ES2718343T3 - Evaluación del riesgo de discapacidad lectora y lingüística - Google Patents

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DESCRIPCIÓN
Evaluación del riesgo de discapacidad lectora y lingüística
Antecedentes
Las dificultades del aprendizaje (DA) específicas son trastornos caracterizados por una dificultad inesperada con un modo de aprendizaje específico, a pesar de la presencia de un coeficiente intelectual (CI) adecuado y oportunidades educativas adecuadas. Las DA pueden afectar las competencias en las áreas de la lectura, la escritura, el habla y las matemáticas, entre otras, pero las más comunes se relacionan con el lenguaje. El Instituto Nacional de Salud y Desarrollo Infantil (NICHD) estima que entre el 15 y el 20 % de los estadounidenses tiene una DA asociada al lenguaje, y que es la discapacidad lectora (DL) la que afecta a la mayoría (1). La DL, también conocida como dislexia, es una dificultad específica con el procesamiento del lenguaje escrito (2). Otra DA, el trastorno del lenguaje (TL), se caracteriza por una dificultad para procesar y expresar el lenguaje hablado (3). Estas DA son con frecuencia concomitantes; los niños con TL tienen un mayor riesgo de desarrollar DL (3). Debido a que las competencias lectoras y lingüísticas son fundamentales para lograr el éxito académico, las personas afectadas corren el riesgo de sufrir efectos psicológicos adversos, así como también de tener posibilidades educativas y laborales limitadas (2). Además, la prevalencia de estas DA hace que el costo de las medidas de apoyo sea una carga para el sistema educativo (4). La intervención es más eficaz cuanto antes se administre (2), lo que hace que la detección temprana de las personas de alto riesgo sea una posibilidad deseable.
El documento WO 2006/032021 describe un haplotipo de siete marcadores (AGCTAGA), que abarca los exones de 5 a 8 de DCDC2, que se correlaciona con la dislexia.
HAROLD et al. (“Evidencia adicional de que el gen KIAA0319 confiere susceptibilidad a la dislexia del desarrollo”, MOLECULAR PSYCHIATRY, 2006, vol. 11, n.212, páginas 1085-1091), SCERRI et al. (“DCDC2, KIAA0319 y CMIP están asociados a rasgos relacionados con la lectura”, BIOLOGICAL PSYCHIATRY, vol. 70, n.° 3, 2011, páginas 237-245), COPE et al. (“Las variantes en el locus DYX2 están asociadas a la activación cerebral alterada en regiones cerebrales relacionadas con la lectura en sujetos con discapacidad lectora”, NEUROIMAGE, 2012, vol. 63, n.° 1, páginas 148-156) y LIND et al. (“Dislexia y DCDC2: la variación normal en la lectura y la ortografía está asociada a polimorfismos de DCDC2 en una muestra de población australiana”, EUROPEAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, 2010, vol. 18, n.° 6, páginas 668-673) describen el DCDC2 como un gen marcador asociado a las dificultades del aprendizaje y describen varios polimorfismos que están relacionados con diferentes discapacidades lectoras y cognitivas.
Compendio
La presente divulgación proporciona métodos, matrices y micromatrices tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas. Tal como se describe en el presente documento, dos haplotipos, ambos en el mismo bloque de haplotipos de seis marcadores en el gen de riesgo de discapacidad lectora (DL), DCDC2, están asociados, respectivamente, a la discapacidad lectora y al trastorno del lenguaje (TL). Cada uno de los haplotipos presenta un desequilibrio de enlace muy fuerte con un alelo de BV677278 (también conocido como READ1), que es una repetición corta en tándem STR de compuestos polimórficos asociada a la discapacidad lectora y capaz de modular la expresión del promotor de DCDC2. Se ha demostrado que BV677278 (READ1) se une específicamente a ETV6, un potente regulador transcripcional y protooncogén, in vivo. BV677278 se une a la proteína nuclear expresada en el cerebro con una especificidad muy alta y es capaz de modular la expresión del gen reportero del promotor de DCDC2 de una manera específica con respecto a los alelos. Los patrones de activación en las áreas del cerebro relacionadas con la lectura, medidos por imágenes de resonancia magnética funcional, están influenciados por los alelos de BV677278. El trabajo que se describe en el presente muestra que BV677278 está asociado a la lectura y el lenguaje, y que al menos dos alelos de BV677278 tienen un efecto perjudicial sobre la lectura y el lenguaje. El alelo 5 es importante para la dislexia (DL) y el alelo 6 es importante para el trastorno del lenguaje. BV677278 ha sufrido un cambio de nombre y en el presente también se denomina READ1, que significa “elemento regulador asociado a la dislexia 1”. Los dos términos se usan indistintamente.
Como también se describe en el presente documento, los haplotipos o alelos de riesgo de DCDC2 interactúan con un haplotipo de riesgo de KIAA0319 de una manera sinérgica. La sinergia entre los alelos de BV677278 (READ1) o los haplotipos de riesgo de DCDC2 y los haplotipos de KIAA0319 en la disminución del rendimiento en la eliminación de fonemas (muy importante para la lectura), la ortografía, el coeficiente intelectual total y el coeficiente intelectual de rendimiento no se ha descrito anteriormente. Juntos, el efecto es de 3 a 8 veces mayor que si está presente la versión perjudicial de un alelo o un haplotipo de riesgo.
En particular, en el presente se describe un bloque de haplotipos de seis marcadores dentro de DCDC2, de los cuales dos haplotipos (CGCGAG y GACGAG) están asociados a un rendimiento muy bajo en una tarea de eliminación de fonemas y una medición compuesta del lenguaje, respectivamente. Los dos haplotipos muestran una fuerte asociación con sus respectivos fenotipos: CGCGAG con DL y GACGAG con TL. Los portadores del haplotipo CGCGAG, en promedio, mostraron un rendimiento significativamente inferior en ocho mediciones relacionadas con la lectura, en comparación con los no portadores, y los portadores del haplotipo GACGAG mostraron un rendimiento medio significativamente inferior en la medición compuesta del lenguaje WOLD/WR.
En el presente documento se describen además los métodos para identificar o ayudar a identificar a un individuo que corre el riesgo de desarrollar al menos una (o más) dificultad(es) del aprendizaje (DA), para los cuales se analiza una muestra obtenida del individuo a fin de determinar la presencia de al menos un haplotipo (o más) en el locus DYX2 (cromosoma 6p; 6p22) que está asociado a la susceptibilidad de desarrollar al menos una (o más) DA en seres humanos. La presencia de al menos un haplotipo que esté asociado a la susceptibilidad de desarrollar al menos una (o más) DA en seres humanos en el locus DYX2 indica que el individuo corre el riesgo de desarrollar al menos una (o más) DA. En algunos aspectos de la divulgación, dicho al menos una DA es la discapacidad lectora (DL) o el trastorno del lenguaje (TL). Dicho al menos un haplotipo puede ubicarse en el gen DCDC2, dentro del locus DYX2, o en el gen KIAA0319, dentro del locus DYX2. De manera alternativa, se analiza una muestra para determinar la presencia de un haplotipo ubicado en el gen DCDC2, dentro del locus DYX2, y la presencia de un haplotipo ubicado en el gen KIAA0319, dentro del locus DYX2. Dicho al menos un haplotipo puede comprender (a) CGCGAG, GACGAG, o ambos en un gen DCDC2 dentro del locus DYX2; (b) uno o más polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) asociados a una variante de KIAA0319, como rs4504469, rs2038137 o rs2143340 o cualquier combinación de dos o tres de rs4504469, rs2038137 y rs2143340; o (c) cualquier combinación de los haplotipos en (a) y (b). En el presente documento también se describen métodos para tratar a un individuo con una DA sospechada o confirmada. El tratamiento puede incluir, por ejemplo, inhibir a ETV6 en el individuo y/o proporcionar servicios diseñados para abordar o remediar ciertos aspectos asociados con una DA, como la DL o el TL, tal como proporcionar intervención, incluidos servicios y materiales como, entre otros, utilizar técnicas especiales de enseñanza; realizar modificaciones en el aula, como proporcionar tiempo adicional para realizar las tareas y pruebas grabadas para permitir que el individuo escuche, en lugar de leer, las pruebas; utilizar libros grabados; utilizar programas de procesamiento de texto con características de verificación ortográfica; ayudar al individuo a aprender a través de experiencias multisensoriales; enseñar herramientas de afrontamiento; y proporcionar servicios para fortalecer la capacidad del individuo para reconocer y pronunciar palabras.
En el presente documento se describe un método para determinar si una muestra obtenida de un individuo comprende ácido nucleico que comprende un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) en seres humanos, que comprende analizar una muestra que comprende ácido nucleico del individuo para determinar la presencia en el locus DYX2 de al menos uno de los siguientes marcadores: (a) CGCGAG en un gen DCDC2; (b) GACGAG en un gen DCDC2; (c) tanto CGCGAG como GACGAG en un gen DCDC2; (d) rs4504469 en un gen KIAA0319; (e) rs2038137 en un gen KIAA0319; (f) rs2143340 en un gen KIAA0319; (g) cualquier combinación de dos o tres de rs4504469, rs2038137 y rs2143340 en un gen KIAA0319; y (h) cualquier combinación de CGCGAG en un gen DCDC2; GACGAG en un gen DCDC2; tanto CGCGAG como GACGAG en un gen DCDC2; rs4504469 en un gen KIAA0319; rs2038137 en un gen KIAA03109; rs2143340 en un gen KIAA0319; y cualquier combinación de dos o tres de rs4504469, rs2038137 y rs2143340 en un gen KIAA0319, en donde si la muestra comprende al menos uno de (a) - (h), la muestra comprende un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje en seres humanos. En un aspecto, la muestra se analiza para determinar la presencia de al menos un marcador de (a), (b) y (c), y al menos un marcador de (d), (e), (f) y (g). En varios aspectos de la divulgación, la muestra se analiza para determinar la presencia de dos o más marcadores de (a), (b) y (c), y dos o más marcadores de (d), (e), (f) y (g); solo marcadores de (a), (b) y (c); solo marcadores de (d), (e), (f) y (g); o cualquier combinación de los marcadores de (a) - (h). La DA puede ser DL o TL, o tanto DL como TL. Se puede analizar cualquier muestra que contenga ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico; ARN) que pueda analizarse en busca de un haplotipo de interés; los métodos para analizar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y también se describen en el presente documento. Incluyen, entre otros, métodos mediados por hibridación y secuenciación. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, células o tejido. De manera alternativa, se puede secuenciar ADN genómico y determinar la presencia o ausencia de un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) en seres humanos. En un aspecto, el método comprende además analizar la muestra para determinar la presencia del alelo 5 del gen DCDC2, como se presenta en este documento (por ejemplo, la SEQ ID NO: 35); el alelo 6 del gen DCDC2, como se presenta en este documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 36), o ambos.
Otro aspecto de la divulgación es un método para analizar una muestra en busca de un marcador de un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad de aprendizaje (DA) en seres humanos, que comprende: (a) obtener una muestra que comprenda ácido nucleico de un individuo; y (b) determinar si la muestra comprende al menos uno de los siguientes: (i) CGCGAG en un gen DCDC2 en el locus DYX2; (ii) GACGAG en un gen DCDC2 en el locus DYX2; (iii) tanto CGCGAG como GACGAG en un gen DCDC2 en el locus DYX2; (iv) rs4504469 en un gen KIAA0319 en el locus DYX2; (v) rs2038137 en un gen KIAA0319 en el locus DYX2; (vi) rs2143340 en un gen KIAA0319 en el locus DYX2; (vii) cualquier combinación de dos o tres de rs4504469, rs2038137 y rs2143340 en un gen KIAA0319 en el locus dYx 2; y (viii) cualquier combinación de CGCGAG en un gen DCDC2; GACGAG en un gen DCDC2 en el locus DYX2; tanto CGCGAG como GACGAG en un gen DCDC2 en el locus DYX2; rs4504469 en un gen KIAA0319 en el locus DYX2; rs2038137 en un gen KIAA03109 en el locus DYX2; rs2143340 en un gen KIAA0319 en el locus DYX2; y cualquier combinación de dos o tres de rs4504469, rs2038137 y rs2143340 en un gen KIAA0319 en el locus DYX2, en donde si la muestra comprende al menos un marcador de (i) - (vii), la muestra comprende un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje en seres humanos.
En un aspecto, la muestra se analiza para detectar al menos un marcador de (i), (ii) y (iii) y al menos un marcador de (iv), (v), (vi) y (vii). La DA es discapacidad lectora (DL) o trastorno del lenguaje (TL), o tanto DL como TL. Se puede analizar cualquier muestra que contenga ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico; ARN) que pueda analizarse en busca de un haplotipo de interés; los métodos para analizar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y también se describen en el presente documento. Incluyen, entre otros, métodos mediados por hibridación y secuenciación. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, células o tejido. De manera alternativa, se puede secuenciar ADN genómico y determinar la presencia o ausencia de un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) en seres humanos.
Un aspecto adicional de la divulgación es un método para determinar si una muestra obtenida de un individuo comprende ácido nucleico que comprende un alelo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) en seres humanos, que comprende: analizar una muestra que comprende ácidos nucleicos del individuo para determinar la presencia del alelo 5 del gen DCDC2 en el locus DYX2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 35), alelo 6 del gen DCDC2 en el locus DYX2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 36), o tanto el alelo 5 del gen DCDC2 como el alelo 6 del gen DCDC2, en donde si la muestra comprende al menos uno del alelo 5 y el alelo 6, la muestra comprende un alelo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje. La DA es discapacidad lectora (DL) o trastorno del lenguaje (TL), o tanto DL como TL. Se puede analizar cualquier muestra que contenga ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico; ARN) que pueda analizarse en busca de un haplotipo de interés; los métodos para analizar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y también se describen en el presente documento. Incluyen, entre otros, métodos mediados por hibridación y secuenciación. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, células o tejido. De manera alternativa, se puede secuenciar ADN genómico y determinar la presencia o ausencia de un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) en seres humanos.
Un aspecto adicional de la divulgación es un método para determinar si una muestra obtenida de un individuo comprende al menos un marcador asociado a discapacidad lectora (DL) y trastorno del lenguaje (TL) concomitantes en seres humanos, que comprende: (a) obtener un muestra que contenga ácido nucleico del individuo y (b) analizar la muestra para determinar la presencia de (i) al menos un marcador en el gen DCDC2 en el locus DYX2 para un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar DA en seres humanos y (ii) al menos un marcador en el gen KIAA0319 en el locus DXY2 para un haplotipo asociado con la susceptibilidad de desarrollar TL en seres humanos, en donde si la muestra comprende un marcador de (i) y un marcador de (ii), la muestra comprende al menos un marcador asociado a DL y TL concomitantes. El marcador de (b) (i) y el marcador de (b) (ii) pueden ser el mismo marcador o dos marcadores diferentes. En un aspecto, dicho al menos un marcador de (b)(i) es CGCGAG o GACGAG, y dicho al menos un marcador de (b)(ii) es rs4504469; rs2038137; o rs2143340. En cualquiera de estos aspectos de la divulgación, el método puede comprender además analizar la muestra para determinar la presencia del alelo 5 del gen DCDC2 en el locus DYX2, el alelo 6 del gen DCDC2 del locus DYX2, o tanto el alelo 5 del gen DCDC2 en el locus DYX2 como el alelo 6 del gen DCDC2 en el locus DYX2. En aún otros aspectos de la divulgación, dicho al menos un marcador de (b)(i) y dicho al menos un marcador de (b)(ii) se seleccionan de: rs12636438; rs1679255; rs9521789; rs1983931; rs9814232; rs7995158; rs6573225; rs4082518; rs442555; rs259521; rs16889556; rs1047782; rs1530680; rs12667130; rs6965855; rs985080; rs4726782; rs1718101; rs10487689; rs1918296; rs737533; rs4504469; rs2038137; rs2143340; rs9295626; rs7763790 rs6935076; rs2817201; rs10456309; rs4576240; rs17307478; rs9356939; rs7763790; rs6456621; rs6456624; rs6935076; rs2038137; rs3756821; rs1883593; rs3212236; rs6456621; rs12193738; rs2817198; rs793845; rs2799373; rs793862; rs793834; rs2792682; rs807704; rs707864; y rs807694. Se puede analizar cualquier muestra que contenga ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico; ARN) que pueda analizarse en busca de un haplotipo de interés; los métodos para analizar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y también se describen en el presente documento. Incluyen, entre otros, métodos mediados por hibridación y secuenciación. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, células o tejido. De manera alternativa, se puede secuenciar ADN genómico y determinar la presencia o ausencia de un marcador asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) en seres humanos.
Otro aspecto de la divulgación es un método para determinar si una muestra obtenida de un individuo comprende un marcador asociado a trastorno del lenguaje (TL) en seres humanos, lo que comprende analizar una muestra obtenida del individuo para determinar la presencia de al menos uno de los siguientes marcadores: GACGAG en un gen DCDC2 en el locus DYX2; rs793845; rs2799373; rs793862; rs793834; rs2792682; rs807704; rs707864; rs12193738; rs2817198; rs10456309; rs985080; rs1554690; rs2533096; rs6951437; rs344470; rs344468; rs807694; rs482700; rs7695228; rs1940309; rs505277; rs476739; rs867036; rs867035; rs2071674; rs7694946; rs4823324; y un marcador para al menos uno de los siguientes genes: NEK2; DLEC1; NARS; IL4I1; PKD2; ATF5; NUP62; SIGLEC11; ACAN; y PGD. Se puede analizar cualquier muestra que contenga ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico; ARN) que pueda analizarse en busca de un haplotipo de interés; los métodos para analizar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y también se describen en el presente documento. Incluyen, entre otros, métodos mediados por hibridación y secuenciación. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, células o tejido. De manera alternativa, se puede secuenciar ADN genómico y determinar la presencia o ausencia de un marcador asociado a la susceptibilidad de desarrollar TL en seres humanos.
Un aspecto adicional de la divulgación es un método para determinar si una muestra obtenida de un individuo comprende un marcador asociado a la discapacidad lectora (DL) en seres humanos, lo que comprende analizar una muestra obtenida del individuo para determinar la presencia de al menos uno de los siguientes marcadores: CGCGAG en un gen DCDC2 en el locus DYX2; rs180950; rs2590673; rs892100; rs1792745; rs12546767; rs12634033; rs892270; rs10887149; rs10041417; rs6792971; rs4725745; rs12444778; rs1444186; rs2294691; rs10456309; rs1562422; y un marcador para al menos uno de los siguientes genes: MAP4; OR2L8; CRYBA4; OR2T8; KIAA1622; OR2AK2; DHX30; GEMIN6; C20orf10; y PPIF. Se puede analizar cualquier muestra que contenga ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico; ARN) que pueda analizarse en busca de un haplotipo de interés; los métodos para analizar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y también se describen en el presente documento. Incluyen, entre otros, métodos mediados por hibridación y secuenciación. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, células o tejido. De manera alternativa, se puede secuenciar ADN genómico y determinar la presencia o ausencia de un marcador asociado a la susceptibilidad de desarrollar DL en seres humanos.
Otro aspecto de la divulgación es un método para determinar si los ácidos nucleicos (ADN, ARN) en un individuo comprenden marcadores de haplotipos que interactúen de una manera sinérgica y produzcan una dificultad del aprendizaje (DA) en seres humanos, que comprende: (a) obtener una muestra que comprenda ácidos nucleicos de un individuo y (b) analizar la muestra para determinar la presencia de al menos un haplotipo de riesgo de DCDC2 o un alelo de riesgo de DCDC2 y al menos un haplotipo de riesgo de KIAA0319, en donde dicho al menos un haplotipo de riesgo de DCDC2 es CGCGAG o GACGAG, dicho al menos un alelo de riesgo de DCDC2 es el alelo 5 del gen DCDC2 en el locus DYX2 (SEQ ID NO: 35) o el alelo 6 del gen DCDC2 en el locus DYX2 (SEQ ID NO: 36), y dicho al menos un haplotipo de riesgo de KIAA0319 es una variante de haplotipo de KIAA0319 que comprende un SNP que es rs4504469; rs2038137; o rs2143340, y en donde si la muestra comprende al menos un haplotipo de riesgo de DCDC2 o al menos un alelo de riesgo de DCDC2 y al menos un haplotipo de riesgo de KIAA0319, los ácidos nucleicos comprenden marcadores de haplotipos que interactúan de forma sinérgica y producen una DA en seres humanos. Se puede analizar cualquier muestra que contenga ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico; ARN) que pueda analizarse en busca de un haplotipo de interés; los métodos para analizar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y también se describen en el presente documento. Incluyen, entre otros, métodos mediados por hibridación y secuenciación. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, células o tejido. De manera alternativa, se puede secuenciar ADN genómico y determinar la presencia o ausencia de marcadores que interactúen de una manera sinérgica y produzcan DA en seres humanos.
Un aspecto adicional de la divulgación es un método para identificar o ayudar a identificar a un individuo que corre el riesgo de desarrollar al menos una dificultad del aprendizaje (DA), que comprende analizar una muestra obtenida del individuo para determinar la presencia en el locus DYX2 de al menos un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una DA en seres humanos, en donde la presencia en el locus DYX2 de al menos un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una DA en seres humanos indica que el individuo corre el riesgo de desarrollar una DA. Al menos una DA es una discapacidad lectora o trastorno del lenguaje. Dicho al menos un haplotipo está localizado en el gen DCDC2 dentro del locus DYX2 o en el gen KIAA0319 dentro del locus DYX2. Dicho al menos un haplotipo puede comprender (a) CGCGAG o GACGAG en un gen DCDC2 dentro del locus DYX2; o (b) rs4504469, rs2038137, rs2143340, o cualquier combinación de estos en un gen KIAA0319 dentro del locus DYX2; o (c) cualquier combinación de los haplotipos en (a) y (b). Se puede analizar cualquier muestra que contenga ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico; ARN) que pueda analizarse en busca de un haplotipo de interés; los métodos para analizar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y también se describen en el presente documento. Incluyen, entre otros, métodos mediados por hibridación y secuenciación. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, células o tejido. De manera alternativa, se puede secuenciar el ADN genómico y determinar la presencia o ausencia en el locus DYX2 de al menos un haplotipo que esté asociado a la susceptibilidad de desarrollar una DA en seres humanos. La presencia en el locus DYX2 de al menos un haplotipo que esté asociado a la susceptibilidad de desarrollar una DA en seres humanos indica que el individuo corre el riesgo de desarrollar una DA.
También se describe en el presente documento un método para determinar si una muestra obtenida de un individuo comprende un marcador de susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) que es discapacidad lectora (DL) o trastorno del lenguaje (TL), que comprende: obtener una muestra que comprenda ácidos nucleicos del individuo y determinar si la muestra comprende al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en: rs12636438; rs1679255; rs9521789; rs1983931; rs9814232; rs7995158; rs6573225; rs4082518; rs442555; rs259521; rs482700; rs7695228; rs1940309; rs505277; rs476739; rs867036; rs867035; rs2071674; rs7694946; rs4823324; rs180950; rs2590673; rs892100; rs1792745; rs12546767; rs12634033; rs892270; rs10887149; rs10041417; rs6792971; rs12636438; rs1679255; rs9521789; rs476739; rs505277; rs482700; rs7695228; rs867036; rs867035; rs1940309; rs16889556; rs1047782; rs1530680; rs12667130; rs6965855; rs985080; rs4726782; rs1718101; rs10487689; rs1918296; rs737533; rs793845; rs2799373; rs793862; rs793834; rs2792682; rs807704; rs707864; rs12193738; rs2817198; rs10456309; rs985080; rs1554690; rs2533096; rs6951437; rs344470; rs344468; rs4725745; rs12444778; rs1444186; rs2294691; rs10456309; rs1562422; rs807694; rs3756814; rs3777663; rs9295626; rs7763790; rs6935076; rs9348646; rs2328791; rs2328791; rs2817201, rs9295626; rs4576240; rs17307478, rs9356939, rs7763790, rs6456621; rs6456624, rs6935076, rs2038137, rs3756821, rs1883593, rs3212236; rs3777663, rs3756814, rs6931809, rs6916186, rs6933328, rs17491647; rs2328791; rs33914824a; rs807694a; rs707864a; rs10456301a; rs16889066a; rs9379651a; rs2817201; rs9295626; rs10456309; rs4576240; rs17307478; rs9356939; rs7763790; rs6456621; rs3756821; rs1883593; rs3212236; rs2294691; rs3777663; rs3756814; rs6931809; rs6916186; rs6933328; rs17491647; rs9348646; rs1562422 y un marcador para cada uno de los siguientes genes: R5H2; OR5H6; RRAGA; OR6B3; UMOD; A26C1A; FAM29A; CHRNA1; IFIT5; LOC643905; K2; DLEC1; NARS; IL4I1; PKD2; ATF5; NUP62; SIGLEC11; ACAN; PGD; MAP4; OR2L8; CRYBA4; OR2T8; KIAA1622; OR2AK2; DHX30; GEMIN6; C20orf10; y PPIF. La DA es discapacidad lectora (DL) o trastorno del lenguaje (TL), o tanto DL como TL. Se puede analizar cualquier muestra que contenga ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico; ARN) que pueda analizarse en busca de un marcador de susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) que sea discapacidad lectora (DL) o trastorno del lenguaje (TL); los métodos para analizar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y también se describen en el presente documento. Incluyen, entre otros, métodos mediados por hibridación y secuenciación. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, células o tejido. De manera alternativa, se puede secuenciar el ADN genómico y determinar la presencia o ausencia de dicho marcador o marcadores.
