KR100978215B1 - 건조형태의 ｐｃｒ 반응용 조성물에 기반한 ｐｃｒ의 최적증폭 조건 탐색 및 설정에 활용될 수 있는 키트 및 그것의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 건조형태의 PCR 반응용 조성물을 이용하고자 하는 PCR에서의 최적 증폭 조건 탐색 및 설정 방법을 제공하기 위하여, PCR 결과에 크게 영향을 미치는 핵심 요인들이 다양하게 조합된 구성의 건조형태로 제작된 PCR 조건 탐색 키트를 제공하는 것에 관한 것이다. 본 발명을 활용하면 연구자는 건조형태의 PCR 제품을 사용하여서도 자신의 실험에 최적인 PCR 조건으로 PCR 반응을 실시할 수 있게 되어 결국 최적의 조건으로 목적 유전자를 증폭할 수 있게 된다.

건조형태, PCR, 조건, 탐색, 설정, 키트

Description

건조형태의 ＰＣＲ 반응용 조성물에 기반한 ＰＣＲ의 최적 증폭 조건 탐색 및 설정에 활용될 수 있는 키트 및 그것의 제조방법{Kit suitable for screening and establishment of optimal amplification condition in PCR constructed with dried-formulated PCR reagent and method for producing the same}

본 발명은 건조형태의 PCR(polymerase chain reaction) 반응용 조성물에 기반한 PCR의 최적 증폭(amplification) 조건을 탐색하고 설정하는데 유용하게 활용될 수 있는 키트 및 그것의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 건조형태의 PCR 반응용 조성물을 사용하여 실현되는 PCR에 있어서의 최적 증폭 조건 탐색 및 설정에 활용될 수 있게, PCR 결과에 크게 영향을 미치는 핵심 요인들이 다양하게 조합된 건조형태의 PCR 조건 탐색 키트 및 그것의 제조방법에 관한 것이다.

PCR은 DNA의 원하는 부분의 복사본(copy)의 수를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 분자생물학적(molecular biological) 방법이다. DNA의 어느 부분이든지 그 서열만 알면 PCR을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해 서 고안되었으며 유전자를 연구, 분석하는 분자유전학을 포함한 많은 생물학 관련 연구에서 현재까지도 널리 이용되고 있는 기법이다. PCR은 DNA 중합효소(polymerase)에 의한 DNA 복제(replication)의 특징을 이용한 기법이다. DNA 중합효소는 외가닥(single stranded) DNA를 주형(template)으로 해서 상보적인(complementary) DNA를 합성할 수 있는데, 이러한 외가닥 DNA는 두 가닥(double stranded) DNA를 끓임(boiling)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 이 과정을 DNA 변성(denaturation)이라 한다. DNA 중합효소가 DNA 복제를 시작하기 위해서는 시작 부위가 두 가닥 DNA 형태로 되어 있어야 한다. 따라서 PCR에서는 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단에 주형 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 함께 넣어 주어야 하며 이것이 특정 DNA 서열의 양 끝에 결합(annealing)하여 두 가닥 형태의 DNA가 되어야 한다. 이럴 경우에만 DNA 중합효소에 의한 DNA 복제가 개시될 수 있다. 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머(primer) 또는 줄여서 프라이머라 한다. 일단 프라이머가 주형 DNA에 결합한 후에는 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행(extension)된다. 이런 일련의 기작에 PCR 반응이 기반하기 때문에 PCR 주기(cycle)는

1) 두 가닥 주형 DNA를 외가닥 DNA로 바꾸어 주는 변성 단계,

2) 프라이머가 주형 DNA에 결합하는 결합 단계, 및

3) DNA 중합효소의 작용으로 주형 DNA에 상보적 DNA가 합성되는 신장 단계

의 3단계로 구성된다. 최초 1회의 PCR 주기가 끝난 후에 그 다음으로 이어지 는 PCR 주기에서는 최초(original) 주형 DNA와 PCR에 의해 새로 합성된 DNA 모두가 DNA 주형이 된다. 이렇게 PCR은 주기가 계속적으로 반복될수록 DNA 주형의 수는 계속 늘어나게 된다. 따라서 n번의 PCR 주기 후에는 이론적으로 2ⁿ 개의 두 가닥 DNA가 존재하게 된다. 즉, 1 개의 주형 DNA로부터 (2ⁿ -1) 개의 복사본이 합성된 꼴이다. PCR은 그 반복되는 주기마다 첫 단계로 90℃ 이상의 높은 온도에서 DNA를 변성시키는 단계가 있는데, 이 단계에서 DNA 중합효소 (PCR 개발 초기 단계에서 사용하던 상기 중합효소는 열적 안정성이 낮았었는데 이 중합효소를 mesophilic DNA polymerase라 함)도 함께 변성될 수 있다. 이런 이유로 인하여 개발 초기의 PCR에서는 DNA 중합효소를 매 PCR 주기마다 반응액에 새로이 첨가해 주어야 했다. 그러나 Thermus aquaticus라는 온천에 사는 호열성 세균(thermophile)에서 열에 비교적 안정한 DNA 중합효소가 새롭게 발견되면서 이 문제는 해결되어 PCR의 매 주기마다 DNA 중합효소를 다시 넣어 주지 않고 PCR 반응 시작 때만 DNA 중합효소를 한번 넣어주면 되게 되었다. 이 DNA 중합효소(Taq DNA polymerase라 함)는 72℃가 최적온도이며, 94℃에서도 안정하다. 이 Taq DNA 중합효소의 발견은 PCR을 보다 손쉽게 실시할 수 있게 하였으며, 결과적으로 PCR이 다양한 연구 분야에서 활용되게 한 계기가 되었다(Science 252: 1643-1651, 1991). 이제 PCR 기법은 대부분의 연구 분야에서 활용되고 있는 매우 강력한 실험 기법이 되었다.

