewählten DNA-Zielen und/oder Sonden entwickelt, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), der Ligase-Kettenreaktion (LCR), der selbstunterhaltenden Sequenz-Replikation (3SR), der auf der Nukleinsäuresequenz basierenden Amplifikation (NASBA), der Strangverdrängungsamplifikation (SDA) und der Amplifikation mit Qβ-Replikase (Birkenmeyer und Mushahwar, J. Virological Methods, 35: 117–126 (1991); Landegren, Trends Genetics, 9: 199–202 (1993)).
Zusätzlich wurden verschiedene Methoden angewandt, um zirkuläre DNA-Moleküle, wie z. B. Plasmide oder DNA von Bakteriophagen wie M13, zu amplifizieren. Eine davon war die Vermehrung dieser Moleküle in geeigneten Wirtsstämmen von E. coli und danach die Isolierung der DNA nach gut etablierten Protokollen (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). PCR war ebenfalls eine häufig angewandte Methode, um definierte Sequenzen in Ziel-DNAs, wie Plasmiden und DNA von Bakteriophagen wie M13, zu amplifizieren (PCR-Protocols, 1990, Hrsg. M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, Academic Press, San Diego). Einige dieser Methoden sind mühsam, teuer, zeitaufwändig und ineffizient und leiden an mangelnder Sensitivität.
Als eine Verbesserung gegenüber diesen Methoden verwendet die lineare Rolling-Circle-Amplifikation (LRCA) einen Primer, der an ein zirkuläres Ziel-DNA-Molekül angeheftet ist, und es wird DNA-Polymerase hinzugefügt. Der Amplifikationszielkreis (ATC) bildet eine Matrize, an der neue DNA gebildet wird, wobei die Primer-Sequenz als eine kontinuierliche Sequenz aus wiederholten Sequenzen, die komplementär zum Kreis sind, verlängert wird, wobei aber nur etwa einige Tausend Kopien pro Stunde gebildet werden. Eine Verbesserung gegenüber der LRCA bildet die Anwendung der exponentiellen RCA (ERCA) mit zusätzlichen Primern, die sich an die replizierten, komplementären Sequenzen anheften, um neue Amplifikationszentren zur Verfügung zu stellen, und dadurch eine exponentielle Kinetik und eine gesteigerte Amplifikation liefern. Die exponentielle Rolling-Circle-Amplifikation (ERCA) verwendet eine Kaskade von Strangverdrängungsreaktionen, auch als HRCA (Lizardi, P. M. et al., Nature Genetics, 19, 225–231 (1998)) bezeichnet. Jedoch ist die ERCA beschränkt auf die Verwendung nur eines einzelnen Primers P1, der an das zirkuläre Ziel-DNA-Molekül angeheftet ist, wobei die spezifische DNA-Sequenz des Primers P1 bekannt sein und das zirkuläre Ziel-DNA-Molekül ein zirkulärer DNA-Einzelstrang sein muss.
WO 97/42346 beschreibt eine Methode der Amplifizierung einer Nukleinsäuresequenz. Die Methode umfasst die Schritte (a) Zurverfügungstellung eines Konstruktes, das einen geschlossenen Loop einer Nukleinsäuren-Matrize einschließt, der die zu amplifizierende Sequenz enthält, und eines Primers, der mit der Nukleinsäure des Loops hybridisiert ist; und (b) Behandlung des Konstruktes (unter Verlängerungsbedingungen) mit einem Gemisch der vier Nukleotide und mit einem polymerisierenden Enzym, das so beschaffen ist, dass es (i) die Primerverlängerung unter Verwendung der Nukleinsäure des Loops als Matrize ermöglicht, um ein Kopie-Produkt mit einem „wachsenden Ende" zu bilden, an dem die Verlängerung stattfindet und dass (ii) die Nukleinsäure, die zu der des Loops komplementär und mit dieser hybridisiert ist, am „wachsenden Ende" des Kopie-Produktes von dieser verdrängt wird.
Die Methoden der vorliegenden Erfindung (hier bezeichnet als Multiply-Primed-Rolling-Circle-Amplifikation – MPRCA) vermeiden solche Nachteile durch Anwendung von Verfahren, die die Sensitivität der linearen Rolling-Circle-Amplifikation durch die Verwendung mehrerer Primer zur Amplifikation einzelner Zielkreise verbessern. Die vorliegende Erfindung bietet den Vorteil, dass mehrere Tandem-Sequenz-DNA(TS-DNA)-Kopien von jedem zirkulären Ziel-DNA-Molekül gebildet werden. Zusätzlich hat die MPRCA die Vorteile, dass in einigen Ausführungsformen die Sequenz des zirkulären Ziel-DNA-Moleküls unbekannt sein kann, während das zirkuläre Ziel-DNA-Molekül einzelsträngig (ssDNA) oder doppelsträngig (dsDNA oder Duplex-DNA) sein kann. Ein weiterer Vorteil einiger Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Amplifikation einzelsträngiger oder doppelsträngiger, zirkulärer Ziel-DNA-Moleküle isotherm und/oder bei Umgebungstemperaturen durchgeführt werden kann. Weitere Vorteile bestehen in dem hohen Nutzen bei neuen Anwendungen der Rolling-Circle-Amplifikation, den niedrigen Kosten, der Sensitivität für niedrige Konzentrationen des Ziel-Kreises, der Flexibilität, besonders bei der Verwendung von Nachweis-Reagenzien, und dem niedrigen Kontaminationsrisiko.
Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Verfahren verwendet, die die Ausbeute an amplifiziertem DNA-Produkt verbessern durch die Verwendung von mehreren Primern, die gegen den Abbau durch Exonuklease-Aktivität, die in der Reaktion vorhanden sein kann, resistent sind. Dies hat den Vorteil, dass die Primer in Reaktionen verbleiben können, die Exonuklease-Aktivität enthalten, und die über lange Inkubationszeiträume durchgeführt werden können. Das Verbleiben der Primer erlaubt das Auftreten neuer Priming-Ereignisse während der ganzen Inkubationszeit der Reaktion, was eines der Kennzeichen der ERCA ist und den Vorteil bietet, die Ausbeute an amplifizierter DNA zu erhöhen.
Die Methoden der vorliegenden Erfindung erlauben zum ersten Mal „In-vitro-Klonierung" von bekannten oder unbekannten Ziel-DNAs in zirkulärer Form, d. h., es ist nicht nötig, in einen Organismus zu klonen. Es kann eine Padlock-Sonde verwendet werden, um die Ziel-Sequenz mit der Lückenfüll-Methode (Lizardi, P. M. et al., Nature Genetics, 19, 225–231 (1998)) in einen Ring zu kopieren. Alternativ dazu können Ziel-Sequenzen in zirkuläre ssDNA oder dsDNA durch viele andere allgemein verwendete Methoden kopiert oder eingefügt werden. Die RCA-Amplifilcation macht es unnötig, vermehrte DNA-Ausbeuten durch Klonen in Organismen zu erzeugen.
Eine beabsichtigte Anwendung ist das gezielte Herausgreifen bekannter Sequenzen aus genomischen oder anderen komplexen DNAs. Eine zweite Anwendung ist die RCA von Ringen, die durch eine Methode zur Amplifikation des gesamten Genoms gebildet wurden. Die Amplifikation des gesamten Genoms schließt eine zufällig oder spezifisch geprimte Bildung einer Teilmenge der genomischen, cDNA oder anderer komplexer DNA ein. Auf dem Fachgebiet gut bekannte Methoden können angewandt werden, um die Produkte der Amplifikation des gesamten Genoms zu einem Ring zu schließen. Padlocks können die zirkulären Ziele ebenso erzeugen. Diese Ringe würden dann Substrate für die gezielte Amplifikation der vorliegenden Erfindung darstellen. Ungeachtet der Mittel, die zur Erzeugung der zirkulären Produkte bei der Amplifikation des gesamten Genoms verwendet werden, würde die RCA mit zufälligem Priming der vorliegenden Erfindung die selektive Amplifikation der Ringe gegenüber dem Hintergrund der linearen DNAs erlauben, ohne dass die Sequenzen bekannt sein müssen. Ebenso könnte die zirkuläre DNA bekannte Vektor- oder Zielsequenzen enthalten, die es erlauben würden, spezifische Primer-Sequenzen für die RCA mit mehreren Primern zu verwenden.
Die Methoden der vorliegenden Erfindung sind eine Verbesserung gegenüber der LRCA, da sie eine erhöhte Syntheserate und Ausbeute erlauben. Dieses resultiert aus den mehrfachen Primer-Stellen für die DNA-Polymerase-Verlängerung. Die RCA mit zufälligem Priming bietet auch den Vorteil der Bildung doppelsträngiger Produkte. Der Grund dafür ist, dass die linearen ssDNA-Produkte, die durch das Kopieren der zirkulären Matrize gebildet werden, durch das zufällige Priming bei der DNA-Synthese selbst in die Duplex-Form überführt werden. Ein doppelsträngiges DNA-Produkt ist vorteilhaft, da es die DNA-Sequenzierung beider Stränge und die Verdauung durch Restriktions-Endonukleasen erlaubt sowie andere Methoden, die beim Klonen, Markieren und Nachweisen angewendet werden.
Man erwartet auch, dass DNA-Synthese mit Strang-Verdrängung bei der RCA mit zufälligem Priming auftreten kann, was zu einer exponentiellen Amplifikation führt. Dies ist eine Verbesserung gegenüber der konventionellen ERCA, auch als HRCA bezeichnet (Lizardi et al. (1998)), indem sie es ermöglicht, sehr große Ziele, die in Ringen enthalten sind, exponentiell zu amplifizieren. Die Amplifikation langer, zirkulärer DNA, einschließlich künstlicher bakterieller Chromosomen (BACs), wurde in der vorliegenden Erfindung in die Praxis umgesetzt. In der Praxis wurde die konventionelle ERCA auf die Verwendung kleiner Ringe mit einer Länge von weniger als 200 Nukleotiden beschränkt.
Es wurden Methoden zur Amplifikation des gesamten Genoms publiziert, unter Verwendung degenerierter Primer (Cheung, V. G. und Nelson, S. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14676–14679 (1996)) und Zufallsprimer (Zhang, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5847–5851 (1992)), bei denen eine Teilmenge einer komplexen Mischung aus Zielen, wie der genomischen DNA, amplifiziert wird. Die Reduzierung der Komplexität ist ein Ziel dieser Methoden. Ein weiterer Vorteil der Methode der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie, als eine RCA-Reaktion, zirkuläre Ziel-DNA-Moleküle selektiv vermehrt, ohne die Notwendigkeit „eine Teilmenge zu bilden" oder die Komplexität des DNA-Zieles zu reduzieren. Stattdessen macht sich die vorliegende Erfindung die Tatsache zunutze, dass zirkuläre Ziel-DNA gegenüber linearen DNA-Molekülen, die in derselben Reaktion vorliegen, bevorzugt amplifiziert wird.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur gesteigerten Amplifikation zirkulärer DNA-Ziele unter Verwendung von spezifischen oder zufälligen Primern. Sie verbessert die Sensitivität der linearen Rolling-Circle-Amplifikation mit einzeln geprimten, zirkulären DNA-Molekül-Matrizen. Bei einer spezifischen Ausführungsform verwendet dieser Aspekt der Erfindung mehrere Primer (spezifische oder zufällige, sensitiv oder resistent gegenüber Exonuklease), die an die zirkulären Ziel-DNA-Moleküle angeheftet sind, um die Ausbeute an amplifiziertem Produkt durch RCA zu steigern. Mehrere Primer heften sich an mehreren Stellen auf dem Ring an, und von jeder Anheftungsstelle beginnt die Bildung eines Verlängerungsproduktes durch Polymerase. Auf diese Art erhält man gleichzeitig mehrere Verlängerungen von einem einzelnen Amplifikations-Zielkreis.