En el presente documento se describe además un método para identificar o ayudar a identificar a un individuo que corre el riesgo de desarrollar al menos una dificultad del aprendizaje (DA), que comprende analizar una muestra obtenida del individuo para determinar la presencia en el locus DYX2 de al menos un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una DA en seres humanos, en donde la presencia en el locus DYX2 de al menos un haplotipo que está asociado a la susceptibilidad de desarrollar una DA en seres humanos indica que el individuo corre el riesgo de desarrollar una DA. Al menos una DA es una discapacidad lectora (DL) o un trastorno del lenguaje (TL). Dicho al menos un haplotipo se encuentra en el gen DCDC2 dentro del locus DYX2 o en el gen KIAA0319 dentro del locus DYX2, y puede comprender (a) CGCGAG, GACGAG, o tanto CGCGAG como GACGAG, en un gen DCDC2 dentro del locus DYX2; o (b) rs4504469, rs2038137, rs2143340, o cualquier combinación de estos en un gen KIAA0319 dentro del locus DYX2; o (c) cualquier combinación de los haplotipos en (a) y (b). En el método, el ensayo comprende un método mediado por hibridación, secuenciación de ácidos nucleicos, o tanto un método mediado por hibridación como una secuenciación de ácidos nucleicos. La muestra puede ser sangre, células o tejido.
Otro aspecto de la divulgación es un método para identificar a un individuo que tiene, o es susceptible de desarrollar, una dificultad del aprendizaje (DA), que comprende obtener una muestra que comprende ácido nucleico de un individuo; determinar si el ácido nucleico en la muestra comprende un haplotipo del gen DCDC2 en el locus DYX2 asociado a la susceptibilidad de desarrollar una discapacidad lectora (DL) y un haplotipo del gen KIAA0319 asociado a la susceptibilidad de desarrollar un trastorno del lenguaje (TL), en donde el haplotipo del gen DCDC2 y el haplotipo del gen KIAA0319 interactúan de forma sinérgica para disminuir el rendimiento en la eliminación de fonemas y provocar una dificultad del aprendizaje (DA) en seres humanos, en donde si la muestra comprende ambos haplotipos, se identifica que el individuo tiene o es susceptible de desarrollar una DA. En este método, la determinación comprende un método mediado por hibridación, una secuenciación de ácidos nucleicos, o tanto un método mediado por hibridación como una secuenciación de ácidos nucleicos. La muestra es sangre, células o tejido.
En algunos aspectos de la divulgación, un método por el cual se identifica a un individuo que tiene o es susceptible de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) comprende tratar al individuo así identificado. El tratamiento comprende proporcionar intervenciones, incluidos servicios y materiales como, entre otros, utilizar técnicas especiales de enseñanza; realizar modificaciones en el aula, como proporcionar tiempo adicional para realizar las tareas y pruebas grabadas para permitir que el individuo escuche, en lugar de leer, las pruebas; utilizar libros grabados; utilizar programas de procesamiento de texto con características de verificación ortográfica; ayudar al individuo a aprender a través de experiencias multisensoriales; enseñar herramientas de afrontamiento; y proporcionar servicios para fortalecer la capacidad del individuo para reconocer y pronunciar palabras. Véase, por ejemplo, nichd.nih.gov/health/topics/learning/conditioninfo. ¿Cuáles son los tratamientos para las dificultades del aprendizaje?
Otro aspecto de la divulgación es un método para tratar a un individuo por una dificultad del aprendizaje (DA) que comprende inhibir a ETV6 en el individuo. El individuo tiene DL, TL, o ambos.
En algunos aspectos de la divulgación, un método por el cual se identifica a un individuo que corre el riesgo de desarrollar un trastorno del aprendizaje comprende además monitorear al individuo cuyo riesgo de desarrollar una dificultad del aprendizaje se ha identificado para evaluar si se produce el desarrollo de una dificultad del aprendizaje y, si se produce dicha dificultad, tratar al individuo, en donde el tratamiento comprende proporcionar intervenciones, incluidos servicios y materiales, que incluyen, entre otros, utilizar técnicas especiales de enseñanza; realizar modificaciones en el aula, como proporcionar tiempo adicional para realizar las tareas y pruebas grabadas para permitir que el individuo escuche, en lugar de leer, las pruebas; utilizar libros grabados; utilizar programas de procesamiento de texto con características de verificación ortográfica; ayudar al individuo a aprender a través de experiencias multisensoriales; enseñar herramientas de afrontamiento; y proporcionar servicios a fin de fortalecer la capacidad del individuo para reconocer y pronunciar palabras.
Véase, por ejemplo, nichd.nih.gov/health/topics/learning/conditioninfo. ¿Cuáles son los tratamientos para las dificultades del aprendizaje?
En el presente documento también se describen matrices, tales como micromatrices (matrices de ADN o micromatrices). De acuerdo con un aspecto, se describe una matriz (por ejemplo, una micromatriz) para identificar o ayudar a identificar a un individuo que corre el riesgo de desarrollar al menos una dificultad del aprendizaje (DA). La matriz comprende un soporte que tiene una pluralidad de regiones discretas (por ejemplo, manchas), teniendo cada región discreta (habiéndose adherido a ella) uno o más fragmentos de ácido nucleico (por ejemplo, sondas) manchados, o unidos o depositados de otro modo en ellas. Normalmente, cada región discreta lleva un reactivo, como ácido nucleico (ADN, ARN) que detecta un marcador (por ejemplo, SNP, marcador de haplotipo, alelo, etc.) asociado a la susceptibilidad de desarrollar una DA (por ejemplo, DL, TL) en seres humanos. Los fragmentos de ácido nucleico son complementarios a los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, como ADN genómico, o ARN, como ARNm) que son marcadores para un gen variante, como variantes de DCDC2, KIAA0319, y otros nombrados en el presente, asociados a la susceptibilidad de desarrollar al menos una DA (por ejemplo, como se describe en el presente). Los fragmentos de ácido nucleico en una región discreta particular pueden ser de cualquier longitud y secuencia (por ejemplo, que complementa el ácido nucleico que comprende un marcador) adecuada para la detección de cualquier marcador descrito en el presente documento. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, sonda, sonda SNP) tiene una longitud de entre 10 y 100 nucleótidos. En algunos aspectos de la divulgación, un fragmento de ácido nucleico tiene entre alrededor de 20 y 80, alrededor de 30 y 60, o alrededor de 40 y 50 nucleótidos (nt) de longitud. En aspectos específicos de la divulgación, las sondas tienen 25 nt, 30 nt, 35 nt o 40 nt de longitud. Véase, por ejemplo, LaFramboise, T., Nucl. Acids Res. (2009) 37 (13): 4181-4193. En algunos aspectos de la divulgación, una región discreta particular comprende una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico (por ejemplo, sondas, sondas SNP), cada uno de los cuales es capaz de hibridarse con un marcador particular. En algunos aspectos de la divulgación, la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico tienen longitudes y secuencias variables (por ejemplo, como se describe en el presente documento). En algunos aspectos de la divulgación, la matriz detecta dos o más marcadores asociados a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) en humanos, en donde los dos o más marcadores comprenden uno o más marcadores en un gen DCDC2 y uno o más marcadores en un gen KIAA0319. En algunos aspectos de la divulgación, dicho uno o más marcadores en un gen DCDC2 se seleccionan de CGCGAG, GACGAG, el alelo 5 de READ1 (s Eq ID NO: 35), el alelo 6 de READ1 (SEQ ID NO: 36), o cualquier combinación de dos, tres o cuatro de CGCGAG, GACGAG, el alelo 5 de READ1 (SEQ ID NO: 35) y el alelo 6 de READ1 (SEQ ID NO: 36). En algunos aspectos de la divulgación, el uno o más marcadores en un gen KIAA0319 se seleccionan de rs4504469, rs2038137, rs2143340, o cualquier combinación de dos o tres de rs4504469, rs2038137 y rs2143340.
En algunos aspectos de la divulgación, la matriz (por ejemplo, la micromatriz) detecta marcadores asociados a la susceptibilidad de desarrollar trastorno del lenguaje (TL) en seres humanos. En algunos aspectos de la divulgación, la matriz comprende regiones discretas (por ejemplo, regiones discretas que comprenden uno o más fragmentos de ácido nucleico) capaces de detectar marcadores en un gen DCDC2, como GACGAG, el alelo 6 de READ1 (SEQ ID NO: 36), rs793845, rs2799373, rs793862, rs793834, rs2792682, rs807704, rs707864, rs807694, o cualquier combinación de estos. En algunos aspectos de la divulgación, la matriz (además) detecta uno o más marcadores en un gen KIAA0319, como rs12193738, rs2817198, rs10456309, o cualquier combinación de estos. En algunos aspectos de la divulgación, la matriz comprende además una o más regiones discretas que comprenden fragmentos de ácido nucleico localizados en el soporte que detecta uno o más marcadores seleccionados de rs985080, rs1554690, rs2533096, rs6951437, rs344470, rs344468, rs482700, rs7695228, rs1940309, rs505277, rs476739, rs867036, rs867035, rs2071674, rs7694946, rs4823324, y marcadores para los siguientes genes: NEK2; DLEC1; NARS; IL4I1; PKD2; ATF5; NUP62; SIGLEC11; ACAN; y PGD.
En algunos aspectos de la divulgación, la matriz (por ejemplo, la micromatriz) detecta marcadores asociados a la susceptibilidad de desarrollar una discapacidad lectora (DL) en seres humanos. En algunos aspectos de la divulgación, la matriz comprende regiones discretas (por ejemplo, regiones discretas que comprenden uno o más fragmentos de ácido nucleico) capaces de detectar marcadores en un gen DCDC2, CGCGAG y el alelo 5 de READ1 (SEQ ID NO: 35), o ambos. En algunos aspectos de la divulgación, la matriz (además) detecta uno o más marcadores en un gen KIAA0319, como rs10456309. En algunos aspectos de la divulgación, la matriz comprende además uno o más regiones discretas que comprenden fragmentos de ácido nucleico manchados sobre el soporte que detectan uno o más marcadores seleccionados de rs180950, rs2590673, rs892100, rs1792745, rs12546767, rs12634033, rs892270, rs10887149, rs10041417, rs6792971, rs4725745, rs12444778, rs1444186, rs2294691, rs10456309, rs1562422 y marcadores para los siguientes genes: MAP4; OR2L8; CRYBA4; OR2T8; KIAA1622; OR2AK2; DHX30; GEMIN6; C20orf10; y PPIF.
En algunos aspectos de la divulgación, se describe una matriz (por ejemplo, micromatriz) que detecta uno o más marcadores asociados con la susceptibilidad de desarrollar un DA en seres humanos, en donde dicho uno o más marcadores se seleccionan de rs12636438; rs1679255; rs9521789; rs1983931; rs9814232; rs7995158; rs6573225; rs4082518; rs442555; rs259521; rs482700; rs7695228; rs1940309; rs505277; rs476739; rs867036; rs867035; rs2071674; rs7694946; rs4823324; rs180950; rs2590673; rs892100; rs1792745; rs12546767; rs12634033; rs892270; rs10887149; rs10041417; rs6792971; rs12636438; rs1679255; rs9521789; rs476739; rs505277; rs482700; rs7695228; rs867036; rs867035; rs1940309; rs16889556; rs1047782; rs1530680; rs12667130; rs6965855; rs985080; rs4726782; rs1718101; rs10487689; rs1918296; rs737533; rs793845; rs2799373; rs793862; rs793834; rs2792682; rs807704; rs707864; rs12193738; rs2817198; rs10456309; rs985080; rs1554690; rs2533096; rs6951437; rs344470; rs344468; rs4725745; rs12444778; rs1444186; rs2294691; rs10456309; rs1562422; rs807694; rs3756814; rs3777663; rs9295626; rs7763790; rs6935076; rs9348646; rs2328791; rs2328791; rs2817201, rs9295626; rs4576240; rs17307478, rs9356939, rs7763790, rs6456621; rs6456624, rs6935076, rs2038137, rs3756821, rs1883593, rs3212236; rs3777663, rs3756814, rs6931809, rs6916186, rs6933328, rs17491647; rs2328791; rs33914824a; rs807694a; rs707864a; rs10456301a; rs16889066a; rs9379651a; rs2817201; rs9295626; rs10456309; rs4576240; rs17307478; rs9356939; rs7763790; rs6456621; rs3756821; rs1883593; rs3212236; rs2294691; rs3777663; rs3756814; rs6931809; rs6916186; rs6933328; rs17491647; rs9348646; rs1562422 y marcadores de los siguientes genes: R5H2; OR5H6; RRAGA; OR6B3; UMOD; A26C1A; FAM29A; CHRNA1; IFIT5; LOC643905; K2; DLEC1; NARS; IL4I1; PKD2; ATF5; NUP62; SIGLEC11; ACAN; PGD; MAP4; OR2L8; CRYBA4; OR2T8; KIAA1622; OR2AK2; DHX30; GEMIN6; C20orf10; y PPIF.
Breve descripción de las figuras
FIG. 1: (A) Estructura del STR BV677278. (B) Ubicación del bloque de haplotipos de riesgo dentro del gen DCDC2, en relación con BV677278. Los exones están numerados.
FIG. 2: (A-B) resultados de SILAC para células Raji y HeLa; diagrama de interacción bidimensional. (C) Resultados del ChIP. a-H3: anticuerpo contra una variante de histona H3 enriquecida en genes de transcripción activa. p-actina: amplicón de control del gen de la p-actina. Las barras de error representan la desviación estándar entre 3 replicados. El doble asterisco (**) representa un valor de p por debajo de 0,01 (prueba T de una cola; véase la Tabla S6).
FIG. 3: (A) Efecto del estado de portador de haplotipos de riesgo en varios fenotipos de la lectura, el lenguaje y la cognición (descritos en la Tabla S1 y en la sección “Materiales y métodos de los ejemplos”). Los puntos de datos representan la media de cada grupo, convertida en una puntuación z relativa a la media de la población de muestra de ALSPAC. Las unidades del eje “y” son fracciones de una desviación estándar. PD: tarea de eliminación de fonemas; Lectura 7: lectura de palabras sueltas a los 7 años de edad; Lectura NW: lectura de seudopalabras a los 9 años de edad; Ortografía 7 y 9: ortografía a los 7 y 9 años de edad; WOLD: tarea de comprensión verbal de las Dimensiones Objetivas del Aprendizaje de Wechsler; NWR: tarea de repetición de seudopalabras. (B) Modelo de efectos diferenciales de los alelos de BV677278. Los monómeros de ETV6 deben al menos homodimerizarse a través de sus dominios puntiagudos (PNT) para unirse al ADN a través de sus dominios ETS, y pueden homopolimerizarse in vivo. Los indeles de las unidades de repetición de BV677278 podrían cambiar el tamaño del polímero de ETV6 y, por lo tanto, afectar la expresión del gen objetivo.
FIG. 4: Árbol filogenético basado en la alineación múltiple de 22 alelos de BV677278. Se utilizó el algoritmo Clustal W, con parámetros de método predeterminados (matriz IUB, penalización por hueco = 15, penalización por extensión de hueco = 6,66). Clado 1, que contiene los alelos de riesgo 5 y 6, es el grupo más ramificado de todos, en gris claro (sin incluir la rama para el alelo 22).
FIG. 5: Epistasia de READ1 sobre el haplotipo de riesgo de KIAA0319. (A) Esta gráfica muestra el efecto de tener al menos una copia del alelo READ1 denotado solo (por ejemplo, alelo 5), al menos una copia de KIAHap solo, y al menos una copia de cada uno (ambos), en comparación con todos los miembros de ALSPAC. (B) Esta gráfica muestra los efectos protectores de tener un alelo READ1 que comprende una sola copia de la Unidad de Repetición 1 (RU1_1). Los puntos de datos representan la media transformada en z de cada grupo, en comparación con la media total de ALSPAC (Media de todos), en las medidas indicadas. Las unidades del eje “y” son fracciones de una desviación estándar. Para medir el CI verbal, de rendimiento y total a los 8 años de edad se utilizó la WISC-III. PD: tarea de eliminación de fonemas a los 7 años de edad; Lectura 7: tarea de lectura de palabras sueltas a los 7 años de edad; Lectura 9: tarea de lectura de palabras sueltas a los 9 años de edad; Lectura NW: tarea de lectura de seudopalabras sueltas a los 9 años de edad, Ortografía 7: tarea de ortografía a los 7 años de edad; Ortografía 9: tarea de ortografía a los 9 años de edad.
FIG. 6: (A) Esquema de los genes dentro del locus DYX2 en el cromosoma 6p21.3. Los genes en gris claro, DCDC2 y KIAA0319, han replicado asociaciones con fenotipos del lenguaje escrito y verbal, a saber, DL y TL. Las regiones en gris oscuro dentro de los genes denotan dos variantes funcionales, READ1 en DCDC2 y un haplotipo de riesgo con marcadores en KIAA0319 y TDP2, que se han asociado funcionalmente a DL y TL utilizando modelos animales y técnicas moleculares. (B) Un esquema actualizado de genes con marcadores que muestran asociaciones replicadas a DL, TL y/o CI. Los genes (que se muestran en gris claro) se han expandido a siete (DCDC2, KIAA0319, TDP2, ACOT13, C6orf62, FAM65B y CMAHP), aunque el desequilibrio del enlace pueda dar cuenta de múltiples asociaciones (en particular para KIAA0319, TDP2 , ACOT13 y C6orf62).
Descripción detallada
Las sondas y cebadores polinucleotídicos de una variante de DCDC2 y una variante de KIAA0319 que se describen en el presente documento son polinucleótidos recombinantes, aislados y sintéticos que detectan una alteración en un gen DCDC2 (denominado gen “DCDC2 variante”) que está asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA), tales como polinucleótidos aislados y recombinantes que detectan una alteración de DCDC2 en el locus DYX2. La variante es, por ejemplo, un haplotipo de riesgo de DCDC2 (por ejemplo, CGCGAG, GACGAG), el alelo 5 de BV677278 (READ1 ); el alelo 6 de BV677278 (READ1); o una, dos o tres o más de las variantes asociadas a la susceptibilidad a desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA). También se describen polinucleótidos aislados, sintéticos y recombinantes que detectan una alteración en un gen KIAA0319 (denominada “variante del gen KIAA0319") que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA), tales como polinucleótidos aislados y recombinantes que detectan una alteración de KIAA0319 en el locus DYX2. La variante es, por ejemplo, un haplotipo de riesgo de KIAA0319 (por ejemplo, rs4504469, rs2038137, rs2143340); o una, dos o tres o más de las variantes asociadas a la susceptibilidad a desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA). La DA es una discapacidad lectora (DL) o un trastorno del lenguaje (TL). Las sondas polinucleotídicas típicamente tienen una secuencia que es total o parcialmente complementaria a la secuencia de la alteración y la región flanqueante, y se hibridan a la alteración de interés y a la secuencia flanqueante de una manera específica. Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden detectar una variedad de alteraciones en un gen DCDC2 o en un gen KIAA0319 asociadas a la susceptibilidad de desarrollar DA, tales como DL y TL. Por ejemplo, se puede detectar un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de una región codificante, exón, límite exón-intrón, péptido señal, región no traducida 5’, región promotora, secuencia potenciadora, región no traducida 3’ o intrón que está asociado a DA, tales como DL y TL. Estos polimorfismos incluyen, a modo no taxativo, aquellos que dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por el gen DCDC2, y cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por el gen KIAA0319, generan productos de empalme alternativos, crean productos truncados, introducen un codón de parada prematuro, introducen un exón críptico, alteran el grado o la expresión en mayor o menor grado, alteran la especificidad tisular de DCDC2 y/o la expresión de KIAA0319 (por ejemplo, a nivel del ARNm o de la proteína), introducen cambios en la estructura terciaria de las proteínas codificadas por DCDC2 y/o KIAA0319, introducen cambios en la afinidad de unión o especificidad de las proteínas expresadas por DCDC2 y/o KIAA0319 o alteran la función de las proteínas codificadas por DCDC2 y/o KIAA0319. Los polinucleótidos en cuestión incluyen polinucleótidos que son variantes de los polinucleótidos descritos en el presente documento, siempre que los polinucleótidos variantes mantengan su capacidad para detectar específicamente una variación en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar DA, como DL y/o TL, o en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad para desarrollar DA, tales como DL y/o TL. Los polinucleótidos variantes pueden incluir, por ejemplo, secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos.
En ciertos aspectos de la divulgación, el polinucleótido aislado o recombinante es una sonda que se hibrida, en condiciones rigurosas, tales como condiciones altamente rigurosas, a una alteración en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA, o una alteración en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA. Una DA puede ser, por ejemplo, una discapacidad lectora (DL) o trastorno del lenguaje (TL). Tal como se usa en el presente documento, el término “hibridación” se utiliza en referencia al emparejamiento de ácidos nucleicos complementarios. El término “sonda” se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridarse con otro ácido nucleico de interés. El polinucleótido puede ser natural, como en un producto de digestión restringido purificado, o puede producirse de forma sintética, recombinante o mediante amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, amplificación por PCR).
En la técnica es bien conocido cómo realizar experimentos de hibridación con moléculas de ácidos nucleicos. El experto en la técnica está familiarizado con las condiciones de hibridación y sabe que las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación de ADN pueden variar. Estas condiciones de hibridación se mencionan en libros de texto estándar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley y Sons: 1992. En un aspecto, los polinucleótidos se hibridan con una variación en el gen DCDC2, con una variación en un gen KIAA0319, o tanto con una variación en el gen DCDC2 como con una en el gen KIAA0319 (por ejemplo, el uso de sondas distintas que se hibridan con cada uno de los genes, respectivamente). En condiciones altamente rigurosas, esencialmente no se produce hibridación con polinucleótidos no relacionados.
La hibridación de ácidos nucleicos se ve afectada por condiciones tales como la concentración de sales, la temperatura, los disolventes orgánicos, la composición de la base, la longitud de las cadenas complementarias y el número de emparejamientos erróneos de bases de nucleótidos entre los ácidos nucleicos hibridantes, como sabrán apreciar fácilmente los expertos en la técnica. Las condiciones rigurosas de temperatura generalmente incluirán temperaturas superiores a 30 °C, o pueden ser superiores a 37 °C o 45 °C. Las condiciones rigurosas de sales normalmente serán menores que 1000 mM, o pueden ser menores que 500 mM o 200 mM. Por ejemplo, uno podría realizar la hibridación a 6,0x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguida de un lavado de 2,0x SSC a 50 °C. Por ejemplo, la concentración de sales en la etapa de lavado se puede seleccionar desde una rigurosidad baja de aproximadamente 2,0x SSC a 50 °C hasta una rigurosidad alta de aproximadamente 0,2x SSC a 50 °C. Además, la temperatura en la etapa de lavado se puede aumentar desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, hasta condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 °C. Tanto la temperatura como la sal pueden variar, o la temperatura o la concentración de sales pueden mantenerse constantes mientras se cambia la otra variable. En un aspecto, los ácidos nucleicos se hibridan en condiciones de baja rigurosidad de 6,0x SSC a temperatura ambiente, seguido de un lavado a 2,0x SSC a temperatura ambiente. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medición de cualquier parámetro individual. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson, J Mol Biol. 1968; 31 (3): 349-70. Las secuencias de sondas también pueden hibridarse específicamente con ADN dúplex, en ciertas condiciones, para formar complejos de ADN tríplex o de orden superior. La preparación de tales sondas y las condiciones de hibridación adecuadas son bien conocidas en la técnica. Un método para obtener ADN que codifica las construcciones biosintéticas divulgadas en el presente documento es mediante el ensamblaje de oligonucleótidos sintéticos producidos en un sintetizador de oligonucleótidos convencional y automatizado.
Una sonda o cebador polinucleotídico utilizado en un método descrito en el presente documento puede marcarse con una molécula reportera, de modo que sea detectable en un sistema de detección, que incluye, entre otros, sistemas enzimáticos (por ejemplo, ELISA, así como ensayos histoquímicos enzimáticos), sistemas fluorescentes, radioactivos, químicos y luminiscentes. Una sonda o cebador polinucleotídico usado en un método descrito en el presente documento puede incluir además un resto extintor que, cuando se coloca muy cerca de una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta fluorescente), hace que se produzca poca o ninguna señal desde la etiqueta. No se pretende que la presente invención se limite a ningún sistema o etiqueta de detección particular.
En otro aspecto, el polinucleótido aislado es un cebador que se hibrida de forma adyacente, ascendente o descendente a una alteración en el gen DCDC2 o el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA en seres humanos. Por ejemplo, un cebador polinucleotídico se puede hibridar de forma adyacente, ascendente o descendente a una alteración en el gen DCDC2, o de forma adyacente, ascendente o descendente a una alteración en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA (por ejemplo, DL, TL). Tal como se usa en el presente documento, el término “cebador” se refiere a un polinucleótido que actúa como un punto de inicio de la síntesis de ácidos nucleicos cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácidos nucleicos (por ejemplo, en la presencia de nucleótidos, un agente inductor como la ADN polimerasa, y la temperatura, el pH y la concentración de electrolitos adecuados). De manera alternativa, el cebador se liga a un ácido nucleico proximal cuando se coloca en condiciones en las que se induce la ligadura de dos ácidos nucleicos no enlazados (por ejemplo, en presencia de un ácido nucleico proximal, un agente inductor como la ADN ligasa, y la temperatura, el pH y la concentración de electrolitos adecuados). Un cebador polinucleotídico puede ser natural, como en un producto de digestión restringido purificado, o puede producirse sintéticamente. El cebador es monocatenario o bicatenario. Si es bicatenario, el cebador se trata para separar sus cadenas antes de ser utilizado. El cebador puede ser un oligodesoxirribonucleótido. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluida la temperatura, la fuente del cebador y el método utilizado.