Taq DNA 중합효소 발견 이후 PCR 관련 기술은 획기적으로 발전하였으며 주로 이러한 발전은 새로운 DNA 중합효소의 탐색 및 새로운 PCR 기법의 개발에 의해서였 다. 새로이 개발 또는 발견된 DNA 중합효소로는 Thermus thermophilus 유래의 Tth DNA 중합효소, Thermus flavus 유래의 Tfl DNA 중합효소, Thermus ubiquitos 유래의 Hot Tub DNA 중합효소, Thermotoga maritima 유래의 Ultma DNA 중합효소, Pyrococcus furiosus 유래의 Pfu DNA 중합효소, Thermococcus litoralis 유래의 Vent DNA 중합효소 및 Tli DNA 중합효소, Pyrococcus woesei 유래의 Pwo DNA 중합효소 등이 있다(이상 제품명). 이 DNA 중합효소들은 각기 구별되는 특징을 가지고 있어 서로 구별되게 다양한 PCR에 활용되고 있다. 즉, 이들 DNA 중합효소 간에는 DNA 합성속도, 중합효소가 주형 DNA에 결합했다가 분리될 때까지 합성하는 뉴클레오티드(nucleotide)의 수, 주형-프라이머 종류에 대한 선호성, 및 저해제에 대한 감수성에서 차이가 있다. 또한 최근에는 이들 DNA 중합효소를 서로 혼합하여 사용하는 방법도 개발되었다. 이러한 DNA 중합효소의 혼합사용은 서로의 PCR에서의 장점을 모두 활용할 수 있어 이점이 있으며 또한 저해제에 의한 저해 효과를 분산 완화시키는 이점도 제공한다.

최근까지 개발된 PCR 기법으로는, 증폭에 소요되는 시간을 줄인 래피드 PCR(rapid PCR), 시료의 정제 과정을 생략하고자 하는 직접 PCR(direct PCR), 역전사 반응과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형으로 사용하게 한 역전사 효소-PCR(reverse transcriptase PCR; RT-PCR), 상온에서 일어나는 비특이 증폭을 획기적으로 감소시켜 PCR 반응의 특이성(specificity)을 개선시킨 핫-스타트 PCR(hot-start PCR), PCR 반응의 실시간 모니터링(monitering)이 가능한 실시간 PCR(real-time PCR) 등이 있다. 이외에도 매우 많은 기법들과 관련 기술들이 개발되었다. 이에 대한 상세 한 설명은 생략한다.

이런 새로운 DNA 중합효소의 개발 및 새로운 PCR 기법의 개발과 병행하여 자연스럽게 PCR 반응 자체를 손쉽게 구현하고자 하는 PCR 수행의 용이성을 제공하고자 하는 연구들이 있어 왔다. PCR 반응의 용이성을 높이려는 시도는 다양한 방법으로 시도되었는데, 가장 먼저 대두된 것이 전혼합체(master mixture; master mix; pre-mixture; premix)의 이용이다. PCR 반응을 구축하기 위해서는 PCR에 필요한 개별 성분들을 섞어 PCR 반응액을 준비해야 한다. 그런데 미리 개별 성분들이 적합한 농도로 섞여 있는 전혼합체를 이용하여 PCR 반응액을 준비하면 훨씬 수고가 줄어든다. 이렇게 전혼합체를 이용하여 PCR 반응액을 준비하는 경우에는 이 전혼합체에 DNA 중합효소, 주형, 프라이머와 물만 첨가하면 PCR 반응액의 준비가 끝나게 된다. 이러한 방법은 PCR 반응액 준비에 필요한 피펫팅 횟수를 획기적으로 줄여 줄 수 있으며 PCR 반응 간의 편차를 줄이는데 크게 기여할 수 있다. 또한 이러한 전혼합체의 사용은 여러 번의 피펫팅에 의해 발생하던 이관 오염(carry-over contamination)도 상당히 줄여 주었다. 초기의 전혼합체는 개별 성분의 모용액(stock solution)으로부터 일정량을 취하여 단순 혼합하여 준비하였기 때문에 당연히 전혼합체의 성상은 용액 상태였다.

그런데 이러한 용액 상태의 전혼합체는 개별 구성 성분의 자유도(degrees of freedom)가 높아 일정 수준의 비활성화(deactivation; inactivation) 반응이 계속 발생하여, 용액 상태의 전혼합체를 포함한 제품은 배송(delivery) 및 보관(storage) 상 안정성(stability)이 떨어지는 문제가 있었다. 이런 낮은 안정성은 배송 및 보관에 있어 추가의 노력을 요구했으며 이로 인하여 상당한 불편함을 초래 했다. 이러한 배송 및 보관에 있어서의 불편함을 해소하기 위해서는 전혼합체의 안정성을 개선하여야 한다. 이러한 기술적 필요로 건조형태(dried-formulation)의 전혼합체를 사용하는 기술이 개발되었다 (한국특허 등록 제0730364호). 본 명세서에서는 용액 상태의 PCR용 전혼합체를 동결건조, 가온건조, 상온건조, 감압건조 등을 포함한 여러 가지의 건조법을 통하여 건조하여 제조한 고체 상태의 조성물을 지칭하여 “건조형태의 PCR 전혼합체”, “건조형태의 PCR용 전혼합체”, “건조형태의 전혼합체”, “건조형태의 PCR 조성물”, “건조형태의 PCR용 조성물”, “건조형태의 조성물”로 특별히 구분하지 않고 사용한다. 이러한 건조형태의 전혼합체를 이용한 PCR용 조성물을 이용하면 전혼합체를 이용함에 따른 편리성은 그대로 유지되면서도 이 전혼합체를 포함한 제품의 안정성이 높아져 배송 및 보관이 훨씬 용이해 진다. 이러한 건조형태의 PCR 제품은 일반적인 PCR 모두에 효과적으로 활용될 수 있지만 특히 일정한 PCR을 반복적으로 수행해야 하는 분야에의 활용에 특히 효과적이다. 그러한 분야로는 유전자 검사, 질환 검사 등을 실시하는 진단(diagnosis) 분야를 예로 들 수 있다. 크게 임상(clinical) 분야 및 환경 관련 분야에서 실시하는 PCR이 예가 될 수 있다.

그러나 이러한 건조형태의 PCR 조성물이 포함된 제품은 용액 상태의 제품과 달리 제조자에 의해 모든 조건이 정해져 공급되기 때문에 실험자가 임의로 조건을 변경하는 데는 어려움이 있었다. 실험자에 의해서 변경 가능한 요소로는, 프라이머와 관련하여 종류, GC 함량(GC content), Tm 값, 적용 농도가 있으며, PCR 실시 조 건(operation condition)과 관련하여 PCR 각 단계의 적용 시간, PCR 주기 수, PCR 각 단계의 적용 온도가 고작이다. 그러나 PCR의 결과에 영향을 줄 수 있는 주요 요인으로는 마그네슘 이온(magnesium ion)의 농도, DNA 중합효소의 종류 및 농도, 반응완충액(reaction buffer)의 조성(composition)을 포함하여 다양하게 존재하는데, 이들 요소들은 건조형태의 PCR 조성물을 사용하고자 하는 실험자가 임의로 조정할 수 없었던 것이 현재까지의 상황이었다. 따라서 건조형태의 PCR 조성물을 활용한 PCR에서도 실험자가 자신의 실험에 맞게 최적 PCR 조건을 탐색하고 이를 활용할 수 있게 하는 방안의 제공이 필요하다.