Bei verschiedenen Ausführungsformen der vorher erwähnten Methoden wird die Verwendung mehrerer Primer auf verschiedene Arten erreicht. Sie wird erreicht durch die Verwendung von zwei oder mehreren spezifischen Primern, die sich an unterschiedliche Sequenzen auf dem Ring anheften, oder man hat einen gegebenen Primer, der an eine Sequenz bindet, die an zwei oder mehr unterschiedlichen Stellen auf dem Ring wiederholt wird, oder man verwendet Zufallsprimer oder degenerierte Primer, die sich an viele Stellen auf dem Ring anheften können. Degeneriert bezieht sich auf ein Oligonukleotid, in dem eine oder mehrere der Nukleotidpositionen von mehr als einer Base besetzt wird, das bedeutet eine Mischung aus Oligonukleotiden definierter Länge, bei der eine oder mehrere Positionen eines individuellen Mitglieds der Mischung durch eine Base besetzt ist, die aus mehr als einer Möglichkeit für diese Position zufällig ausgewählt ist. Solche Sammlungen von Oligonukleotiden werden leicht synthetisiert unter Verwendung von Standard-Instrumenten und Standard-Software zur Oligonukleotidsynthese. Zufällig bezieht sich auf ein Oligonukleotid, bei dem jede der Nukleotidpositionen von einer Base besetzt ist, die zufällig aus einem kompletten Satz von Möglichkeiten ausgewählt ist, sich gewöhnlich aber auf die vier Nukleoside dAMP, dCMP, dGMP oder dTMP beschränkt.
Bei einigen Ausführungsformen enthalten die Primer Nukleotide, einschließlich aller Arten von modifizierten Nukleotiden, die möglicherweise dazu dienen, die Primer resistent gegen enzymatischen Abbau zu machen. Enzymatischer Abbau kann durch eine spezifische Exonuklease verursacht werden, wie die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, die mit einer DNA-Polymerase assoziiert ist, oder durch eine nichtspezifische, verunreinigende Exonuklease.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine allgemeine Ausführungsform der Methoden entsprechend der vorliegenden Erfindung, wobei Oligonukleotid-Primer, die Regionen besitzen, die zum Amplifikations-Ziel-Ring (gezeigt in A) komplementär sind, spezifisch mit dem Amplifikations-Ziel-Ring hybridisieren (gezeigt in B). C zeigt das Ergebnis der Zugabe von dNTPs, DNA-Polymerase usw. zu den hybridisierten Strukturen von B, wobei das 3'-Ende jedes Primers verlängert wird. Die Verlängerung jedes Produktes setzt sich fort, wobei die DNA-Polymerase die synthetisierte DNA durch das anliegende Enzym verdrängt. In diesem Fall interagiert ein Zielring mit 3 Primern und 3 Enzymmolekülen, um 3 lineare Replikationsrunden auf derselben ringförmigen Amplifikations-Ziel-Matrize zu erhalten. Es können mehr Primer verwendet werden. Mehrere spezifische Primer können verwendet werden, oder die Primer können eine zufällige Sequenz besitzen und an zufälligen Stellen mit dem Ziel-Ring hybridisieren.
2 ist eine graphische Darstellung des Amplifikationsgrades (in pmol/Input oder Zahl der Picomole, gebildet pro pmol der Start-Matrize), wobei die Amplifikationsreaktionen M13 mit unterschiedlichen Zahlen an angehefteten Primern verwenden. Die Zahl der Primer, die an das M13-DNA-Substrat angeheftet sind, ist durch Anmerkungen bezeichnet, die sich rechts neben dem Graphen und nahe am letzten Datenpunkt jeder Kurve befinden. Die Darstellung, die einen einzelnen Primer verwendet, ist eine lineare RCA-Reaktion (LRCA).
3 ist eine graphische Darstellung des Amplifikationsgrades (in pmol/Input; definiert als Ausmaß der DNA-Synthese, gemessen in pmol Deoxynukleotide, eingebaut in das Produkt, geteilt durch die Menge an DNA-Matrize, gemessen in pmol Deoxynukleotide) aufgetragen gegen die Zeit (in Stunden) während der Rolling-Circle-Amplifikationsreaktionen, unter Verwendung von M13 mit mehreren Zufallsprimern oder nur einem einzelnen Primer. Die Anwesenheit von Hexamer-Zufallsprimern oder nur eines einzigen Primers, gebunden an das M13-Substrat, ist durch Anmerkungen bezeichnet, die sich rechts neben dem Graphen und nahe am letzten Datenpunkt jeder Kurve befinden.
4 ist eine graphische Darstellung des Ausmaßes des Primer-Abbaus, hier eines zufälligen Hexamers (in % an unverändertem, verbleibendem Primer), gegen die Zeit (in Stunden) durch die Φ29-DNA-Polymerase. Die Menge an Φ29-DNA-Polymerase, die in jeder Reaktion vorhanden ist, ist durch Anmerkungen bezeichnet, die sich rechts neben dem Graphen und nahe am letzten Datenpunkt jeder Kurve befinden.
5 ist eine graphische Darstellung des Amplifikationsgrades (in pmol Produkt/Input) aufgetragen gegen die Menge an Φ29-DNA-Polymerase, die zur Reaktion hinzugefügt wurde (in Units), bei Rolling-Circle-Amplifikationsreaktionen, unter Verwendung von M13 mit exonuklaseresistenten (exo^R) oder exonukleasesensitiven (exo^S) Zufallsprimern. Die Anwesenheit von exo^R oder exo^S Hexamer-Zufallsprimern, oder von keinem Primer, die an das M13-Substrat angeheftet sind, sind durch Anmerkungen bezeichnet, die sich rechts neben dem Graphen und nahe am letzten Datenpunkt jeder Kurve befinden.
6 ist ein Elektropherogramm einer DNA-Sequenzierungsreaktion, das das Ergebnis einer durchgeführten DNA-Sequenzierungsreaktion darstellt, unter Verwendung von DNA, die durch MPRCA amplifiziert wurde, ausgehend von 0,01 ng M13-DNA als Matrize.
7 ist ein Elektropherogramm einer DNA-Sequenzierungsreaktion, das das Ergebnis einer durchgeführten DNA-Sequenzierungsreaktion darstellt, unter Verwendung von 200 ng M13-DNA als Matrize.
Ausführliche Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung mehrerer Primer bei der Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen, unter Verwendung einer zirkulären DNA-Matrize als ein Mittel, die DNA-Synthese in hohem Maße zu steigern und eine enorm gesteigerte Signal-Amplifikation zu liefern, zur Entdeckung spezifischer Nukleinsäuresequenzen, die darin enthalten sind, z. B. einer Ziel-DNA, die als einzelsträngige oder doppelsträngige zirkuläre DNA vorliegt oder Teil einer solchen zirkulären DNA ist. Während frühere Methoden oft Ziele mit beträchtlicher Komplexität verwendeten, verwendet die vorliegende Erfindung relativ einfache Ziele, wie z. B. einfache Plasmid-Ziele.
Außerdem, während andere Methoden versucht haben, zufällige Teilmengen beträchtlich komplexer Ziel-DNA-Moleküle zu vermehren (z. B. eine Nukleinsäure, die entweder DNA oder RNA enthält, deren Anwesenheit in einer Probe festgestellt werden soll oder deren Sequenz vermehrt werden soll, um sie in nachfolgenden Methoden oder Verfahren zu verwenden, oder deren Anwesenheit in jener Probe die Identität einer oder mehrerer anderer Nukleinsäuren bestimmt, deren Sequenz(en) vermehrt werden soll(en)), um einen weniger komplexen Satz an amplifiziertem Material zu bilden, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Vermehrung eines einzelnen Ziels, ohne Versuche, die Komplexität zu reduzieren oder andere Teilmengen zu bilden. Sie zieht dabei Vorteil aus der bevorzugten Amplifikation eines zirkulären Ziels gegenüber linearen DNA-Molekülen, z. B. in DNA, die aus Kolonien oder Plaques extrahiert wurde.
In einer Hinsicht bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur selektiven Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen, umfassend die Bildung eines Gemisches, enthaltend: mehrere einzelsträngige, nicht-zirkuläre Oligonukleotid-Primer (P1), ein oder mehrere zirkuläre Amplifikationsziele (ATCs), eine Rolling-Circle-DNA-Polymerase vom Φ29-Typ, ausgewählt aus DNA-Polymerasen der Phagen Φ29, Cp-1, PRD1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, SF5, GA-1, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 und L17, und mehreren Deoxynukleosidtriphosphaten (dNTP), unter Bedingungen, bei denen ATC an mehr als einen der mehreren P1 Primer bindet und wobei die Bedingungen die Replikation des Amplifikationszielkreises begünstigen, indem die P1 Primer verlängert werden, um mehrere Tandem-Sequenz-DNA(TS-DNA)-Produkte zu bilden, wobei das ATC direkt aus einer Kultur gewonnen ist.
So kann man in einer Ausführungsform ein Vorgemisch zur Verfügung stellen, wie z. B. in Form eines Kits, das eine Rolling-Circle-DNA-Polymerase vom Φ29-Typ enthält, und sogar mehr als eine Polymerase einschließt, einen geschützten Oligonukleotidprimer, wie z. B. ein Hexamer, die erforderlichen Nukleosidtriphosphate, einen geeigneten Puffer, eine Pyrophosphatase und andere möglicherweise wünschenswerte Bestandteile, entweder mit jedem Bestandteil in einem eigenen Fläschchen oder in verschiedenen Kombinationen zusammengemischt, um eine Gesamtmenge von ein, zwei, drei oder mehr getrennten Fläschchen zusammenzustellen und, z. B., ein leeres oder ein Pufferfläschchen, um eine geplante Ziel-Nukleinsäure zur Verwendung im Amplifikationsprozess zu suspendieren. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Kit zum Amplifizieren von DNA-Sequenzen, das nukleaseresistente Zufallsprimer enthält, eine DNA-Polymerase und ein oder mehrere Deoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), die markiert sein können, wie z. B. mit einem fluoreszierenden Rest oder mit einem radioaktiven Marker. In einer anderen Ausführungsform besitzt die DNA-Polymerase 3'-5'-Exonuklease-Aktivität. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Polymerase eine Φ29-DNA-Polymerase. Ein solches Kit kann weiterhin ein Set an Anweisungen enthalten, auf Papier oder möglicherweise auch auf Computerdiskette oder CD-Rom, um die Verfahren der Erfindung durchzuführen.
Bei einer spezifischen Anwendung einer solchen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, bei dem eine Nukleinsäure-Probe, wie z. B. eine DNA in Kreisform, in einem Puffer suspendiert wird, wie z. B. TE-Puffer, und dann erwärmt und abgekühlt wird, und anschließend mit oben angegebenen Bestandteilen in Kontakt gebracht wird, entweder nacheinander oder durch Zufügen dieser Bestandteile als oben erwähntes Vorgemisch, wobei die Bedingungen für Temperatur, pH-Wert und dergleichen anschließend angepasst werden, z. B. durch Halten (Bewahren) einer solchen Kombination bei 30°C.
Außerdem können die Bedingungen, die bei der Durchführung der Verfahren verwendet werden, die entsprechend der vorliegenden Erfindung aufgezeigt wurden, bei jeder gegebenen Anwendung variieren. Somit können, als nicht einschränkendes Beispiel, die Primer und ATCs unter Bedingungen zugefügt werden, die die Hybridisierung begünstigen, und die DNA-Polymerase und die Nukleosidtriphosphate können unter anderen Bedingungen zugefügt werden, die die Amplifikation begünstigen, ohne eine Denaturierung der Primer- ATC-Komplexe zu verursachen, die als Substrate für die Polymerase oder die Polymerasen dienen.
Bei einer anderen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur selektiven Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen, umfassend:

(a) Mischen mehrerer einzelsträngiger, nicht-zirkulärer Oligonukleotidprimer (P1) und eines oder mehrerer Amplifikations-Zielkreise (ATC) unter Bedingungen, bei denen ATC mit mehr als einem der mehreren P1-Primer ein Hybrid bildet, um ein Primer-ATC-Proben-Gemisch zu produzieren;
(b) Zufügen einer Rolling-Circle-DNA-Polymerase vom Φ29-Typ, ausgewählt aus DNA-Polymerasen der Phagen Φ29, Cp-1, PRD1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, SF5, GA-1, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 und L17 und mehrerer Deoxynukleosidtriphosphate unter Bedingungen, die die Replikation des Amplifikationszielkreises fördern, indem die P1-Primer verlängert werden, um mehrere primäre Tandem-Sequenz-DNA(TS-DNA)-Produkte zu bilden, wobei das ATC direkt aus einer Kultur gewonnen ist.