Un aspecto de la divulgación es un par de cebadores que detectan específicamente una alteración en un gen DCDC2 o una alteración en un gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA. En tal caso, el primer cebador se hibrida corriente arriba de la alteración y un segundo cebador se hibrida corriente abajo de la alteración. Uno de los cebadores se hibrida con una cadena de una región de ADN que comprende una alteración en el gen DCDC2 o en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar DA, y el segundo cebador se hibrida con la cadena complementaria de una región de ADN que comprende una alteración en el gen DCDC2 o en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA. Tal como se usa en el presente documento, el término “región de ADN” se refiere a un tramo subcromosómico de ADN. Otros aspectos de la divulgación son pares de cebadores que detectan específicamente alteraciones en otros genes, descritos en el presente documento, que están asociados a una susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje. Un aspecto adicional de la divulgación es un conjunto de tres cebadores útiles para distinguir entre dos alelos de DCDC2, en donde el primer alelo es un gen DCDC2 no eliminado (por ejemplo, un alelo que no comprende una deleción de READ1), y el segundo alelo comprende una deleción en el gen DCDC2 (por ejemplo, comprende el alelo 39/indicado “Del” en la Tabla S4, Ejemplo 1) que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar DA. El primer cebador se hibrida con una secuencia de nucleótidos que es común a ambos alelos, como una secuencia de nucleótidos no alélica que está corriente arriba o corriente abajo de la secuencia polimórfica en el gen DCDC2. El segundo cebador se hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos que es única para un primer alelo (por ejemplo, un gen DCDC2 no eliminado). El tercer cebador se hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos que es única para el segundo alelo (por ejemplo, una deleción en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad para desarrollar DL). El uso del conjunto de tres cebadores da como resultado la amplificación de una región de ADN que depende de qué alelo de DCDC2 está presente en la muestra. De manera alternativa, dos cebadores del conjunto se hibridan con una secuencia de nucleótidos que es común a dos alelos del gen DCDC2, como las secuencias de nucleótidos no alélicas que están corriente arriba y corriente abajo de una secuencia polimórfica en el gen DCDC2, y el tercer cebador se hibrida específicamente a uno de los dos alelos del gen DCDC2.
Sondas y cebadores polinucleotídicos de la variante de DCDC2
Los polinucleótidos se pueden usar en cualquier ensayo que permita la detección de una variación en el gen DCDC2 que esté asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA (por ejemplo, DL, TL). Dichos métodos pueden abarcar, por ejemplo, métodos de detección mediados por hibridación, mediados por ligación o mediados por extensión de cebador. Además, cualquier combinación de estos métodos puede utilizarse en la invención.
En un aspecto, los polinucleótidos detectan una alteración en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA al amplificar una región de ADN que comprende la alteración en el gen. Se puede utilizar cualquier método de amplificación. En un segundo aspecto, los polinucleótidos detectan una alteración en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA al amplificar una región de ADN que comprende la alteración en el gen. En un aspecto específico, una región de ADN que comprende una alteración se amplifica utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). (Ann. Rev. Biochem., 61:131-156 (1992)); Gilliland et al., Proc. Natl. Acad Sci., 87: 2725-2729 (1990); Bevan et al., PCR Methods and Applications, 1: 222-228 (1992); Green et al., PCR Methods and Applications, 1: 77-90 (1991); Blackwell et al., Science, 250: 1104-1110 (1990). “PCR” se refiere, por ejemplo, al método de Mullis (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N.° 4,683,1954,683,202 y 4,965,188), que describen un método para aumentar la concentración de una región de ADN, en una mezcla de ADN genómico, sin clonación ni purificación. Por ejemplo, los cebadores polinucleotídicos de la invención, descritos en el presente documento, se combinan con una mezcla de ADN (o cualquier secuencia de polinucleótidos que pueda amplificarse con los cebadores polinucleotídicos), en donde el ADN comprende el gen DCDC2 y/o el gen KIAA0319. La mezcla también incluye los reactivos de amplificación (por ejemplo, desoxirribonucleótido trifosfatos, amortiguadores, etc.) necesarios para la reacción de ciclado térmico. De acuerdo con los métodos PCR estándar, la mezcla experimenta una serie de pasos de desnaturalización, hibridación del cebador y extensión de la polimerasa para amplificar la región de ADN que comprende una variación en el gen DCDC2y/o una variación en el gen KIAA0319. La longitud de la región amplificada de ADN está determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. Por ejemplo, la hibridación de los cebadores puede producirse de tal manera que los extremos de los cebadores proximales a la mutación estén separados por 1 a 10.000 pares de bases (por ejemplo, 10 pares de bases (pb) 50 pb, 200 pb, 500 pb, 1.000 pb, 2.500 pb, 5.000 pb o 10.000 pb).
Se usa instrumentación estándar para la amplificación de ADN y la detección de ADN amplificado. Por ejemplo, se ha desarrollado una amplia variedad de instrumentos para llevar a cabo amplificaciones de ácidos nucleicos, particularmente PCR, por ejemplo, Johnson et al., Patente de los Estados Unidos N.° 5,038,852 (termociclador controlado por ordenador); Wittwer et al., Nucleic Acids Research, 17: 4353-4357 (1989) (PCR de tubos capilares); Hallsby, Patente de los Estados Unidos N.° 5,187,084 (control de temperatura basado en aire); Garner et al, Biotechniques, 14: 112-115 (1993) (PCR de alto rendimiento en placas de 864 pocillos); Wilding et al., Solicitud Internacional N.° PCT/US93/04039 (PCR en estructuras micromecanizadas); Schnipelsky et al., Solicitud de Patente Europea N.° 90301061.9 (publ. N.° 0381501 A2) (dispositivo de PCR desechable de un solo uso). En ciertos aspectos de la divulgación, se usa PCR en tiempo real u otros métodos conocidos en la técnica, tales como el ensayo de Taqman.
El ADN amplificado puede analizarse mediante varios métodos diferentes. Los métodos para analizar el ADN amplificado incluyen, a modo no taxativo, secuenciación (Sanger) del ADN, determinación del tamaño del fragmento por electroforesis o cromatografía, hibridación con una sonda marcada, hibridación con una matriz o micromatriz de ADN, incorporación de cebadores biotinilados seguida de detección de conjugado de avidina-enzima, o incorporación de desoxinucleótidos trifosfatos marcados con 32P, como dCTP o dATP, en el segmento amplificado. En un aspecto, el ADN amplificado se analiza mediante electroforesis en gel. Los métodos de electroforesis en gel son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley y Sons: 1992. El ADN amplificado se puede visualizar, por ejemplo, por medios fluorescentes o radioactivos. El ADN también puede transferirse a un soporte sólido como una membrana de nitrocelulosa y someterse a transferencia de Southern después de la electroforesis en gel. En un aspecto, el ADN se analiza por electroforesis y se expone a bromuro de etidio, y se visualiza bajo luz ultravioleta.
En un aspecto, la alteración en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar DL es una deleción. La deleción se puede detectar utilizando cebadores polinucleotídicos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se puede usar un conjunto de tres cebadores para distinguir entre un alelo del gen DCDC2 que comprende una deleción y un gen DCDC2 de tipo natural. El uso del conjunto de tres cebadores da como resultado la amplificación de una región de ADN que depende de qué alelo de DCDC2 está presente en la muestra. En algunos casos, una deleción es protectora, como el alelo 39/Del en la Tabla S4 del Ejemplo 1. En algunos aspectos de la divulgación, las modificaciones o variantes son protectoras.
En otro aspecto, el ADN amplificado se analiza mediante secuenciación de ADN. La determinación de la secuencia de ADN se puede realizar mediante métodos estándar como la tecnología de terminación de cadena dideoxi (secuenciación de Sanger) y electroforesis en gel, o mediante otros métodos como la pirosecuenciación (Biotage AB, Uppsala, Suecia). La secuencia de ácidos nucleicos del ADN amplificado se puede comparar con la secuencia de ácidos nucleicos del ADN de tipo natural para identificar si existe una variación en el gen DCDC2 y/o KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar DA.
En otro aspecto, los polinucleótidos de la divulgación detectan una alteración en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA mediante métodos mediados por hibridación. En un aspecto adicional, los polinucleótidos detectan una alteración en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA mediante métodos mediados por hibridación. En un aspecto, una sonda polinucleotídica se hibrida con una alteración en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA (y con nucleótidos flanqueantes), pero no con un gen DCDC2 de tipo natural. En otro aspecto, una sonda polinucleotídica se hibrida con una alteración en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar un DA (y nucleótidos flanqueantes), pero no con un gen KIAA0319 de tipo natural. La sonda polinucleotídica puede comprender nucleótidos que están marcados de manera fluorescente, radioactiva o química para facilitar la detección de la hibridación. La hibridación puede realizarse y detectarse mediante métodos estándar conocidos en la técnica como, por ejemplo, mediante transferencia de Northern, transferencia de Southern, hibridación in situ fluorescente (FISH) o hibridación con polinucleótidos en un soporte sólido (por ejemplo, matrices, micromatrices de ADN, matrices de ADNc o chips Affymetrix). En un aspecto, la sonda polinucleotídica se usa para hibridar el ADN genómico mediante FISH. El método FISH se puede usar, por ejemplo, en células en metafase, para detectar una deleción en el ADN genómico. Por medio de FISH, el ADN genómico se desnaturaliza para separar las cadenas complementarias dentro de la estructura de doble hélice del ADN. La sonda polinucleotídica se combina con el ADN genómico desnaturalizado. Si está presente una alteración en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA o una alteración en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA, la sonda se hibridará al ADN genómico. La señal de la sonda (por ejemplo, fluorescencia) se puede detectar a través de un microscopio fluorescente para detectar la presencia o ausencia de señal. La ausencia de señal indica la ausencia de una alteración en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA (por ejemplo, DL, TL) o la ausencia de una alteración en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA (por ejemplo, DL, TL). De manera alternativa, la presencia de señal puede usarse para determinar la ausencia de una alteración en el gen DCDC2 o KIAA0319.
En otro aspecto, los polinucleótidos detectan una alteración en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar un DA (por ejemplo, DL, TL) o una alteración en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA (por ejemplo, DL, TL) por extensión de cebador con ADN polimerasa. En un aspecto, un cebador polinucleotídico se hibrida de forma inmediatamente adyacente a la alteración. Se puede usar una reacción de secuenciación de una sola base utilizando terminadores de didesoxinucleótidos marcados para detectar la alteración. Si hay una alteración presente, el terminador marcado se incorporará al producto de extensión; si no hay una alteración presente, el terminador marcado no se incorporará. En otro aspecto, un cebador polinucleotídico se hibrida a una alteración en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA o una alteración en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA. El cebador, o una porción de este, no se hibridará con un gen DCDC2 de tipo natural o un gen KIAA0319 de tipo natural. Si hay una alteración presente, se produce la extensión del cebador; si no hay una alteración presente, no se produce la extensión del cebador. Los cebadores y/o nucleótidos pueden incluir además sondas fluorescentes, radioactivas o químicas. Un cebador marcado por la extensión del cebador puede detectarse midiendo la intensidad del producto de extensión, como por ejemplo mediante electroforesis en gel, espectrometría de masas o cualquier otro método para detectar marcas fluorescentes, radioactivas o químicas.
En otro aspecto, los polinucleótidos detectan una alteración en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA o una alteración en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA mediante ligación. En un aspecto, un cebador polinucleotídico se hibrida con una variación en el gen DCDC2 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA o con una variación en el gen KIAA0319 que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA. El cebador no se hibridará con el gen de tipo natural (por ejemplo, el gen DCDC2 de tipo natural). También se describe un segundo polinucleótido que se hibrida con una región del gen DCDC2 inmediatamente adyacente al primer cebador o con una región del gen KIAA0319 inmediatamente adyacente al primer cebador. Uno, o ambos, de los cebadores polinucleotídicos pueden estar marcados por fluorescencia, radioactividad o químicamente. La ligación de los dos cebadores polinucleotídicos se produce en presencia de ADN ligasa si existe una alteración en el gen (por ejemplo, una alteración del gen DCDC2 o KIAA0319) que está asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA. La ligación puede detectarse mediante electroforesis en gel, espectrometría de masas o mediante la medición de la intensidad de marcadores fluorescentes, radioactivos o químicos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos tienen fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos de ninguna manera.
Ejemplo 1
Materiales y métodos
Reclutamiento de sujetos, recopilación de datos y ADN, y gestión de datos.
El equipo de ALSPAC realizó el reclutamiento de sujetos y la recopilación de datos de fenotipo y ADN para la cohorte ALSPAC, bajo la supervisión de S.M. Ring, y estos datos fueron manejados para este estudio por L.L. Miller. El Estudio Longitudinal Avon de Padres e Hijos (ALSPAC)
El ALSPAC es una cohorte de nacimientos prospectiva con sede en la región de Avon del Reino Unido. Se compone de niños, en su mayoría de ascendencia del norte de Europa, nacidos en 1991 y 1992. Los niños fueron reclutados antes del nacimiento; el reclutamiento de sus madres embarazadas dio lugar a un total de 15.458 fetos, de los cuales 14.701 estaban vivos al año de edad. Los detalles sobre los participantes, el reclutamiento y las metodologías de estudio se describen en detalle en otra parte (bristol.ac.uk/alspac). Los niños de ALSPAC han sido ampliamente fenotipados desde antes del nacimiento hasta la edad adulta temprana. Una actualización sobre el estado de la cohorte se publicó en 2012. (S11). Las mediciones de lectura, del lenguaje y cognitivas utilizadas para este estudio se recopilaron a los 7, 8 y 9 años de edad. Las muestras de ADN de 10.676 de estos niños estaban disponibles para el genotipado. De este subconjunto, la cantidad de niños que completaron las mediciones del lenguaje y cognitivas varía según la medición, pero generalmente es de 5200-5600 sujetos.
Mediciones de lectura de ALSPAC
Las mediciones de lectura en ALSPAC incluyen una tarea de eliminación de fonemas a los 7 años de edad, la lectura de palabras sueltas a los 7 y 9 años de edad, la ortografía a los 7 y 9 años de edad, la lectura de seudopalabras sueltas a los 9 años de edad, y la comprensión de un texto, velocidad y precisión a los 9 años de edad. La tarea de eliminación de fonemas mide el reconocimiento de los fonemas (S12), que se considera en general como un déficit central en la DL (S13). El niño escucha una palabra hablada en voz alta, y luego se le pide que elimine un fonema específico de esa palabra para formar una nueva palabra (por ejemplo, ¿qué palabra se crea cuando el sonido /b/ se elimina de la palabra “block” (bloque)? “Lock” (cerradura)). Esta tarea también se conoce como Prueba de Análisis Auditivo y fue desarrollada por Rosner y Simon (S14). La lectura de palabras sueltas se evaluó a los 7 años de edad utilizando la subprueba de lectura de las Dimensiones Objetivas de la Lectura de Wechsler (WORD) (S15). A los 7 y 9 años de edad, se evaluó la ortografía; se le pidió al niño que escribiera un conjunto de 15 palabras adecuadas a su edad (S15). A los 9 años de edad, se volvió a evaluar la lectura de palabras sueltas pidiéndole al niño que leyera diez palabras reales y diez seudopalabras en voz alta. Las palabras y seudopalabras utilizadas son un subconjunto de una lista más grande de palabras y seudopalabras tomadas de la investigación realizada por Terezinha Nunes y otros en Oxford (S16). Las puntuaciones de velocidad, precisión y comprensión lectoras se determinaron a los 9 años de edad, utilizando el Análisis de la Capacidad Lectora de Neale (NARA-11) (S17). Las tres mediciones están estandarizadas. El niño leyó pasajes de un folleto en voz alta e, inmediatamente después, se le hicieron preguntas acerca de lo que había leído para evaluar su comprensión lectora. La precisión se midió contando el número de errores (errores de pronunciación, sustituciones, etc.) que cometió el niño y convirtiéndolo en una puntuación estandarizada. La velocidad de lectura era el número de palabras por minuto.
Mediciones del lenguaje de ALSPAC
Las mediciones del lenguaje en las que se centra este estudio se determinaron a los 8 años de edad. La primera de ellas es una tarea de repetición de seudopalabras (NWR), en la que se le pide al niño que repita las seudopalabras grabadas. Esta tarea mide la memoria fonológica a corto plazo y el procesamiento (S18). La segunda es una subprueba de las Dimensiones Objetivas del Lenguaje de Wechsler que mide la comprensión del lenguaje (WOLD Comp) (S19). Para esta tarea, al niño se le hace una serie de preguntas sobre un párrafo que describe una imagen, que fue leído en voz alta por un examinador. Los niños con TL tienen constantemente un desempeño deficiente en estas mediciones (S20, s 21).
Evaluación del CI de ALSPAC
El CI verbal, de rendimiento y total se evaluaron a los 8 años de edad, utilizando la Escala de Inteligencia de Wechsler para Niños (WISC-III).
Aprobación ética
La aprobación ética para el estudio se obtuvo del Comité de Ética y Ley de ALSPAC, el Comité de Ética de Investigación local del Reino Unido y el Comité de Investigación con Seres Humanos de Yale.
Diseño y genotipado de paneles TagSNP en DYX2.
Los TagSNP diseñados para capturar la variación común en el locus DYX2 se seleccionaron usando el servidor de diseño de estudios de asociaciones de Han et al. (design.cs.ucla.edu) (33). Los SNP fueron genotipados en la plataforma Sequenom, en colaboración con el Centro de Análisis del Genoma de Yale (West Haven, CT), según protocolos estándar. La tasa de llamadas y las estadísticas descriptivas de los SNP descritos en el presente documento se enumeran en la Tabla S4. rs4504469, rs2038137 y rs2143340 fueron genotipados por Scerri et al., como se describe (24). La frecuencia de alelos menores para todos los tagSNP fue mayor o igual a 0,05. La potencia promedio para capturar variantes comunes conocidas (FAM >0,05) dentro de DYX2 usando este panel se estimó en 83,44 % a priori. Se incluyeron varios otros SNP además del panel tagSNP, incluidos varios que anteriormente se habían asociado con DL y SNP codificaciones en DCDC2.
Análisis de asociaciones basado en haplotipos.
Se evaluó el desequilibrio de enlace y se definieron los haplotipos utilizando el paquete de software Haploview, versión 4.2 (34). Los marcadores que se desviaban sustancialmente del equilibrio de Hardy-Weinberg, o que tenían una tasa de llamada <85 %, no se utilizaron para el análisis de haplotipos. Para demarcar los bloques de haplotipos se usó la opción de la regla de los cuatro gametos, lo que dio como resultado 44 bloques de haplotipos que cubren el locus DYX2. El análisis de asociaciones se realizó con haplotipos individuales que tenían frecuencias de 0,01 o más (208 en total), utilizando el paquete de software Plink, versión 1.07 (S4). Los análisis de asociaciones se realizaron utilizando estadísticas de prueba de regresión logística y chi cuadrado (opciones -hap-assoc y -haplogistic). Los individuos que no fueron identificados como blancos no hispanos, aquellos que tenían un coeficiente intelectual total inferior a 75 o cuya muestra de ADN devolvió una tasa de llamada promedio inferior al 85 % para los SNP que pasaron el control de calidad, se excluyeron del análisis de asociaciones. Para corregir las pruebas múltiples, se aplicó una corrección de Bonferroni con el nivel alfa establecido en 0,05, tratando a cada uno de los 208 haplotipos como una prueba individual; por lo tanto, el nivel de umbral es 0,05/208 = 2,4038 x 10-4. Como cada fenotipo constituía una hipótesis independiente (reconocimiento fonológico y lenguaje), este umbral no se duplicó para tener en cuenta que había dos fenotipos.
Genotipado de BV677278.
Los portadores de los haplotipos de DCDC2 de interés que se podían eliminar de forma inequívoca (utilizando la función -hap-phase de Plink) se genotiparon para el STR BV677278. BV677278 está genotipado por amplificación por PCR y subsiguiente secuenciación de Sanger. Los alelos se llaman por un script interno de Perl desarrollado por Y. Kong. El script de Perl está disponible a petición.
Cebadores de amplificación
STR_F: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTGAATCCCAGACCACAA-3' (SEQ ID NO:1)
STR_R: 5'-ATCCCGATGAAATGAAAAGG-3' (SEQ ID NO:2)
Cebador de secuenciación M13F
5'-TGTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO:3)
Mezcla de reacción de amplificación (por reacción de 10 pl)
Amortiguador para PCR 10X (Qiagen): 1 pl
MgCl2 (25 mM) (Qiagen): 0,4 pl
dNTP (10 mM): 0,25 pl
Cebador STR_F (10 pM): 0,25 pl
Cebador STR_R (10 pM): 0,25 pl
HotStarTaq ™ (Qiagen, diluido a 0,5 unidades/pl en amortiguador de dilución Taq): 0,20 pl
ADN de plantilla: 1 pl (~10 ng/pl)
H2O sin nucleasa: 6,65 pl
Reacción de amplificación
1. 15 minutos, 95 °C
2. 30 segundos, 95 °C
3. 30 segundos, 65 °C
-Disminuir 1 °C/ciclo
4. 60 segundos, 72 °C
5. Ir al paso 2, 9 veces
6. 30 segundos, 95 °C
7. 30 segundos, 56 °C
8. 60 segundos, 72 °C
9. Ir al paso 6, 34 veces
10. 5 minutos, 72 °C
11. « 4 °C
Purificación y secuenciación de PCR
Los productos de PCR se purificaron usando la mezcla de enzimas ExoSAP-IT®, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los amplicones purificados se mezclaron luego con el cebador de secuenciación M13F y se secuenciaron. La secuenciación de Sanger se realizó en el Centro de Secuenciación de ADN W.M. Keck de Yale, según su protocolo de secuenciación estándar.
Tipificación de genotipos
Los alelos fueron tipificados desde los electroferogramas, usando un script de Perl interno desarrollado por Y. Kong para este propósito.
Genotipado de microdeleción
Los portadores de los haplotipos de DCDC2 de interés también fueron genotipados para la microdeleción de 2.445 pb de DCDC2. Esta eliminación abarca todo el STR BV677278 dentro de sus puntos de ruptura, por lo que debe ser genotipado además de BV677278 para obtener un genotipo preciso para homocigotos BV677278 aparentes. La microdeleción se genotipa mediante PCR específica de alelos y electroforesis en agarosa. La reacción de tres cebadores genera un amplicón de ~600 pb a partir de cromosomas intactos (sin deleción), y un amplicón de ~200 pb de cromosomas con la deleción, lo que permite que los heterocigotos y ambos homocigotos sean fácilmente distinguibles entre sí.
Cebadores de amplificación
Cebador Del_F: 5'-AGCCTGCCTACCACAGAGAA-3' (SEQ ID NO:4)
Cebador Del_RC: 5'-GGAACAACCTCACAGAAATGG-3' (SEQ ID NO:5)
Cebador Del_RD: 5'-TGAAACCCCGTCTCTACTGAA-3' (SEQ ID NO:6)
Mezcla de reacción de amplificación (por reacción de 10 pl)
Amortiguador para PCR 10X (Qiagen): 1 gl
MgCl2 (25 mM) (Qiagen): 0,4 gl
dNTP (10 mM): 0,25 gl
Cebador Del_F (10 gM): 0,30 gl
Cebador Del_RC (10 gM): 0,20 gl
Cebador Del_RD: 0,20 gl
HotStarTaq ™ (Qiagen, diluido a 0,5 unidades/gl en amortiguador de dilución Taq): 0,20 gl
ADN de plantilla: 1 gl (~10 ng/gl)
H2O sin nucleasa: 6,45 gl
Reacción de amplificación
La reacción de amplificación para la microdeleción es la misma que para el STR BV677278 (véase arriba).
Electroforesis en agarosa
Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1 %, utilizando un amortiguador TBE 1X estándar con bromuro de etidio (0,2 gg/ml), a través de métodos estándar, a 100-150 V, dependiendo del tamaño del gel. Se tomaron imágenes de los geles en un transiluminador UV y se documentaron con un sistema de imágenes XR Bio-Rad Gel Doc™. Los genotipos fueron obtenidos de los geles manualmente.
Identificación de proteínas por espectrometría de masas basada en SILAC.
Las células Raji y HeLa se marcaron con SILAC con Lys-8 y Arg-10 (Eurisotop) o sus contrapartes naturales Lys-0, Arg-10 (Sigma), como se describe (20). El lisado nuclear pesado preparado a partir de estas células se incubó con una sonda oligonucleotídica biotinilada idéntica a un segmento de BV677278 que se había demostrado previamente que se unía a una proteína nuclear con alta especificidad (15). El lisado nuclear ligero se incubó con una sonda encriptada biotinilada que previamente no se había demostrado que se unía a la proteína nuclear de interés (15). Los complejos de oligonucleótidos y proteínas obtenidos se eliminaron con perlas conjugadas con estreptavidina y se sometieron a espectrometría de masas cuantitativa, como se describió anteriormente (36). También se realizó el experimento inverso (sonda de unión con lisado ligero, sonda encriptada con lisado pesado), dando como resultado los diagramas de interacción bidimensional de la Fig. 3A-B. El experimento anterior se describe con más detalle a continuación:
Marcado con SILAC de células HeLa y Raji
Se marcaron células Raji para al menos 8 generaciones en medio DMEM (-Arg, -Lys) que contenía suero bovino fetal dializado al 10 % (Gibco) suplementado con 58 mg/L de L-arginina 13C615N4 y 34 mg/L de L- lisina 13C615N2 (Eurisotop), o los correspondientes aminoácidos no marcados. Para Raji, los extractos celulares se prepararon como se describe en Wu et al. (S5). Las células HeLa S3 se marcaron con SILAC en medio RPMI 1640 (-Arg, -Lys) que contenía suero bovino fetal dializado al 10 % (Gibco) suplementado con 84 mg/L de L-arginina 13C615N4 y 40 mg/L de L-lisina 13C615N2 (Eurisotop), o los correspondientes aminoácidos no marcados, respectivamente. Para HeLa S3, tres lotes consecutivos de células se recolectaron independientemente, y los extractos celulares se prepararon como describe por Dignam et al. (S6).