본 발명자들은 이러한 건조형태의 PCR 조성물을 활용한 PCR에서도 개별 실험에 적합한 PCR 조건을 쉽게 탐색할 수 있게 하는 방법과 이를 구현한 키트를 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

따라서, 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 건조형태의 PCR 조성물을 활용한 PCR에서의 개별 실험에 적합한 PCR 조건을 쉽게 탐색할 수 있게 하는 방법과 이를 구현한 키트를 제안하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 건조형태로 제조되는 PCR용 조성물을 활용한 PCR에서의 최적 증폭 조건 탐색 및 설정에 활용될 수 있는 방법을 제공하기 위하여, PCR 결과에 크게 영향을 미치는 마그네슘 이온의 농도, 반응완충액의 조성 등을 포함하는 핵심 요인들과 추가 요인들이 다양하게 조합된 건조 형태의 PCR 조건 탐색용 키트를 제공한다.

PCR 반응의 결과는 다양한 성분 및 조건에 의해서 영향을 받으며, 이 때문에 PCR을 이용하여 특정 유전자를 증폭하기 위해서는 우선적으로 자신의 실험에 적합한 PCR 조건을 설정해야 한다. 통상 연구자는 이를 위해서 여러 가지의 PCR 조건을 적용하여 수차례의 PCR을 수행하여 적합한 PCR 조건을 설정하게 된다. 그런데 기존의 건조형태의 PCR 조성물을 포함한 제품은 미리 제조사에 의해서 특정 조성 및 구 성으로 제조되어 공급되기 때문에 실험자가 임의로 PCR 조건을 조정하기에는 적합하지 않았다. 그리고 하려고 해도 할 수가 없었다. 이런 상황으로 인하여 많은 연구자들은 건조형태의 PCR 조성물이 포함된 제품의 편리함은 그대로 유지되면서도 자신들의 실험에 보다 부합할 수 있는 PCR 조건을 탐색하여 활용할 수 있는 제품을 필요로 하였다. 즉, 건조형태의 전혼합체 형태는 그대로 유지하면서도 본인들이 임의로 PCR 조건을 조정하여 본인들의 실험에 맞는 적절한 PCR 조건을 설정할 수 있기를 소망하였다.

본 발명자들은 이러한 요구에 부합할 수 있는 방안을 고안하고자 노력하였다. 이에 PCR 조건 설정을 위한 여러 번의 PCR 수행에 따른 어려움을 줄여주고 건조형태의 전혼합체를 활용한 PCR에서의 PCR 조건 설정에 활용 가능한 건조형태의 PCR 조건 탐색용 키트인 일종의 스타터 키트(starter kit)를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

상기의 스타터 키트는 PCR 조건 설정을 위한 일종의 고속처리검색법(HTS; High Throughput Screening)에 적합한 키트라 할 수 있다. 적합 PCR 조건을 빠르고 쉽게 탐색하기 위해, PCR 결과에 영향을 줄 수 있는 반응완충액의 조성, 마그네슘 이온 농도, 높은 GC 함량을 가진 주형이나 프라이머를 이용한 PCR 반응에서의 증폭효율의 개선을 위하여 첨가해 주는 DNA 헬릭스(helix) 불안정화(destabilization)에 관련되는 물질의 첨가량, DNA 중합효소의 종류, DNA 중합효소의 농도 등을 포함한 다양한 조건을 여러 가지 조합의 구성으로 제조하여 공급하는 건조형태의 PCR 조성물을 활용한 PCR의 조건 탐색에 활용될 수 있는 키트이다. 따라서 연구자는 프 라이머 종류, 프라이머의 농도, PCR 반응시간, PCR 반응 주기 수, 및 PCR 적용 온도만을 조정하면서 적합한 PCR 조건을 탐색할 수 있게 되어 훨씬 편리해 진다. 근본적으로는 지금까지 하고자 하여도 할 수 없었던 건조형태의 PCR 조성물을 사용한 자신의 실험에 적합한 PCR을 실시할 수 있게 된다. 따라서 본 발명의 키트는 진단제품의 개발에도 활용될 수 있다. 지금까지 건조형태의 PCR 조성물을 이용하는 진단제품을 일반 연구자가 자신의 상황에 맞게 실현하기에는 어려움이 매우 많았다. 본 발명은 이러한 필요에 부합할 수 있다.

본 명세서에서는 PCR에 반드시 필요한 구성 성분을 특별히 “핵심 성분”, “핵심 요인”, “필요 성분”, 또는 “필요 요인”으로 지칭하고 핵심 성분 외에 PCR 반응의 효율을 증진시킬 수 있는 성분을 “추가 성분” 또는 “추가 요인”으로 지칭하였다.

이해의 편의성을 제공하고자 마그네슘 이온, 반응 완충액의 완충성분, 반응완충액의 일가 이온, DNA 중합효소를 핵심 성분으로 한정하고 그 외 성분들은 모두 추가 성분으로 지칭하였다.

우선, 마그네슘 이온은 농도를 달리한 것으로서, 본 발명의 실시예에서는 1.5 mM 내지 3.5 mM로 다양하게 하고, 각 샘플간의 농도 간격은 0.2 내지 0.5 mM로 다양하게 하였다. 실시예에서 이렇게 하였으나 농도 범위 및 간격은 적절하게 조정된다.

반응완충액의 완충성분으로는 트리스(tris), 트리신(tricine), 및 Hepes (N- [2-hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid])를 예로 들 수 있다.

반응완충액의 일가 이온으로는 암모늄(ammonium) 이온, 칼륨(potassium) 이온 및 나트륨(sodium) 이온을 예로 들 수 있다.

상기 DNA 중합효소로는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소, Tfl DNA 중합효소, Hot Tub DNA 중합효소, Ultma DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, Tli DNA 중합효소, Pwo DNA 중합효소 등(이상 제품명)이 그 예로 제시될 수 있으나 본 발명이 이에만 국한되지 않음은 당연하다.

추가 성분으로는 핵심 성분을 제외한 높은 GC 함량(high GC content)을 가진 주형이나 프라이머를 이용한 PCR 반응에서의 증폭효율의 개선을 위하여 첨가해 주는 DNA 헬릭스 불안정화에 관련되는 물질, PCR 증진제(enhancer) 등이 그 예가 될 수 있다.