Bei der Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es selbstverständlich, dass es zahlreiche Reihenfolgen gibt, in denen Bestandteile zugefügt werden können und die obige Reihenfolge der Zugabe soll nicht limitierend sein, sondern soll so gelesen werden, um die ganze Reihe der Zugabekombinationen einzuschließen, die ein Fachmann als von Interesse oder als wertvoll ansehen würde in dem speziellen Zusammenhang, in dem diese Diskussion vorgelegt wird. Zum Beispiel könnten alle Komponenten gleichzeitig in einem Ein-Schritt-Protokoll zugefügt werden, oder die DNA-Polymerase könnte vor der Zugabe zum DNA-Ziel mit exonukleaseresistenten Primern gemischt werden.
Insgesamt können die Schritte der Methoden in jeder Reihenfolge ausgeführt werden, in der sie hier zitiert sind, können aber, wo gewünscht, vorteilhaft oder anderweitig zweckdienlich, in jeder passenden Reihenfolge ausgeführt werden, so lange die Zielsetzung und die Vorteile der Erfindung erreicht werden. Somit kann z. B. das oben zitierte Verfahren durchgeführt werden, indem Primer und ATCs in einem Medium gemischt werden, das bereits die DNA-Polymerase enthält.
Bei einer Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren, wie hier beschrieben, bei dem ATC an mindestens 3, 4, 5, sogar 10 oder mehr Oligonukleotidprimer bindet oder hybridisiert, wobei jeder Primer unter geeigneten Bedingungen ein getrenntes Tandem-Sequenz-DNA-Molekül bildet. Da die Sequenzen der Tandem-Sequenz-DNAs (TS-DNAs) komplementär zu den Sequenzen der ATCs sind, die als Matrize fungieren, werden natürlich die TS-DNA-Produkte alle die gleiche Sequenz haben, wenn die ATCs die gleiche Sequenz haben, ungeachtet der Sequenz der Primer.
Eine beispielhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die mehrere (hier drei) Primer für jeden Amplifikations-Zielkreis (ATC) verwendet, ist in 1 gezeigt. Oligonukleotidprimer (jeder mit einer Länge von 20–50 Basen und in A dargestellt) mit Bereichen, die zu einzelnen Segmenten eines Amplifikations-Zielkreises komplementär sind, hybridisieren spezifisch mit dem Amplifikations-Zielkreis (dargestellt in B). C zeigt die Ergebnisse der Zugabe von dNTPs, DNA-Polymerase usw. zu den hybridisierten Strukturen von B, wobei das 3'-Ende jedes Primers verlängert wird. Die Verlängerung jedes Produktes schreitet fort, wobei die DNA-Polymerase die synthetisierte DNA durch das anliegende Enzym verdrängt. Oligonukleotidprimer können wahlweise einen Bereich oder eine Nukleotidsequenz am 5'-Ende der Primer enthalten, wobei dieser Bereich oder diese Nukleotidsequenz nicht-komplementär zu ATC ist, wenn eine solche nicht-komplementäre Region oder Nukleotidsequenz als nützlich gilt, um die Fähigkeit der DNA-Polymerase zu verbessern, eine DNA-Synthese mit Strangverdrängung durchzuführen. In der spezifischen Ausführungsform, die hier gezeigt ist, interagiert ein ATC mit 3 Primern und 3 Enzymmolekülen, um 3 lineare Replikationsrunden an derselben Amplifikationszielkreis-Matrize zu erhalten.
Bei einzelnen Ausführungsformen können die Oligonukleotidprimer (P1), die bei den Methoden der Erfindung verwendet werden, entweder spezifisch oder zufällig sein, wobei die letzteren besonders nützlich sind. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „spezifisch" auf einen Primer, der eine Nukleotidsequenz besitzt oder so konstruiert ist, dass er eine Nukleotidsequenz besitzt, die, im Sinne von Watson-Crick, komplementär zu einer Sequenz ist, die sich im Amplifikationszielkreis (ATC) befindet und die dazu dient, die Hybridisierung des Primers mit ATC zu erleichtern, besonders wenn die komplementäre Sequenz innerhalb des Oligonukleotidprimers das 3'-Ende des Primers einschließt. Solche spezifischen Sequenzen können an ihren 5'-Enden eine Sequenz einschließen, die zu keinem Abschnitt der ATC-Matrize komplementär ist, wobei der letztere nicht-komplementäre Abschnitt dazu dient, die Verdrängung der TS-DNA während der nachfolgenden Amplifikationsrunden zu erleichtern. Wo solche spezifischen Primer verwendet werden, wird die Zahl der Primer, die an einen gegebenen ATC binden, gewöhnlich in Beziehung stehen zur Anzahl der korrespondierenden komplementären Stellen, die sich auf dem ATC befinden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Primer, die zur Amplifikation verwendet werden, zufällige Sequenzen besitzen. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „zufällig", dass die Oligonukleotidprimer (P1) Nukleotidsequenzen besitzen, die keinen Bezug zu den Nukleotidsequenzen des Amplifikationszielkreises (ATC) besitzen, der als Matrize für die Amplifikation dient. Das Ergebnis einer solchen zufälligen Beziehung ist, dass die Stellen auf dem ATC, an denen die Zufallsprimer hybridisieren, ebenfalls zufällig sein werden. Außerdem werden, da die Primer zufällige Sequenzen besitzen, Fälle auftreten, bei denen ein gegebener Primer unvollständig mit dem ATC hybridisieren kann und eines oder mehrere Nukleotide besitzen kann, die nicht komplementär zu dem korrespondierenden Nukleotid oder den korrespondierenden Nukleotiden auf dem ATC sind. Man muß verstehen, dass solche Vorkommnisse in keiner Weise dazu dienen, die Verwendung solcher Primer aus dem Umfang der vorliegenden Erfindung zu entfernen. Zum Beispiel ist es unwahrscheinlich, dass solche Vorkommnisse die Wirksamkeit der Zufallsprimer beim Initiieren der DNA-Synthese auf dem ATC vermindern werden.
Die Oligonukleotidprimer, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können jede gewünschte Länge besitzen. Zum Beispiel können solche Primer eine Länge von mindestens 2 bis etwa 30 bis 50 Nukleotiden besitzen, vorzugsweise eine Länge von etwa 2 bis etwa 35 Nukleotiden, am bevorzugtesten eine Länge von etwa 5 bis etwa 10 Nukleotiden, wobei Hexamere und Octamere speziell bevorzugte Ausführungsformen darstellen. Solche multiplen Primer, wie sie hier verwendet werden, können gleichermaßen nur spezifisch, oder nur zufällig oder eine Mischung aus beidem sein, wobei Zufallsprimer besonders nützlich und praktisch sind bei der Bildung und Verwendung.
Obwohl die Ausführungsform, dargestellt in 1, die Verwendung von spezifischen Primern (hier 3 an der Zahl, aber jede Anzahl reicht aus) zeigt, können die Primer leicht zufällig und von einer höheren Anzahl sein. Somit bildet jeder an ATC gebundene Primer eine Replikationsgabel, während er durch die DNA-Polymerase um den ATC herum verlängert wird. Je länger ein ATC ist, desto mehr Amplifikationsgabeln werden erwarteterweise gebildet. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, gibt es gewöhnlich etwa alle 10 bis etwa alle 1000 Nukleotide der ATC-Matrize Amplifikationsgabeln, wobei eine Amplifikationsgabel etwa alle 50 bis etwa alle 100 Nukleotide sicherlich normal ist, und sogar eine Amplifikationsgabel etwa alle 10 Nukleotide o. ä. ist nicht unerwartet bei der vorliegenden Erfindung.
Die Oligonukleotidprimer der vorliegenden Erfindung können Abschnitte besitzen, die zu einem Teilbereich des ATC komplementär sind, und das nicht-limitierende Beispiel, dargestellt in 1, zeigt lediglich die Verwendung von drei derartiger Primer, die alle gleich lang zu sein scheinen. Wie bereits dargelegt wurde, ist die vorliegende Erfindung jedoch weder in der Anzahl derartiger Primer, die an einen gegebenen ATC binden, noch in der Länge dieser Primer beschränkt, oder deren Sequenzen, die in demselben Experiment verwendet werden, können leicht von unterschiedlicher Länge sein oder dieselbe Länge besitzen, wie in der Abbildung gezeigt.
Amplifikationszielkreise (ATCs), die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, sind ringförmige DNA- oder RNA-Moleküle, entweder einzel- oder doppelsträngig, einschließlich DNA-RNA-Hybridmolekülen, die gewöhnlich zwischen 40 und 10000 Nukleotide enthalten. Man erwartet jedoch, dass es keine Obergrenze für die Größe des ATC geben wird. Wenn der ATC ein doppelsträngiger Ring ist, sollen sich solche Zahlenangaben eher auf Basenpaare beziehen als auf einzelne Nukleotidreste. Die ATCs, die in den Verfahren von Nutzen sind, die hier beschrieben sind, können funktionell unterschiedliche Teilbereiche oder Abschnitte besitzen, die sie für verschiedene Zwecke besonders nützlich machen. Mindestens zwei solcher Teilbereiche werden zu einem oder mehreren Oligonukleotidprimern komplementär sein und werden, wenn sie vorhanden sind, als primerkomplementäre Bereiche oder Stellen bezeichnet. Amplifikationszielkreise, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen z. B. solche, die direkt aus Quellen wie einer Bakterienkolonie, einem Bakteriophagen, einem Virusplaque, einer Hefekolonie, einem Baculovirusplaque sowie aus transient transfizierten eukaryotischen Zellen gewonnen sind. Solche Quellen können vor dem Gewinnen der ATCs lysiert werden oder nicht. Wo solche Quellen lysiert worden sind, wird eine solche Lyse üblicherweise durch eine Anzahl von Mitteln erreicht, einschließlich dem lysierenden Agens Hitze, ein Enzym, wobei letzteres Enzyme wie Lysozym, Helicase, Glucylase und Zymolase einschließt, aber nicht auf diese beschränkt ist, oder ein solches lysierendes Agens kann ein organisches Lösungsmittel sein.
Amplifikationszielkreise (ATCs) der vorliegenden Erfindung enthalten die Zielsequenzen, die mit den hier beschriebenen Methoden amplifiziert werden sollen, und in Übereinstimmung mit der vorliegenden Beschreibung soll sich die Bezeichnung von P1 und ATC auf eine Anfangsrunde der RCA beziehen und kann, durch Verwendung der geeigneten Sequenzen für die P1-Primer, leicht ausgeweitet werden auf die Verwendung von zusätzlichen derartigen DNA-Amplifikationsrunden, durch Zufügen nachfolgender Gemische aus Oligonukleotidprimern, bezeichnet als P2-Primer, die ziemlich die gleichen Eigenschaften wie P1-Primer haben, aber Abschnitte besitzen, die zu einem oder mehreren der Tandem-Sequenz-DNA-Produkte (die selbst zu den Start-ATCs komplementär sind) komplementär sind. Natürlich sind derartige weitere Amplifikationsrunden lediglich eine Option, die zur Anwendung bei den Verfahren der Erfindung zur Verfügung steht, und die Planung und Ausführung solcher zusätzlicher Runden liegen im Bereich des fachmännischen Könnens der Molekularbiologie und werden hier nicht weiter beschrieben werden.
Bei der MPRCA findet Amplifikation mit jedem Primer statt, wobei ein Konkatemer aus Tandem-Repeats (d. h. eine TS-DNA) von Abschnitten gebildet wird, die zum primären ATC (oder ATC), der von jedem Primer repliziert wird, komplementär sind. Somit werden da, wo Zufallsprimer verwendet werden, viele derartige TS-DNAs gebildet, eine von jedem Primer, um eine in hohem Maße gesteigerte Amplifikation der entsprechenden ATC-Sequenz zu liefern, da die Nukleotidsequenz, oder Struktur, des Produktes nur von der Sequenz des ATC abhängt, der als Matrize verwendet wird, und nicht von den Sequenzen der Oligonukleotidprimer, ob die letzteren zufällig oder spezifisch oder ein Gemisch aus beiden darstellen.