Se realizaron SILAC, extracción de ADN de proteínas y espectrometría de masas cuantitativa como se describió previamente (S7), utilizando las líneas celulares de Raji y HeLa. La sonda desplegable de unión es un concatémero de dos copias de la sonda EMSA3 utilizada en los experimentos EMSA que informamos en 2011, mientras que la sonda encriptada es un concatémero de dos copias de la sonda EMSA3-Scram1 de los mismos experimentos (S8). Oligon ucleó tidos:
EMSA3_for:
5'-TTGAGAGGAAGGAAAGGAAGGATCCCTGAGAGGAAGGAAAGGAAGGA-3' (SEQ ID NO:7)
EMSA3_rev:
5'-AATCCTTCCTTTCCTTCCTCTCAGGGA TCCTTCCTTTCCTTCCTCTC-3' (SEQ ID NO:8) EMSA3/Scram1_for:
5'-TTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATCCCTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA-3' (SEQ ID NO:9) EMSA3/Scram1_rev:
5'-AATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGGGATCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3' (SEQ ID NO:10)
Ensayo desplegable de ADN
Se unieron 25 pg de sondas de ADN hibridadas, concatenadas y destiobiotiniladas a 75 pl de Dynabeads MyOne C1 (Life Technologies). El exceso de oligonucleótidos se eliminó y las perlas se incubaron con 400 pg de extractos nucleares marcados con SILAC en amortiguador de unión a proteínas (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 8), NP-40 al 0,5 %, MgCl2 10 mM, cóctel inhibidor de proteasa; Roche). Después de 1 h en una rueda de rotación a 4 °C, las perlas se lavaron tres veces, se combinaron, y los complejos de ADN-proteína se eluyeron en un amortiguador de unión a proteínas que contenía biotina 16 mM. El sobrenadante se precipitó con 4 volúmenes (v/v) de etanol durante la noche y las proteínas se sedimentaron por centrifugación máxima en una microcentrífuga de mesa. El sedimento se resolubilizó en urea 8 M/Tris 50 mM, pH 8,0, se redujo con DTT 1 mM, se alquiló con yodoacetamida 3 mM y, posteriormente, se digirió con tripsina (Promega) en amortiguador de bicarbonato de amonio 50 mM, pH 8, a temperatura ambiente durante toda la noche. Las muestras se almacenaron en las puntas de pipeta y se eluyeron antes de su uso.
Espectrometría de masas
Los péptidos se separaron con un gradiente de 140 minutos de acetonitrilo al 5 a 60 por ciento (EasyHPLC, Thermo Fisher) utilizando un capilar de 15 cm, 75 um, lleno con 3,0 um de perlas C18 (Dr. Maisch) montado directamente en un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher). El instrumento fue operado en modo de adquisición top10 dependiente de datos. Los datos sin procesar se buscaron utilizando el paquete de software MaxQuant (versión 1.2.0.18) con la base de datos humana completa de IPI (v3.68, 87061 entradas). La especificidad de búsqueda de enzimas fue tripsina/p, con 2 errores permitidos. La carbamidometilación se estableció como modificación fija, mientras que la oxidación de metionina y la N-acetilación de proteína se consideraron modificaciones variables. La búsqueda se realizó con una tolerancia de masa inicial de 7 ppm de precisión de masa para el ion precursor y 0,5 Da para los espectros de MS/ MS.
ChIP-QPCR.
Se usó el kit AbCam ChIP (cat. # Ab500) para realizar los ensayos de ChIP descritos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero con varias modificaciones que se describen a continuación. Para qPCR, se utilizó el kit qPCR Qiagen QuantiTect® SYBR® Green para ChIP-qPCR. Se siguieron las instrucciones del fabricante de 25 pg de plantilla por reacción. Todas las reacciones por triplicado. Los anticuerpos, las secuencias de cebadores y los métodos detallados para este experimento están disponibles en la “Información de respaldo”. Los datos de control de calidad para qPCR se muestran en la Fig. S3.
Paso 1: Fijación y recolección celular
• Para cada conjunto de 3 reacciones de ChIP, se usaron 9 millones de células recién cosechadas (Raji) en lugar de 3 millones, con volúmenes apropiados para 9 millones de células, como se indica en el protocolo. Paso 2: Lisis celular
• Después del lavado final en PBS en el paso de fijación celular, cada parte de 9 millones de células se llevó al paso de lisis celular con volúmenes apropiados para 3 millones de células (9 millones se trataron como si fueran 3 millones, dando como resultado 3 millones de células por reacción de ChIP, en lugar de 1 millón).
• Se reemplazaron 100 pl de amortiguador D con inhibidores de proteasa por ~ 150 pl de lo siguiente:
Amortiguador D2/PI (S9)
Tris 10 mM
EDTA 1 mM
EGTA 0,5 mM
pH = 7
Cóctel inhibidor de la proteasa 1X
• Se usó un sonicador de sonda Branson 450 para la sonicación. El ADN se fragmentó con 18 pulsos de 20 segundos, con la amplitud establecida en 6 y el DC establecido en continuo. Las muestras se mantuvieron en agua helada durante la sonicación y se dejaron reposar 2 minutos en hielo entre cada pulso.
Paso 3: Inmunoprecipitación
• Se siguió el protocolo del fabricante.
° Anticuerpo a-ETV6: sc-166835X (Santa Cruz Biotech), 5 pg/ChIP
° Anticuerpo de control: ab1791 (AbCam) (histona H3 variante a, enriquecida en genes de transcripción activa, una parte de esto viene con el kit), 2 pg/ChIP
• En lugar de las perlas provistas en el kit, se usaron perlas magnéticas Magna-Bind™ Protein A/G y se usó un soporte magnético, de acuerdo con el protocolo del fabricante, en lugar de la centrífuga, para la inmunoprecipitación.
Etapa 4: Purificación de ADN
• Después de revertir los enlaces cruzados y el tratamiento con proteinasa K, el ADN se purificó utilizando un kit de purificación por PCR Qiagen QIAquick® en lugar de la suspensión purificadora de ADN proporcionada en el kit de ChIP.
• Después de la purificación con una columna QIAquick®, cada producto final se eluyó con un total de 60 pl de amortiguador EB, en dos etapas de elución de 30 pl. El producto final se cuantificó por fluorescencia (kit de ensayo Quant-IT™ PicoGreen® dsDNA, según el protocolo del fabricante).
qPCR
• Se usó el kit qPCR Qiagen QuantiTect® SYBR® Green para ChIP-qPCR, siguiendo las instrucciones del fabricante.
• Se usó una plantilla de 25 pg por reacción.
• Se usaron 1,25 pl de cada cebador (5 pM) por reacción.
• Se realizó una curva estándar de log-5 utilizando el ADN de Raji de entrada (sonicado, pero no sometido a ChIP). Véase la Fig. S3A-B.
• Para evitar el error de pipeteo, todas las muestras se diluyeron a la misma concentración que la muestra menos concentrada, por lo que se podría agregar la misma cantidad a cada reacción. Las diluciones se realizaron en serie.
• Se realizaron todas las reacciones por triplicado.
Cebadores qPCR
ChIP-STR (amplicón BV677278)
Cebador ChIPSTR_F: 5'-TCATGCAAAGTTCCAAAACC-3' (SEQ ID NO:11)
Cebador ChIPSTR_R: 5'-GATTTCCTCCCTCCCTTCC-3' (SEQ ID NO:12)
Estos cebadores capturan toda la repetición de BV677278 y generan un amplicón de ~200 pb.
p-actina (+ control)
Cebador pAct_F: 5'-GCCCTAGGCACCAGGGTGTGA-3' (SEQ ID NO:13)
Cebador pAct_R: 5'-ACAGGGTGCTCCTCAGGGGC-3' (SEQ ID NO:14)
Estos cebadores amplifican una secuencia de ~ 150 pb del gen de la p-actina que se transcribe activamente.
Reacción de qPCR
minutos, 95 °C
2. 30 segundos, 95 °C
3. 30 segundos, 65 °C
-Disminuir 1 °C por ciclo
4. 60 segundos, 72 °C
5. Lectura de placa
6. Ir al paso 2, 9 veces
7. 30 segundos, 95 °C
8. 30 segundos, 56 °C
9. 60 segundos, 72 °C
10. Lectura de placa
11. Ir al paso 6, 39 veces
12. 5 minutos, 72 °C
13. Curva de fusión
14. ~ 4 °C
*En la Figura S3, se muestran los datos de control de calidad para el experimento ChIP mostrado aquí.
Cálculos de enriquecimiento
El enriquecimiento multiplicado se calculó con respecto al control sin anticuerpos (una reacción completa de ChIP, pero sin perlas de solo anticuerpo). Brevemente, esto se hizo aumentando 2 a la potencia negativa de la diferencia entre la C(t) de una condición experimental y su respectivo control sin anticuerpos: Enriquecimiento multiplicado = 2-[C(t)Exp - C(t)Sin anticuerpo]
Resultados
Dos haplotipos de seis marcadores en DCDC2 están asociados a un rendimiento reducido en las mediciones de lectura y del lenguaje
Para determinar si DCDC2, KIAA0319, ambos o ninguno de los dos genes es responsable de la señal en DYX2, se diseñó un panel tagSNP para cubrir densamente el locus DYX2. Se realizó un análisis de asociación basado en haplotipos de la lectura y el lenguaje en una gran cohorte de nacimiento fenotípicamente extensa: el Estudio Longitudinal Avon de Padres e Hijos (ALSPAC) (17). El análisis mostró un bloque de haplotipos de seis marcadores dentro de DCDC2, de los cuales dos haplotipos (CGCGAG y GACGAG) se asociaron a un rendimiento muy bajo en una tarea de eliminación de fonemas y una medición compuesta del lenguaje, respectivamente (Tabla 1). Para este análisis, los casos de DL se definieron como individuos con una puntuación de dos o más desviaciones estándar por debajo de la media en la tarea de eliminación de fonemas, y los casos de TL como individuos con una puntuación de dos o más desviaciones estándar por debajo de la media en cualquiera de las dos medidas del lenguaje (WOLD/NWR). La tarea de eliminación de fonemas mide el reconocimiento fonológico, que se considera en general como el déficit principal en la DL (2). Las tareas de comprensión verbal y de repetición de seudopalabras (NWR) de las Dimensiones Objetivas del Aprendizaje de Wechsler (WOLD) que comprenden la medición compuesta del lenguaje WOLD/NWR se utilizan para evaluar las habilidades lingüísticas deficientes; los niños con TL muestran un rendimiento sistemáticamente bajo en estas mediciones (18, 19) (véase la Tabla S1 y los “Materiales y métodos” para obtener más información sobre estas mediciones fenotípicas). Los casos se definieron de esta manera para examinar la asociación de variantes de DYX2 con DL y TL graves. Los dos haplotipos muestran una fuerte asociación con sus respectivos fenotipos; la asociación CGCGAG-DL sobrevivió a la corrección de Bonferroni para pruebas múltiples y el valor p de GACGAG-TL estaba justo por debajo del umbral. Sin embargo, las asociaciones por sí mismas no son lo suficientemente fuertes como para descartar un error de tipo I, en parte debido a las bajas frecuencias de los haplotipos y al pequeño número de casos. Curiosamente, sin embargo, el efecto de estos haplotipos es lo suficientemente fuerte como para reducir el rendimiento medio en medidas fenotípicas relevantes en portadores versus no portadores. Los portadores del haplotipo CGCGAG, en promedio, mostraron un rendimiento significativamente peor en ocho mediciones relacionadas con la lectura en comparación con los no portadores. Del mismo modo, los portadores del haplotipo GACGAG mostraron un rendimiento promedio significativamente más bajo en la medición compuesta del lenguaje WOLD/NWR (Tabla 2). Este efecto cuantitativo indicó que este hallazgo no es un falso positivo y provocó un análisis adicional. Además, este bloque de haplotipos se encuentra muy cerca de BV677278, un compuesto supuestamente funcional de repetición corta en tándem (STR) del que los solicitantes ya informamos con anterioridad (11) (Fig. 1C). El polimorfismo de BV677278 se deriva de cinco unidades de repetición discretas que varían en número (Fig. 1A, Tabla S4). Esta STR evoluciona rápidamente, como lo indica su alto grado de polimorfismo entre las especies de primates y dentro del Homo sapiens (Fig. 1B, Fig. S2, Tabla S4).
Los haplotipos de riesgo de DCDC2 están en un fuerte desequilibrio de enlace con dos alelos de BV677278
El bloque de haplotipos asociado es adyacente a BV677278 (Fig. 1C) y se evaluó si los dos haplotipos de riesgo podrían capturar la asociación que surge de los alelos funcionales de BV677278 a través del desequilibrio de enlace. Para abordar esta pregunta, todos los portadores de estos haplotipos fueron sometidos a genotipado de BV677278 por secuenciación de Sanger. De los portadores del haplotipo CGCGAG, el 92 % también tiene el alelo 5 de BV677278. Asimismo, el 78 % de los portadores de GACGAG también portan el alelo 6 de BV677278 (Tabla 1). Los alelos 5 y 6 son similares en estructura, y se agrupan filogenéticamente al mismo clado (Tabla S4, Fig. S1). De hecho, casi todos los portadores de estos dos haplotipos también portan un alelo de este clado (Tabla 1). Estos resultados implican aún más a BV677278 como una variante de riesgo de DL y lo amplían como una posible variante de riesgo de TL (11), y junto con su capacidad reguladora aparente, sugieren que estos alelos de BV677278 son responsables de los efectos de los haplotipos de riesgo.
BV677278 se une específicamente al factor de transcripción ETV6
Para obtener información mecánica sobre la función de BV677278, se usó espectrometría de masas cuantitativa para identificar la(s) proteína(s) que se unen a este locus (20). Con este fin, una sonda oligonucleotídica biotinilada que llevaba segmentos de la repetición de BV677278, que previamente se había demostrado que se unía a una proteína nuclear, y un control no enlazado encriptado, se incubaron con extractos nucleares que habían sido marcados con SILAC (15). El marcado de SILAC implica cultivar dos poblaciones paralelas de células: una con medios que contienen aminoácidos marcados con isótopos pesados de carbono y nitrógeno, y la otra con isótopos naturales. Una vez que se incorpora la marca, las proteínas de las dos poblaciones (“pesada” y “ligera”) se pueden diferenciar entre sí mediante espectrometría de masas cuantitativa. El extracto nuclear pesado se incubó con la sonda de BV677278 y el extracto nuclear ligero con la sonda de control. Después, las sondas se extrajeron con perlas conjugadas con estreptavidina y la mezcla de proteínas obtenida se sometió a espectrometría de masas cuantitativa, y se buscaron proteínas que se enriquecieron significativamente con la sonda de BV677278 en comparación con la sonda de control (alto ratio pesada: ligera). El experimento se realizó con extractos nucleares derivados de células HeLa o Raji, y se repitió con una conmutación de marcas que dio como resultado un diagrama de interacción bidimensional. Estos experimentos produjeron un único candidato, compartido tanto por HeLa como por Raji: el factor de transcripción ETV6 (Fig. 2A-B). Para confirmar la interacción BV677278-ETV6, se realizó una inmunoprecipitación de cromatina con PCR cuantitativa (ChIP-qPCR) utilizando anticuerpo a-ETV6, en células Raji. La inmunoprecipitación con el anticuerpo a-ETV6 mostró un pronunciado enriquecimiento para el amplicón de BV677278, pero no para el amplicón de control derivado del gen que codifica la p-actina (ACTB) (Fig. 2C). Estos resultados demostraron que ETV6 se une a la región de BV677278.
Los haplotipos de riesgo de DCDC2 muestran una interacción genética sinérgica con un haplotipo de riesgo de DL conocido en el gen KIAA0319
Junto con los hallazgos anteriores del solicitante, estos datos implicaron a BV677278 como un elemento regulador. Los ensayos de luciferasa sugieren que BV677278 es capaz de modular la expresión del promotor de DCDC2, pero podría regular otros genes (15). Un haplotipo de riesgo de tres marcadores que abarca la mitad de 5' y la secuencia corriente arriba de KIAA0319 se ha asociado de manera consistente a un rendimiento reducido en la lectura (21-24). Además, la expresión de KIAA0319 en líneas celulares neuronales humanas se reduce con este haplotipo, en relación con los haplotipos sin riesgo (25). Por lo tanto, los solicitantes cuestionaron si BV677278 podría interactuar genéticamente con el haplotipo de riesgo de KIAA0319, y examinaron el efecto de portar tanto un haplotipo de riesgo de DCDC2 (CGCGAG o GACGAG) como el de KIAA0319 en varias mediciones de la lectura, del lenguaje y cognitivas. Sorprendentemente, los sujetos con haplotipos de riesgo en ambos genes mostraron un rendimiento promedio notablemente peor (hasta 0,40 desviaciones estándar) en casi todas las mediciones examinadas (Fig. 3A). Esta reducción en el rendimiento en portadores de ambos haplotipos de riesgo es, para la mayoría de los fenotipos examinados, mayor que la suma de los portadores individuales, lo que indica una interacción sinérgica entre estos dos genes. Este resultado corrobora un informe anterior, que proporcionó evidencia estadística de que DCDC2 y KIAA0319 interactúan para influir en el riesgo de DL (26).
Discusión
Dada la notable similitud del exoma humano con los de otros primates superiores, se ha planteado la hipótesis de que los elementos reguladores en rápida evolución son responsables de las grandes diferencias fenotípicas que observamos. Los resultados recientemente publicados del ENCODE Consortium, que mostraron que la mayor parte del genoma no codificante está activa y la mayor parte de la proporción activa es reguladora, prestan un respaldo circunstancial a esta hipótesis (27). Aquí, los solicitantes proporcionan evidencia de tal elemento regulador que afecta la lectura y el lenguaje, dos fenotipos exclusivamente humanos. BV677278 se expandió rápidamente del gorila al ser humano, aunque la secuencia que lo flanquea está bastante conservada (Fig. 1B), y su presencia, longitud y secuencia varían ampliamente entre las especies de primates (Fig. S2).
Este elemento se une específicamente a ETV6, un factor de transcripción, y un protooncogén también conocido como TEL (translocación ETS leucemia). El gen ETV6 forma fusiones oncogénicas, a menudo con el protooncogén AML1, que se ven con frecuencia en la leucemia (28). El efecto de ETV6 en la transcripción es generalmente represivo, a través del reclutamiento de un complejo correpresor (29). El ETV6 monomérico esencialmente no tiene afinidad por su secuencia de unión; debe al menos dimerizarse para unirse al ADN (30). Existe evidencia de que ETV6 se polimeriza in vivo, y la longitud del polímero depende del número y el espaciado de los sitios de unión (31). Esta propiedad sugiere que diferentes alelos de BV677278 se unen a polímeros de ETV6 de diferentes longitudes, dependiendo del número de sitios de unión de ETV6 con un espaciado adecuado, y que estas diferencias cambian la potencia reguladora del complejo (Fig. 3B). Respalda esta idea la similitud estructural de los alelos 5 y 6: ambos tienen la misma inserción de GGAa en la unidad de repetición 2, en relación con el alelo más común (Tabla S4). GGAA es la secuencia de unión principal de ETV6 (30), y esta inserción podría reclutar un monómero de ETV6 adicional al complejo.
Sin embargo, es incierto si ETV6 reprime la transcripción en este contexto y a qué genes se dirige. Los solicitantes informaron previamente de que los ensayos de luciferasa parecen indicar que algunos alelos de BV677278 activan la transcripción del promotor de DCDC2, y que los alelos con estructuras muy diferentes (por ejemplo, 3 y 5, Tabla S4) activan la transcripción en un grado similar (15). La interacción genética de BV677278 con el haplotipo de riesgo de KIAA0319, y su dramático efecto sobre el fenotipo, sugieren que KIAA0319 es un gen objetivo in vivo. Se sabe que el haplotipo de riesgo de KIAA0319 está asociado a una expresión reducida de KIAA0319, al menos en líneas celulares neuronales humanas, lo que sugiere la posibilidad de que porte un promotor o variante proximal del promotor que aumente la represión (o disminuya la activación) por BV677278, lo que da como resultado una expresión génica reducida y posibles consecuencias fenotípicas. Esa reducción en el coeficiente intelectual también se observó con la interacción DCDC2-KIAA0319 (Fig. 3A), puede reflejar una patología a nivel celular (por ejemplo, migración neuronal interrumpida), o simplemente puede reflejar la importancia del lenguaje en la medición del coeficiente intelectual. El genotipado de BV677278 en todos los miembros de ALSPAC y el posterior análisis combinatorio, junto con los experimentos de conformación de la cromatina, arrojarán aún más luz sobre los genes objetivo y el mecanismo de acción de BV677278.
Los haplotipos de riesgo de DCDC2 y KIAA0319 tienen un efecto sinérgico en fenotipos de la lectura, el lenguaje y la cognición. Esto confiere credibilidad a la hipótesis de “heredabilidad fantasma”, que explica la llamada heredabilidad perdida de rasgos continuos como resultado de interacciones no aditivas entre variantes de riesgo (32). También respalda esta idea el hecho de que aunque los portadores de los haplotipos de riesgo de DCDC2 muestran un rendimiento promedio reducido en las medidas fenotípicas, las desviaciones estándar para estas medidas fueron generalmente similares a las de los no portadores (Tabla 2). Esto implica que la magnitud del efecto de los haplotipos de riesgo sobre el fenotipo yace en un continuo y depende de otras variantes de riesgo que interactúan, así como de factores ambientales y estocásticos. Además, estos resultados pueden explicar parcialmente la eficacia faltante de los estudios GWAS. Si los elementos reguladores que evolucionan rápidamente son, de hecho, sustancialmente responsables de la variación fenotípica continua, se esperaría que, como BV677278, muestren un mayor grado de polimorfismo que el SNP promedio. Esto los haría difíciles de identificar mediante un análisis estándar de marcadores únicos en GWAS, reforzando la importancia de los análisis de interacción de genes, marcadores múltiples y vías en el estudio de rasgos complejos.
Referencias
1. Development NIoCHa (2010) Learning Disabilities (nichd.nih.gov/health/topics/learning_disabilities.cfm).
2. Peterson RL y Pennington BF (2012) Lancet 379(9830):1997-2007.
3. Pennington BF y Bishop DV (2009) Annual review of psychology 60:283-306.
4. Anónimo (2007) National Assessment of Educational Progress (NAEP): The Nation’s Report Card, Reading 2007 (National Center for Education Statistics, (nces.ed.gov/nationsreportcard/pubs/main2007/2007496.asp), (Institute of Education Sciences UDoE).
5. Scerri TS y Schulte-Korne G (2010) European child & adolescent psychiatry 19(3):179-197.
6. Meng H, et al. (2005) Human genetics 118(1 ):87-90.
7. Peschansky VJ, et al. (2010) Cereb Cortex 20(4):884-897.
8. Poelmans G, et al. (2011) Molecularpsychiatry 16(4):365-382.
9. Liu JS (2011) Current neurology andneuroscience reports 11 (2):171-178.
10. Velayos-Baeza A, et al. (2010) The Journal of biological chemistry 285(51):40148-40162.
11. Meng H, et al. (2005) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102(47):17053-17058.
12. Ludwig KU, et al. (2008) Psychiatric genetics 18(6):310-312.
13. Marino C, et al. (2012) Psychiatric genetics 22(1):25-30.
14. Wilcke A, et al. (2009) Annals of dyslexia 59(1 ):1-11.
15. Meng H, et al. (2011) Behavior genetics 41(1) :58-66.
16. Cope N, et al. (2012) NeuroImage 63(1):148-156.
17. Boyd A, et al. (2012) International journal of epidemiology.
18. Bishop DV, et al. (1996) Journal of child psychology and psychiatry, and allied disciplines 37(4):391-403.
19. Newbury DF, et al. (2009) American journal of human genetics 85(2):264-272.
20. Mittler G, et al. (2009) Genome research 19(2):284-293.
21. Francks C, et al. (2004) American journal of human genetics 75(6):1046-1058.
22. Luciano M, et al. (2007) Biological psychiatry 62(7) :811 -817.
23. Paracchini S, et al. (2008) The American journal of psychiatry 165(12):1576-1584.
24. Scerri TS, et al. (2011) Biological psychiatry 70(3):237-245.
25. Paracchini S, et al. (2006) Human molecular genetics 15(10):1659-1666.
26. Harold D, et al. (2006) Molecular psychiatry 11 (12):1085-1091, 1061.
27. Djebali S, et al. (2012) Nature 489(7414):101 -108.
28. Fuka G, et al. (2011) PloS one 6(10):e26348.
29. Wang L y Hiebert SW (2001) Oncogene 20(28):3716-3725.
30. Green SM, et al. (2010) The Journal of biological chemistry 285(24):18496-18504.
31. Kim CA, et al. (2001) The EMBO journal20(15):4173-4182.
32. Zuk O, et al. (2012) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109(4):1193-1198.
33. Han B, et al. (2008) Annals of human genetics 72(Pt 6):834-847.
34. Barrett JC, et al. (2005) Bioinformatics 21(2):263-265.
35. Purcell S, et al. (2007) American journal of human genetics 81 (3):559-575.
36. Butter F, et al. (2010) EMBO reports 11 (4):305-311.
Referencias suplementarias
51. Han B, et al. (2008) Annals of human genetics 72(Pt 6):834-847.
52. Scerri TS, et al. (2011) Biological psychiatry 70(3):237-245.
53. Barrett JC, et al. (2005) Bioinformatics 21(2):263-265.
54. Purcell S, et al. (2007) American journal of human genetics 81 (3):559-575.
55. Wu KK (2006) Methods Mol Biol338:281-290.
56. Dignam JD, et al. (1983) Nucleic acids research 11 (5):1475-1489.
57. Mittler G, et al. (2009) Genome research 19(2):284-293.
58. Meng H, et al. (2011) Behaviorgenetics 41 (1 ):58-66.
59. Kolodziej KE, et al. (2009) BMC molecular biology 10:6.
510. Meng H, et al. (2005) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102(47):17053-17058.
511. Boyd A, et al. (2012) International journal of epidemiology.
512. Hulme C, et al. (2007) Paired-associate learning, phoneme awareness, and learning to read. Journal of experimental child psychology 96(2): 150-166.
513. Peterson RL y Pennington BF (2012) Lancet 379(9830):1997-2007.
514. Rosner J y Simon DP (1971) Journal of Learning Disabilities 4(384):40-48.
515. Rust J, et al. (1993) WORD: Wechsler Objective Reading Dimensions Manual (Psychological Corporation, Sidcup, Reino Unido).
516. Nunes T, et al. (2003) Scientific Studies of Reading 7(3):289-307.
517. Neale MD (1997) Neale Analysis of Reading Ability, Revised: Manual for Schools (NFER-Nelson).
518. Gathercole SE y Baddeley AD (1996) The Children's Test of Nonword Repetition (Psychological Corporation, Londres, Reino Unido).
