KR100984483B1

KR100984483B1 - 순환적 역전사 방법

Info

Publication number: KR100984483B1
Application number: KR1020070026846A
Authority: KR
Inventors: 정희정; 김민정; 박해준; 박한오
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2007-03-19
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2010-10-01
Also published as: US20100221786A1; WO2008115002A1; KR20080085398A; US8058007B2

Abstract

본 발명은 (ⅰ) 주형 RNA, RNA 의존 DNA 폴리머라제, 반응용 완충용액, 역전사 반응용 프라이머, 임의로 안정화제 및 dNTPs를 포함하는 역전사 반응액을 이용하여 10~40℃에서 반응을 수행하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 반응을 수행한 반응액을 이용하여 42~55℃에서 반응을 수행하는 단계를 포함하는 주기로 역전사 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법을 제공함으로써, 종래의 단일 온도 조건에서 수행되는 역전사 방법과 비교하여 역전사 반응의 효율을 극대화하여 반응의 민감도 및 증폭율을 증가시킬 수 있게 한 것이다.

역전사 반응, 안정화제, 트레할로스, 고온, 저온, 중온, 순환적 역전사, 역전사 중합효소연쇄반응

Description

순환적 역전사 방법{Cyclic reverse transcription method}

도 1은 프라이머, MMLV 역전사 효소, 10× 반응 완충용액, 안정화제 및 dNTPs를 함유하는 조성물을 2× 용액으로 예비 혼합하여 분주하고 건조한 후, 재수화한 역전사 반응액에 주형 RNA(HeLa 세포에서 추출한 총 RNA)를 가하여 단일 온도 조건과 순환적 온도 조건으로 역전사 반응을 수행한 후, 트랜스페린 수용체 유전자를 길이별로 증폭하여 전기영동으로 확인한 결과이다.

도 2는 프라이머, MMLV 역전사 효소, 10× 반응 완충용액, 안정화제 및 dNTPs를 함유하는 조성물을 2× 용액으로 예비 혼합하여 분주하고 건조한 후, 재수화한 역전사 반응액에 주형 RNA를 가하여 단일 온도 조건과 순환적 온도 조건으로 역전사 반응을 수행한 다음, GAPDH와 β-액틴 유전자를 증폭하여 전기영동으로 확인한 결과이다.

도 3은 프라이머, MMLV 역전사 효소, 10× 반응 완충용액, 안정화제 및 dNTPs를 함유하는 조성물을 2× 용액으로 예비 혼합하여 분주하고 건조한 후, 재수화한 역전사 반응액에 주형 RNA를 가하여 단일 온도 조건과 순환적 온도 조건으로 역전사 반응을 수행한 다음, GAPDH와 β-액틴 유전자를 증폭하여 전기영동으로 확인한 결과이다.

도 4는 주형 RNA, 프라이머, MMLV 역전사 효소, 10× 반응 완충용액, 안정화 제 및 dNTPs를 함유하는 역전사 반응액을 이용하여, 단일온도 조건과 순환적 조건으로 역전사 반응을 수행한 다음, ELAVL1 유전자를 증폭하여 전기영동으로 확인한 결과이다.

도 5는 주형 RNA, dT20 프라이머, MMLV 역전사 효소, 10× 반응 완충용액, 안정화제 및 dNTPs를 함유하는 역전사 반응액을 이용하여 온도 조건별로 역전사 반응을 수행하여 결과를 비교한 것으로서, 도 5a는 단일 온도 조건으로 역전사 반응을 수행한 결과이고, 도 5b는 순환적 온도 조건으로 역전사 반응을 수행한 결과이다.

도 6은 MMLV 역전사 효소, 10× 반응 완충용액 및 dNTPs를 함유하는 조성물을 2× 용액으로 예비혼합하여 분주하고 건조한 후, 재수화한 역전사 반응액에 역전사 반응용 프라이머 및 주형 RNA를 첨가하여 기존의 단일 온도 조건과 순환 온도 조건으로 역전사 반응을 수행하여 GAPDH 유전자를 증폭하여 전기영동으로 확인한 결과이다.