Während frühere Technologien Zufallsprimer verwendet haben [vgl. z B. Lizardi, U.S. Pat. Nr. 5,854,033], wurden diese dazu benutzt, ganze Genome oder lineare Sequenzen zu amplifizieren und nicht die einzelsträngigen oder doppelsträngigen Ringe der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Verbesserung gegenüber bestehenden Methoden (Cheung, V. G. und Nelson, S. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14676–14679 (1996)) und Zufallsprimern (Zhang, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5847–5851 (1992)), die zufällige oder mehrere Primer bei der Amplifikation linearer Ziel-DNA benutzen, mit der hier vorgeschlagenen Verwendung von Φ29-DNA-Polymerase als bevorzugtem Enzym für diese Reaktion und mit der Verwendung von exonukleaseresistenten Primern (siehe unten). Deshalb schließt die vorliegende Erfindung eine Methode zur Amplifikation von linearen Ziel-DNAs mit hohem Molekulargewicht ein, die sich die Eigenschaften der Φ29-DNA-Polymerase und die exonukleaseresistenten Primer zunutze macht, welche mit der 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, assoziiert mit der Φ29-DNA-Polymerase, kompatibel sind, und bei der das lineare DNA-Ziel an Stelle eines ATCs verwendet werden kann.
Wie bereits beschrieben, können die Amplifikations-Zielkreise, die als Matrize für die Amplifikation, die hier gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellt ist, verwendet werden, entweder einzelsträngige DNA-Ringe oder Duplex(doppelsträngige)-DNA-Ringe sein. Wo diese ATCs doppelsträngig sind, kann es wünschenswert sein, dass mindestens ein Strang des Doppelstrangs einen Strangbruch enthält. Solche Strangbrüche sind gewöhnlich in doppelsträngigen Ringen vorhanden, können aber auch in solche Ringe, z. B. wie durch auf dem Fachgebiet bekannte enzymatische Methoden, eingefügt werden, wenn sie nicht bereits vorhanden sind. Alternativ kann das Vorhandensein eines Strangbruchs in einem Strang eines doppelsträngigen Ringes weder wünschenswert noch notwendig sein. Die beiden Stränge eines doppelsträngigen DNA-Rings können in Abwesenheit von Strangbrüchen durch dem Fachmann bekannte Verfahren ausreichend denaturiert oder aufgewunden werden, um die Hybridisierung mehrerer Primer, die für die MPRCA notwendig sind, zu ermöglichen.
Wo doppelsträngige Ringe verwendet werden, wird die Amplifikation üblicherweise an beiden Strängen als Matrizen stattfinden. Gleichzeitige Amplifikation beider Ringe kann erwünscht sein oder nicht. In Fällen, in denen die doppelsträngigen Ringe in Reaktionen weiter verwendet werden sollen, die geplant wurden, um die DNA der Ringe zu sequenzieren, ist die Amplifikation beider Stränge eine wünschenswerte Eigenschaft, und so können die doppelsträngigen Ringe direkt ohne weiteres Bearbeiten (außer zur Bildung eines Strangbruchs, wenn nötig) verwendet werden. Bei anderen Anwendungen jedoch, bei denen gleichzeitige Amplifikation beider Stränge kein erwünschtes Kennzeichen ist, liegt es im Bereich fachmännischen Könnens, die Stränge vor der Amplifikation durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung zu denaturieren und zu trennen, oder, alternativ, mehrere spezifische Primer zu verwenden, die Sequenzen enthalten, die nur zu einem der beiden Stränge der doppelsträngigen ringförmigen Matrize komplementär sind. Zweifellos werden den Fachleuten sofort andere nützliche Strategien einfallen und müssen hier nicht weiter beschrieben werden.
In Abhängigkeit von der Größe des amplifizierten Ringes, davon, ob er einzelsträngig ist oder eine doppelsträngige Struktur besitzt, und von der verwendeten DNA-Polymerase, erreicht die MPRCA einen extrem hohen Grad der Amplifikation (und Sensitivität), der für die Zahl der Kreise (oft aus dem Augenblick heraus bestimmt für die einzelnen Primer und Zielsequenzen, die verwendet werden sollen), die DNA-Polymerasen, die dNTPs und Mg²⁺ optimiert werden kann.
Unter manchen Umständen kann es erwünscht sein, das Ausmaß der erreichten Amplifikation und/oder die Menge an TS-DNA, die gebildet wird, quantitativ zu bestimmen, oder unter manchen Umständen im Stande zu sein, auf eine unterscheidbare Art die relativen Mengen an Amplifikationszielkreisen zu messen, die da gebildet werden, wo die ATCs des Start-Gemisches in Struktur und/oder Größe nicht einheitlich sind. In solchen Fällen funktioniert die vorliegende Erfindung gut mit jeder Anzahl an Standard-Nachweis-Methoden, wie z. B. da, wo spezielle Deoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) verwendet werden, die quantitative Messungen erleichtern. Das gebräuchlichste Beispiel ist, wo solche Nukleotidsubstrate radioaktiv markiert sind oder eine andere Art von Markierung besitzen, wie z. B. eine Fluoreszenz-Markierung oder ähnliches. Wiederum sind die Methoden, die unter solchen Umständen angewendet werden, zahlreich und die benutzten Techniken sind Standard und dem Fachmann gut bekannt. Somit umfassen solche Nachweis-Markierungen jedes Molekül, das, direkt oder indirekt, mit amplifizierter Nukleinsäure verbunden werden kann und zu einem messbaren, nachweisbaren Signal führt, entweder direkt oder indirekt. Viele solcher Markierungen zum Einbau in Nukleinsäuren oder zur Kopplung an Nukleinsäuresonden sind dem Fachmann bekannt. Allgemein gebräuchliche Beispiele umfassen radioaktive Isotope, fluoreszierende Moleküle, phosphoreszierende Moleküle, Enzyme, Antikörper und Liganden.
Beispiele von geeigneten Fluoreszenzmarkern umfassen CyDyes, wie z. B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5 und Cy5.5, erhältlich von Amersham Pharmacia Biotech (U.S. Patent Nr. 5,268,486). Weitere Beispiele von geeigneten fluoreszierenden Markern umfassen Fluorescein, 5,6-Carboxymethylfluorescein, Texas-Rot, Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD), Cumarin, Dansylchlorid und Rhodamin. Bevorzugte Fluoreszenzmarker sind Fluoreszein (5- Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester) und Rhodamin (5,6-Tetramethylrhodamin). Diese können von verschiedenen kommerzieller Quellen bezogen werden, einschließlich Molecular Probes, Eugene, OR und Research Organics, Cleveland, Ohio.
Markierte Nukleotide sind eine bevorzugte Form von Nachweis-Marker, da sie während der Synthese direkt in die Produkte der RCA eingebaut werden können. Beispiele für Nachweis-Marker, die in amplifizierte DNA eingebaut werden können, umfassen Nukleotid-Analoga wie z. B. BrdUrd (Hoy und Schimke, Mutation Research, 290: 217–230 (1993)), BrUTP (Wansick et al., J. Cell Biology, 122: 283–293 (1993)) und Nukleotide, die mit Biotin modifiziert sind (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 6633 (1981)) oder mit geeigneten Haptenen, wie z. B. Dioxygenin (Kerkhof, Anal. Biochem, 205: 359–364 (1992)). Geeignete fluoreszenzmarkierte Nukleotide sind Fluorescein-isothiocyanat-dUTP, Cyanin-3-dUTP und Cyanin-5-dUTP (Yu et al., Nucleic Acids Res., 22: 3226–3232 (1994)). Ein bevorzugter nukleotidanaloger Nachweismarker für DNA ist BrdUrd (BUDR-triphosphat, Sigma), und ein bevorzugter nukleotidanaloger Nachweismarker ist Biotin-16-uridin-5'-triphosphat (Biotin-16-dUTP, Boehringer, Mannheim). Radioaktive Marker sind besonders nützlich für die hier beschriebenen Amplifikationsmethoden. Somit können solche dNTPs einen leicht nachweisbaren Rest einbauen, wie z. B. einen Fluoreszenzmarker, wie her beschrieben.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Mittel, durch verschiedenartige Methoden eine Signalamplifikation zu erreichen. In diesem Fall besteht der Zweck darin, ein Signal zu amplifizieren, das den Nachweis oder die Charakterisierung eines Zieles ermöglicht. Bei Methoden, die Fälle einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind, in denen eine DNA durch Befestigung einer markierten Sonde oder durch Einbau eines markierten Nukleotids, oder durch Markierung eines DNA-Produktes nach der Synthese, z. B. durch kovalente Modifikationen oder Einfügen nachweisbarer Moleküle, liefert die vorliegende Erfindung einen Weg, das DNA-Produkt und damit die Signalintensität zu amplifizieren.
Die Methoden der vorliegenden Erfindung liefern eine in hohem Maße gesteigerte Amplifikation infolge multipler Priming-Ereignisse, die auf zirkulären DNA-Molekülen, die Amplifikationsziele darstellen, induziert werden. Somit ist die Amplifikationsrate und das Amplifikationsausmaß nicht beschränkt auf das, was durch eine einzelne DNA-Polymerase erzielt wird, die den DNA-Ring kopiert. Stattdessen werden mehrere DNA-Polymerasen veranlasst, jede zirkuläre Matrize gleichzeitig zu kopieren, wobei jede von einem der Primer ausgehend beginnt. Es ist diese Eigenschaft, die einen einzigartigen Vorteil der vorliegenden Methode darstellt.
In einer Ausführungsform der Methoden der vorliegenden Erfindung werden völlig zufällige Primer für das Amplifikationsverfahren verwendet, das ein besonders erwünschtes Verfahren darstellt, weil die Sequenz des ATC, das die Matrize bildet, nicht bekannt sein muss. Somit kann ohne weiteres jeder einzelsträngige oder doppelsträngige DNA-Ring verwendet werden, mit oder ohne umfassende Reinigung, entsprechend den Methoden, die hier beschrieben sind. Somit besteht ein Hauptvorteil der Verwendung von Zufallsprimern darin, dass zirkuläre DNA-Ziele mit bekannter oder unbekannter Sequenz aus einem komplexen Gemisch von DNA-Molekülen, die Gemische sowohl aus linearen als auch zirkulären DNA-Molekülen enthalten, bevorzugt und selektiv amplifiziert werden können.
Eine spezifische Ausführungsform ist in Beispiel 1 beschrieben, bei der DNA des Bakteriophagen M13, an der neun unterschiedliche Oligonukleotidprimer an neun unterschiedliche Stellen um den Ring herum angeheftet sind, eine höhere Amplifikation liefert als M13-DNA, die sechs oder weniger Primer trägt. Darüberhinaus liefert eine M13-DNA, die sechs unterschiedliche Primer besitzt, eine höhere Amplifikation als M13-DNA, die drei oder weniger Primer trägt. Schließlich liefert eine M13-DNA, die drei Primer trägt, eine höhere Amplifikation als M13 mit nur einem Primer.
Eine andere spezifische Ausführungsform ist in Beispiel 2 beschrieben, bei der M13-DNA, die zufällige, um den Ring herum angeheftete Oligonukleotidprimer besitzt, eine höhere Amplifikation liefert als M13 mit nur einem Primer.
Eine weitere spezifische Ausführungsform ist in Beispiel 3 beschrieben, bei der Kolonie-Roh-Extrakte die Quelle für zirkuläre Plasmid-DNA-Ziele, und Plaque-Roh-Extrakte die Quelle für zirkuläre Bakteriophage-M13-DNA-Ziele darstellen. Diese Zielkreise werden gegenüber der vorhandenen Bakterien-DNA bevorzugt amplifiziert, unter Anwendung der Methoden der vorliegenden Erfindung.
Eine weitere spezifische Ausführungsform ist in Beispiel 5 beschrieben, bei der M13-DNA, die exonukleaseresistente Zufallsprimer um den Ring herum angeheftet hat, eine höhere Amplifikation liefert als M13 mit exonukleasesensitiven Zufallsprimern. Dies stimmt überein mit den in Beispiel 4 dargestellten Ergebnissen, in dem gezeigt wird, dass solche speziellen exonukleaseresistenten Nukleotide, wenn keine Zufallsprimer vorhanden sind, oft ohne weiteres abgebaut werden, besonders beim Vorliegen größerer Mengen eines Enzyms mit Exonuklease-Aktivität.
Eine weitere spezifische Ausführungsform ist in Beispiel 6 beschrieben, bei der DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Matrizen-DNA, die ausgehend von 0,01 ng M13-DNA amplifiziert wurde, zu einer Signalstärke führte, die dem Signal ähnlich war, das man von 200 ng nicht-amplifizierter DNA-Matrize erhielt.