519. Wechsler D (1996) Wechsler Objective Language Dimensions (WOLD) (Psychological Corporation, Londres, Reino Unido).
520. Bishop DV, et al. (1996) Journal of child psychology and psychiatry, and allied disciplines 37(4):391-403.
521. Newbury DF, et al. (2009) American journal of human genetics 85(2):264-272.
Tablas del Ejemplo 1
Tabla 1: Datos de asociación y desequilibrio de enlace para haplotipos de riesgo de DCDC2. Los fenotipos se describen en la Tabla S1 y en “Materiales y métodos”. Los casos se definen con una puntuación menor o igual a 2SD por debajo de la media. Los valores P que sobrevivieron a la corrección de Bonferroni para pruebas múltiples (a = 0,05) están en negrita. “% Alelo 5”, etc. significa “porcentaje de portadores de haplotipos con al menos una copia de ese alelo o grupo de alelos”. Clado 1, la rama filogenética de alelos que incluye 5 y 6, se describe en la Fig. S1.
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Tabla 2: Rendimiento medio en mediciones de la lectura y cognitivas en portadores de haplotipos de riesgo de DCDC2 en comparación con no portadores. La desviación estándar se muestra entre paréntesis al lado de cada media. El número de sujetos en cada categoría se muestra debajo de esa categoría. Los valores P son de las pruebas T de Student que comparan los medios de portadores y no portadores de cada haplotipo; los valores de p inferiores a 0,05 están marcados con un asterisco. NWR/WOLD se refiere a la puntuación z promedio del rendimiento en las tareas de comprensión verbal de NWR y WOLD. Los fenotipos se describen en la Tabla S1 y en “Materiales y métodos”.
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Tabla S1: (A) Lista de fenotipos utilizados. En los “Materiales y métodos” se proporciona una descripción detallada de cada fenotipo. (B) Definiciones de casos/controles utilizados en el análisis de asociación.
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Tabla S2: Correlaciones bivariadas de Pearson entre las mediciones de la lectura y el lenguaje en ALSPAC. Fonema = Tarea de eliminación de fonemas a los 7 años de edad; NWR = Repetición de seudopalabras a los 8 años de edad; WOLD = Tarea de comprensión verbal de las Dimensiones Objetivas del Aprendizaje de Wechsler a los 8 años de edad; Prom. NWR WOLD = promedio del rendimiento de la puntuación z en las tareas de NWR y WOLD; Lectura 7 = Lectura de palabras sueltas a los 7 años de edad; Lectura 9 = Lectura de palabras sueltas a los 9 años de edad; Todas las mediciones del CI fueron recopiladas a los 8 años de edad con la Escala de Inteligencia para Niños de Wechsler, versión III.
Figure imgf000025_0004
Tabla S3: Estadísticas para los SNP reportados en el presente. Las estadísticas se calcularon después de la exclusión de muestras con una tasa de llamada baja (<85 % de la tasa de llamada promedio) y de individuos que no eran de ascendencia europea. Los SNP en fuente normal (no en negrita) (SNP 1-6 en la tabla) comprenden el bloque de haplotipos de riesgo de DCDC2; los SNP en letra negrita (SNP 7-9 en la tabla) comprenden el bloque de haplotipos de riesgo de KIAA0319. Los SNP se enumeran en el orden de sus respectivos haplotipos (por ejemplo, CGCGAG).
Figure imgf000026_0001
Tabla S4: Estructuras y frecuencias poblacionales para todos los alelos de BV677278 descritos hasta la fecha. Las frecuencias alélicas para los alelos disponibles se calcularon a partir de un estudio previo (10). Se encuentran disponibles frecuencias alélicas poblacionales solo para los alelos 11-22 en portadores de haplotipos de riesgo de DCDC2 (véase la Tabla S5). “Del” se refiere a la microdeleción de 2.445 pb que abarca a BV677278.
Figure imgf000026_0002
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Secuencias de los alelos 1 -39 de la Tabla S4 del Ejemplo 1
Alelo 1 (SEQ ID NO: 31)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGG AAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 2 (SEQ ID NO: 32)
GAGAGÜAAÜGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAAGAATGAAGGA AGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 3 (SEQ ID NO: 33)
GAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGGAAAGAATGAAGGA AGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 4 (SEQ ID NO: 34)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGG AAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 5 (SEQ ID NO: 35)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGG AAGGAAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 6 (SEQ ID NO: 36)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGG AAGGAAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 7 (SEQ ID NO: 37)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGG AAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 8 (SEQ ID NO: 38)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAAGAATG AAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 9 (SEQ ID NO: 39)
GAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGGAAAGAATGA AGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 10 (SEQ ID NO: 40)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGGAAAGAATG AAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 11 (SEQ ID NO: 41)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGG AAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 12 (SEQ ID NO: 42)
GAGAGGAAMrAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGUAAGGAAAGA ATGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 13 (SEQ ID NO: 43)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGA AAGGAAGGAAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 14 (SEQ ID NO: 44)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGA AAGGAAGGAAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 15 (SEQ ID NO: 45)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGAAAGGAAGGAAGG AAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 16 (SEQ ID NO: 46)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGGAAAG AATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 17 (SEQ ID NO: 47)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGA:\GGAAGGAAGGAAGAAAGAAAGGAAGGAAGGAAAG AATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 18 (SEQ ID NO: 48)
GAGAGí i AAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGAAAGG AAGGAAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 19 (SEQ ID NO: 49)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGG AAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 20 (SEQ ID NO: 50)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGG AAGAAAGGAAGGAAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 21 (SEQ ID NO: 51)
GAGAÜGAAGÜAAAÜAGAGGAAGÜAAAGGAAGGAAÜGAAGÜAAGGAAGGAAGAAAÜGAAGGAAGÜ AAAGAATGAAGGAACrGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 22 (SEQ ID NO: 52)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGG AAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 23 (SEQ ID NO: 53)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGG AAGGAAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 24 (SEQ ID NO: 54)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGG AAAGG AAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGAAAGGAAGG AAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 25 (SEQ ID NO: 55)
GAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGGAAAGA ATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 26 (SEQ ID NO: 56)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGGAAAG AATGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 27 (SEQ ID NO: 57)
GAGAGCrAAGG AAAGG AAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGGAAAGAATGAAGGAAGGA AGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 28 (SEQ ID NO: 58)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGG AAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 29 (SEQ ID NO: 59)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGAAGAAAGGAAGG AAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 30 (SEQ ID NO: 60)
GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGGAAGG AAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 31 (SEQ ID NO: 61) GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGG GAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 32 (SEQ ID NO: 62) GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAAG AATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 33 (SEQ ID NO: 63) GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAAGAATGAAGG AAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 34 (SEQ ID NO: 64) GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGAAAGG AAGGAAGGAAAGAATüAAGGAAGGAAGGAAGüGAGGGA
Alelo 35 (SEQ ID NO: 65) GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGAAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGG AAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 36 (SEQ ID NO: 66) GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAA AGGAAGGAAGGAAAGAATGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 37 (SEQ ID NO: 67) GAGAGGAAGGAAAGAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGG AAAGAATGAAGGAAGAAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Alelo 38 (SEQ ID NO: 68) GAGAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAAGAATGA AGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGA
Tabla S5: Frecuencias de alelos de BV677278 en los portadores de los haplotipos CGCGAG y GACGAG en ALSPAC. Los alelos que pertenecen al Clado 1 están demarcados con un “1” entre paréntesis.
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Tabla S6: Valores p para el experimento ChIP-qPCR (Figura 2B). Los valores representan pruebas T emparejadas de una cola para el enriquecimiento multiplicado entre cada par de condiciones de ChIP especificadas (tres réplicas de cada una). STR: Amplicón STR de BV677278; p-actina: Amplicón de control del gen de la p-actina; a-ETV6: ChIP con anticuerpo anti-ETV6; a-H3: ChIP con anticuerpo de control antivariante de histona H3; NA: ChIP sin control de anticuerpos. Los valores p por debajo de 0,05 se muestran en negrita con un asterisco, los valores p por debajo de 0,01 tienen dos asteriscos.
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Tabla S7: ANOVA de una vía entre los grupos enumerados en la Figura 3A: portadores de 1) haplotipo sin riesgo, 2) haplotipo de riesgo de KIAA0319, 3) haplotipo de DCDC2, y 4) un haplotipo de riesgo en ambos genes.
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Ejemplo 2
Una vez establecida la asociación entre los haplotipos de riesgo de DCDC2 y los haplotipos de riesgo de KIAA0319, se investigó la relación de READ1 (una variante funcional de riesgo de DL/TL dentro de DCDC2) y la variante de riesgo de DL de KIAA0319, KIAHap (un haplotipo que cubre la mitad 5' del gen de riesgo de DL KIAA0319, así como parte de su secuencia corriente arriba y el gen vecino TDP2). Como se describe en el presente documento, READ1 está compuesto por cinco unidades de repetición discretas, cada una de las cuales varía en número, lo que da lugar a un polimorfismo considerable. Incluyendo la deleción, se han descrito 39 alelos de READ1 hasta el momento, 6 de los cuales son comunes y 32 de los cuales son raros (en individuos de ascendencia europea). Estos alelos varían en longitud, de 81 pb a 114 pb. READ1 no parece existir fuera de los primates superiores, y entre las especies de primates superiores (y dentro del Homo sapiens) su longitud es muy variable. Parece que READ1 es un elemento hipermutable y de rápida evolución que apareció por primera vez en primates y alcanzó su tamaño completo en el Homo sapiens (Powers et al., 2013).
Para determinar los efectos de los alelos individuales de READ1 in vivo, se examinó la asociación de READ1 a la lectura y el lenguaje en el Estudio Longitudinal Avon de Padres e Hijos (ALSPAC), una gran cohorte de nacimiento longitudinal. El alelo 5 de READ1 se asoció fuertemente a DL grave, mientras que el alelo 6 de READ1 se asoció fuertemente a TL grave (Tabla 1). Además, aquellos individuos que portaban al menos una copia del alelo 5 tuvieron un peor desempeño en seis mediciones diferentes relacionadas con la lectura, en promedio, en comparación con los no portadores del alelo 5 (p <0,05), mientras que los portadores del alelo 6 tuvieron un peor desempeño en una medición compuesta del lenguaje, en promedio, que los no portadores del alelo 6 (p <0,05). Estos dos alelos relativamente comunes (frecuencias alélicas del 3,6 % y 5,0 %, respectivamente) son estructuralmente similares entre sí, y se agrupan filogenéticamente en el mismo clado. En comparación con el alelo más común (alelo 1), ambos alelos tienen una inserción GGAA en la misma posición. Por el contrario, otros alelos de READ1 comunes parecían tener un efecto protector en la lectura y el lenguaje. Los portadores de al menos una copia de un alelo de READ1 más corto (un alelo con una sola iteración de la unidad de repetición 1 o RU1, a diferencia de dos iteraciones en la mayoría de los alelos de READ1) obtuvieron mejores resultados en las tareas de lectura y del lenguaje en comparación con los no portadores, aunque las asociaciones protectoras a DL y TL graves solo fueron sugerentes (Tabla 1 del Ejemplo 2, más adelante).
Tabla 1: Resultados de la asociación para READ1. Esta tabla muestra los resultados de la asociación de los alelos simples y compuestos de READ1 con DL grave y TL grave. Las asociaciones se calcularon según un modelo alélico. Los valores #p significativos están en negrita, y se muestran los ratios de probabilidades notables para el riesgo aumentado (#) y reducido (*).
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Figure imgf000034_0001
Como se describe en el presente documento, la proteína de unión a READ1 se identificó como el potente represor transcripcional ETV6, cuya secuencia de unión (GGAA) coincide con la inserción observada en los alelos de riesgo 5 y 6. Esto sugiere que los alelos 5 y 6 tienen más sitios de unión a ETV6 disponibles que los alelos neutros o protectores (particularmente los alelos protectores más cortos). Cuando se consideran las propiedades de ETV6, el comportamiento peculiar de los alelos de READ1 comienza a tener sentido. En su estado monomérico, ETV6 es incapaz de unirse al ADN. Debe al menos homodimerizarse para desplazar un dominio autoinhibitorio que bloquea su dominio de unión al ADN en el estado monomérico (Green et al., 2010), y se sabe que es capaz de homopolimerizarse (Tognon et al., 2004). Esta propiedad sugiere una posibilidad intrigante: los alelos de READ1 de diferentes longitudes se unen a diferentes cantidades de monómeros ETV6, y esto altera la potencia reguladora del complejo (Figura 3B).
Asimismo, se cree que KIAHap marca un promotor funcional o una variante proximal del promotor que altera la regulación génica de KIAA0319. Hay evidencia de que esta variante funcional es el SNP rs9461045. Este SNP está en desequilibrio de enlace con KIAHap y está asociado a una expresión reducida del gen reportero del promotor de KIAA0319 en líneas celulares tanto neuronales como no neuronales (Dennis et al., 2009; Paracchini et al., 2006). La naturaleza reguladora de KIAHap y el hecho de que READ1 parece ser un elemento regulador de la unión a ETV6 llevó a la pregunta de si los alelos de riesgo 5 y 6 de READ1 interactúan con KIAHap para afectar el fenotipo. Sorprendentemente, los portadores de un alelo de riesgo de READ1 y KIAHap mostraron un desempeño notablemente peor en las tareas de lectura, lenguaje y CI (la Figura 5A muestra el alelo 5). Esta interacción es generalmente sinérgica; es decir, el efecto de tener dos alelos de riesgo es mayor que la suma de los efectos individuales de los alelos (Figura 5A). Además, los alelos protectores más cortos de READ1 (por ejemplo, aquellos que comprenden una sola unidad de repetición 1, “RU1_1”) parecen interactuar de manera epistática con KIAHap. En individuos con al menos una copia de un alelo RU1_1 más corto de READ1, el efecto deletéreo de KIAHap es completamente denegado. El rendimiento promedio de los sujetos con un alelo RU1_1 y KIAHap generalmente es ligeramente superior al promedio de la población y se asemeja al de los sujetos con un alelo RU1_1 solo (Figura 5B). Por lo tanto, parece que KIAHap sinergiza con alelos de READ1 deletéreos para exacerbar sus efectos deletéreos individuales en la lectura y el lenguaje, pero está enmascarado epistáticamente por alelos protectores de READ1. Esto sugiere que ETV6 y READ1 forman un complejo regulador que regula epistáticamente a KIAA0319 y, posiblemente, DCDC2 y otros genes objetivo.
Ejemplo 3
Caracterización del locus DYX2 en el cromosoma 6p22 con la discapacidad lectora, el trastorno del lenguaje y la cognición en general
Introducción
Aquí se describe la evaluación de la relación del locus DYX2 con DL, TL y la cognición. Se desarrolló un panel de marcadores que cubre densamente el locus DYX2 de 1,4 Mb y se usó para evaluar la asociación a las mediciones de lectura, lenguaje y cognitivas en sujetos del Estudio Longitudinal Avon de Padres e Hijos (ALSPAC). Las asociaciones se replicaron luego en tres cohortes independientes seleccionadas. Confirmando los resultados de los otros ejemplos descritos en el presente documento, hubo asociaciones con genes de riesgo de DL conocidos, KIAA0319 y DCDC2 (Figura 6A). Además, se identificaron otros marcadores en o cerca de otros genes de DYX2, incluidos TDP2, ACOT13, C6orf62, FAM65B y CMAHP. La estructura de DA del locus sugiere que los aciertos de asociación dentro de TDP2, ACOT13 y C6orf62 están capturando una variante de riesgo reportada previamente en KIAA0319. Estos resultados respaldan aún más que KIAA0319 y DCDC2 son genes efectores principales en DYX2, e identifican a FAM65B y CMAHP como nuevos genes de riesgo de DYX2. La asociación de DYX2 con múltiples rasgos neuroconductuales sugiere que las variantes de riesgo tienen consecuencias funcionales que afectan a múltiples procesos neurológicos.
Métodos
Sujetos
La cohorte de descubrimiento en esta investigación fue el Estudio Longitudinal Avon de Padres e Hijos (ALSPAC). ALSPAC es una cohorte de nacimientos basada en la población con sede en Avon, Reino Unido. Los sujetos fueron reclutados antes del nacimiento; se reclutaron un total de 15.458 fetos, de los cuales 14.701 estaban vivos al año de edad. El reclutamiento, los participantes y las metodologías de estudio se describen en detalle en otra parte (bristol.ac.uk/alspac) (Boyd et al. 2012; Golding et al. 2001). Las muestras de ADN para el análisis genético estaban disponibles para 10.259 sujetos. Las mediciones de lectura, lenguaje y cognición se realizaron a los 7, 8 y 9 años de edad. Los sujetos con un CI <75 en el CI Total de la Escala de Inteligencia de Wechsler para Niños (WISC-III) fueron excluidos para evitar los efectos de confusión de la discapacidad intelectual (Eicher et al. 2013a; Eicher et al. 2013b; Powers et al. 2013; Wechsler et al. 2002). Para evitar la estratificación de la población en los análisis genéticos, también se excluyeron los sujetos de ascendencia no europea. Las muestras con tasas de llamada de genotipo generales <0,85 se excluyeron de los análisis, dejando un tamaño de muestra final de 5579 individuos para los análisis de TL y 5525 individuos para los análisis de DL. La aprobación ética se obtuvo del Comité de Ética y Derecho de ALSPAC, los comités locales de ética en investigaciones del Reino Unido y el Comité de Investigación con Seres Humanos de Yale.
Mediciones de la lectura, el lenguaje y la cognición
Las mediciones de la lectura en el ALSPAC utilizadas en esta investigación incluyen una tarea de eliminación de fonemas a los 7 años de edad, la lectura de palabras sueltas a los 7 y 9 años de edad y la lectura de seudopalabras sueltas a los 9 años de edad (Tabla 1a). La tarea de eliminación de fonemas, también conocida como Prueba de Análisis Auditivo, evalúa el reconocimiento de los fonemas, un déficit central en la DL (Rosner y Simon 1971). Para la tarea de eliminación de fonemas, el niño escucha una palabra hablada en voz alta y luego se le pide que elimine un fonema específico de esa palabra para formar una nueva palabra. La lectura de palabras sueltas se evaluó a los 7 años de edad utilizando la subprueba de lectura de las Dimensiones Objetivas de la Lectura de Wechsler (WORD) (Rust et al. 1993). A los 9 años de edad, se volvió a evaluar la lectura de palabras sueltas pidiéndole al niño que leyera diez palabras reales y diez seudopalabras en voz alta, un subconjunto de una lista más grande de palabras y seudopalabras (Nunes et al. 2003). Para examinar los casos graves (Dl grave), se definieron los casos con una puntuación de 2 o más desviaciones estándar por debajo de la media en la tarea de eliminación de fonemas (Tabla 1b). Los casos con DL moderada también se definieron como una puntuación de al menos 1 desviación estándar por debajo de la media en la lectura de palabras sueltas a los 7 años de edad, la lectura de palabras sueltas a los 9 años de edad y la lectura de seudopalabras sueltas los 9 años de edad (Tabla 1b). Se eligió un umbral de 1 desviación estándar, ya que las mediciones se incluyeron en tres puntos de tiempo para aislar a los individuos con habilidades de decodificación persistentemente deficientes. Se examinaron diferentes niveles de gravedad porque los estudios anteriores en el locus DYX2 habían mostrado diferencias en los patrones de asociación genética según la gravedad del caso, particularmente con KIAA0319 que se asocia a definiciones de casos de DL más moderadas, y a DCDC2 con definiciones más graves (Paracchini et al. 2008; Powers et al. 2013; Scerri et al. 2011).
Las mediciones de lenguaje se recopilaron a los 8 años de edad (Tabla 1a). Con una adaptación de la Tarea de Repetición de Seudopalabras (NWR), en la que los sujetos repitieron grabaciones de seudopalabras, se evaluó la memoria fonológica a corto plazo y las capacidades de procesamiento (Gathercole y Baddeley 1996). Los niños también realizaron la tarea de comprensión verbal de las Dimensiones Objetivas del Lenguaje de Wechsler (WOLD) a los 8 años de edad (Wechsler et al. 1996), en la que respondieron a preguntas sobre un párrafo leído en voz alta por un examinador que describía una imagen presentada. Estas mediciones se analizaron porque se sabe que los individuos con TL muestran un desempeño deficiente en las tareas de NWR y WOLD (Bishop et al. 1996; Newbury et al. 2009). Al igual que con DL, también se examinó la asociación del locus DYX2 a definiciones de casos moderados y graves de TL. Para evaluar el riesgo impartido para TL grave, los casos de TL grave se definieron como una puntuación de 2 o más desviaciones estándar por debajo de la media de la muestra en cualquiera de las tareas (TL grave) (Tabla 1b). Para evaluar los déficits más moderados, los casos se definieron como puntuaciones de al menos 1,5 desviaciones estándar por debajo de la media de la muestra en cada tarea (NWR moderada y WOLD moderado) (Tabla 1b). Como se usaron menos mediciones para evaluar los rasgos relacionados con TL, el umbral para las definiciones de casos se incrementó a 1,5 desviaciones estándar para evaluar déficits más moderados. Los CI verbal, de rendimiento y total se evaluaron a los 8 años de edad, utilizando la Escala de Inteligencia de Wechsler para Niños (WISC-III) (Tabla 1a). Las mediciones del CI se examinaron como rasgos cuantitativos (Tabla 1b).
Genotipado y análisis genéticos
Se desarrolló un panel de marcadores de SNP para capturar la variación común en el locus DYX2. Los TagSNP en el locus se seleccionaron utilizando el servidor de diseño de estudios de asociaciones de Han et al. (Han et al. 2008). El panel final de DYX2 contenía 195 SNP con una potencia promedio estimada del 83 % y del 68 % para capturar variantes comunes y raras conocidas, respectivamente, en el locus DYX2 que abarca aproximadamente 1,4 Mb. Los marcadores fueron genotipados en la plataforma Sequenom (San Diego, CA), siguiendo las pautas del fabricante, en el Centro de Análisis de Genomas de Yale (West Haven, CT).
Los marcadores que se desviaban sustancialmente del equilibrio de Hardy-Weinberg, o que tenían una tasa de llamada global <85 %, no se utilizaron para el análisis basado en haplotipos. En la cohorte de descubrimiento de ALSPAC, se llevaron a cabo los análisis de SNP de marcadores únicos de los estados de casos y controles, y los rasgos cuantitativos, utilizando la SNP & Variation Suite (SVS) v7.6.4 (Bozeman, MT). Se evaluó el desequilibrio de enlace y se construyeron bloques de haplotipos utilizando la opción de la regla de cuatro gametos en HaploView v4.2. Las pruebas de asociación de haplotipos se realizaron con haplotipos que tenían frecuencias mayores o iguales al 1 % utilizando PLINK v1.07 (Barrett et al. 2005; Purcell et al. 2007). Se informa de que las asociaciones con p <0,001 para la cohorte de descubrimiento de ALSPAC presentan resultados sugerentes. Sin embargo, para corregir las pruebas múltiples, se usó un umbral de Bonferroni de 0,000256 (0,05 dividido entre 195 marcadores) para las pruebas de asociación de descubrimiento en la cohorte ALSPAC.
Después de los análisis de descubrimiento en ALSPAC, las variantes asociadas se evaluaron en tres cohortes reclutadas específicamente para DL o TL: TL Iowa, DL Italiana, DL Colorado (Tabla 2). La cohorte TL Iowa está compuesta por 219 casos de TL y 209 controles no relacionados, emparejados por sexo y edad, recopilados en la Universidad de Iowa. Los sujetos se sometieron a varias mediciones del lenguaje, incluidas la prueba Woodcock Johnson-III (WJ) y la Prueba Gray de Lectura Oral (GORT), que se utilizaron para obtener una puntuación compuesta del lenguaje, que luego se dicotomizó en estado caso-control en -1,14 desviaciones estándar (Eicher et al. 2013a; Weismer 2000). La cohorte del Centro de Investigación de Discapacidades del Aprendizaje de Colorado (CLDRC) consta de 1201 individuos en 293 familias nucleares. Se reclutaron familias para el estudio si al menos un niño tenía antecedentes de problemas de lectura. La cohorte italiana consta de 878 individuos en 304 familias nucleares; estas familias fueron reclutadas a través de un probando con DL clínicamente diagnosticada. La aprobación ética para el reclutamiento y las metodologías del estudio se obtuvieron del Comité de Investigación con Seres Humanos de Yale y de las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Iowa, de la Universidad de Denver y de Italia. Los SNP que tenían un solo marcador o asociaciones dentro de haplotipo con p <0,001 en el ALSPAC se probaron para determinar la replicación en las cohortes TL Iowa, DL Italiana y DL Colorado. TL Iowa se analizó utilizando SNP & Variation Suite (SVS) v7.6.4 (Bozeman, MT), mientras que las cohortes DL Italiana y DL Colorado basadas en familias se examinaron utilizando PLINK v1.07 (Purcell et al. 2007). Los resultados sugerentes de ALSPAC se derivaron para análisis de replicación a fin de enfatizar la replicación de asociaciones sobre correcciones estadísticas para pruebas múltiples. Se reportan replicaciones con p <0,05 en las cohortes TL Iowa, DL Italiana y DL Colorado.
Resultados
La asociación con marcadores de DYX2 se realizó en tres dominios separados: (1) DL, (2) TL y (3) CI. En aras de la claridad, las asociaciones se presentan dominio por dominio, con un énfasis en la replicación de la fuerza de las asociaciones en lugar de la corrección de pruebas múltiples.
DL
Las asociaciones con DL se realizaron utilizando dos definiciones de gravedad diferentes: (1) DL grave y (2) DL moderada (Tabla 1b). Para DL grave, se encontraron asociaciones con DCDC2, KIAA0319 y TDP2 (Tabla 3). La asociación de DCDC2 y DL grave se explora completamente en el Ejemplo 1; Powers et al. (2013). El marcador rs2294691 de TDP2 no replicó su asociación en ninguna de las tres cohortes de replicación (Tabla 5). El marcador rs10456309 de KIAA0319 se replicó en las cohortes TL Iowa y DL Colorado (Tabla 5). Con DL moderada, hubo una asociación entre rs1562422 cerca del gen FAM65B y el seudogén CMAHP, que se replicó en la cohorte DL Colorado (Tabla 3, Tabla 5).