상기 DNA 헬릭스 불안정화에 관련된 물질로는 베타인(betaine; Biochemistry 32: 137-144, 1993), 테트라알킬암모늄(tetraalkylammonium; J. Mol . Biol. 86: 469-489, 1974), 프롤린(proline; FEBS Letters 410: 201-205, 1997), 글리세롤(glycerol; Nucleic Acids Res. 27: 1566-1568, 1999), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol; Nucleic Acids Res. 27: 1566-1568, 1999) 등을 예로 들 수 있는데, 본 발명이 이것들에만 국한되지 않음은 당연하다.

상기 PCR 증진제의 예로는 삼투농도(osmolarity)를 변화시켜 PCR 반응의 효율을 높일 수 있는 슈크로즈(sucrose) 및 트레할로즈 등의 탄수화물(carbohydrate) 성분이 있으며 이러한 PCR 증진제의 또 다른 예로는 상기 탄수화물 외에 젤라 틴(gelatin)이나 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG) 등이 있다. 물론 본 발명은 이들에만 제한되지 않는다.

따라서 본 발명은 건조형태의 PCR 조성물에 기반한 PCR에서의 HTS 방식으로 최적 조건을 탐색하고 이로부터 최적 조건을 설정하는 데에 이용될 수 있는 방법 및 이에 관련된 키트를 제공한다.

본 발명의 키트 및 방법은 상기에서 언급한 바와 같은 PCR 결과에 영향을 미치는 요인을 포함하는데, 이 요인은 한 종류일 수도 있고 그 이상의 종류일 수도 있다. 또한, 본 발명의 키트에 포함되는 PCR 결과에 영향을 미치는 요인이 특정 성분의 종류일 수도 있고, 그 특정 성분의 농도일 수도 있다.

본 발명의 키트 및 방법을 이용하여 조건을 탐색할 수 있는 PCR 종류로는 DNA 중합효소가 관여하는 PCR과 RT-PCR이 될 수 있다.

본 발명의 PCR 반응 조성물을 이용한 키트의 제작형태는 다음과 같으나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

(1) 8-strip의 1번에서 8번 튜브에 동일한 PCR 반응혼합물에 다만, 마그네슘 이온의 농도를 8단계로 달리 첨가한 PCR 반응혼합물

(2) 8-strip의 1번에서 8번 튜브에 동일한 PCR 반응혼합물에 다만, 높은 GC-비율의 프라이머나 주형의 사용 경우를 위해 DNA 헬릭스 불안정화에 관련된 물질의 농도를 8단계로 달리 첨가한 PCR 반응 혼합물

(3) 8-strip의 1번에서 8번 튜브에 동일한 PCR 반응혼합물에 다만, DNA 중합 효소의 농도를 8단계로 달리 첨가한 PCR 반응 혼합물

(4) 8-strip의 1번에서 8번 튜브에 동일한 PCR 반응혼합물에 다만, DNA 중합효소의 종류를 8가지로 달리 첨가한 PCR 반응 혼합물

(5) 8-strip의 1번에서 8번 튜브에 동일한 PCR 반응혼합물에 다만, 반응용완충액의 조성을 8가지로 달리 첨가한 PCR 반응 혼합물

상기에 제시한 내용은 단지 하나의 실시예일 뿐이며, 이는

(1) 8-strip이 아니라, 96-strip일 수도 있으며 그 이상 및 이하 일 수도 있다. 즉, 8단계로 할 수도 있고, 4단계로 할 수도 있고, 그 이상/이하의 단계로 할 수도 있다. 즉, 8단계는 제조상 간편성을 위한 하나의 실시예일 뿐이다.

(2) 동결건조, 가온건조, 실온건조, 및 감압건조 등을 통하여 건조형태의 전혼합체 형태로 제작될 수 있다.

(3) PCR 반응에 사용되는 DNA 중합효소로는 일반적으로 Taq DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Hot-Start용 DNA 중합효소, Long PCR용 DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소, Tfl DNA 중합효소, Hot Tub DNA 중합효소, Ultma DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, Tli DNA 중합효소, Pwo DNA 중합효소 등 다양하다.

(4) 상기 PCR은 물론, RT-PCR 반응에도 적용 가능하다. 즉, 모든 PCR 반응의 조건을 설정하는데 사용가능하다.

이렇게 제조된 키트를 이용함으로써 고객은 프라이머 종류, 프라이머의 농도, PCR 반응시간, PCR 반응 주기 수, 및 PCR 적용 온도의 조정을 통해서, 자신에게 가장 잘 맞는 PCR 조건의 확인 및 설정은 물론, 적합 PCR 제품을 선택할 수도 있다.

본 발명의 키트 및 방법에 따르면, 연구자는 건조형태의 PCR 조성물에 기반한 PCR에서의 HTS 방식으로 최적 조건을 탐색하고 이로부터 최적 조건을 설정할 수 있다. 즉, 건조형태의 PCR 조성물 사용을 그대로 유지하면서도 자신의 실험 목적에 보다 부합할 수 있는 PCR 조건의 탐색이 가능해 진다. 결국 최적의 조건으로 목적 유전자를 건조형태의 PCR 조성물에 기반한 PCR을 계속 사용하면서도 효율적인 PCR 방법을 확보하게 된다. 따라서 연구자는 상기 키트를 활용하여 1회의 PCR 반응만을 실시함으로서도 자신의 실험에 적합한 PCR 반응조건을 결정할 수 있다. 이러한 건조형태의 PCR 제품은 일반적인 PCR 모두에 효과적으로 활용될 수 있지만 특히 일정한 PCR을 반복적으로 수행해야 하는 분야에의 활용에 특히 효과적이다. 그러한 분야로는 유전자 검사, 질환 검사 등을 실시하는 진단 분야를 예로 들 수 있다. 좀더 크게 생각하면 임상 분야, 식품 위생 관련 분야 및 환경 관련 분야에서 실시하는 PCR이 그 예가 될 수 있다. 본 발명의 효과는 근본적으로는 지금까지 하고자 하여도 할 수 없었던 건조형태의 PCR 조성물을 사용하여 자신의 실험에 적합한 PCR 조건을 설정하는 것이 가능해 진다. 이러한 점은 진단제품의 개발에 매우 효과적이다. 지금까지 건조형태의 PCR 조성물을 이용하는 진단제품을 일반 연구자가 자신의 상황에 맞게 실현하기에는 어려움이 매우 많았다. 본 발명은 이러한 필요에 부합할 수 있으며 이러한 진단제품 개발에 효과적으로 활용될 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서는 본 발명을 적용할 수 있는 몇 가지 주요 요소에 대해서만 설명하지만, 이들 실시예에 국한되지 않고 다양한 PCR 구성 성분에 대해서도 제약 없이 본 발명을 적용할 수 있다. 하기 실시예에서는 8-strip으로 키트 구성을 실시하나 이는 대표적 예일 뿐이며 96-strip 등 다양한 수로 구현될 수 있다. 또한 PCR용 튜브가 아니라 마이크로플레이트 등 그 구현 용기도 다양하게 선택될 수 있다. 또한, 실시예에서는 농도 단계를 8단계로 하는 경우가 제시되어 있으나 4단계로 할 수도 있고, 그 이상/이하의 단계로도 할 수 있다. 즉, 8단계는 대표적 실시예일 뿐이다. 또 다음의 실시예에서는 하나 또는 두 가지의 성분에 대한 적정 농도 탐색이 제시되어 있으나 더 많은 개수의 성분에 대해서 제약 없이 본 발명을 적용할 수 있음은 당연하다. 하기 실시예에서는 건조 공정으로 가온건조를 이용하였으나 건조가 가능한 공정이라면 동결건조, 가온건조, 실온건조, 감압건조 등의 어떤 공정도 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 하기 실시예에서는 PCR에 대하여 설명하고 있으나 역전사 반응과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형으로 사용하게 한 역전사 효소-PCR에도 적용 가능하다. 이 경우 역전사 반응을 지원해 줄 수 있는 성분만 추가로 첨가되면 된다. 이는 당업자에게는 일반적인 내용이므로 상세한 설명은 생략한다. 즉, 본 발명은 DNA 중합효소를 이용하는 모든 반응에 적용될 수 있다. 이러한 변형 적용은 당분야에 익숙한 당업자에게는 일반적 사항이므로 따로 설명하지 않겠다.