Eine weitere spezifische Ausführungsform ist in Beispiel 7 beschrieben, bei der Kolonie-Roh-Extrakte die Quelle für zirkuläre BAC-DNA-Ziele darstellen, und diese BAC-Ziele werden gegenüber der vorhandenen Bakterien-DNA bevorzugt amplifiziert, unter Anwendung der Methoden der vorliegenden Erfindung.
Eine weitere spezifische Ausführungsform ist in Beispiel 8 beschrieben, bei der Amplifikation von menschlicher, genomischer DNA unter Verwendung von exonukleaseresistentem zufälligem Hexamer anstelle von unmodifiziertem zufälligem Hexamer die Ausbeuten mindestens 200fach verbessern kann.
Exonukleaseresistente Primer, die bei den hier beschriebenen Methoden zweckdienlich sind, können modifizierte Nukleotide enthalten, um sie gegen Exonuklease-Verdauung resistent zu machen. Z. B. kann ein Primer eine, zwei, drei oder vier Phosphorthioat-Bindungen zwischen Nukleotiden am 3'-Ende des Primers besitzen.
Somit bezieht sich, in manchen Ausführungsformen, die vorliegende Erfindung auf Verfahren, in denen die Primer mindestens ein Nukleotid enthalten, das den Primer resistent gegen Abbau, üblicherweise durch ein Enzym, insbesondere durch eine Exonuklease und ganz besonders durch 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, macht. In einer solchen Ausführungsform kann mindestens ein Nukleotid ein Phosphorthioat-Nukleotid oder irgendein modifiziertes Nukleotid sein. Ein solches Nukleotid ist üblicherweise ein 3'-terminales Nukleotid, aber die Verfahren der vorliegenden Erfindung beziehen sich auch auf Ausführungsformen, in denen ein solches Nukleotid an einer anderen als der 3'-terminale Position lokalisiert ist und in denen das 3'-terminale Nukleotid des Primers durch 3'-5'-Exonuklease-Aktivität entfernt werden kann.
Es kann auch bei der vorliegenden Erfindung vorteilhaft sein, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, um eine ATC-Matrize an einem festen Träger zu befestigen. Um dies zu erreichen, muss man nur für jeden der ATCs, die amplifiziert werden sollen, einen einzelnen Oligonukleotid-Primer an einen festen Träger binden. Somit wird, bei Ausführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, ein gegebener ATC an mehrere Primer gebunden, von denen lediglich einer selbst an irgendeine Art von festem Träger gebunden sein muss. Oft ist es von Vorteil, dass solch ein bindender Primer bipolar ist und somit zwei 3'-Enden besitzt, wobei eines der Enden dazu dient, den Primer an den Träger zu binden, während der andere an den Ring binden und einen Primer für die Amplifikation zur Verfügung stellen kann. Keiner der anderen mehreren Primer, die an den ATC gebunden sind, muss selbst an irgendeine Art von Träger gebunden sein. Der bipolare bindende Primer kann spezifisch oder zufällig sein, ohne Nachteil für die hier beschriebenen Verfahren. Beispiele für solche bipolare Primer sowie ihre Vorbereitung und Verwendung sind in der Literatur gut bekannt [siehe z. B. die Beschreibung von Lizardi et al. (1998), oben].
Außerdem können die ATCs der vorliegenden Erfindung auch in einer Form verwendet werden, in der sie direkt, durch welches zweckmäßige Mittel auch immer, an irgendeine Art von festem Träger gebunden sind, obwohl die Befestigung unter Verwendung eines Oligonukleotidprimers besonders praktisch und unkompliziert ist.
Das Binden von ATCs oder Oligonukleotidprimern an solche Träger kann mittels mehrerer Molekülarten erfolgen, wie z. B. irgendeine biologische oder andere Polymerart, die dazu dient, den Primer oder das ATC an einen festen Träger zu binden. Solche für die Methoden der Erfindung nützliche, Festkörper- Substrate können jedes feste Material umfassen, an das Oligonukleotide gebunden werden können. Dies schließt Materialien ein, wie z. B. Acrylamid, Cellulose, Nitrocellulose, Glas, Polystyren, Polyethylenvinylacetat, Polypropylen, Polymethacrylat, Polyethylen, Polyethylenoxid, Glas, Polysilicate, Polycarbonate, Teflon, Fluorcarbone, Nylon, Siliconkautschuk, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Polyorthoester, Polypropylfumarat, Kollagen, Glycosaminoglycane und Polyaminosäuren. Festkörper-Substrate können jede zweckmäßige Form haben, einschließlich dünner Filme oder Membranen, Kügelchen, Flaschen, Schalen, Fasern, Fasergewebe, geformte Polymere, Partikel und Mikropartikel. Eine bevorzugte Form für ein Festkörper-Substrat ist ein Glas-Objektträger oder eine Microtiter-Platte (z. B. die Standard-Platte mit 96 Vertiefungen). Bevorzugte Ausführungsformen verwenden Glas oder Plastik als Träger. Zusätzliche Anordnungen sind im U.S. Patent Nr. 5,854,033 beschrieben.
Methoden zur Immobilisierung von Oligonukleotiden an Festkörper-Substraten sind gut etabliert. Oligonukleotide, einschließlich Adress-Sonden und Nachweis-Sonden, können unter Verwendung etablierter Kopplungsmethoden an Substrate gebunden werden. Geeignete Befestigungsmethoden sind z. B. bei Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11): 5022–5026 (1994) beschrieben. Eine bevorzugte Methode zur Befestigung von Oligonukleotiden an Festkörper-Substraten ist bei Guo et al., Nucleic Acids Res. 22: 5456–5465 (1994) beschrieben.
Oligonukleotidprimer und ATCs, die in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, können unter Verwendung etablierter Oligonukleotid-Synthesemethoden synthetisiert werden. Methoden zur Oligonukleotid-Synthese sind auf dem Fachgebiet bekannt. Solche Methoden können sich erstrecken vom enzymatischen Abbau als Standard, gefolgt von der Isolierung der Nukleotidfragmente (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, New York, NY, 1997), und Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molcular Biology, Vol. 62, (Tuan, Hrsg., Humana Press, Totowa, NJ, 1997), deren Beschreibungen hier durch Bezugnahme eingefügt sind) bis zu rein synthetischen Methoden, z. B. durch die Cyanethylphosphoramidit-Methode, die einen Milligen oder Beckman System 1Plus DNA-Syntheseapparat (z. B. Modell 8700 automatisierter Syntheseapparat von Milligen-Biosearch, Burlington, Mass. oder ABI Modell 380B) verwendet. Zur Oligonukleotid-Herstellung nützliche, synthetische Methoden sind auch bei Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53: 323–356 (1984), (Phosphotriester- und Phosphittriester-Methoden), und Narang et al., Methods Enzymol., 65: 610–620 (1980), (Phosphotriester-Methode) beschrieben. Protein-Nukleinsäure-Moleküle können unter Verwendung bekannter Methoden, wie z. B. jener, beschrieben von Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5: 3–7 (1994), hergestellt werden.
Methoden zur Synthese von Primern, die exonukleaseresistente Phosphorthioat-diester durch chemische Sulfurisation enthalten, sind gut etabliert. Die Festphasen-Synthese von Zufallsprimern verwendet einen oder mehrere spezifisch zwischen den Nukleotiden platzierte Phosphorthioat-diester am 3'-Ende. Phosphothioat-triester können eingefügt werden durch Oxidierung der Zwischenform Phosphit-triester, die man während der Phosphoramidit-Chemie mit 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid^1,2 oder Beaucage-Reagenz erhält, um 5-wertigen Phosphor zu bilden, in dem der Phosphorthioat-triester als ein Thion vorliegt. Das auf diese Weise gebildete Thion ist gegenüber den darauf folgenden Oxidationsschritten, die nötig sind, um internukleotidische Phosphodiester zu bilden, stabil (Iyer, R. P., Egan, W., Regan, J. B., und Beaucage, S. L., J. Am. Chem. Soc., 112: 1253 (1990), und Iyer, R. P., Philips, L. R., Egan, W., Regan, J. B., und Beaucage, S. L., J. Org. Chem, 55: 4693 (1990)).
Viele der hier beschriebenen Oligonukleotide sind so geplant, dass sie zu bestimmten Bereichen anderer Nukleotide oder Nukleinsäuren komplementär sind, so dass Hybride zwischen ihnen gebildet werden können. Die Stabilität dieser Hybride kann berechnet werden unter Verwendung von bekannten Methoden, wie z. B. jene beschrieben in Lesnick und Freier, Biochemistry 34: 10807–10815 (1995), McGraw et al., Biotechniques 8: 674–678 (1990), und Rychlik et al., Nucleic Acid Res. 18: 6409–6412 (1990).
DNA-Polymerasen, die im Rolling-Circle-Replikationsschritt der RCA zweckmäßig sind, müssen Rolling-Circle-Replikation von geprimten, einzelsträngigen Ringen durchführen (oder von jedem Strang eines doppelsträngigen Substrats). Solche Polymerasen sind hier als Rolling-Circle-DNA-Polymerasen bezeichnet. Für die Rolling-Circle-Replikation bevorzugt man eine DNA-Polymerase, die fähig sein soll, den Strang, der dem Matrizenstrang komplementär ist, zu verlagern, was als Strangverlagerung bezeichnet wird, und keine 5'-3'-Exonukleaseaktivität besitzt. Strangverlagerung ist notwendig, um als Ergebnis eine Synthese von multiplen Tandem-Kopien des ATC zu erhalten. Eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität, falls vorhanden, könnte die Zerstörung des synthetisierten Strangs zur Folge haben. Man bevorzugt auch DNA-Polymerasen, die hoch prozessiv sind, zur Verwendung in der beschriebenen Methode. Die Eignung einer DNA-Polymerase zur Verwendung in der beschriebenen Methode kann leicht ermittelt werden, indem man ihre Fähigkeit bestimmt, Rolling-Circle-Replikation durchzuführen. Bevorzugte Rolling-Circle-DNA-Polymerasen sind die DNA-Polymerase des Bakteriophagen Φ29 (U.S. Pat. Nr. 5,198,543 und 5,001,050 von Blanco et al.) und die DNA-Polymerase des Phagen PRD1 (Jung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8287 (1987), und Zhu und Ito, Biochem. Biophys. Acta 1219: 267–276 (1994)). Φ29-DNA-Polymerase wird am meisten bevorzugt. Besonders die DNA-Polymerasen vom Φ29-Typ, ausgewählt aus DNA-Polymerasen der Phagen Φ29, Cp-1, PRD1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, SF5, GA-1, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 und L17, werden verwendet. In einer bestimmten Ausführungsform ist die DNA-Polymerase eine DNA-Polymerase des Bakteriophagen Φ29, wobei die multiplen Primer gegen Exonukleaseaktivität resistent sind und die Ziel-DNA eine lineare DNA von hohem Molekulargewicht ist.
Strang-Verdrängung während der RCA, besonders, wenn Doppelstrang-ATCs als Matrizen verwendet werden, können durch Verwendung eines Strangverdrängungsfaktors, wie z. B. eine Helicase, erleichtert werden. Im Allgemeinen ist jede DNA-Polymerase, die Rolling-Circle-Replikation in Anwesenheit eines Strangverdrängungsfaktors durchführen kann, zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet, sogar, wenn die DNA-Polymerase in Abwesenheit eines solchen Faktors keine Rolling-Circle-Replikation ausführt. Strangverdrängungsfaktoren, die für die RCA nützlich sind, umfassen die Zusatz-Untereinheit der BMRF 1-Polymerase (Tsurumi et al., J. Virology 67(12): 7648–7653 (1993)), Adenovirus-DNA-bindendes Protein (Zijderveld und van der Vliet, J. Virology 68(2): 1158–1164 (1994)), virales Herpes-simplex-Protein ICP8 (Boehmer und Lehman, J. Virology 67(2): 711–715 (1993); Skaliter und Lehman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(22): 10665–10669 (1994)), einzelsträngige, DNA-bindende Proteine (SSB; Rigler und Romano, J. Biol. Chem. 270: 8910–8919 (1995)), und Kalbs-Thymus-Helicase (Siegel et al., J. Biol. Chem. 267: 13629–13635 (1992)).