TL
Las pruebas de asociación se realizaron en tres fenotipos de TL: (1) TL grave, (2) NWR moderada y (3) WOLD moderado (Tabla 1b). Al igual que con DL grave, hubo asociaciones entre DCDC2 y TL grave. El haplotipo de DCDC2 que se asoció a TL grave se describe en el Ejemplo 1; Powers et al. (2013). Un marcador dentro de este haplotipo de DCDC2, rs807694, mostró asociación con TL grave y se replicó en la cohorte TL Iowa (Tabla 3, Tabla 5). Con una definición de caso más moderada, se observaron asociaciones a ACOT13 y C6orf62 (Tabla 3), genes adyacentes a KIAA0319 y TDP2. Tanto rs3777663 en ACOT13 como rs3756814 en C6orf62 mostraron asociaciones en las cohortes DL Italiana y TL Iowa (Tabla 5).
CI
También se realizaron pruebas de asociación entre los marcadores de DYX2 y el CI verbal, el CI de rendimiento y el CI total (Tabla 1b). Las asociaciones del CI verbal incluyeron marcadores únicos y haplotipos que cubren la mitad 5” de KIAA0319, rs9348646 en FAM65B, y un haplotipo que abarca ACOT13 y C6orf62, con evidencia de replicación (Tabla 4a, Tabla 4b, Tabla 5). Hubo una superposición sustancial de las asociaciones de DYX2 con el CI verbal y las asociaciones con DL y TL. Estas similitudes de asociaciones no son inesperadas, ya que los rasgos están altamente correlacionados y se sabe que capturan dominios similares (Tabla 6). Las asociaciones de DYX2 con el CI de rendimiento y total fueron más débiles; no hubo asociaciones con el CI de rendimiento y una asociación única no replicada del CI total con rs2328791, que se encuentra en una gran región intergénica telomérica a NRSN1 y DCDC2 (Tabla 4a, Tabla 4b, Tabla 5).
Desequilibrio de enlace dentro de DYX2
En los análisis, se observaron asociaciones replicadas en los siguientes genes: DCDC2, KIAA0319, TDP2, ACOT13, C6orf62, FAM65B y el seudogén CMAHP. Sin embargo, como estos SNP están muy próximos entre sí, se evaluó el desequilibrio de enlace (DE) entre el panel de marcadores para determinar si los SNP asociados estaban marcando la misma variación en el locus. Como se describe en los Ejemplos 1 y 2, las asociaciones de DCDC2 marcaban alelos de READ1. Dentro de KIAA0319, parece que hay dos bloques de DE claros que separan el gen en una mitad 5' y una mitad 3' (datos no mostrados). La mitad 5' de KIAA0319 está en DE fuerte con TDP2, ACOT13 y C6orf62, lo que indica que las asociaciones dentro de estos genes pueden capturar la misma variación (datos no mostrados). Las asociaciones en FAM65B y CMAHP parecen estar marcando asociaciones independientes (datos no mostrados). Si bien rs1562422 se ubica como intergénico a FAM65B y CMAHP, este marcador está en DE fuerte con otros marcadores dentro del seudogén CMAHP. La integración de los análisis de asociación y la estructura DE indican cuatro señales de asociación independientes centradas en (1) DCDC2, (2) la mitad 5' de KIAA0319, (3) FAM65B y (4) CMAHP.
En este ejemplo, se caracteriza la relación del locus DYX2 con DL, TL y CI (Figura 6B). Los resultados confirman que las asociaciones de los genes de riesgo de DL, KIAA0319 y DCDC2, incluyen TL. Además, FAM65B y CMAHP se identificaron como genes de riesgo para rasgos lingüísticos. Los marcadores dentro del locus DYX2 mostraron asociación con numerosos rasgos de la comunicación, incluidos DL, TL y CI verbal. Hubo una notoria ausencia de asociaciones de DYX2 con CI de rendimiento y total, lo que indica que el locus DYX2 influye en los procesos relacionados con el lenguaje en mucho mayor grado que los rasgos cognitivos generales.
La asociación genética de DYX2 con DL, TL e CI verbal es el último ejemplo de varios procesos neurocognitivos y comunicativos que comparten asociaciones genéticas. El solicitante y otros han demostrado que estos rasgos neuroconductuales tienen contribuyentes genéticos comunes, que incluyen variantes en FOXP2, KIAA0319, CMIP, ZNF385D, CNTNAP2 y DCDC2 (Eicher et al. 2013b; Newbury et al. 2009; Newbury et al. 2011, Pennington y Bishop 2009, Peter et al. 2011; Pinel et al. 2012; Powers et al. 2013; Scerri et al. 2011; Wilcke et al. 2012). La expansión de la asociación de DYX2 a partir de la lectura para incluir otros procesos relacionados con el lenguaje sugiere que las variantes causales pueden afectar estos rasgos de manera pleiotrópica, en lugar de influir exclusivamente en el lenguaje verbal o escrito. Los hallazgos de este estudio coinciden con esta “hipótesis de los genes generalistas”, que también está respaldada por un reciente análisis de rasgos complejos del genoma (GTCA) de las capacidades cognitivas y de aprendizaje (Trzaskowski et al. 2013). Las fuertes correlaciones y la relación entre estas medidas neurocognitivas (Tabla 6) sugieren que estos genes de DYX2 afectan a procesos centrales del lenguaje que, a su vez, se manifiestan fenotípicamente de varias maneras, incluyendo la lectura, el lenguaje y la cognición.
Que los múltiples genes de DYX2 hayan mostrado una asociación con los fenotipos en este estudio es interesante y, a primera vista, algo inesperado. Una posibilidad es que uno o dos genes no sean los únicos responsables de la implicación consistente de este locus en los fenotipos de la lectura, el lenguaje y la cognición, como se cree principalmente. KIAA0319 y DCDC2 se conocen actualmente como los dos genes de mayor riesgo en el locus DYX2. Ambos han sido implicados tanto en la DL como en la variación subclínica del rendimiento en la lectura, utilizando mediciones neurocomportamentales clásicas y, más recientemente, técnicas de neuroimagen (Eicher y Gruen 2013; Graham y Fisher 2013). Otros genes en DYX2 se han asociado al DL, pero no tan a menudo como DCDC2 y KIAA0319. Sin embargo, con el panel de SNP denso descrito en el presente documento, fue posible observar asociaciones con otros elementos de DYX2, incluidos FAM65B y CMAHP.
Otra posible explicación para el número de genes de DYX2 observados que se asocian a los fenotipos en este estudio es el desequilibrio de enlace DE dentro del locus DYX2. De hecho, es probable que el DE explique el grupo de asociaciones alrededor de KIAA0319, TDP2, ACOT13 y C6orf62. Como se describe aquí, dos bloques con DE principales abarcan KIAA0319: uno abarca la mitad 3' del gen, mientras que el otro abarca la región 5' de KIAA0319, así como ACOT13, TDP2 y parte de C6orf62. Casi todas las asociaciones en este estudio se localizan en este bloque con DE 5', que también contiene el haplotipo de riesgo de DL KIAA0319 reportado anteriormente. Debido a esta estructura con DE, es imposible determinar si las asociaciones en esta región son independientes o si capturan la misma variante funcional. La última posibilidad se considera la más probable, y se cree que las asociaciones en esta región probablemente estén marcando la misma variante causal capturada por el haplotipo de riesgo de DL KIAA0319. El estudio funcional de esta región, particularmente de los genes menos estudiados, TDP2, ACOT13 y C6orf62, será útil para determinar si estas asociaciones son independientes o no.
En contraste, los marcadores dentro o cerca de FAM65B y CMAHP parecen estar capturando distintas señales de asociación de dos bloques con DE diferentes (datos no mostrados). El SNP rs9348646, que mostró asociación con IC verbal, se localiza dentro de un intrón de FAM65B en un bloque con DE, mientras que rs1562422, que mostró asociación con DL moderada, se localiza en un bloque con DE separado. Si bien rs1562422 es un marcador intergénico ubicado físicamente entre FAM65B y CMAHP, muestra un DE fuerte con marcadores en CMAHP (datos no mostrados). Los patrones de DE dentro del locus DYX2 sugieren que las asociaciones en KIAA0319, TDP2, ACOT13 y C6orf62 están marcando la misma variante causal, mientras que rs9348646 en FAM65B y rs1562422 son independientes.
Los otros genes de DYX2, incluidos FAM65B y CMAHP, se han estudiado mucho menos que los genes de riesgo DCDC2 y KIAA0319. Poco se sabe acerca de FAM65B en términos de función biológica; sin embargo, existe evidencia de que FAM65B puede influir en la migración en los linfocitos T (Rougerie et al. 2013). Los modelos animales de DCDC2 y KIAA0319 han implicado a estos genes en procesos migratorios, aunque en un contexto neuronal. CMAHP, que codifica una enzima clave en la síntesis de los ácidos siálicos Neu5Ac y Neu5Gc en otros mamíferos, se convirtió en un seudogén en humanos por una microdeleción inactivadora y la subsiguiente fijación del alelo inactivo en poblaciones humanas tempranas (Chou et al. 1998). Aunque ACOT13 parece estar marcando la variación dentro de KIAA0319, los estudios funcionales preliminares de ACOT13 resultan intrigantes. ACOT13 se asoció recientemente a una activación asimétrica más baja del surco temporal superior posterior durante las tareas de lectura y fonología (Pinel et al. 2012). El producto proteico codificado por ACOT13 ha sido colocalizado con betatubulina en microtúbulos; se propone que la unión a los microtúbulos es importante para la DL, ya que DCDC2 contiene dos dominios de doblecortina que se cree que se unen a los microtúbulos (Cheng et al. 2006).
Los genes y elementos reguladores dentro del locus DYX2 pueden contribuir interactivamente a los dominios de la lectura y el lenguaje, como se ve con la relación no aditiva entre las variantes reguladoras putativas en DCDC2 y KIAA0319 (Ejemplo 1; Powers et al. 2013, Ludwig et al. 2008). Se ha demostrado que estas variantes de riesgo influyen en la expresión genética y que interactúan entre sí para influir sustancialmente en el rendimiento en las tareas de la lectura y el lenguaje. Una red reguladora compleja, donde los elementos reguladores interactúan y corregulan otros genes y elementos de DYX2, podría contribuir a la lectura, el lenguaje y la cognición. Si es así, es probable que el elemento READ1 en DCDC2 y la variante causal marcada por el haplotipo de riesgo de KIAA0319 tengan los efectos más fuertes sobre la expresión génica y el fenotipo neurocognitivo definitivo. Respalda esta idea el hecho de que muchos de los aciertos de asociación descritos en el presente documento, tanto basados en marcadores únicos como en haplotipos, y con los tres fenotipos, se localizan en el mismo bloque con DE que el haplotipo de riesgo de KIAA0319. Este resultado, junto con la asociación del haplotipo de riesgo de KIAA0319 con expresión reducida de KIAA0319 y su interacción sinérgica con un elemento regulador en un intrón de DCDC2, indica la presencia de al menos una variante reguladora en esta región que influye en la expresión de KIAA0319. Las ubicaciones de los únicos otros aciertos independientes en el locus (aparte de READ1 en DCDC2), un intrón de FAM65B y corriente abajo de un seudogén, pueden sugerir la presencia de regiones reguladoras adicionales que influyen en la expresión génica. Según el trabajo descrito en el presente documento, DCDC2 y KIAA0319 son los principales genes efectores responsables de la influencia de DYX2 en el riesgo de DL y TL, y la alteración de los niveles o patrones de expresión génica es el mecanismo por el cual se ejerce este efecto.
En el trabajo descrito en el presente documento, se enfatizó la replicación de asociaciones genéticas en cohortes independientes, en lugar de la confianza en correcciones estadísticas para pruebas múltiples, para la validación de las asociaciones en la cohorte de descubrimiento de ALSPAC. Las replicaciones de la asociación genética con los rasgos neurocognitivos de interés, en particular en las diversas cohortes de esta investigación, proporcionan pruebas sólidas de que los resultados de este estudio no se deben a un error de Tipo I. También se reportan valores p no corregidos y un umbral estadístico que corrige 195 marcadores genéticos (umbral de 0,000256) para presentar el contexto de los hallazgos en términos de fuerza y confiabilidad. No obstante, las tres cohortes de replicación no eran idénticas y tenían diferencias inherentes entre sí y con respecto a la cohorte de descubrimiento, que pudieron haber evitado la replicación. Estas diferencias incluyen: (1) el trastorno para el que se seleccionó cada cohorte (DL vs. TL vs. no seleccionado), (2) la gravedad de la definición del caso y el reclutamiento, y 3) el país de reclutamiento (Reino Unido vs. EE. UU. vs. Italia) y el idioma hablado (inglés vs. italiano). Por ejemplo, el uso de un idioma regular como el italiano en lugar de un idioma irregular como el inglés puede haber permitido detectar más fácilmente las verdaderas deficiencias en la lectura y el lenguaje. Este problema probablemente se haya evitado en la cohorte de descubrimiento de ALSPAC debido al gran tamaño de la muestra. La observación de múltiples asociaciones replicadas en todo el locus DYX2 descrito en el presente documento aumenta la confianza en estos resultados. En resumen, los análisis indican cuatro señales de asociación para DL, TL y Coeficiente verbal en el locus DYX2: DCDC2, KIAA0319, FAM65B y el seudogén CMAHP. Los resultados de asociación dentro de las áreas de DCDC2 y KIAA0319 (incluyendo TDP2, ACOT13 y C6orf62) están en DE con dos variantes de riesgo reportadas previamente: el elemento regulador READ1 en DCDC2 y el haplotipo de riesgo KIAA0319 en KIAA0319 y TDP2. Estos resultados apuntan fuertemente a la variación en la expresión del gen KIAA0319 como mediadora del efecto de DYX2 en los fenotipos de la lectura y el lenguaje.
Referencias
Barrett JC, et al. (2005) Bioinformatics 21:263-265.
Beaver KM, et al. (2010) J Neural Transm 117(7):827-30.
Bishop DV, et al. (2008) Genes Brain Behav 7(3):365-72.
Bishop DV, et al. (1996) J Child Physiol Psychiatry 37:391-403.
Boyd A, et al. (2012) Int J Epidemiol42(1):111 -27.
Cardón LR, et al. (1994) Science 266(5183):276-9.
Catts HW, et al. (2005) J Speech Lang Hear Res 48(6) :1378-96.
Cheng Z, et al. (2006) Biochem Biophys Res Commun 350(4):850-3.
Chou HH, et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(20) :11751 -6.
Cope N, et al. (2005) Am J Hum Genet 76(4):581-91.
Couto JM, et al. (2010) Am J Med Genet B Neuropsychatr Genet 153B(2):447-62. Deffenbacher KE, et al. (2004) Hum Genet 115(2):128-38.
Dennis MY, et al. (2009) PLoS Genet 5(3):e1000436.
Eicher JD y Gruen JR. (2013) Mol Genet Metab, doi: 10.1016/j.ymgme.2013.07.001. Eicher JD, et ai. (2013a) PLoS One 8(5):e63762.
Eicher JD, et al. (2013b) Genes Brain Behav, en prensa.
Elbert A, et al. (2011) Behav Genet 41(1) :77-89.
Francks C, et al. (2004) Am J Hum Genet 75(6):1046-1058.
Gathercole S y Baddeley AD. (1990) Journal of Memory and Language 29:336-360. Gathercole SE y Baddeley AD. (1993) Lawrence Erlbaum, Mahwah, NJ.
Gathercole SE y Baddeley AD. (1996) The Psychological Corportation, Londres. Gayán J, et al. (1999) Am J Hum Genet 64(1):157-64.
Golding J, et al. (2001) Paediatr Perinat Epidemiol 15(1) :74-87.
Graham SA y Fisher SE. (2013) Curr Opin Neurobiol23(1 ):43-51.
Han B, et al. (2008) Ann Hum Genet 72(Pt 6):834-847
Harold D, et al. (2006) Mol Psychiatry 11(12):1085-1091.
Kaminen N, et al. (2003) J Med Genet 40(5):340-5.
Kaplan DE, et al. (2002) Am J Hum Genet 70(5):1287-98.
Landi N, et al. (2013) Dev Sci 16(1):13-23.
Lind PA, et al. (2010) Eur J Hum Genet 18(6):668-73.
Luciano M, et al. (2007) Biol Psychiatry 62:811-817.
Ludwig KU, et al. (2008) J Neural Transm 115(11):1587-9.
Marino C, et al. (2012) Psychiatr Genet 22(1):25-30.
Meng H, et al. (2011) Behav Genet 41(1):58-66.
Meng H, et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:17053-17058.
Newbury DF, et al. (2010) Genome Med 2(1):6.
Newbury DF, et al. (2011) Behav Genet 41(1 ):90-104.
Newbury DF, et al. (2009) Am J Hum Genet 85(2):264-72.
Nunes T, et al. (2003) Scientific Studies of Reading 7(3):289-307.
Paracchini S, et al. (2008). Am J Psychiatry 165(12):1576-1584.
Paracchini S, et al. (2006) Hum Mol Genet 15(10):1659-1666.
Pennington BF. (2006) Cognition 101(2):385-413.
Pennington BF y Bishop DV (2009) Annual Review of Psychology 60:283-306.
Peter B, et al. (2011) J Neurodev Disord3(1):39-49.
Pinel P, et al. (2012) J Neurosci 32(3):817-25.
Plomin R, et al. (2004) Mol Psychiatry 9(6):582-6.
Powers NR, et al. (2013) Am J Hum Genet 93(1): 19-28.
Purcell S, et al. (2007) Am J Hum Genet 81(3):559-575.
Rosner J y Simon DP. (1971) Journal of Learning Disabilities 4(384):40-48.
Rougerie P, et al. (2013) J Immunol 190(2):748-55.
Rust J, et al. (1993) Psychological Corporation, Sidcup, Reino Unido.
Scerri TS, et al. (2011) Biol Psychiatry 70:237-245.
Schumacher J, et al. (2006) Am J Hum Genet 78(1):52-62.
Trzaskowski M, et al. (2013) Behav Genet43(4):267-73.
Wechsler D. (1996) Psychological Corporation, Londres, Reino Unido.
Wechsler D, et al. (1992) Psychological Corporation, Sidcup, Reino Unido.
Weismer SE, et al. (2000) J Speech Lang Hear Res 43(4):865-78.
Wilcke A, et al. (2011) Eur J Hum Genet 20(2):224-9.
Wilcke A, et al. (2009) Ann Dyslexia 59(1 ):1 -11.
Wise JC, et al. (2007) J Speech Lang Hear Res 50(4):1093-9.
Wong PC, et al. (2013) PLoS One 8(5):e64983.
Viding E, et al. (2004) J Child Psychol Psychiatry 45(2):315-25.
Zhong R, et al. (2013) Mol Neurobiol47(1):435-42.
Zou L, et al. (2012) Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 159B(8):970-6.
Leyendas de las figuras
Figura 1: Esquema de los genes dentro del locus DYX2 en el cromosoma 6p21.3. Los genes en azul, DCDC2 y KIAA0319, tienen asociaciones replicadas con fenotipos del lenguaje verbal y escrito, a saber, de DL y TL. Las regiones en rojo marcan dos variantes funcionales, READ1 en DCDC2 y un haplotipo de riesgo con marcadores en KIAA0319 y TDP2, que se han asociado funcionalmente a DL y TL, utilizando modelos animales y técnicas moleculares.
Figura 4: Un esquema actualizado de genes en nuestro estudio con marcadores que muestran asociaciones replicadas a DL, TL y/o CI. La lista de estos genes (mostrados en azul) se ha ampliado a siete (DCDC2, KIAA0319, TDP2, ACOT13, C6orf62, FAM65B y CMAHP), aunque el desequilibrio de enlace pueda dar cuenta de múltiples asociaciones (en particular para KIAA0319, TDP2, ACOT13 y C6orf62).
Tablas del Ejemplo 3
Tabla 1a: Mediciones del fenotipo de ALSPAC
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Tabla 1b: Definiciones de fenotipos para análisis de ALSPAC
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Tabla 2: Cohortes de replicación
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Tabla 3: Asociaciones genéticas de marcadores únicos con varias definiciones de casos y controles de DL y TL.
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Tabla 4: Asociaciones genéticas basadas en marcadores únicos (Tabla 4a) y haplotipos (Tabla 4b) con medición cuantitativa de la cognición.
Tabla 4a: Asociaciones genéticas de marcadores únicos con la cognición
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Tabla 4b: Asociaciones genéticas basadas en haplotipos con cognición
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Tabla 5: Replicación de asociaciones genéticas en las cohortes de lowa, Italia y Colorado.
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Tabla 6: Correlaciones de fenotipos en la cohorte de ALSPAC*
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Ejemplo 4
Estudio de Asociación del Genoma Completo de Componentes Compartidos de la Discapacidad Lectora y el Trastorno del Lenguaje; ZNF385D influye en los trastornos de la lectura y el lenguaje.
Introducción
Tanto DL como TL son rasgos complejos que se comanifiestan con frecuencia, lo que lleva a la hipótesis de que estos trastornos comparten una etiología genética. Para probar esto, se realizó un estudio de asociación del genoma completo (GWAS) en individuos afectados con DL y TL en el Estudio Longitudinal Avon de Padres e Hijos. Las asociaciones más fuertes se vieron con marcadores en ZNF385D (OR = 1,81, p = 5,45 x 10-7) y COL4A2 (OR = 1,71, p = 7,59 x 10-7). Los marcadores dentro de NDST4 mostraron las asociaciones más fuertes con TL individualmente (OR = 1,827, p = 1,40 x 10-7). La asociación de ZNF385D se replicó utilizando mediciones del vocabulario receptivo en el estudio de Genética Neurocognitiva Pediátrica en Imágenes (p = 0,00245). Luego se utilizaron los datos de volumen de tractos de fibras del tensor de difusión en 16 tractos de fibra para examinar las implicaciones de los marcadores replicados. ZNF385D fue un predictor de los volúmenes generales de tractos de fibra en ambos hemisferios, así como del volumen global del cerebro. En este ejemplo, se presenta evidencia para ZNF385D como un gen de riesgo para DL y TL. La implicación del factor de transcripción de ZNF385D en DL y TL subraya la importancia de la regulación transcripcional en el desarrollo de rasgos neurocognitivos de orden superior.
Métodos
ALSPAC.
El equipo de ALSPAC llevó a cabo el reclutamiento de sujetos y la recopilación de fenotipos y datos genéticos para la cohorte de ALSPAC. El ALSPAC es una cohorte de nacimientos prospectiva, basada en la población, con sede en la región de Avon en el Reino Unido. Se compone principalmente de niños de ascendencia del norte de Europa, nacidos en 1991 y 1992. Los niños fueron reclutados antes del nacimiento; el reclutamiento de sus madres embarazadas dio lugar a un total de 15.458 fetos, de los cuales 14.701 estaban vivos al año de edad. Los detalles sobre los participantes, el reclutamiento y las metodologías de estudio se describen en detalle en otra parte (http://www.bristol.ac.uk/alspac) (Boyd et al., 2012; Golding et al., 2001). Los niños de ALSPAC han sido ampliamente fenotipados desde antes del nacimiento hasta la edad adulta temprana. La aprobación ética se obtuvo del Comité de Ética y Derecho de ALSPAC, los comités locales de ética en investigaciones del Reino Unido y el Comité de Investigación con Seres Humanos de Yale.
Mediciones de la lectura y el lenguaje.
Las mediciones de la lectura, el lenguaje y la cognición utilizadas para este estudio se recopilaron a las edades de 7, 8 y 9 años. Los sujetos con CI < 75 en el CI Total de la Escala de Inteligencia de Wechsler para Niños (WISC-III), realizado a los 8 años de edad, fueron excluidos de los análisis presentados (Weschler et al. 1992). Las mediciones de la lectura en el ALSPAC incluyen una tarea de eliminación de fonemas a los 7 años de edad, la lectura de palabras sueltas a los 7 y 9 años de edad, la lectura de seudopalabras a los 9 años de edad, y la comprensión lectora de un texto a los 9 años de edad. La tarea de eliminación de fonemas evalúa el reconocimiento de los fonemas, considerado ampliamente como un déficit central tanto en DL como en TL (Pennington, 2006; Pennington y Bishop, 2009). Para la tarea de eliminación de fonemas, también conocida como Prueba de Análisis Auditivo, el niño escucha una palabra hablada en voz alta y luego se le pide que elimine un fonema específico de esa palabra para formar una nueva palabra (Rosner y Simon, 1971). La lectura de palabras sueltas se evaluó a los 7 años de edad utilizando la subprueba de lectura de las Dimensiones Objetivas de la Lectura de Wechsler (WORD). A los 9 años de edad, se evaluó la lectura de palabras y seudopalabras sueltas pidiéndole al niño que leyera diez palabras reales y diez seudopalabras en voz alta de un subconjunto de una lista más grande de palabras y seudopalabras tomadas de la investigación realizada por Terezinha Nunes y colegas (Rust et al., 1993). Las puntuaciones de comprensión lectora se determinaron a los 9 años de edad, utilizando el Análisis de la Capacidad Lectora de Neale (NARA-II) (Neale 1997). Se recopilaron dos mediciones del lenguaje adicionales, las tareas de repetición de seudopalabras y de comprensión verbal, durante entrevistas clínicas a los 8 años de edad. Se utilizó una adaptación de la Tarea de Repetición de Seudopalabras (NWR), en la que los sujetos repitieron grabaciones de seudopalabras, para evaluar el procesamiento y la memoria fonológica a corto plazo (Gathercole y Baddeley, 1996). Los niños también completaron la tarea de comprensión verbal de las Dimensiones Objetivas del Lenguaje de Wechsler (WOLD), en la que respondieron a preguntas sobre un párrafo leído en voz alta por un examinador que describía una imagen presentada (Weschler 1996). Se calcularon las puntuaciones Z para cada sujeto en cada medición individual.