하기 실시예 1에서는 본 발명의 적용 예로 PCR의 핵심 성분에 대한 적정 농도 탐색이 제시되어 있으며 마그네슘 이온을 대상으로 하였다. 그러나 마그네슘 이온은 적용 가능한 한가지 예에 불과하며 DNA 중합효소, 반응완충액 성분도 같은 방법으로 본 발명을 적용할 수 있다. 즉 마그네슘 이온 농도, DNA 중합효소 농도, 반응완충액의 한 성분의 농도 등 특정 한 성분의 농도에만 국한되지 않고 공지의 많은 PCR 필요 성분들이 제한 없이 본 발명에 적용될 수 있다. 더 나아가 실시예 2에서 알 수 있듯이 핵심 성분이 아니더라도 PCR에 효과적인 성분 (추가 성분)까지도 본 발명이 적용될 수 있다.

실시예 1: 마그네슘 적정 농도 탐색용 키트

본 발명의 적용 예로 PCR의 핵심 성분에 대한 적정 농도 탐색이 본 실시예에 제시되어 있다.

PCR 반응의 결과에 가장 심각한 영향을 주는 마그네슘 이온에 대한 적정 농도 탐색에 활용될 수 있는 마그네슘 적정 농도 탐색용 키트를 아래와 같이 제조한 다음 이를 이용하여 적정 마그네슘 농도를 결정해 보았다. 이는 다음과 같이 실시하였다. 8-strip의 1번에서 8번 튜브에 동일한 조성으로 준비한 PCR 반응액에 염화마그네슘(MgCl₂) 농도만을 8단계 농도단계로 달리 첨가하여 한국특허등록 제0730364호에 개시된 방법에 따라 가온건조시켜 건조형태의 PCR 전혼합체를 제조하였다. 상 기 동일한 조성은 다음과 같으며 이를 기본 조성이라 지칭한다. 30 mM 트리스-염산(Tris-HCl)(pH 9.0), 15 mM 염화칼륨(KCl), 15 mM 염화나트륨(NaCl), 5 유니트(unit)의 Taq DNA 중합효소, 30 mM 트레할로즈, 및 0.005%(w/v)의 자일렌 사이아놀(xylene cyanol). 물론 이 기본 조성은 다양하게 변경될 수 있으며 본 발명은 이 기본 조성에 제약받지 않는다. 상기의 기본 조성에 1번부터 8번 튜브에 차례대로 1.5 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.3 mM, 2.5 mM, 2.8 mM, 3.0 mM, 3.5 mM의 농도가 되게 염화마그네슘을 추가로 첨가해 주었다. 이렇게 준비된 액체 조성물을 건조시켜 건조형태의 조성물을 얻었다.

본 실시예의 PCR에 사용한 주형은 인간세포(human cell-line) K562로부터 추출한 인간 gDNA(genomic DNA)였다. gDNA 추출은 인트론바이오테크놀로지사의 G-spinTM Genomic DNA Extraction kit(for Cell/Tissue)를 사용하여 제품의 사용 설명서에 따라 실시했다. 본 실시예에서 실시한 PCR의 증폭 대상 유전자(target gene)는 1.8 kbp 크기를 가진 베타-글로빈(beta-globin) 단편(fragment)이었다. 베타-글로빈 유전자의 NCBI accession number는 NW925006.1이다. 주형 DNA는 4 ng을 사용하였다. 이 PCR에서 사용한 프라이머로 정방향(forward) 프라이머는 5’-GAA GGC TCA TGG CAA GAA AG-3’(서열번호 1)이었고 역방향 프라이머는 5’-GAT TCC GGG TCA CTG TGA GT-3’(서열번호 2)이었다. PCR은 써멀 사이클러(thermal cycler)를 이용하여 실시했으며 사용한 PCR 조건은 94℃로 2분 가온한 다음, 94℃에서 20초 가온, 60℃에서 20초 가온, 72℃에서 2분 가온하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회 반복한 후, 이를 72℃에서 2분 더 가온한 다음 최종적으로 4℃에서 방 치하는 조건이었다.

이렇게 PCR을 실시한 후 PCR 반응액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동한 다음 젤을 Bio-Rad사의 GS-800 Calibrated Densitometer를 이용하여 증폭 산물의 양과 특이도를 확인하였다. 여기서 특이도란 비특이 증폭(non-specific amplification) 산물에 대한 목적유전자의 증폭 정도를 나타낸다. 특이도가 높다는 것은 목적유전자 증폭이 상대적으로 우세함을 의미한다. 본 실시예의 목적유전자는 약 1.8 kbp 크기를 가지며 1.8 kbp 크기를 가지는 PCR 산물이 증폭됨을 확인할 수 있었다. 이와 같이 전기영동한 젤의 사진이 도 1에 이해를 돕기 위해 제시되어 있으며 그 분석 결과가 표 1에 제시되어 있다. 표 1에서는 목적유전자의 생성량이 해당 밴드(band)의 강도(intensity)에 대한 상대적 값으로 “+”를 이용하여 제시되어 있다. “+”가 많을수록 증폭이 잘된 경우이다. 특이도에서도 “+”가 많을수록 목적유전자만의 증폭이 우세했음을 나타낸다.