Die Fähigkeit einer Polymerase, Rolling-Circle-Replikation auszuführen, kann durch Verwendung der Polymerase in einem Rolling-Circle-Replikationsversuch ermittelt werden, wie z. B. beschrieben bei Fire und Xu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4641–4645 (1995) und bei Lizardi (U.S. Patent Nr. 5,854,033, z. B. Beispiel 1).
In einzelnen spezifischen Ausführungsformen kann die Ziel-DNA z. B. eine einzelsträngige Bakteriophagen-DNA, ein doppelsträngiges DNA-Plasmid oder eine anderer Vektor sein, der zum Zwecke der DNA-Sequenzierung, der Klonierung oder Kartierung und/oder zum Nachweis amplifiziert wird. Die weiter unten folgenden Beispiele liefern spezifische Protokolle, die Bedingungen können aber, in Abhängigkeit von den DNA-Ringen, die amplifiziert werden sollen, variieren.
Somit muss man, bei der Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, verstehen, dass Verweise auf besondere Puffer, Medien, Reagenzien, Zellen, Kulturbedingungen, pH-Werte und ähnliches nicht limitierend sein sollen, sondern gelesen werden sollen, um alle erwähnten Materialien, die ein Fachmann als interessant oder wertvoll ansehen würde in dem besonderen Zusammenhang, in dem diese Diskussion präsentiert wird, einzuschließen. Z. B. ist es oft möglich, ein Puffersystem oder Kulturmedium durch ein anderes zu ersetzen und noch immer ähnliche, wenn nicht identische, Ergebnisse zu erhalten. Fachleute auf dem Gebiet werden genügend Kenntnis von derartigen Systemen und Methoden haben, um, ohne unnötiges Experimentieren, solche Austausche unter Verwendung der hier dargestellten Methoden und Verfahren so vorzunehmen zu können, dass sie ihren Zielsetzungen bestmöglich dienen.
Die vorliegende Erfindung wird, aus erläuternden und nicht-limitierenden Absichten, weiter beschrieben durch die folgenden, nicht-limitierenden Beispiele. Bei der Anwendung der Beschreibung dieser Beispiele sollte im Sinn behalten werden, dass sich andere und unterschiedliche Ausführungsformen der Methoden, beschrieben entsprechend der vorliegenden Erfindung, zweifellos für die Fachleute auf diesem Gebiet selbstverständlich sein werden.
Beispiel 1
Erhöhte Ausbeute bei der Rolling-Circle-Amplifikation unter Verwendung multipler, spezifischer Primer
Darin wird gezeigt, dass die Ausbeute an amplifizierter DNA bei der RCA erhöht ist, wenn multiple Primer an das DNA-Substrat angeheftet sind. Bei der RCA kann der Ertrag an amplifizierter DNA durch die Anzahl der Replikationsgabeln limitiert sein, die auf der ringförmigen Matrize eingesetzt worden sind. Die Einführung multipler Replikationsgabeln auf einer einzelsträngigen, zirkulären DNA erhöht proportional die Anzahl der Punkte, an denen Amplifikation stattfindet. Die Verwendung multipler Primer, angeheftet an eine zirkuläre DNA-Matrize, führt zur Einführung multipler Replikationsgabeln durch die DNA- Polymerase. Dieses Beispiel zeigt, dass DNA-Synthese gesteigert ist, wenn multiple Primer an einem DNA-Substrat befestigt sind.
Geprimte M13-DNA wurde wie folgt hergestellt. Neun Oligonukleotide wurden erhalten, die sich an bestimmte Stellen rund um die einzelsträngige, virale M13-(+)-Strang-DNA anheften. Die Anheftungsreaktionen enthielten M13-DNA und entweder eines der Oligonukleotide, drei der Oligonukleotide, sechs der Oligonukleotide oder alle neun Oligonukleotide. Die Anheftung wurde durchgeführt in Reaktionenansätzen (100 μl), die 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 40 mM NaCl, 6,5 μg der viralen M13-(+)-Strang-DNA (äquivalent zu 2,75 pmol M13-Ringen) und 50 pmol von jedem zugefügten Oligonukleotid enthielten. Unter diesen Bedingungen betrug das Verhältnis Oligonukleotid:Ring für jeden Primer 18:1. Die Reaktionsansätze wurden für 1 Minute auf 95°C erwärmt und langsam über 30 Minuten auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die Strukturen der neun Oligonukleotide waren wie folgt:
Primer 1
Primer 2
Primer 3
Primer 4
Primer 5
Primer 6
Primer 7
Primer 8
Primer 9
Vier RCA-Reaktionen wurden durchgeführt, um den gesteigerten Ertrag der DNA-Synthese durch die Verwendung multipler Primer, die an einzelsträngige, zirkuläre DNA gebunden sind, aufzuzeigen. Die Reaktionsansätze (50 μl) enthielten 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl₂ und 30 mM NaCl, 200 μM Deoxyribonukleosidtriphosphate, α-[³²P]-dCTP, spezifische Aktivität 40 cpm/pmol Gesamt-dNTP, 12 ng geprimte, virale M13-(+)-Strang-DNA und 26 Units T7-Sequenase.
Die Reaktionsansätze wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach 30, 60, 90 und 120 Minuten wurden Aliquots entnommen und auf einen DE81-Filter getropft, um die DNA-Synthese durch den Einbau radioaktiver Deoxyribonukleotide mengenmäßig zu bestimmen. Der Amplifikationsgrad der eingesetzten M13-DNA wurde bestimmt durch Bildung des Quotienten aus den pmol der eingebauten Deoxyribonukleotide, geteilt durch die pmol der Deoxyribonukleotide, die in der eingesetzten M13-DNA vorhanden waren. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
Wie man sehen kann, findet an M13-Matrizen, die mehr gebundene Primer besitzen, signifikant mehr DNA-Synthese statt.
Beispiel 2
Erhöhte Ausbeute bei der Rolling-Circle-Amplifikation unter Verwendung von Hexamer-Zufallsprimern
Es wurde ebenso gezeigt, dass die Ausbeute an amplifizierter DNA bei der RCA verbessert wird, wenn multiple Hexamer-Zufallsprimer an das DNA-Substrat angeheftet sind.
Geprimte M13-DNA wurde wie folgt hergestellt. Einfach geprimte M13-DNA wurde wie oben beschrieben hergestellt. Die Anheftungsreaktion für DNA mit Hexamer-Zufallsprimern enthielt M13-DNA und zufällige Hexamer-Oligonukleotide. Die Anheftung wurde in einem Reaktionsansatz (60 μl) ausgeführt, der 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 6 ng virale M13-(+)-Strang-DNA (entsprechend 2,5 fmol M13-Ringen) und 6000 pmol zufällige Hexamer-Primer enthielt. Unter diesen Bedingungen war das Verhältnis Primer:Ring 2,4 × 10⁶:1. Die Reaktionsansätze wurden für 1 Minute auf 95°C erwärmt und langsam über 30 Minuten auf Zimmertemperatur abgekühlt.
Zwei RCA-Reaktionen wurden durchgeführt, um die gesteigerte Ausbeute der DNA-Synthese unter Verwendung von Hexamer-Zufallsprimern, die an zirkuläre Einzelstrang-DNA angeheftet sind, darzustellen. Reaktionsansätze (20 μl) enthielten 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 20 mM Ammoniumsulfat und 200 μg/ml Rinderserum-Albumin, 1 mM Deoxyribonukleosidtriphosphate, α-[³²P]-dCTP, spezifische Aktivität 24 cpm/pmol Gesamt- dNTP, und 0,3 Units Φ29-DNA-Polymerase. Die erste Reaktion enthielt 1 ng einzeln geprimten M13, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, während die zweite Reaktion 1 ng M13 mit Hexamer-Zufallsprimern enthielt, hergestellt wie oben beschrieben.
Die Reaktionsansätze wurden für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach 2, 6 und 24 Stunden wurden Aliquots entnommen, und der Einbau von radioaktiven Deoxyribonukleotide wurde bestimmt. Der Amplifikationsgrad der eingesetzten M13-DNA wurde durch die Bildung des Quotienten aus den pmol der eingebauten Deoxyribonukleotide, geteilt durch die pmol der Deoxyribonukleotide, die in der eingesetzten M13-DNA vorhanden waren, bestimmt. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
Wie man sehen kann, findet an M13-Matrizen, die multiple Zufallsprimer angeheftet tragen (siehe M13-Kurve mit Hexamer-Zufallsprimern), im Vergleich zu einzeln-geprimtem M13 (siehe einzel-geprimte M13-Kurve) signifikant mehr DNA-Synthese statt. Unter diesen Bedingungen wurde eine 370fache Amplifikation der M13-DNA erreicht, was für die Amplifikation von kleinen Mengen an DNA-Matrize von großem Nutzen ist.
Beispiel 3
Rolling-Circle-Amplifikation von Plasmid- und Bakteriophagen-DNA aus Bakterienkolonien und Plaques unter Verwendung von Hexamer-Zufallsprimern
Es wurde auch gezeigt, dass zirkuläre Plasmid- und Bakteriophagen-DNA, geprimt mit multiplen Hexamer-Zufallsprimern, spezifisch aus Roh-Material mittels RCA amplifiziert wird, das aus Bakterienkolonien oder Plaques gewonnen wurde.
DNA-Proben wurden wie folgt hergestellt. Ein Ende eines 1 cm langen Polyethylen-Röhrchens (Intramedic, PE20, 1,09 mm äußerer Durchmesser) wurde in eine E.-coli-Kolonie, transformiert mit dem Plasmid pUC19, oder in einen Plaque des Bakteriophagen M13 auf einem E.-coli-Rasen, gebohrt. Für die Kontroll-Reaktionen wurde das Röhrchen entweder nicht in eine Platte gebohrt oder es wurde in einen Bereich mit Bakterienrasen gebohrt, der keine Plaques und keine mit Plasmid transformierte Bakterien enthielt. Das Röhrchen wurde dann in eine Thermocycler-Röhre überführt (200 μl), die 20 μl Puffer enthielt (20 mM Tris- HCl, pH 7,5, 40 mM NaCl, 1 mM EDTA). Hexamer-Zufallsprimer (1000 pmol) wurde zu jeder Röhre zugegeben und die Reaktionsansätze wurden für 3 Minuten auf 95°C erwärmt und langsam über 30 Minuten auf Zimmertemperatur abgekühlt.
Zur Durchführung der RCA wurden die Reaktionsansätze auf ein Endvolumen von 40 μl gebracht, wobei sie Endkonzentrationen von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 20 mM Ammoniumsulfat, 5% Glycerol, 200 g/ml Rinderserum-Albumin, 1 mM Deoxyribonukleosidtriphosphate, α-[³²P]-dCTP, spezifische Aktivität 67 cpm/pmol Gesamt-dNTP, 0,04 Units Hefe-Pyrophosphatase und 0,6 Units Φ29-DNA-Poylmerase enthielten.
Die Reaktionsansätze wurden für 8 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach 8 Stunden wurde ein Aliquot entnommen und der Einbau der radioaktiven Deoxyribonukleotide bestimmt. Die Menge an DNA-Synthese wurde auf zwei Arten bestimmt. Zuerst wurde die Menge an eingebautem Deoxyribonukleotid dazu verwendet, die Menge an synthetisierter DNA in Nanogramm zu berechnen. Als zweites wurden die radioaktiv markierten Reaktionsprodukte mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut und die Produkte wurden mittels Elektrophorese im Agarose-Gel (1,0%, TBE) analysiert. Die linearen Produkte der Amplifikation von M13 (7,2 kb) und pUC19 (2,7 kb) wurden quantitativ erfasst und mit den bekannten Mengen an linearer, radioaktiv markierter M13-DNA verglichen. Die beiden Messungen der Menge an amplifizierter DNA lieferten übereinstimmende Ergebnisse. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 zeigt die Ausbeute an DNA (in ng), nachdem Plasmid- und Bakteriophagen-DNA, geprimt mit multiplen Hexamer-Zufallsprimern, ausgehend von Roh-Material, gewonnen aus Bakterienkolonien oder Plaques, amplifiziert wurde. Wie man sieht, erhält man eine signifikante Ausbeute an DNA aus Kolonien (pUC19-Plasmid-DNA) oder Plaques (Bakteriophage M13-DNA), im Vergleich zu Proben, die kein Plasmid oder keine Bakteriophagen-DNA enthalten.