Definiciones de casos.
El solicitante se propuso capturar de manera persistente el bajo desempeño en varios dominios de la lectura y el lenguaje verbal como casos de DL y TL en las definiciones de casos (Tabla 1). Por lo tanto, se definió que los casos de DL tenían una puntuación z menor o igual a -1 en al menos 3 de las 5 tareas siguientes: lectura de palabras sueltas a los 7 años de edad, eliminación de fonemas a los 7 años de edad, lectura de palabras sueltas a los 9 años de edad, lectura de seudopalabras a los 9 años de edad y comprensión lectora a los 9 años de edad. Hubo 527 sujetos definidos como casos de DL. Se definió que los casos de TL tenían una puntuación z menor o igual a -1 en al menos 2 de las 3 tareas siguientes: eliminación de fonemas a los 7 años de edad, comprensión verbal a los 8 años de edad y repetición de seudopalabras a los 8 años de edad. Hubo 337 sujetos definidos como casos de TL. Como el reconocimiento de fonemas es importante tanto en DL como en TL, se incluyó en la definición de casos, tanto para DL como TL, con el fin de reflejar la presentación clínica. Hubo 174 individuos afectados con DL y TL, con una proporción de hombres y mujeres de 1,7:1. En la caracterización adicional de las asociaciones observadas, se crearon subconjuntos de casos sin comorbilidad. Hubo 163 casos de TL, excluyendo aquellos con DL concomitante, y 353 casos de DL, excluyendo aquellos con TL concomitante. Para todos los análisis, los controles se definieron como sujetos de ALSPAC de ascendencia europea que realizaron todas las evaluaciones neuroconductuales necesarias, pero no cumplieron con los criterios para el estado del caso.
Genotipado y análisis.
Los sujetos fueron genotipados en matrices de cuentas Illumina HumanHap 550 (San Diego, CA). Los sujetos eran excluidos si el porcentaje de genotipos faltantes era superior al 2 % (n = 6). Para evitar una posible estratificación de la población, solo se incluyeron sujetos de ascendencia europea. En el análisis primario de individuos con DL y TL, hubo 174 casos y 4117 controles. Hubo un total de 500.527 SNP genotipados antes de la evaluación de calidad y el control de calidad. Los marcadores se eliminaban si el equilibrio de Hardy-Weinberg p <0,0001 (n = 93) o si la falta era mayor que 10 % (n = 19). Todos los marcadores tenían una frecuencia de alelo menor mayor que 0,01. Todos los análisis genéticos se realizaron mediante regresión logística en PLINK v1.07 (Purcell et al., 2007). Para corregir las pruebas múltiples, se estableció un umbral corregido de Bonferroni de a = 1,00 x 10-7 = 0,05/500.000 marcadores probados.
Después de los análisis iniciales que examinaron los casos con DL y TL, se examinaron las definiciones de los casos de DL y TL de forma individual (por ejemplo, TL excluyendo aquellos con DL concomitante, y DL excluyendo aquellos con TL concomitante). Estos análisis se llevaron a cabo para determinar si un solo trastorno (DL o TL) impulsaba señales de asociación en el análisis de DL y TL concomitantes. También se examinaron las asociaciones de marcadores dentro de varios genes de riesgo de DL y/o TL previamente identificados, incluidos los reportados recientemente en Luciano et al., para presentar sus resultados con estas definiciones fenotípicas. Estos genes incluían: ABCC13, ATP2C2, BC0307918, CMIP, CNTNAP2, DAZAP1, DCDC2, DYX1C1, FOXP2, KIAA0319, KIAA0319L, PRKCH, ROBO1 y TDP2.
Se realizaron análisis genéticos en cada fenotipo (DL y TL concomitantes, así como DL y TL individualmente) utilizando el programa VEGAS, similar al del estudio de Luciano et al. (Liu et al., 2010; Luciano et al., 2013). Para corregir las pruebas múltiples, se estableció un umbral corregido de Bonferroni de a = 2,84 x 10-6 = 0,05/17,610 genes probados.
Análisis de replicación de PING.
Los análisis de replicación se llevaron a cabo en el estudio PING. Los detalles sobre los métodos de reclutamiento, de constatación, neuroconductuales, genéticos y neuroimagenológicos, y la adquisición de datos en el estudio PING, se describen en detalle en otra parte, pero se resumen brevemente a continuación (Akshoomoff et al., 2013, Brown et al., 2012; Fjell et al., 2012; Walhovd et al., 2012). El estudio PING es una cohorte transversal de niños y adolescentes con un desarrollo típico entre las edades de 3 y 20 años. Los sujetos fueron evaluados en busca de antecedentes de trastornos importantes del desarrollo, psiquiátricos y/o neurológicos, lesión cerebral o afecciones médicas que afectan el desarrollo. Sin embargo, los sujetos no fueron excluidos debido a problemas de aprendizaje como DL y TL. Los programas de protección para investigaciones con seres humanos y las juntas de revisión institucional en las 10 instituciones (Weil Cornell Medical College, Universidad de California en Davis, Universidad de Hawái, Instituto Kennedy Krieger, Hospital General de Massachusetts, Universidad de California en Los Ángeles, Universidad de California en San Diego, Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, Universidad del Sur de California y Universidad de Yale) que participaron en el estudio PING aprobaron todos los procedimientos experimentales y de consentimiento. Para individuos menores de 18 años de edad, se obtuvo el consentimiento informado de los padres y el asentimiento del menor (para las personas de 7 a 17 años de edad). Todos los participantes mayores de 18 años de edad dieron su consentimiento informado por escrito.
Los sujetos realizaron la versión del estudio validada de NIH Toolbox Cognition Battery, en la que se llevaron a cabo dos tareas relacionadas con el lenguaje y la lectura: la Prueba de Reconocimiento de Lectura Oral y la Prueba de Vocabulario con Imágenes (Akshoomoff et al., 2013; Weintraub et al., 2013). En la Prueba de Reconocimiento de Lectura Oral, una palabra o letra se presenta en la pantalla de la computadora y se le pide al participante que la lea en voz alta. Las respuestas son registradas como correctas o incorrectas por el examinador, quien ve las pronunciaciones aceptadas en una pantalla de computadora aparte. La Prueba de Vocabulario con Imágenes es una medición del vocabulario receptivo y se administra en un formato adaptativo computarizado. Al participante se le presenta una grabación auditiva de una palabra y cuatro imágenes en la pantalla de la computadora; la tarea es tocar la imagen que mejor represente el significado de la palabra.
Los sujetos fueron genotipados en el Illumina Human660W-Quad BeadChip (San Diego, CA), con marcadores utilizados para análisis de replicación que pasaron los filtros de control de calidad (tasa de llamada de muestra >98 %, tasa de llamada de SNP >95 %, frecuencia de alelos menores >5 %). Se construyó un panel de referencia como se describe en otra parte (Brown et al., 2012; Fjell et al., 2012; Walhovd et al., 2012). Para evaluar las proporciones de ascendencia y mezcla en los participantes de PING, se utilizó un enfoque de agrupación supervisado implementado en el software ADMIXTURE (Alexander et al., 2009), y se agruparon los datos de los participantes en seis grupos correspondientes a seis poblaciones continentales principales: Africano, asiático central, asiático oriental, europeo, nativo americano y oceánico. La implementación de proporciones de ascendencia y mezcla en los sujetos de PING se describe en detalle en otra parte (Brown et al., 2012; Fjell et al., 2012; Walhovd et al., 2012). Para evitar una posible estratificación de la población, solo se incluyeron en el análisis genético del comportamiento los sujetos con un factor de ascendencia genética (GAF) europea de 1. Estos 440 individuos de ascendencia europea (edad promedio de 11,5 [desviación estándar = 4,8] años, 53,0 % de sexo masculino) se analizaron utilizando el rendimiento cuantitativo en las puntuaciones de Reconocimiento de Lectura Oral y Vocabulario con Imágenes con PLINK v1.07, con la edad incluida como covariable (Purcell et al., 2007). Para corregir las pruebas múltiples (20 pruebas totales = 10 SNP x 2 mediciones de lenguaje), establecimos umbrales estadísticos utilizando la tasa de descubrimiento falso con a = 0,05 (Benjamini y Hochberg, 1995).
Análisis de imágenes en PING.
Las técnicas de obtención de imágenes, la adquisición de datos y los análisis de PING se tratan en profundidad en otro lugar y brevemente a continuación (Brown et al., 2012; Fjell et al., 2012; Walhovd et al., 2012). En los diez sitios y 12 escáneres, se implementó un protocolo estandarizado de IRM estructural de alta resolución de modalidad múltiple, que implicó volúmenes 3D ponderados en T1 y T2, y un conjunto de exploraciones ponderadas por difusión. En la Universidad de California en San Diego, los datos se obtuvieron en un escáner GE 3T SignaHDx y un escáner 3T Discovery 750x (GE Healthcare) utilizando bobinas de cabeza en serie de ocho canales. El protocolo incluía un localizador de tres planos convencional, una ecoimagen sagital en 3D con recuperación de inversión degradada ponderada en T1 con volumen optimizado para el máximo contraste de materia gris/blanca (tiempo de ecoimagen = 3,5 ms, tiempo de repetición = 8,1 ms, tiempo de inversión = 640 ms, ángulo de giro = 8°, ancho de banda del receptor = ± 31,25 kHz, FOV = 24 cm, frecuencia = 256, fase = 192, grosor del corte = 1,2 mm), y dos exploraciones de imágenes de tensor de difusión en 2D (DTI) axiales (30 direcciones valor b = 1.000, TE = 83 ms, TR = 13.600 ms, frecuencia = 96, fase = 96, espesor de corte = 2,5 mm). Se instalaron protocolos de adquisición con parámetros de secuencia de pulsos idénticos o casi idénticos a los protocolos utilizados en la Universidad de California en San Diego en escáneres en los otros nueve sitios. Se adquirieron datos en todos los escáneres para estimar las tasas de relajación, y medir y corregir el gradiente de deformación no lineal de la bobina específica del escáner. Los archivos de imagen en formato DICOM fueron procesados con un flujo de procesamiento automatizado escrito en MATLAB (Natick, MA) y C++ por el Laboratorio de Imágenes Multimodales de UCSD. Las imágenes estructurales ponderadas en T1 se corrigieron por distorsiones causadas por gradientes de no linealidad, se corregistraron, se promediaron y se volvieron a muestrear rígidamente en alineación con un atlas cerebral. El posprocesamiento y el análisis de las imágenes se realizaron utilizando un conjunto totalmente automatizado de herramientas disponibles en el paquete de software FreeSurfer (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/), así como un método basado en atlas para delinear y etiquetar los tractos de fibra de WM (Fischl, 2012).
Imágenes del tensor de difusión.
En las imágenes ponderadas por difusión, se corrigió la distorsión de la corriente de Foucault utilizando un método de descenso de gradiente conjugado iterativo e inverso de mínimos cuadrados para resolver los 12 parámetros de escalado y traducción que describen las distorsiones de la corriente de Foucault en toda la exploración por IRM de difusión, teniendo en cuenta explícitamente las orientaciones y amplitudes del gradiente de difusión (Zhuang et al., 2006). El movimiento de la cabeza se corrigió registrando cada imagen ponderada por difusión a una imagen correspondiente sintetizada desde un ajuste tensorial a los datos (Hagler et al., 2009). Para los datos de la IRM de difusión, se corrigieron las distorsiones espaciales y de intensidad causadas por la falta de homogeneidad del campo magnético B0 mediante el método del gradiente de inversión (Holland et al., 2010). Las distorsiones causadas por las no linealidades de gradiente se corrigieron aplicando una transformación no lineal, predefinida, específica del escáner (Jovicich et al., 2006). Las imágenes ponderadas por difusión se registraron automáticamente en imágenes estructurales ponderadas en T1 utilizando información mutua (Wells et al., 1996) y se volvieron a muestrear rígidamente en una orientación estándar con respecto a las imágenes ponderadas en T1 con vóxeles isotrópicos de 2 mm. Se utilizó interpolación cúbica para todos los pasos de remuestreo. Se utilizaron métodos DTI convencionales para calcular las medidas de difusión (Basser et al., 1994; Pierpaoli et al., 1996). La duración del escaneo para la secuencia DTI fue de 4:24 minutos. Los tractos de fibra de materia blanca se marcaron utilizando un método de segmentación basado en atlas probabilístico (Hagler et al., 2009). Los vóxeles que contienen principalmente materia gris o líquido cefalorraquídeo, identificados mediante la segmentación cerebral automática de FreeSurfer, fueron excluidos del análisis (Fischl et al., 2002). Los volúmenes de tractos de fibra se calcularon como el número de vóxeles con probabilidad mayor que 0,08, el valor que proporcionó una correspondencia óptima en volumen entre las regiones de interés derivadas del atlas y los tractos de fibra trazados manualmente.
Análisis estadísticos.
Los análisis de imagenología-genética se realizaron en individuos de ascendencia genética europea. El escáner, la edad, la lateralidad manual, el estatus socioeconómico y el sexo se incluyeron como covariables en todos los análisis (Akshoomoff et al., 2013; Brown et al., 2012; Fjell et al., 2012; Walhovd et al., 2012). 332 sujetos de ascendencia genética europea habían realizado mediciones de imágenes que pasaron el control de calidad PING. Los volúmenes de los tractos de fibra en 16 zonas de interés se probaron mediante análisis de regresión múltiple en R utilizando el portal de datos de PING (https://mmil-dataportal.ucsd.edu).
Resultados
SNP y asociaciones basadas en genes
En la Tabla 2, se presentan las diez asociaciones de GWAS más fuertes de DL y TL concominantes en ALSPAC. Las asociaciones más fuertes se observaron con ZNF385D (OR = 1,81, p = 5,45 x 10-7) y COL4A2 (OR = 1,71, p = 7,59 x 10-7) (Tabla 2). A continuación, se examinaron individualmente DL y TL, sin incluir casos concomitantes, para determinar si uno de los trastornos estaba impulsando estas asociaciones. Las diez asociaciones más fuertes para casos de DL y casos de TL se presentan individualmente en la Tabla 3 y la Tabla 4, respectivamente. Las asociaciones más fuertes con TL fueron con marcadores en NDST4 (OR = 1,83, p = 1,40 x 10-7) (Tabla 3). Los marcadores en el cromosoma 10 (OR = 1,43, p = 5,16 x 10-6), el cromosoma 8 (OR = 1,70, p = 5,85 x 10-6) y el gen OPA3 (OR = 1,53, p = 6,92 x 10-6) tenían las asociaciones más fuertes con DL (Tabla 4). Los marcadores con p <0,01 dentro de los genes previamente implicados en DL y/o TL se presentan en la Tabla Suplementaria 1 para cada fenotipo. Las asociaciones más fuertes con estos marcadores se observaron para KIAA0319 con DL y TL concomitantes (rs16889556, p = 0,0005177), FOXP2 con DL y TL concomitantes (rs1530680, 0,0001702), CNTNAP2 con TL (rs6951437, p = 0,0000462) y DCD2 con TL (rs793834, 0,0002679) (Tabla Suplementaria 1a-1c). Se realizaron análisis genéticos en cada fenotipo (DL y TL concomitantes, DL individualmente y TL individualmente), y las diez asociaciones genéticas más sólidas se presentan en la Tabla Suplementaria 2. Ninguna de las asociaciones genéticas sobrevivió a la corrección para pruebas múltiples; sin embargo, las asociaciones más fuertes fueron vistas con: (1) OR5H2, OR5H6y RRAGA con DL y TL concomitantes, (2) NEK2, DLEC1 y NARScon TL, y (3) MAP4, OR2L8 y CRYBA4 con DL. Los marcadores con los valores p más fuertes en los análisis de descubrimiento en ZNF385D, COL4A2y NDST4fueron llevados hacia el análisis de replicación en PING. Observamos la replicación de dos marcadores dentro de ZNF385D y el rendimiento en la Prueba de Vocabulario con Imágenes (p = 0,00245 y 0,004173) (Tabla 5). Sin embargo, los marcadores no se replicaron con la Prueba de Reconocimiento de Lectura Oral (p >0,05).
Imagenología genética de ZNF385D
Para hacer un seguimiento de las asociaciones replicadas de ZNF385D, se examinaron los efectos de estas variantes en los volúmenes de tractos de fibra previamente implicados en el lenguaje escrito y verbal. Antes de hacerlo, el volumen de los tractos de fibra se determinó por primera vez como un factor predictivo del rendimiento en el Reconocimiento de Lectura Oral y las Pruebas de Vocabulario con Imágenes (datos no mostrados). En sujetos con antecedentes genéticos solo europeos, los genotipos de ZNF385D fueron predictores del volumen total de los tractos de fibra y también de los volúmenes de los tractos de fibra en los hemisferios derecho e izquierdo (Tabla 6). Los SNP de ZNF385D también fueron predictores bilateralmente dentro del fascículo longitudinal inferior (ILF), el fascículo frontooccipital inferior (IFO) y el fascículo temporal longitudinal superior (tSLF) en este subconjunto (Tabla 6). Para discernir si estas asociaciones entre ZNF385D y los volúmenes de los tractos de fibra reflejaban diferencias globales en el volumen cerebral según el genotipo, se examinó la relación de ZNF385D con la segmentación cerebral total y los volúmenes corticales totales. Se encontraron asociaciones para ambas medidas con rs1679255 (p = 0,00072 y 0,00027, respectivamente) y rs12636438 (p = 0,000259 y 0,000069, respectivamente). Los efectos parecían ser de naturaleza aditiva, con individuos heterocigotos que tienen fenotipos intermedios en relación con aquellos homocigotos para el alelo mayor y con aquellos homocigotos para el alelo menor. De hecho, cuando estas medidas del volumen cerebral total se insertaron en el modelo como covariable, ya no existían asociaciones de ZNF385D con los volúmenes de los tractos de fibra por DTI.
Como se describe en el presente documento, se identificaron genes que contribuyen a la aparición conjunta de DL y TL. En los análisis de descubrimiento, se encontraron asociaciones de ZNF385D y COL4A2 en casos concomitantes, y de NDST4 con TL. Después, se observaron asociaciones de ZNF385D con el rendimiento en una medición del vocabulario, pero no en una medición de la lectura oral, en PING. La asociación con el rendimiento en una medición del vocabulario, aunque no recapitula exactamente el fenotipo de comorbilidad, proporciona evidencia adicional de la contribución de ZNF385D al lenguaje. Para obtener una comprensión funcional, se interrogaron los efectos de los marcadores de ZNF385D replicados en los volúmenes de tractos de fibra relacionados con el lenguaje. Los marcadores de ZNF385D se asocian bilateralmente con los volúmenes generales de los tractos de fibra, así como con el volumen cerebral general.
Los estudios han demostrado que DL y TL comparten contribuyentes genéticos (Trzaskowski et al. 2013). Sin embargo, los genes específicos que contribuyen tanto a DL como a TL solo han comenzado a ser examinados recientemente. Estos estudios solo han usado un enfoque de gen candidato para examinar esta etiología genética compartida. Tal enfoque ha tenido éxito al mostrar la contribución compartida de DCDC2, KIAA0319, FOXP2, CNTNAP2, entre otros, a DL y TL (Eicher y Gruen, 2013; Graham y Fisher, 2013; Newbury et al., 2009; Newbury et al., 2010; Pinel et al., 2012; Rice et al., 2009; Scerri et al., 2011). De hecho, los marcadores dentro de KIAA0319, FOXP2 y CNTNAP2 (junto con BC0307918) mostraron una asociación nominal con DL y TL concomitantes en los análisis (p <0,01) descritos en el presente documento. Los genes de riesgo de DL/TL también mostraron una tendencia a asociarse con TL individualmente (DCDC2, KIAA0319 y CNTNAP2) y con DL individualmente (CNTNAP2 y CMIP) (p <0,01). Es probable que la falta de replicación para otros genes de riesgo de DL/TL, y las diferencias específicamente entre este estudio y los de Scerri et al. (2011) y Luciano et al. (2013) sean resultado de diferentes definiciones de casos y números, ya que se diseñaron clasificaciones de casos instantáneas para capturar el mayor rango posible de sujetos con problemas de lectura y lenguaje en lugar de usar medidas neurocognitivas altamente específicas.
Una omisión evidente en las investigaciones genéticas de DL y TL es la falta de métodos libres de hipótesis. Estos métodos permiten el descubrimiento de nuevos genes porque no dependen de candidatos preseleccionados. Aquí, los análisis de GWAS indican que ZNF385D contribuye a la comorbilidad de DL y TL. Este estudio no es el primero en realizar un GWAS en rasgos relacionados con la lectura y el lenguaje. Luciano et al. (2013) informaron recientemente de un GWAS de mediciones cuantitativas del lenguaje verbal y escrito en dos cohortes basadas en la población, incluida ALSPAC. Encontraron pruebas sólidas de que ABCC13, BC0307918, DAZAP1, entre otros, afectan el rendimiento en estas mediciones, aunque los análisis instantáneos no proporcionaron pruebas sólidas para ello. Las estrategias analíticas diferían de dos maneras: (1) el uso de medidas dicotómicas en lugar de cuantitativas para condicionar las asociaciones genéticas y (2) el análisis de la lectura y el lenguaje juntos en lugar de hacerlo de manera individual. Los estudios de asociación anteriores de DL y TL han mostrado diferencias en los resultados dependiendo de si los datos genéticos estaban condicionados por fenotipos dicotómicos o cuantitativos. Por ejemplo, KIAA0319 tiende a asociarse más fácilmente con mediciones cuantitativas, mientras que DCDC2 se asocia más a menudo con variables dicotomizadas (Paracchini et al., 2008; Powers et al., 2013; Scerri et al., 2011). El presente estudio, que examina la comorbilidad, y el de Luciano et al., que examinó el rendimiento en tareas de lectura y lenguaje de forma individual, condicionó asociaciones genéticas en diferentes rasgos, lo que puede llevar a diferentes asociaciones estadísticas. Ambas estrategias analíticas son válidas y han recogido información distinta, pero relacionada, sobre los fundamentos genéticos del lenguaje verbal y escrito. Demuestran la importancia del examen creativo y cuidadoso de los fenotipos al examinar los rasgos neurocognitivos y otros rasgos complejos.
Tras el análisis primario de DL y TL concomitantes, se examinaron DL y TL individualmente para determinar si un solo trastorno estaba impulsando las señales de asociación. ZNF385D no se asoció ni con DL ni con TL individualmente, lo que indica que ZNF385D contribuye a los procesos relacionados tanto con DL como con TL, en vez de contribuir a solo uno de estos trastornos. Dentro de la cohorte de PING, se observaron asociaciones de marcadores de ZNF385D con el rendimiento en la Prueba de Vocabulario con Imágenes y no en la Prueba de Reconocimiento de Lectura Oral. Las mediciones del vocabulario receptivo (por ejemplo, la Prueba de Vocabulario con Imágenes) están relacionadas con las tareas del lenguaje verbal y escrito (Scarborough 1990, Wise et al., 2007), mientras que el rendimiento en las mediciones de la decodificación (por ejemplo, la Prueba de Reconocimiento de Lectura Oral) parece ser específico de la lectura. Por lo tanto, la Prueba de Vocabulario con Imágenes puede reflejar el fenotipo de DL y TL concomitantes utilizado para la asociación en ALSPAC mejor que la Prueba de Reconocimiento de Lectura Oral y explicar el patrón de asociación de ZNF385D en PING. Además de ZNF385D, se observaron asociaciones sugestivas de COL4A2 con DL/TL concomitantes y de NDST4 con TL. Ninguna de estas asociaciones se replicó con las mediciones en PING, pero los estudios que se realicen en el futuro deberían intentar replicar estas asociaciones, en particular debido a la participación conocida de COL4A2 en lesiones porencefálicas y de la sustancia blanca (Verbeek et al., 2012, Yoneda et al., 2011).
Los análisis genéticos no revelaron ninguna asociación que sobreviviera a la corrección para pruebas múltiples. No obstante, hubo asociaciones génicas intrigantes que deberían investigarse en estudios que se realicen en el futuro. Por ejemplo, con TL, hubo asociaciones sugestivas con varios genes en el cromosoma 19-IL4I1, ATF5, NUP62 y SIGLEC11, que pueden corresponder al pico de enlace SLI2 (Monaco, 2007; SLI Consortium, 2002), Luciano et al. (2013) encontraron una acumulación similar de genes sugestivamente asociados a aproximadamente 5 Mb de los genes identificados en el presente documento. Además, MAP4, un gen de ensamblaje de microtúbulos, fue el gen que tuvo la asociación más fuerte con DL. Existe evidencia de que la función de los microtúbulos desempeña un papel clave en el desarrollo de la lectura, ya que se cree que la migración neuronal aberrante contribuye a la etiología de DL, y se cree que otros genes candidatos de DL interactúan con los microtúbulos (por ejemplo, DCDC2 y ACOT13) (Cheng et al., 2006). Estos hallazgos se pueden validar en una cohorte independiente, utilizando métodos descritos en el presente documento y métodos conocidos para concluir que están involucrados en DL y TL.
Las asociaciones más fuertes observadas en este estudio fueron con marcadores dentro de ZNF385D. ZNF385D se ha relacionado previamente a la esquizofrenia y al trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) (Poelmans et al., 2011; Xu et al., 2013). Tanto la esquizofrenia como el TDAH son trastornos neuroconductuales que se cree que tienen alteraciones del núcleo en común con DL y TL, incluida la comprensión y el procesamiento semántico (Gilger et al., 1992; Li et al., 2009; Willcutt et al., 2005). Además, la asociación observada de ZNF385D, como se describe en el presente documento, en el volumen cerebral global puede indicar que ZNF385D influye en varios rasgos neurocognitivos por medio de su efecto en todo el cerebro.