	Tube 1	Tube 2	Tube 3	Tube 4	Tube 5	Tube 6	Tube 7	Tube 8
마그네슘 농도 (mM)	1.5	1.8	2.0	2.3	2.5	2.8	3.0	3.5
증폭정도	+	++	+++	+++++	++++	++++	++++	++++
특이도	++++	++++	+++	+++++	+++	++	+	+
선정 여부				선정

상기의 결과에서 알 수 있듯이 1회의 PCR 실시로 적정 마그네슘 이온 농도(2.3 mM)를 결정할 수 있었다.

실시예 2: DNA 헬릭스 불안정화에 관련된 물질 적정 농도 탐색용 키트

본 발명의 적용 예로 PCR의 핵심 성분은 아니지만 PCR에 있어 경우에 따라 효과적인 추가 성분에 대한 적정 농도 탐색이 본 실시예에 제시되어 있다.

PCR 반응의 결과에 영향을 줄 수 있는 추가 성분의 예로 DNA 헬릭스 불안정화에 관련된 물질에 대한 적정 농도 탐색에 활용될 수 있는 DNA 헬릭스 불안정화에 관련된 물질 적정 농도 탐색용 키트를 제조한 다음 이를 이용하여 DNA 헬릭스 불안정화에 관련된 물질의 적정 농도를 결정해 보았다. 본 실시예에서 사용한 DNA 헬릭스 불안정화에 관련된 물질로는 베타인을 선정하였다.

이는 다음과 같이 실시하였다. 8-strip의 1번에서 8번 튜브에 동일한 조성으로 준비한 PCR 반응액에 베타인 농도만을 8단계 농도단계로 달리 첨가하여 한국특허등록 제0730364호에 개시된 방법에 따라 가온건조시켜 건조형태의 PCR 전혼합체를 제조하였다. 동일한 조성으로 준비하는 PCR 반응액의 기본 조성은 다음과 같다. 30 mM 트리스-염산(pH 9.0), 15 mM 염화칼륨, 15 mM 염화나트륨, 2 mM 염화마그네슘, 5 유니트의 Taq DNA 중합효소, 30 mM 트레할로즈, 및 0.005%(w/v)의 자일렌 사이아놀. 물론 이 기본 조성은 다양하게 변경될 수 있으며 본 발명은 이 기본 PCR 조성에 제약받지 않는다. 상기의 기본 조성에 1번부터 8번 튜브에 차례대로 0.25 M, 0.5 M, 0.75 M, 1.0 M, 1.25 M, 1.5 M, 1.75 M, 2.0 M의 농도가 되게 베타인을 첨가해 주었다. 이렇게 준비된 액체 조성물을 건조시켜 건조형태의 조성물을 얻었다.

본 실시예의 PCR에 사용한 주형은 실시예 1에서와 같이 인간세포 K562로부터 추출한 인간 gDNA였다. gDNA 추출은 실시예 1과 같이 인트론바이오테크놀로지사의 G-spinTM Genomic DNA Extraction kit(for Cell/Tissue)를 사용하여 제품의 사용 설명서에 따라 실시했다. 본 실시예의 PCR 증폭 대상 유전자는 실시예 1과 다른데, 실시예 2에서는 196 bp의 인간 레티노블라스토마 1(human retinoblastoma 1; RB-1) 유전자 단편이었다. RB-1 유전자의 NCBI accession number는 NW925473.1이다. 주형 DNA는 10 ng을 사용하였다. 이 PCR에 사용한 프라이머로 정방향 프라이머는 5’-CAG GAC AGC GGC CCG GAG-3’(서열번호 3)이었고 역방향 프라이머는 5’-CTG CAG ACG CTC CGC CGT-3’(서열번호 4)이었다. PCR은 실시예 1과 같이 써멀 사이클러를 이용하여 실시했으며 사용한 조건은 94℃로 2분 가온한 다음, 94℃에서 30초 가온, 63℃에서 35초 가온, 72℃에서 40초 가온하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 30회 반복한 후, 이를 72℃에서 2분 추가 가온한 다음 최종적으로 4℃에서 방치하는 조건이었다.

이렇게 PCR을 실시한 후 PCR 반응액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동한 다음 젤을 Bio-Rad사의 GS-800 Calibrated Densitometer를 이용하여 증폭 산물의 양과 특이도를 확인하였다. 196 bp 크기를 가지는 PCR 산물이 증폭됨을 확인할 수 있었으며 그 분석 결과가 표 2에 제시되어 있다. 표 2에서는 목적유전자의 생성량이 표 1에서와 같은 방식으로 제시되어 있다. 즉, 해당 밴드의 강도의 상대적 값을 “+”로 나타내었다. “+”가 많을수록 증폭이 잘된 경우이다. 특이도에서도 역시 “+”가 많을수록 목적유전자의 증폭이 우세했음을 나타낸다.

	Tube 1	Tube 2	Tube 3	Tube 4	Tube 5	Tube 6	Tube 7	Tube 8
베타인 농도 (M)	0.25	0.5	0.75	1.0	1.25	1.5	1.75	2.0
증폭정도	+++	++++	++++	+++++	+++++	++++	++++	++++
특이도	+++	++++	++++	+++++	++++	++++	++++	+++
선정 여부				선정

상기의 결과에서 알 수 있듯이 1회의 PCR 실시로 베타인의 적정 농도(1.0 M)를 결정할 수 있었다.

실시예 3: 마그네슘 적정 농도 및 DNA 헬릭스 불안정화에 관련된 물질의 적정 농도 동시 탐색용 키트

본 발명의 적용 예로 PCR의 핵심 성분 1종과 추가 성분 1종에 대한 적정 농도의 동시 탐색이 본 실시예에 제시되어 있다. 본 실시예는 핵심 성분, 추가 성분 구분 없이 여러 가지 성분들에 대해서도 동시에 탐색할 수 있는 키트를 구현할 수 있음을 보여준다. 당연히 한 성분은 핵심 성분이어야 하고 또 하나는 추가 성분이어야 함을 의미하지도 않는다. 또, 본 실시예에서는 특정 두 가지 성분에 대한 탐색이 예시적으로 설명되어 있으나 그 이상 개수의 성분들에 대해서는 적용 가능함은 당연하다.