Tabelle 1. Quantifizierung des Ertrages der RCA aus Plaques und Kolonien
Solche Methoden bieten beträchtliche Vorteile gegenüber früheren Methoden, die zur Sequenzierung genomischer DNA, von cDNA oder anderen komplexen DNAs angewendet wurden:

1. Es besteht keine Notwendigkeit für Plasmid- oder Phagen-Minipreps, die langsam, teuer und arbeitsintensiv sind. Plasmid- und Phagenwachstum wird auch limitiert durch die Verhinderung „giftiger" Sequenzen, die vom Bakterienwirt nicht toleriert werden. Diese Methode verhindert diese möglicherweise und wird die benötigte Zeit für Wachstum und Minipreps um etwa 24 Stunden verkürzen.
2. Es wird ein Produkt zur Verfügung gestellt, das die Sequenzierung beider Stränge erlaubt (im Vergleich zu M13-Phagen-Minipreps, die nur die Sequenzierung des Phagenstranges erlauben).
3. Es wird ein Produkt zur Verfügung gestellt, das wegen seiner Molekülgröße ideal geeignet ist zum Ausschluss elektrokinetischer Injektion, die von Kapillar-Sequenzautomaten mit hohem Durchsatz (hergestellt z. B. von Amersham Pharmacia Biotech, Applied Biosystems und Beckman Instruments) angewendet werden. Im Gegensatz dazu bilden Phagen- oder Plasmid-Minipreps Produkte, die eine Blockade der Kapillaren verursachen können, wenn sie nicht in der richtigen Menge vorliegen.
4. Es werden DNA-Mengen gebildet, die zwischen Proben (Plaques oder Kolonien) „normalisiert" sind. Das bedeutet, dass die Produktmenge so gestaltet werden kann, dass sie konstant bleibt, ohne Rücksicht auf die eingesetzte Matrizenmenge, was eine Eigenschaft darstellt, die in Kapillar-Sequenzautomaten, in denen eine übermäßige Matrizen-Zugabe die Qualität und Leselänge der Sequenz vermindert, höchst vorteilhaft ist.
5. Die Methode erlaubt eine viel größere Flexibilität in der Wahl des Vektors für die Gen-Sequenzierung. Subklonierung kann vermindert oder beseitigt werden. Allgemein übliche BACs werden in den M13-Phagen oder Plasmide von sehr eingeschränkter Zusammensetzung subkloniert. Teilweise oder vollkommen synthetische Subklonierungs-Vektoren sind ermöglicht worden, die so gestaltet werden können, dass sie die Genverbreitung maximieren und die Zahl der Sequenzierungsreaktionen minimieren.

Beispiel 4
Abbau der Primer durch die Exonuklease-Aktivität der Φ29-DNA-Polymerase
Hexamer-Zufallsprimer wurden in Anwesenheit der Φ29-DNA-Polymerase unter Bedingungen abgebaut, die zur RCA verwendet werden.
Geprimte M13-DNA wurde wie folgt hergestellt. Zufällige Hexamer-Oligonukleotide wurden am 5'-Ende mit γ³²P-ATP markiert bis zu einer spezifischen Aktivität von 1,3 × 10⁷ cpm/pmol. Annealing-Reaktionsansätze (60 μl) enthielten 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 40 mM NaCl, 1 mM EDTA, 6 ng virale M13-(+)-Strang-DNA (entsprechend 2,5 fmol M13-Ringen) und 6000 pmol markierte Hexamer-Zufallsprimer. Unter diesen Bedingungen war das Verhältnis Primer:Ring 2,4 × 10⁶:1. Die Reaktionsansätze wurden für 1 Minute auf 95°C erwärmt und langsam über 30 Minuten auf Zimmertemperatur abgekühlt.
Um den Primer-Abbau durch die Φ29-DNA-Polymerase unter RCA-Bedingungen zu bestimmen, wurden die Reaktionsansätze auf ein Endvolumen von 20 μl gebracht, wobei sie Endkonzentrationen von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 20 mM Ammoniumsulfat, 5% Glycerol, 200 μg/ml Rinderserum-Albumin, 1 mM Deoxyribonukleosidtriphosphate, 0,02 Units Hefe-Pyrophosphatase und 0,1, 1,0 und 10 Units Φ29-DNA-Polymerase enthielten, wie angegeben.
Die Reaktionsansätze wurden für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Aliquots (3 μl) wurden zum Zeitpunkt 0, nach 0,25, 2, 6 und 23 Stunden entnommen und die Reaktionsprodukte durch Elektrophorese mittels eines 25%-Polyacrylamid-Sequenzgels analysiert. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Zufallsprimer wurden bei 15-minütiger Anwesenheit von 10 Units Φ29-DNA-Polymerase vollständig abgebaut. In Anwesenheit von 0,1 und 1,0 Unit Φ29-DNA-Polymerase bestanden die Primer längere Zeit.
Somit ist die Anwendung von Methoden zur Verhinderung eines solchen Abbaus vorteilhaft. Eine derartige Methode wird im folgenden Beispiel beschrieben.
Beispiel 5
Auswirkung von exonukleaseresistenten Zufallsprimern auf die Φ29-Amplifikation von M13-RFI-DNA
Es wurde gezeigt, dass zirkuläre, doppelsträngige Bakteriophagen-DNA mit multiplen, exonukleaseresistenten Zufallsprimern in größerem Ausmaß amplifiziert wird als DNA, geprimt mit exonukleasesensitiven Primern.
Exonukleaseresistente Hexamer-Zufallsprimer wurden hergestellt durch Synthese eines degenerierten Heptamer-Oligonukleotids mit der folgenden Struktur, bei der N ein Zufallsnukleotid und die Unterstreichung ein Nukleotid mit einer 5'-Thiophosphat-Bindung repräsentiert:
In diesem Heptamer-Oligonukleotid ist der 3'-T-Rest exonukleasesensitiv und die beiden vorletzten Zufallsnukleotide am 3'-Ende sind resistent gegen 3'→5'-Exonuklease-Aktivität. In Gegenwart einer 3'→5'-Exonuklease wird der 3'-T-Rest entfernt und man erhält ein exonukleaseresistentes Hexamer-Zufallsoligonukleotid.
Geprimte M13-DNA wurde wie folgt hergestellt. Annealing-Reaktionsansätze (60 μl) enthielten 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 40 mM NaCl, 1 mM EDTA, 6 ng M13-RFI-DNA (entsprechend 2,5 fmol M13-Ringe) und 6000 pmol exonukleaseresistente Hexamer-Zufallsprimer. Unter diesen Bedingungen war das Verhältnis Primer:Ring 2,4 × 10⁶:1. Die Reaktionsansätze wurden für 1 Minute auf 95°C erwärmt und langsam über 30 Minuten auf Zimmertemperatur abgekühlt.
Um RCA durchzuführen, wurden die Reaktionsansätze auf ein Endvolumen von 20 μl gebracht, wobei sie Endkonzentrationen von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 20 mM Ammoniumsulfat, 5% Glycerol, 200 μg/ml Rinderserum-Albumin, 1 mM Deoxyribonukleosidtriphophate, α-[³²P]-dCTP, spezifische Aktivität 67 cpm/pmol Gesamt-dNTP, 0,02 Units Hefe-Pyrophosphatase und 0,3 Units Φ29-DNA-Polymerase enthielten.
Die Reaktionsansätze wurden bei 34°C inkubiert, und nach 13 Stunden wurde ein Aliquot entnommen und der Einbau an radioaktivem Deoxyribonukleotid bestimmt. Der Amplifikationsgrad der eingesetzten M13-DNA wurde durch Bildung des Quotienten aus den pmol an eingebautem Deoxyribonukleotid, geteilt durch die pmol an Deoxyribonukleotid, das in der eingesetzten M13-DNA vorhanden war, bestimmt. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Wie man sehen kann, tritt ein signifikant erhöhter Amplifikationsgrad der eingesetzten DNA auf, wenn exonukleaseresistente (exo^R) Primer verwendet werden. Zusätzlich ist eine Steigerung des Amplifikationsgrades zu beobachten, wenn steigende Mengen an Φ29-DNA-Polymerase zu den Reaktionsansätzen (siehe 1000 pmol exo^R-Hexamer- und 100 pmol exo^R-Hexamer-Kurven) zugegeben werden. Im Gegensatz dazu ist der Amplifikationsgrad unter Verwendung exonukleasesensitiver (exo^S) Primer viel geringer als der mit exo^R-Primern. Zusätzlich beobachtet man eine optimale Amplifikation unter Verwendung von exo^S-Primern und 0,3 Units Φ29-DNA-Polymerase, während höhere Enzymspiegel eine geringere Amplifikation ergaben (siehe 1000 pmol exo^S-Primer-Kurve). In Abwesenheit von zugefügtem Primer (siehe Kurve ohne Primer) wurde keine Amplifikation beobachtet. Die Verwendung von exonukleaseresistenten Zufallsprimern erlaubte eine über 9000fache Amplifikation, wobei hohe Konzentrationen an Φ29-DNA-Polymerase verwendet wurden, die großen Nutzen für die Amplifikation sehr niedriger Mengen an Matrizen-DNA bietet.
Beispiel 6
DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Matrizen-DNA, die durch Rolling-Circle-Amplifikation unter Verwendung von exonukleaseresistenten Hexamer-Primern amplifiziert wurde
Es wurde gezeigt, dass zirkuläre, einzelsträngige DNA des Bakteriophagen M13, die unter Verwendung von multiplen, exonukleaseresistenten Hexamer-Zufallsprimern amplifiziert wurde, als Matrize zur DNA-Sequenzierung nützlich ist.
Einzelsträngige M13mp18-DNA (1 ng) wurde in einer 5-Mikroliter-Reaktion amplifiziert, indem man sie mit 62 pmol Hexamer-Zufallsprimern, 2,5 Units Φ29-DNA-Polymerase, 0,007 Units anorganische Hefe-Pyrophosphatase in einem Puffer kombiniert, der 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 MgCl₂, 75 mM KCl und 0,5 mM dNTP enthielt. Die Reaktion wurde für 12 Stunden bei 30°C inkubiert, um die Amplifikation der M13-DNA zu ermöglichen. Eine Unit alkalische Phosphatase aus Kalbs-Darm wurde zugefügt und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 37°C und anschließend für 3 Minuten bei 95°C inkubiert. Zu diesem Reaktionsansatz wurden 495 Mikroliter Wasser zugegeben, und 5 Mikroliter der verdünnten Probe, die die DNA-Menge enthielt, welche aus 0,01 ng der eingesetzten M13mp18-DNA amplifiziert wurde, wurde in eine 20-Mikroliter-Sequenzierungsreaktion überführt, die 5 pmol –40 Universalprimer und 8 Mikroliter DYEnamic-ET-terminator-premix (Amersham Pharmacia Biotech) enthielt. Dieser Reaktionsansatz wurde zyklisch für 20 Sekunden bei 95°C und 60 Sekunden bei 60°C behandelt, dieses 25 mal wiederholt, dann gefällt, und die Hälfte des Produktes wurde auf einen ABI 373-Sequenzgel-Apparat aufgetragen. Das resultierende Elektropherogramm ist in 6 gezeigt. Die erhaltene Sequenz war über mehr als 400 Nukleotide fehlerfrei mit einer durchschnittlichen Signalstärke von 119.
Zu Vergleichszwecken wurden 200 ng reine, nicht-amplifizierte, einzelsträngige M13mp18-DNA als Matrize zur DNA-Sequenzierung verwendet, genau, wie für amplifizierte DNA beschrieben. Das resultierende Elektropherogramm ist in 7 gezeigt. Die erhaltene Sequenz war zu mehr als 400 Nukleotiden fehlerfrei mit einer durchschnittlichen Signalstärke von 425, was etwa 3,6mal mehr ist, als man mit einer DNA-Matrize erhält, die ausgehend von 0,01 ng eingesetzter DNA amplifiziert wurde.
Wie man sehen kann, führte die DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Matrizen-DNA, die ausgehend von 0,01 ng eingesetzter M13-DNA amplifiziert wurde, zu einer Signalstärke, die nur etwa 4fach schwächer war als das Signal, das man von einer 20000fach größeren Menge an nicht-amplifizierter DNA-Matrize erhielt. Somit besitzt die DNA-Matrizen-Amplifikation unter Verwendung der beschriebenen Methoden einen großen Nutzen, indem sie die Sequenzierung kleiner DNA-Matrizen-Mengen ermöglicht.