Se sabe poco acerca de la función de ZNF385D, aunque su dominio de dedos de zinc sugiere que es un regulador transcripcional. La importancia de la regulación transcripcional en el lenguaje verbal y escrito no es un concepto nuevo. El gen del lenguaje más ampliamente estudiado, FOXP2, es un potente factor de transcripción que se ha demostrado que regula otro gen del lenguaje, CNTNAP2 (Vernes et al., 2007; Vernes et al., 2011). Además, en el locus DYX2, dos variantes de riesgo, READ1 en DCDC2 y el haplotipo de riesgo de KIAA0319, parecen tener la capacidad de regular la expresión de los genes (Couto et al., 2010; Dennis et al., 2009; Meng et al., 2011) y, posiblemente, de interactuar (Ludwig et al. 2008; Ejemplo 1; Powers et al., 2013). Las variantes de ZNF385D ahora se unen a esta lista de variantes transcripcionales putativas que influyen en las habilidades del lenguaje verbal y escrito. La caracterización de los genes objetivo de ZNF385D y de sus efectos transcripcionales en estos objetivos será un próximo paso importante. Además, la identificación de genes objetivo puede generar candidatos terapéuticos para el tratamiento y la cura de DL y TL. Para obtener más información sobre ZNF385D, se realizaron análisis genéticos imagenológicos de ZNF385D y de volúmenes de tractos de fibra de tractos relacionados con el lenguaje. ZNF385D parece modular los volúmenes de tractos de fibra y cerebral totales, que posteriormente pueden afectar la conectividad y la funcionalidad de las regiones cerebrales importantes en la integración eficiente y fluida del lenguaje escrito y verbal. Por lo tanto, la identificación de los genes objetivo y cómo la modulación de su expresión durante el desarrollo neuronal produce diferencias en los volúmenes de tractos de fibra y cerebral total será de suma importancia para diseccionar no solo el mecanismo de ZNF385D, sino también para el desarrollo de habilidades lingüísticas básicas en los niños.
Características de la población. En primer lugar, aunque el tamaño total de la muestra de ALSPAC sea formidable, el número de casos para cada definición es relativamente pequeño. Esto es esperable en una cohorte transversal de la población general, ya que la prevalencia de estos trastornos varía entre el 5 y el 17 % (Pennington y Bishop, 2009). No se esperaría que la cohorte de ALSPAC se enriquezca para casos de DL y/o TL. El tamaño pequeño de la muestra puede haber afectado la fuerza estadística y la capacidad de identificar genes de riesgo con un tamaño de efecto pequeño. En segundo lugar, las mediciones de la lectura y el lenguaje realizadas en los estudios de ALSPAC y PING no fueron idénticas. Los fenotipos en PING se trataron como un rasgo cuantitativo en lugar de tratarse como una variable dicotómica, como en ALSPAC. Por lo tanto, los intentos de replicar las asociaciones observadas en la cohorte de ALSPAC pueden haberse visto obstaculizados, ya que las mediciones de la lectura/el lenguaje en PING pueden haber capturado habilidades diferentes a las de ALSPAC. Sin embargo, las asociaciones observadas en PING indican que ZNF385D desempeña un papel importante y consistente en los procesos generales del lenguaje. En tercer lugar, las mediciones de los volúmenes de tractos derivadas del atlas, así como los volúmenes derivados de tractos de fibra trazados manualmente, son probablemente subestimaciones del volumen de fibra real para la mayoría de los tractos. Sin embargo, los volúmenes de tractos de fibra se obtuvieron de manera consistente para todos los sujetos y, probablemente, reflejen diferencias interindividuales. No obstante, la fuerza y la replicación independiente de las asociaciones descritas en el presente documento y la relación con los fenotipos de imágenes cerebrales implican fuertemente a ZNF385D en los procesos del lenguaje central subyacentes a DL y TL.
En conclusión, ZNF385D fue identificado como un gen novedoso que contribuye tanto a DL como a TL, así como también al volumen de tracto de fibra y cerebral total. La implicación de otro factor de transcripción en los trastornos comunicativos subraya la importancia de la regulación transcripcional en el desarrollo neuronal de los dominios del lenguaje en el cerebro. Los estudios que se realicen en el futuro deben apuntar a caracterizar mejor la funcionalidad molecular de ZNF385D y replicar esta asociación, así como nuestras asociaciones no replicadas (NDST4 y COL4A2) en DL, TL y otros trastornos relacionados.
Referencias
Akshoomoff N., et al. (2013) J Int Neuropsychol Soc, bajo revisión.
Alexander D.H., et al. (2009) Genome Res 19(9), 1655-64.
Basser P.J., et al. (1994) Biophys J 66(1), 259-267.
Benjamini Y, et al. (1995) J R Statst Soc B 57(1): 289-300.
Boyd A., et al. (2012) Int J Epidemiol 42(1), 111-27.
Brown T.T., et al. (2012) Curr Biol 22(18), 1693-8.
Catts H.W., et al. (2005) J Speech Lang Hear Res 48(6), 1378-96.
Cheng Z, et al. (2006) Biochem Biophys Res Commun 350(4), 850-3.
Cope N., et al. (2012) Neuroimage 63(1), 148-56.
Couto J.M., et al. (2010) Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 153B(2), 447-62.
Darki F., et al. (2012) Biol Psychiatry 72(8), 671-6.
Dennis, M.Y., et al. (2009) PLoS Genet 5, e1000436.
Eicher J.D. t Gruen J.R. (2013) Mol Genet Metab, doi: 10.1016/j.ymgme.2013.07.001.
Fischl B. (2012) FreeSurfer. Neuroimage 62(2), 774-81.
Fischl B., et al. (2002) Neuron 33(3), 41-55.
Fjell A.M., et al. (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109(48), 19620-5.
Gathercole S. y Baddeley A.D. (1990) Journal of Memory and Language 29, 336-360.
Gathercole S.E. y Baddeley A.D. (1996) The Psychological Corportation, Londres.
Gilger J.W., et al. (1992) JAm Acad Child Adolesc Psychiatry 31(2), 343-8.
Golding J., et al. (2001) I. Study methodology. Paediatr Perinat Epidemiol 15(1), 74-87.
Graham S.A. y Fisher S.E. (2013) Curr Opin Neurobiol23(1), 43-51.
Hagler DJ, Jr., et al. (2009) Hum Brain Mapp 30(5): 1535-1547.
Holland D., et al. (2010) Neuroimage 50 (1), 175-183.
Jovicich J., et al. (2006) Neuroimage 30(2): 436-443.
Li X., et al. (2009) Curr Opin Psychiatry 22(2), 131-9.
Liegeois F., et al. (2003) Nat Neurosci 6(11), 1230-7.
Liu J.Z., et al. (2010) Am J Hum Genet 87(1), 139-45.
Luciano M., et al. (2013) Genes Brain Behav, doi: 10.1111/gbb.12053.
Ludwig K.U., et al. (2008) J Neural Transm 115(11), 1587-9.
Meng H., et al. (2011) Behav Genet 41(1), 58-66.
Monaco A.P. (2007) Ann Hum Genet 71(Pt5), 660-73.
Newbury D.F., et al. (2009) Am J Hum Genet 85(2), 264-72.
Newbury D.F., et al. (2010) Behav Genet 41(1), 90-104.
Neale M.D. (1997) Neale Analysis of Reading Ability-Revised: Manual for Schools, NFER-Nelson.
Paracchini S., et al. (2008) Am J Psychiatry 165(12), 1576-84.
Peterson R.L. y Pennington, B.F. (2012) Lancet 379, 1997-2007.
Pennington B.F. y Bishop D.V. (2009) Annu Rev Psychol60, 283-306.
Pennington BF. (2006) Cognition 101(2), 385-413.
Pierpaoli C., et al. (1996) Radiology 201(3), 637-648.
Pinel P., et al. (2012) J Neurosci 32(3), 817-25.
Poelmans G., et al. (2011) Am J Psychiatry 168(4), 365-77.
Powers N.R., et al. (2013) Am J Hum Genet 93(1), 19-28.
Purcell S., et al. (2007) Am J Hum Genet 81 (3), 559-575.
Rice M.L., et al. (2009) J Neurodev Disord 1 (4), 264-82.
Rosner J. y Simon D.P. (1971) Journal of Learning Disabilities 4(384), 40-48.
Rust J., et al. (1993) WORD: Wechsler Objective Reading Dimensions Manual. Psychological Corporation, Sidcup, Reino Unido.
Scarborough H.S. (1990) Child Dev61(6), 1728-43.
Scerri T.S., et al. (2012) PLoS One 7(11), e50312.
Scerri T.S., et al. (2011) Biol Psychiatry 70(3), 237-45.
Scerri T.S. y Schulte-Korne G. (2010) Eur Child Adolesc Psychiatry 19(3), 179-97.
Scott-Van Zeeland A.A., et al. (2010) Sci Transl Med 2(56), doi: 10.1126/scitranslmed.3001344.
Shaywitz S.E. y Shaywitz B.A. (2008) Dev Psychopathol 20(4), 1329-49.
SLI Consortium. (2002) Am J Hum Genet 70(2), 384-98.
Tan G.C., et al. (2010) Neuroimage 53(3), 1030-42.
Trzaskowski M., et al. (2013) Behav Genet 43(4), 267-73.
Vandermosten M., et al. (2012) Brain 135(Pt 3), 935-48.
Verbeek E., et al. (2012) Eur J Hum Genet 20(8), 844-51.
Vernes S.C., et al. (2011) PLoS Genet 7(7), e1002145.
Vernes S.C., et al. (2007) Am J Hum Genet 81(6), 1232-50.
Walhovd K.B., et al. (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109(49), 20089-94.
Wechsler D. (1996) Wechsler objective language dimensions (WOLD). The Psychological Corporation, Londres.
Wechsler D., et al. (1992) WISC-IIIUK: Wechsler Intelligence Scale for Children. Psychological Corporation, Sidcup, Reino Unido.
Weintraub S., et al. (2013) Neurology 90(11 Supl. 3), S54-64.
Wells W.M. 3.°, et al. (1996) Med Image Anal 1 (1), 35-51.
Wilcke A., et al. (2011) Eur J Hum Genet 20(2), 224-9.
Willcutt E.G., et al. (2005) Dev Neuropsychol 27(1), 35-78.
Wise J.C., et al. (2007) J Speech Lang Hear Res 50(4), 1093-9.
Xu C., et al. (2013) PLoS One 8(1), e51674.
Yoneda Y., et al. (2012) Am J Hum Genet 90(1), 86-90.
Zhuang J., et al. (2006)
Tablas del Ejemplo 4
Tabla 1: Mediciones de la lectura y el lenguaje utilizadas para definir los casos de discapacidad lectora (DL) y trastorno del lenguaje (TL)
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Tabla 2: Asociaciones con casos de DL y TL concomitantes en ALSPAC (n = 174)
Figure imgf000053_0002
Figure imgf000054_0001
Tabla 3: Asociaciones con casos de TL en ALSPAC, excluyendo casos de DL concomitantes (n = 163)
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Tabla 4: Asociaciones con casos de DL en ALSPAC, excluyendo casos de TL concomitantes (n = 353)
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Tabla 5: Replicación de asociaciones en PING (n = 440)
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Tabla 6: Asociaciones de ZNF385D con volúmenes de tractos de fibra de DTI en sujetos con un 100 % de ascendencia genética europea (n = 332)
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Tablas suplementarias
Tabla suplementaria 1: Asociaciones de marcadores dentro de genes previamente implicados en DL y/o TL con (a) TL y DL concomitantes, (b) TL individualmente y (c) DL individualmente.
a) DL y TL concomitantes
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b) TL
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c) DL
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Tabla suplementaria 2: Análisis genéticos de DL y TL concomitantes, TL individualmente y DL individualmente. Se muestran las diez principales asociaciones genéticas para cada uno.
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar si una muestra obtenida de un individuo comprende ácido nucleico que comprende un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) en seres humanos, que comprende analizar una muestra que comprende ácido nucleico del individuo para detectar la presencia en el locus DYX2 de los siguientes haplotipos en el bloque de haplotipos de riesgo de DCDC2 que comprenden rs33914824, rs807694, rs707864, rs10456301, rs16889066 y rs9379651: (a) CGCGAG en un gen DCDC2; o (b) GACGAG en un gen DCDC2; o (c) tanto CGCGAG como GACGAG en un gen DCDC2; en donde si la muestra comprende al menos uno de (a) - (c), la muestra comprende un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje en seres humanos.
2. El método de la reivindicación 1 que comprende, además, analizar una muestra que comprende ácido nucleico del individuo para determinar la presencia en el locus DYX2 de al menos uno de: (d) rs4504469 en un gen KIAA0319; (e) rs2038137 en un gen KIAA0319; (f) rs2143340 en un gen KIAA0319; (g) cualquier combinación de dos o tres de rs4504469, rs2038137 y rs2143340 en un gen KIAA0319; y (h) cualquier combinación de CGCGAG en un gen DCDC2; GACGAG en un gen DCDC2; tanto CGCGAG como GAc Ga G en un gen DCDC2; rs4504469 en un gen KIAA0319; rs2038137 en un gen KIAA03109; rs2143340 en un gen KIAA0319; y cualquier combinación de dos o tres de rs4504469, rs2038137 y rs2143340 en un gen KIAA0319.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde:
(a) la muestra se analiza para detectar al menos un marcador de (a), (b) y (c), y al menos un marcador de (d), (e), (f) y (g); y/o
(b) la DA es discapacidad lectora (DL) o trastorno del lenguaje (TL) o tanto DL como TL; y/o
(c) la muestra es sangre, células o tejido; y/o
(d) el método comprende además analizar la muestra para determinar la presencia del alelo 5 del gen DCDC2, el alelo 6 del gen DCDC2, o tanto el alelo 5 del gen DCDC2 como el alelo 6 del gen DCDC2, por ejemplo, en donde el alelo 5 del gen DCDC2 comprende la SEQ ID NO:35 y el alelo 6 de DCDC2 comprende la SeQ iD nO:36; y/o (e) el análisis implica métodos mediados por hibridación, secuenciación o combinaciones de estos.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para determinar si una muestra obtenida de un individuo comprende al menos un marcador asociado a discapacidad lectora (DL) y trastorno del lenguaje (TL) concomitantes en seres humanos, que comprende analizar la muestra para determinar la presencia de al menos un marcador de (a), (b) y (c), y al menos un marcador en el gen KIAA0319 en el locus DXY2 para un haplotipo asociado a la susceptibilidad de desarrollar TL en seres humanos, opcionalmente en donde:
(a) dicho al menos un marcador de (a), (b) y (c) es CGCGAG o GACGAG, y dicho al menos un marcador en el gen KIAA0319 es rs4504469; rs2038137; o rs2143340; y/o
(b) el método comprende además analizar la muestra para determinar la presencia del alelo 5 del gen DCDC2 en el locus DYX2, el alelo 6 del gen DCDC2 en el locus DYX2, o tanto el alelos 5 del gen DCDC2 en el locus DYX2 como el alelo 6 del gen DCDC2 en el locus DYX2.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para determinar si una muestra obtenida de un individuo comprende un marcador asociado a trastorno del lenguaje (TL) en seres humanos, que opcionalmente comprende además analizar la muestra para determinar la presencia de al menos uno de: rs793845; rs2799373; rs793862; rs793834; rs2792682; rs807704; rs707864; rs12193738; rs2817198; rs10456309; rs985080; rs1554690; rs2533096; rs6951437; rs344470; rs344468; rs807694; rs482700; rs7695228; rs1940309; rs505277; rs476739; rs867036; rs867035; rs2071674; rs7694946; rs4823324; y un marcador para al menos uno de los siguientes genes: NEK2; DLEC1; NARS; IL4I1; PKD2; ATF5; NUP62; SIGLEC11; ACAN; y PGD.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para determinar si los ácidos nucleicos (ADN, ARN) en un individuo comprenden marcadores de haplotipos que interactúan de una manera sinérgica, lo que da como resultado un trastorno del aprendizaje (TA) en seres humanos, que opcionalmente comprende además analizar la muestra para determinar la presencia de al menos uno de: un alelo de riesgo de DCDC2 y al menos un haplotipo de riesgo de KIAA0319, en donde dicho al menos un alelo de riesgo de DCDC2 es el alelo 5 del gen DCDC2 en el locus DYX2 (SEQ ID NO: 35) o el alelo 6 del gen DCDC2 en el locus DYX2 (SEQ ID NO: 36), y al menos un haplotipo de riesgo de KIAA0319 es un haplotipo de una variante de KIAA0319 que comprende un s NP que es rs4504469; rs2038137; o rs2143340, y en donde si la muestra comprende al menos un haplotipo de riesgo de DCDC2 o al menos un alelo de riesgo de DCDC2 y al menos un haplotipo de riesgo de KIAA0319, los ácidos nucleicos comprenden marcadores de haplotipos que interactúan de forma sinérgica, lo que da como resultado un TA en seres humanos.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para identificar o ayudar a identificar a un individuo que corre el riesgo de desarrollar al menos una dificultad del aprendizaje (DA), opcionalmente en donde:
(a) el método comprende además la etapa de analizar una muestra obtenida dl individuo para determinar la presencia de al menos un haplotipo que se encuentre en el gen KIAA0319 dentro del locus DYX2; y/o
(b) el método comprende además la etapa de analizar una muestra obtenida del individuo para determinar la presencia de rs4504469, rs2038137, rs2143340, o cualquier combinación de estos, en un gen KIAA0319 dentro del locus DYX2; o cualquier combinación de los haplotipos en (a) y (b).
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para identificar a un individuo que tiene, o es susceptible de desarrollar, una dificultad del aprendizaje (DA), que comprende además determinar si el ácido nucleico en la muestra comprende un haplotipo del gen KIAA0319 asociado a la susceptibilidad de desarrollar trastorno del lenguaje (TL), en donde el haplotipo del gen DCDC2 y el haplotipo del gen KIAA0319 interactúan de forma sinérgica para disminuir el rendimiento en la eliminación de fonemas y para producir un trastorno del aprendizaje (TA) en seres humanos, en donde si la muestra comprende ambos haplotipos, se identifica que el individuo tiene o es susceptible de desarrollar un TA.
9. Una matriz o micromatriz que comprende un soporte que tiene una pluralidad de regiones discretas, teniendo cada región discreta al menos un fragmento de ácido nucleico manchado en ella, en donde cada región comprende secuencias que son complementarias a los ácidos nucleicos que abarcan al menos un marcador asociado a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) en seres humanos, en donde dicho al menos un marcador es al menos uno de los haplotipos en el bloque de haplotipos de riesgo de DCDC2 que comprende rs33914824, rs807694, rs707864, rs10456301, rs16889066 y rs9379651 definidos en la reivindicación 1, y opcionalmente al menos un marcador en una variante del gen KIAA0319.
10. La matriz o micromatriz de la reivindicación 9, en donde la matriz o micromatriz comprende secuencias complementarias de al menos dos marcadores diferentes asociados a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad de aprendizaje (DA), que comprende, por ejemplo, en al menos una región, secuencias que son complementarias de un marcador en una variante del gen DCDC2 asociada a la susceptibilidad de desarrollar una dificultad del aprendizaje (DA) y, en al menos una región diferente, secuencias que son complementarias a un marcador en una variante del gen KIAA0319 asociada a la susceptibilidad de desarrollar una DA.
11. La matriz o micromatriz de la reivindicación 9 o la reivindicación 10:
(a) que comprende además uno o más marcadores en un gen DCDC2 seleccionado de CGCGAG, GACGAG, alelo 5 de READ1 (SEQ ID NO: 35), alelo 6 de READ1 (SEQ ID NO: 36), o cualquier combinación de dos, tres o cuatro de CGCGAG, GACGAG, alelo 5 de READ1 (SEQ ID NO: 35) y alelo 6 de READ1 (SEQ ID NO: 36); y en donde dicho uno o más marcadores en un gen KIAA0319 se seleccionan de rs4504469, rs2038137, rs2143340, o cualquier combinación de dos o tres de rs4504469, rs2038137 y rs2143340; y/o
(b) en donde la DA es un trastorno del lenguaje (TL) en seres humanos, y que comprende además uno o más marcadores en un gen DCDC2 seleccionado de GACGAG, alelo 6 de READ1 (SEQ ID NO: 36), rs793845, rs2799373, rs793862, rs793834, rs2792682, rs807704, rs707864, rs807694, o cualquier combinación de estos; y en donde dicho uno o más marcadores en un gen KIAA0319 se seleccionan de rs12193738, rs2817198, rs10456309, o cualquier combinación de estos, por ejemplo, que comprende además uno o más fragmentos de ácido nucleico en el soporte que comprenden secuencias que son complementarias a secuencias genómicas que flanquean a uno o más marcadores asociados a la susceptibilidad de desarrollar TL en seres humanos, en donde dicho uno o más marcadores se seleccionan de: rs985080, rs1554690, rs2533096, rs6951437, rs344470, rs344468, rs482700, rs7695228, rs1940309, rs505277, rs476739, rs867036, rs867035, rs2071674, rs7694946, rs4823324, y marcadores para los siguientes genes: NEK2; DLEC1; nArS; IL4I1; PKD2; ATF5; NUP62; SIGLEC11; ACAN; y pGd ; y/o
(c) en donde la DA es discapacidad lectora (DL) en seres humanos, y además comprende uno o marcadores en un gen DCDC2 seleccionado de CGCGAG y alelo 5 de READ1 (SEQ ID NO: 35), o ambos; y en donde dicho uno o más marcadores en KIAA0319 es rs10456309, por ejemplo, que comprende además uno o más fragmentos de ácido nucleico en el soporte que comprenden secuencias que son complementarias a secuencias genómicas que flanquean a uno o más marcadores asociados a la susceptibilidad de desarrollar DL en seres humanos, en donde dicho uno o más marcadores se seleccionan de rs180950, rs2590673, rs892100, rs1792745, rs12546767, rs12634033, rs892270, rs10887149, rs10041417, rs6792971, rs4725745, rs12444778, rsl444186, rs2294691, rs10456309, rs1562422, y al menos un marcador para cada uno de los siguientes genes: MAP4; OR2L8; CRYBA4; OR2T8; KIAA1622; OR2AK2; DHX30; GEMIN6; C20orf10; y PPIF; y/o
(d) que comprende además uno o más fragmentos de ácido nucleico manchados en el soporte que comprenden secuencias que son complementarias a las secuencias genómicas que flanquean a uno o más marcadores asociados a la susceptibilidad de desarrollar una DA en seres humanos, en donde dicho uno o más marcadores se seleccionan de rs12636438; rs1679255; rs9521789; rs1983931; rs9814232; rs7995158; rs6573225; rs4082518; rs442555; rs259521; rs482700; rs7695228; rs1940309; rs505277; rs476739; rs867036; rs867035; rs2071674; rs7694946; rs4823324; rs180950; rs2590673; rs892100; rs1792745; rs12546767; rs12634033; rs892270; rs10887149; rs10041417; rs6792971; rs12636438; rs1679255; rs9521789; rs476739; rs505277; rs482700; rs7695228; rs867036; rs867035; rs1940309; rs16889556; rs1047782; rs1530680; rs12667130; rs6965855; rs985080; rs4726782; rs1718101; rs10487689; rs1918296; rs737533; rs793845; rs2799373; rs793862; rs793834; rs2792682; rs807704; rs707864; rs12193738; rs2817198; rs10456309; rs985080; rs1554690; rs2533096; rs6951437; rs344470; rs344468; rs4725745; rs12444778; rsl444186; rs2294691; rs10456309; rs1562422; rs807694; rs3756814; rs3777663; rs9295626; rs7763790; rs6935076; rs9348646; rs2328791; rs2328791; rs2817201, rs9295626; rs4576240; rs17307478, rs9356939, rs7763790, rs6456621; rs6456624, rs6935076, rs2038137, rs3756821, rs1883593, rs3212236; rs3777663, rs3756814, rs6931809, rs6916186, rs6933328, rs17491647; rs2328791; rs33914824a; rs807694a; rs707864a; rs10456301a; rs16889066a; rs9379651a; rs2817201; rs9295626; rs10456309; rs4576240; rs17307478; rs9356939; rs7763790; rs6456621; rs3756821; rs1883593; rs3212236; rs2294691; rs3777663; rs3756814; rs6931809; rs6916186; rs6933328; rs17491647; rs9348646; rs1562422 y marcadores de los siguientes genes: R5H2; OR5H6; RRAGA; OR6B3; UMOD; A26C1A; FAM29A; CHRNA1; IFIT5; LOC643905; K2; DLEC1; NARS; IL4I1; PKD2; ATF5; NUP62; SIGLEC11; ACAN; PGD; MAP4; OR2L8; CRYBA4; OR2T8; KIAA1622; OR2AK2; DHX30; GEMIN6; C20orf10; y PPIF.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080318217A1 (en) 2004-09-14 2008-12-25 Yale University Identification of Gene Associated with Reading Disability and Uses Therefor
EP3692547B1 (en) 2017-10-02 2024-01-03 Neumora Therapeutics, Inc. Methods and tools for detecting a neurobehavioral phenotype in a subject

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US5038852A (en) 1986-02-25 1991-08-13 Cetus Corporation Apparatus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
CA1338505C (en) 1989-02-03 1996-08-06 John Bruce Findlay Containment cuvette for pcr and method of use
US5187084A (en) 1990-06-22 1993-02-16 The Dow Chemical Company Automatic air temperature cycler and method of use in polymerose chain reaction
NZ242955A (en) 1991-06-13 1995-01-27 Ici Plc Dna containing gene sequences corresponding to sequences causing alzheimers disease, detection, recombinant yeast with such code
US6060240A (en) 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
US6323009B1 (en) 2000-06-28 2001-11-27 Molecular Staging, Inc. Multiply-primed amplification of nucleic acid sequences
US6617137B2 (en) 2001-10-15 2003-09-09 Molecular Staging Inc. Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions
US7355022B2 (en) 2002-02-12 2008-04-08 Licentia Ltd. Gene functionally related to dyslexia
US20080318217A1 (en) * 2004-09-14 2008-12-25 Yale University Identification of Gene Associated with Reading Disability and Uses Therefor
EP2507599A1 (en) 2009-11-30 2012-10-10 Imec Integrated circuit for spectral imaging system

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