본 실시예에서는 마그네슘 이온과 베타인에 대한 적정 농도 동시 탐색에 활용될 수 있는 키트를 제조한 다음 이를 이용하여 마그네슘 적정 농도와 베타인 적정 농도를 결정해 보았다.

이는 다음과 같이 실시하였다. 8-strip의 1번에서 8번 튜브에 동일한 조성의 PCR 반응액에 4단계의 농도단계의 염화마그네슘 농도와 2단계의 농도단계의 베타인 농도로 조합될 수 있는 8가지 구성을 차례로 준비하였다. 동일한 조성으로 준비하는 PCR 반응액의 기본 조성은 다음과 같다. 30 mM 트리스-염산(pH 9.0), 15 mM 염화칼륨, 15 mM 염화나트륨, 5 유니트의 Taq DNA 중합효소, 30 mM 트레할로즈, 및 0.005%(w/v)의 자일렌 사이아놀. 물론 이 기본 조성은 다양하게 변경될 수 있으며 본 발명은 이 기본 PCR 조성에 제약받지 않는다. 상기의 기본 조성에 1번부터 8번 튜브에 다음 표와 같이 염화마그네슘과 베타인을 첨가하였다.

	Tube 1	Tube 2	Tube 3	Tube 4	Tube 5	Tube 6	Tube 7	Tube 8
마그네슘 농도 (mM)	1.8	2.0	2.3	2.5	1.8	2.0	2.3	2.5
베타인 농도 (M)	0.5	0.5	0.5	0.5	1.0	1.0	1.0	1.0

상기처럼 준비한 시료를 실시예 1과 실시예 2에서와 같이 한국특허등록 제0730364호에 개시된 방법에 따라 가온건조시켜 건조형태의 PCR 전혼합체를 제조하였다.

본실시예의 PCR에 사용한 주형은 인간세포 K562로부터 추출한 인간 gDNA였다. gDNA 추출은 인트론바이오테크놀로지사의 G-spinTM Genomic DNA Extraction kit(for Cell/Tissue)를 사용하여 제품의 사용 설명서에 따라 실시했다. 본 실시예에서 실시한 PCR의 증폭 대상 유전자는 1.2 kbp 크기를 가진 인간 c-jun 유전자 단편이었다. c-jun 유전자의 NCBI accession number는 NW921351.1이다. 주형 DNA는 10 ng을 사용하였다. 이 PCR에서 사용한 프라이머로 정방향 프라이머는 5’-GGG AGG GGA CCG GGG AAC AGA G-3’(서열번호 5)이었고 역방향 프라이머는 5’-GAA CAG TCC GTC ACT TCA CGT G-3’(서열번호 6)이었다. PCR은 써멀 사이클러를 이용하여 실시했으며 사용한 PCR 조건은 94℃로 2분 가온한 다음, 94℃에서 30초 가온, 66℃에서 35초 가온, 72℃에서 1분 가온하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 30회 반복한 후, 이를 72℃에서 2분 더 가온한 다음 최종적으로 4℃에서 방치하는 조건이었다.

이렇게 PCR을 실시한 후 PCR 반응액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동한 다음 젤을 Bio-Rad사의 GS-800 Calibrated Densitometer를 이용하여 증폭 산물의 양과 특이도를 확인하였다. 본 실시예의 목적유전자는 약 1.2 kbp 크기를 가지며 1.2 kbp 크기를 가지는 PCR 산물이 증폭됨을 확인할 수 있었다. 그 분석 결과가 표 4에 제시되어 있다. 표 4에서는 목적유전자의 생성량이 제시되어 있으며 해당 밴드의 강도에 대한 상대적 값을 “+”로 나타내었다. “+”가 많을수록 증폭이 잘된 경우이다. 특이도에서도 “+”가 많을수록 목적유전자의 증폭이 우세했음을 나타낸다.

	Tube 1	Tube 2	Tube 3	Tube 4	Tube 5	Tube 6	Tube 7	Tube 8
마그네슘 농도 (mM)	1.8	2.0	2.3	2.5	1.8	2.0	2.3	2.5
베타인 농도 (M)	0.5	0.5	0.5	0.5	1.0	1.0	1.0	1.0
증폭정도	+++	++++	+++	+++	+++	++++	++++	++++
특이도	+++	+++	+++	++	+++	++++	+++	++
선정 여부						선정

상기의 결과에서 알 수 있듯이 1회의 PCR 실시로 마그네슘 이온 적정 농도(2.0 mM) 및 베타인 적정 농도(1.0 M)를 결정할 수 있었다.

실시예 4: 적정 DNA 중합효소 종류 탐색용 키트

본 발명의 적용 예로 PCR의 핵심 성분의 하나인 DNA 중합효소에 대하여 적합한 DNA 중합효소 탐색이 본 실시예에 제시되어 있다. 즉, 본실시예로 본 발명이 적정 농도 탐색 외에 적합 종류 선별에서도 활용될 수 있음을 알 수 있다.

적합한 DNA 중합효소의 탐색은 다음과 같이 실시하였다. 8-strip의 1번에서 8번 튜브에 동일한 조성으로 준비한 PCR 반응액에 각기 서로 종류가 다른 DNA 중합효소를 첨가하여 한국특허등록 제0730364호에 개시된 방법에 따라 가온건조시켜 건조형태의 PCR 전혼합체를 제조하였다. 동일한 조성으로 준비하는 PCR 반응액의 기본 조성은 다음과 같다. 30 mM 트리스-염산(pH 9.0), 15 mM 염화칼륨, 15 mM 염화나트륨, 2 mM 염화마그네슘, 30 mM 트레할로즈, 및 0.005%(w/v)의 자일렌 사이아놀. 물론 이 기본 조성은 다양하게 변경될 수 있으며 본 발명은 이 기본 PCR 조성에 제약받지 않는다. 상기의 기본 조성에 1번부터 8번 튜브에 서로 다른 DNA 중합효소를 첨가해 주었는데 첨가해주는 DNA 중합효소의 양은 모두 5 유니트로 일치시켰다. 1번 튜브에는 Taq DNA 중합효소, 2번 튜브에는 Pfu DNA 중합효소, 3번 튜브에는 Vent DNA 중합효소, 4번 튜브에는 Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 10:1 혼합효소, 5번 튜브에는 Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 15:1 혼합효소, 6번 튜브에는 Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 20:1 혼합효소, 7번 튜브에는 Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 25:1 혼합효소, 8번 튜브에는 Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 30:1 혼합효소를 첨가해 주었다. 이렇게 준비된 액체 조성물을 건조시켜 건조형태의 조성물을 얻었다.