Beispiel 7
Rolling-Circle-Amplifikation von DNA künstlicher Bakterienchromosomen aus Bakterienkolonien unter Verwendung von exonukleaseresistenten Hexamer-Zufallsprimern
Es wurde gezeigt, dass DNA künstlicher Bakterienchromosomen (BAC), geprimt mit multiplen, exonukleaseresistenten Hexamer-Zufallsprimern, spezifisch unter Verwendung von RCA aus Roh-Material amplifiziert wird, das aus Bakterienkolonien entnommen wurde.
DNA-Proben wurden wie folgt hergestellt. Ein BAC-enthaltender Bakterienstamm (Research Genetics) wurde ausgestrichen und als Einzelkolonien gezüchtet. Ein Stück eines Polyethylen-Röhrchens (Intramedic, PE20, 1,09 mm äußerer Durchmesser) wurde in eine Kolonie gestochen und das Röhrchen wurde in ein Thermocycler-Röhrchen (200 μl) gegeben, das 20 μl Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 40 mM NaCl, 1 mM EDTA) enthielt. Exonukleaseresistenter Hexamer-Zufallsprimer (Hexamer-Zufallsprimer, der derart modifiziert ist, dass er zwei Thiophosphat-Bindungen besitzt, die nächst des 3'-Endes des Nukleotids lokalisiert sind, 1000 pmol) wurde zu jedem Röhrchen zugefügt und die Reaktionsansätze wurden für 3 Minuten auf 95°C erwärmt und langsam über 8 Stunden auf Zimmertemperatur abgekühlt. Um die RCA durchzuführen, wurden die Reaktionsansätze auf ein Endvolumen von 40 μl gebracht, wobei sie Endkonzentrationen von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 20 mM Ammoniumsulfat, 5% Glycerol, 200 μg/ml Rinder-Serumalbumin, 0,5 mM Deoxyribonukleosidtriphosphate, 0,04 Units Hefe-Pyrophosphatase und 0,6 Units Φ29-DNA-Polymerase enthielten.
Die Reaktionsansätze wurden für 8 Stunden bei 37°C inkubiert. Nachdem die Reaktionen beendet waren, wurde ein Aliquot entnommen und die DNA-Synthese photometrisch bestimmt (von einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel). Es wurde festgestellt, dass es sich bei der amplifizierten DNA um BAC-DNA handelte, sowohl durch Restriktionsendonukleasen-Analyse als auch durch DNA-Sequenzierung. Die Ausbeute an amplifizierter BAC-DNA betrug 3 μg aus einer einzelnen Bakterienkolonie. Somit besitzt die RCA unter Verwendung exonukleaseresistenter Hexamer-Zufallsprimer großen Nutzen für die Amplifizierung von BAC-DNA direkt aus Bakterienkolonien.
Beispiel 8
Amplifikation menschlicher, genomischer DNA unter Verwendung exonukleaseresistenter Hexamer-Zufallsprimer
Es wurde gezeigt, dass die Amplifikation menschlicher, genomischer DNA zu einem größeren Ausmaß bei Verwendung exonukleaseresistenter Hexamer-Zufallsprimer stattfindet im Vergleich zu menschlicher, genomischer DNA, geprimt mit exonukleasesensitiven Primern.
Menschliche, genomische DNA (Promega) wurde wie folgt amplifiziert. Die DNA (20 ng) wurde mit 700 pmol exonukleasesensitivem Zufalls-Hexamer oder exonukleaseresistentem Zufalls-Hexamer gemischt (d. h. einem Zufalls-Hexamer, das so modifiziert ist, dass es 2 Thiophosphat-Bindungen besitzt, die nächst dem 3'-Ende des Oligonukleotids lokalisiert sind) in einem Puffer, der aus 25 mM Tris HCl pH 8,0, 10 mM MgCl₂, und 50 mM KCl besteht, für 3 Minuten bei 95°C inkubiert und auf 4°C abgekühlt. Diese Gemische wurden dann mit 64 Units Φ29-DNA-Polymerase und 0,04 Units anorganische Hefe-Pyrophosphatase versetzt in einem Puffer, bestehend aus 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 50 mM KCl und 0,5 mM dNTP in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern. Die Reaktionsansätze wurden für 16 Stunden bei 30°C inkubiert, um die Amplifikation der DNA zu ermöglichen. Einmal amplifiziert, wurde die Menge des DNA-Produktes photometrisch (von einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel) bestimmt. Die DNA-Probe, die mit Zufalls-Hexamer geprimt war, wurde 2fach amplifiziert, während die DNA-Probe, die mit nukleaseresistentem Hexamer geprimt war, 400fach amplifiziert wurde. Somit kann die Verwendung eines exonukleaseresistenten Zufallshexamers anstelle eines unmodifizierten Zufallshexamers die Ausbeute mindestens 200fach verbessern und ist von großem Nutzen für die effiziente Amplifikation von DNA-Präparaten mit hohem Molekulargewicht, wie z. B. von menschlicher, genomischer DNA.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur selektiven Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen, umfassend die Bildung eines Gemisches, enthaltend: multiple, einzelsträngige, nicht-zirkuläre Oligonukleotidprimer (P1), ein oder mehrere zirkuläre Amplifikationsziele (ATCs), eine Rolling-Circle-DNA-Polymerase vom Φ29-Typ, ausgewählt aus DNA-Polymerasen der Phagen Φ29, Cp-1, PRD1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, SF5, GA-1, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 und L17, und mehrere Deoxynukleosidtriphosphaten (dNTP), unter Bedingungen, bei denen das ATC an mehr als einen der multiplen P1 Primer bindet und wobei die Bedingungen die Replikation des zirkulären Amplifikationsziels Amplifikationszielkreises begünstigen, indem die P1 Primer verlängert werden, um mehrere Tandem-Sequenz-DNA (TS-DNA) Produkte zu bilden, wobei das ATC direkt aus einer Kultur gewonnen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer Primer mit spezifischen Sequenzen sind, die komplementär zu Abschnitten eines ATCs sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer Zufallsprimer sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer ein Gemisch aus Zufallsprimern und spezifischen Primern umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer eine Länge in einem Bereich von 2 bis 50 Nukleotiden aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer eine Länge in einem Bereich von 2 bis 35 Nukleotiden aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer eine Länge in einem Bereich von 2 bis 10 Nukleotiden aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer Hexamere sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer Octamere sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer am 5'-Ende der Primer einen Bereich aufweisen, der zu dem ATC nicht komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ATC eine einzelsträngige, zirkuläre DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ATC eine doppelsträngige, zirkuläre DNA ist, die mindestens einen Strangbruch aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ATC eine doppelsträngige, zirkuläre DNA ohne Strangbrüche ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ATC eine einzelsträngige, zirkuläre RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, des weiteren umfassend einen Denaturierungsschritt, um die beiden Stränge der doppelsträngigen, zirkulären DNA zu trennen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das zirkuläre Amplifikationsziel direkt erhalten wird aus einem Element ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterienkolonie und Extrakt eines Virenplaques.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Element lysiert worden ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Lyse durch Behandlung mit einem Mittel erreicht wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wärme und Enzym und einem organischen Lösungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lysozym, Helicase, Glucylase und Zymolyase.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ATC nicht größer als etwa 10.000 Nukleotide ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ATC größer als 10.000 Nukleotide ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ATC nicht größer als etwa 1.000 Nukleotide ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ATC nicht größer als etwa 100 Nukleotide ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zirkuläre Amplifikationsziel eine einzelsträngige Bakteriophagen-DNA, ein doppelsträngiges DNA-Plasmid oder einen anderen Vektor, oder einen von einem solchen Vektor abgeleiteten Klon enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zu amplifizierende zirkuläre Amplifikationsziel eine unbekannte Sequenzzusammensetzung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das dNTP ein Element ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dTTP, dCTP, dATP, dGTP, dUTP, ein natürlich vorkommendes, von den Vorgenannten abweichendes dNTP, ein Analoges eines dNTPs und eines dNTPs enthaltend eine universelle Base.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei mindestens eines der dNTPs radioaktiv markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei mindestens ein Nukleotid die TS-DNA nach dessen Einbau dorthinein resistent gegenüber Nukleaseaktivität macht.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei mindestens ein Nukleotid ein Phosphorothioatnukleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Nukleaseaktivität auf einer Endonuklease beruht.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Nukleaseaktivität auf einer Exonuklease beruht.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Exonukleaseaktivität auf einer Polymerase mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität beruht.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Exonukleaseaktivität auf einem zugesetzten Exonukleaseenzym beruht.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Exonukleaseaktivität auf einer verunreinigenden Nuklease beruht.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das zumindest eine Nukleotid ein modifiziertes Nukleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens ein P1 Primer an einem festen Träger befestigt ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei der feste Träger aus Glas oder Kunststoff hergestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Primern, die resistent gegenüber Exonukleaseaktivität sind, und Primern, die gegenüber Nukleaseaktivität empfindlich sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die multiplen Primer gegenüber Exonukleaseaktivität resistent sind und die Ziel-DNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus genomischer DNA und cDNA.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Exonukleaseaktivität durch ein Enzym bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Exonukleaseaktivität durch eine 3'-5'-Exonuklease bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Exonukleaseaktivität durch eine DNA-Polymerase mit 3'-5'-Exonukleaseaktivität bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Exonukleaseaktivität durch eine verunreinigende Nuklease bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei jeder der nukleaseresistenten Primer mindestens ein Nukleotid enthält, welches den Primer resistent gegenüber Nukleaseaktivität macht.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei das mindestens eine Nukleotid ein modifiziertes Nukleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei das modifizierte Nukleotid ein 3'-terminales Nukleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei das modifizierte Nukleotid ein Phosphorothioatnukleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei jeder der exonukleaseresistenten Primer mindestens zwei Nukleotide enthält, welche den Primer resistent gegenüber Exonukleaseaktivität machen.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei das mindestens eine Nukleotid an einer anderen als der 3'-terminalen Position angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei das 3'-terminale Nukleotid des Primers durch 3'-5'-Exonukleaseaktivität entfernt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase die DNA-Polymerase des Bakteriophagen Φ29 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase die DNA-Polymerase des Bakteriophagen Φ29 ist und die multiplen Primer gegenüber Exonukleaseaktivität resistent sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase die DNA-Polymerase des Bakteriophagen Φ29 ist, die multiplen Primer gegenüber Exonukleaseaktivität resistent sind und die Ziel-DNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus genomischer DNA und cDNA.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase keine 3',5'-Exonukleaseaktivität aufweist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die multiplen Primer gegenüber Exonukleaseaktivität resistent sind.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die DNA-Polymerase Φ29 DNA-Polymerase ist.
Verfahren zur selektiven Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen, umfassend: (a) Mischen von multiplen, einzelsträngigen, nicht-zirkulären Oligonukleotidprimern (P1) und einem oder mehreren zirkulären Amplifikationszielen (ATC) unter Bedingungen, bei denen jedes der ATC an einen der multiplen P1 Primer bindet, um ein Primer-ATC-Probengemisch zu erzeugen; (b) Zugabe einer Rolling-Circle-DNA-Polymerase vom Φ29-Typ, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNA-Polymerasen der Phagen Φ29, Cp-1, PRD1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, SF5, GA-1, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 und L17, sowie mehreren Deoxynukleosidtriphosphaten unter Bedingungen, welche die Replikation des zirkulären Amplifikationsziels durch Verlängerung des P1 Primers begünstigen, um multiple primäre Tandemsequenz-DNA (TS-DNA)-Produkte zu bilden und wobei das ATC direkt aus einer Kultur gewonnen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens eines der Deoxyribonukleosidtriphosphate einen einfach nachweisbaren Rest enthält.
Verfahren nach Anspruch 58, wobei der nachweisbare Rest ein Fluoreszenzmarker ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kultur ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienkolonien, Virusplaques, Hefekolonien, einem Baculovirusplaque und transient transfizierten, eukaryotischen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zirkuläre Amplifikationsziel (ATC) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid, Virus und künstlichen Bakterienchromosomen (BAC).
Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Kultur ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienkolonien, Virusplaques, Hefekolonien, einem Baculovirusplaques und transient transfizierten, eukaryotischen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 57, wobei das zirkuläre Amplifikationsziel (ATC) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid, Virus und künstlichen Bakterienchromosomen (BAC).