본 발명은 순환적 역전사 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 주형 RNA, RNA 의존 DNA 폴리머라제, 반응용 완충용액, 역전사 반응용 프라이머, 임의로 안정화제 및 dNTPs를 포함하는 역전사 반응액을 이용하여 10~40℃에서 반응을 수행하는 단계, 및 상기 반응을 수행한 반응액을 이용하여 42~55℃에서 반응을 수행하는 단 계를 포함하는 주기로 역전사 반응을 수행하여 반응 효율을 극대화하면서 반응의 민감도를 향상시킨 순환적 역전사 방법에 관한 것이다.

mRNA 유전자 분석은 여러 생물 현상을 알기 위해 중요한데, 이는 레트로바이러스(retroviruses)의 RNA 의존 DNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase)의 발견으로 주형 RNA(총 RNA 및 mRNA)를 사용하여 cDNA를 합성하는 역전사 반응이 가능해졌다. 이 분석 방법은 유전자 연구의 기본적인 방법 중의 하나로 분자생물학 및 생물학, 의약품 및 법의학, 바이러스 진단 연구 등의 다양한 분야에 적용되는 필수적인 핵심 기술 중 하나이다.

그러나, 기존의 역전사 방법은 cDNA 합성 시, 37~42℃의 비교적 낮은 반응 온도로 인해 주형 RNA의 2차 구조가 형성된 상태인데 이 구조는 역전사 반응시 cDNA 합성에 방해 요소로 작용한다. 이를 해결하기 위해 내열성의 역전사 효소를 사용하는 방법이 고안되었으나 일반적으로 역전사 반응에 사용되는 프라이머인 랜덤 프라이머는 5~15머, dT 프라이머는 14~23머 정도로 길이가 짧아, 고온 반응시 주형 RNA에 어닐링이 충분히 일어나지 못해 반응의 효율이 떨어지는 경향이 있었다.

본 발명자들은 역전사 반응의 효율을 극대화하기 위해 기존의 특정 한 가지 온도 조건에서 반응하는 대신, 프라이머가 RNA 주형에 잘 붙을 수 있도록 하는 온도 조건에서 일정 시간 반응하는 것과 RNA 주형의 2차 구조를 해소하고 역전사 효 소의 반응이 일어나도록 하는 온도에서 일정 시간 반응하는 것을 한 주기로 하고 이 주기를 순환하여 반응하는 순환적 역전사 방법(cyclic reverse transcription)을 안출하였다. 본 발명에 따른 방법에서, 통상 몰로니 무린 류케미아 바이러스(Moloney murine leukemia virus; MMLV) 역전사 효소는 고온 반응이 불가능하므로, RNA 주형의 2차 구조를 해소하기 위해 50~55℃의 반응이 가능하도록 안정화제를 첨가하는 방법을 사용하였다. 한편, 상기 안정화제를 첨가하지 않는 경우에는, 42~50℃ 미만의 온도에서 역전사 효소의 반응이 일어나도록 하였다.

따라서 본 발명의 목적은 주형 RNA가 cDNA로 합성되는 역전사 반응 과정에서 통상의 방법이 갖고 있는 문제점을 해결하여 반응 효율을 극대화하여 반응의 민감도를 높이기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 제1면은

(ⅰ) 주형 RNA, RNA 의존 DNA 폴리머라제, 반응용 완충용액, 역전사 반응용 프라이머 및 dNTPs를 포함하는 역전사 반응액을 이용하여 10~40℃의 온도에서 반응을 수행하는 단계; 및

(ⅱ) 상기 반응을 수행한 반응액을 이용하여 42~55℃의 온도에서 반응을 수행하는 단계:

를 포함하는 주기로 역전사 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법을 제공한다.

본 발명의 제2면은

(ⅰ) 상기 순환적 역전사 방법에 따라 cDNA를 제조하는 단계; 및

(ⅱ) 주형으로 상기 cDNA를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계:

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 역전사 중합효소연쇄반응 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)은 크게 시료에서 추출된 RNA를 cDNA로 전환하는 단계와, 상기 전환된 cDNA를 DNA 폴리머라제에 의해 증폭하는 단계로 이루어져 있는데, 이중 본 발명에서는 RNA를 cDNA로 전환하는 효율을 극대화할 수 있도록 한 것이다. 즉, 본 발명은 1차로 프라이머의 접근성이 용이한 10~40℃의 온도에서 역전사 반응을 수행한 다음, 2차로 종래 RNA 의존 DNA 폴리머라제가 반응하지 못했던 50~55℃에서 안정화제의 존재 하에서 역전사 반응을 수행하거나, 안정화제 없이도 RNA 의존 DNA 폴리머라제가 반응할 수 있는 42~50℃ 미만의 온도에서 역전사 반응을 수행하여, 주형 RNA의 2차 구조를 해소하여 RNA가 cDNA로 전환되는 효율을 향상시킨 것이다.