본 실시예의 PCR에 사용한 주형은 실시예 1에서와 같이 인간세포 K562로부터 추출한 인간 gDNA였다. gDNA 추출은 실시예 1과 같이 인트론바이오테크놀로지사의 G-spinTM Genomic DNA Extraction kit(for Cell/Tissue)를 사용하여 제품의 사용 설명서에 따라 실시했다. 본 실시예의 PCR 증폭 대상 유전자는 실시예 1과 다른데, 실시예 4에서는 2.1 kbp의 p53 유전자 단편이었다. p53 유전자의 NCBI accession number는 NW926584.1이다. 주형 DNA는 20 ng을 사용하였다. 이 PCR에 사용한 프라이머로 정방향 프라이머는 5’-TGC CGT CCC AAG CAA TGG AT-3’(서열번호 7)이었고 역방향 프라이머는 5’-TGT GCA GGG TGG CAA GTG GC-3’(서열번호 8)이었다. PCR은 실시예 1과 같이 써멀 사이클러를 이용하여 실시했으며 사용한 조건은 94℃로 2분 가온한 다음, 94℃에서 20초 가온, 64℃에서 20초 가온, 72℃에서 2분 가온하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회 반복한 후, 이를 72℃에서 2분 추가 가온한 다음 최종적으로 4℃에서 방치하는 조건이었다.

이렇게 PCR을 실시한 후 PCR 반응액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동한 다음 젤을 Bio-Rad사의 GS-800 Calibrated Densitometer를 이용하여 증폭 산물의 양과 특이도를 확인하였다. 2.1 kbp 크기를 가지는 PCR 산물이 증폭됨을 확인할 수 있었으며 그 분석 결과가 표 5에 제시되어 있다. 표 5에서는 목적유전자의 생성량이 제시되어 있으며 해당 밴드의 강도에 대한 상대적 값이 “+”로 나타내어져 있다. “+”가 많을수록 증폭이 잘된 경우이다. 특이도에서도 “+”가 많을수록 목적유전자의 증폭이 우세했음을 나타낸다.

	Tube 1	Tube 2	Tube 3	Tube 4	Tube 5	Tube 6	Tube 7	Tube 8
DNA 중합효소 종류	Taq DNA 중합효소	Pfu DNA 중합효소	Vent DNA 중합효소	Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 10:1 혼합효소	Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 15:1 혼합효소	Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 20:1 혼합효소	Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 25:1 혼합효소	Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 30:1 혼합효소
증폭정도	+++++	+++	++++	++++	+++++	+++++	+++++	+++++
특이도	+++	+++++	++++	++++	+++++	++++	++++	+++
선정 여부					선정

상기의 결과에서 알 수 있듯이 1회의 PCR 실시로 적합한 DNA 중합효소를 결정할 수 있었다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 이해를 돕기 위해 제시된 것으로 본 발명의 적용에서 얻어지는 아가로즈 젤을 이용한 전기영동 결과를 보여주는 사진이다. 이런 젤을 이용하여 GS-800 Calibrated Densitometer로 해당 밴드의 강도를 측정하여 증폭 산물의 양과 특이도를 조사하였다.

<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Kit suitable for screening and establishment of optimal amplification condition in PCR constructed with dried-formulated PCR reagent and method for producing the same <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for beta-globin <400> 1 gaaggctcat ggcaagaaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta-globin <400> 2 gattccgggt cactgtgagt 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for human retinoblastoma 1 <400> 3 caggacagcg gcccggag 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for human retinoblastoma 1 <400> 4 ctgcagacgc tccgccgt 18 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for c-jun <400> 5 gggaggggac cggggaacag ag 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for c-jun <400> 6 gaacagtccg tcacttcacg tg 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for p53 <400> 7 tgccgtccca agcaatggat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for p53 <400> 8 tgtgcagggt ggcaagtggc 20

Claims (13)

1. 건조형태의 PCR용 조성물을 활용하는 PCR에서의 최적 증폭 조건 탐색 및 설정에 활용 가능한, PCR에 필요한 건조형태의 필요성분 및 추가성분을 포함하며, PCR 결과에 영향을 미치는 요인인 이들 성분들의 종류 및 농도가 서로 다른 다수의 상이한 조성의 일련의 PCR 반응 전혼합체들이 하나의 키트에 포함된, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
2. 제 1 항에 있어서 상기 PCR 결과에 영향을 미치는 요인은 마그네슘 이온 농도, DNA 중합효소의 종류, DNA 중합효소의 농도, 반응 완충액의 조성, 반응 완충액의 일가이온 및 PCR 증진제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 마그네슘 이온 농도는 0.5 내지 10 mM인 것을 특징으로 하는, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 반응완충액의 완충 성분은 트리스(Tris), 트리신(Tricine) 및 Hepes(N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid])로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
5. 제 2 항에 있어서, 상기 반응 완충용액의 일가 이온은 암모늄이온, 칼륨이온 및 나트륨 이온으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
6. 제 2 항에 있어서, 상기 PCR 증진제가 DNA 헬릭스 불안정화에 관련되는 물질인 것을 특징으로 하는, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 DNA 헬릭스 불안정화에 관련되는 물질은 베타인(betaine), 테트라알킬암모늄(tetraalkylammonium), 프롤린(proline), 글리세롤(glycerol) 또는 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)인 것을 특징으로 하는, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
8. 제 2 항에 있어서 상기 DNA 중합효소가 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소, Tfl DNA 중합효소, Hot Tub DNA 중합효소, Ultma DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, Tli DNA 중합효소, Pwo DNA 중합효소 또는 이것들의 혼합 효소 형태인 것을 특징으로 하는, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
9. 제 1 항에 있어서 상기 PCR 결과에 영향을 미치는 요인은 한 종류 내지 여섯 종류인 것을 특징으로 하는, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
10. 제 1 항에 있어서 상기 PCR 결과에 영향을 미치는 요인은 특정 성분의 종류일 수도 있고 또는 특정 성분의 농도일 수도 있는 것을 특징으로 하는, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
11. 제 1 항에 있어서 상기 PCR은 DNA 중합효소가 관여하는 PCR과 RT-PCR인 것을 특징으로 하는, 건조형태의 PCR 반응혼합물들로 구성되는 PCR 조건 탐색용 키트.
12. 삭제
13. 삭제

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