본 발명에 있어서, 역전사 반응액은 주형 RNA, RNA 의존 DNA 폴리머라제, 반응용 완충용액, 역전사 반응용 프라이머, 임의로 안정화제 및 dNTPs를 포함하는 수용액 상으로 제조될 수 있다. 다르게는, 역전사 반응액은 RNA 의존 DNA 폴리머라제, 반응용 완충용액, 역전사 반응용 프라이머, 임의로 안정화제 및 dNTPs를 혼합하여 건조한 후 주형 RNA를 가하여 재수화하거나, RNA 의존 DNA 폴리머라제, 반응 용 완충용액, 임의로 안정화제 및 dNTPs를 혼합하여 건조한 후 주형 RNA 및 역전사 반응용 프라이머를 가하여 재수화하여 제조될 수 있다. 이때 필요에 따라서, 건조물에 추가로 안정화제를 가하여 재수화할 수 있다. 나아가 실험 목적에 따라 사용의 편의성을 위해, RNA 의존 DNA 폴리머라제, 반응용 완충용액, 임의로 안정화제 및 dNTPs 중 특정 성분을 제외한 나머지 성분들을 혼합하여 건조한 후, 제외된 나머지 성분들을 가하여 재수화하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 반응에 더 적합하도록 반응용 완충용액의 각 성분(예: Tris-HCl, KCl, MgCl₂, DTT)의 농도를 조절하고자 하는 경우나 반응성을 향상시키기 위해 특정 성분을 선정하고 이의 최적 농도를 결정하고자 하는 경우에는, 반응용 완충용액을 제외한 나머지 성분들, 즉 RNA 의존 DNA 폴리머라제, 임의로 안정화제 및 dNTPs(및 역전사 반응용 프라이머)를 혼합하여 건조한 후, 주형 RNA 및 반응용 완충용액(및 역전사 반응용 프라이머)를 가하여 재수화함으로써, 반응을 편리하고 간편하게 수행할 수 있게 된다. 이때 필요에 따라서, 건조물에 추가로 안정화제를 가하여 재수화할 수 있다. 또 다르게는, 반응성 향상을 위해 RNA 의존 DNA 폴리머라제의 사용량을 변화시키거나 농축 정제된 RNA 의존 DNA 폴리머라제의 적당한 사용량을 결정하고자 하는 경우에는, RNA 의존 DNA 폴리머라제를 제외한 나머지 성분들, 즉 반응용 완충용액, 임의로 안정화제 및 dNTPs(및 역전사 반응용 프라이머)를 혼합하여 건조한 후 주형 RNA 및 RNA 의존 DNA 폴리머라제(및 역전사 반응용 프라이머)를 가하여 재수화함으로써, 반응을 편리하고 간편하게 수행할 수 있다. 이때 필요에 따라서, 건조물에 추가로 안정화제 를 가하여 재수화할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 안정화제의 종류에는, 특별한 제한은 없는 바, 예를 들어 역전사 반응액이 수용액 상으로 제조된 것인 경우에는 트레할로스(trehalose), 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO), 베타인(betaine), 우혈청알부민(bovine serum albumin; BSA) 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 한편, 건조물을 재수화하여 제조된 역전사 반응액을 이용하는 경우에는, 안정화제는 단당류, 이당류, 다당류, 탄수화물 유도체 및 이들의 혼합물으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 단당류는 삼탄당, 사탄당, 오탄당, 육탄당, 칠탄당 등을 포함하는 바, 오탄당은 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 리보스(ribose), 자일룰로스(xylulose), 리그로스(ligrose) 등을 포함하며, 육탄당은 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 만노스(mannose), 소르보스(sorbose), 프럭토스(fructose) 등을 포함하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이당류는 트레할로스, 자일로비오스(xylobiose), 말토스(maltose), 이소말토스(isomaltose), 라미나리비오스(laminaribiose), 셀로비오스(cellobiose), 젠티오비오스(gentiobiose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose) 등을 포함하고, 탄수화물 유도체는 아라비톨(arabitol), 자일리톨(xylitol), 갈락티톨(galactitol), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 메틸글루코피라노사이드(methyl glucopyranoside) 등을 포함하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 중에서도 트레할로스와 다른 안정화제의 혼합물을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 순환적 역전사 방법에서 안정화제를 사용하는 경우, 상기 42~55℃ 단계는 50~55℃에서 반응을 수행하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 이때, 10~40℃ 단계 10초~5분 및 50~55℃ 단계 10초~5분을 한 주기로 하여 1~20회, 특히 2~12회로 순환하는 것이 보다 바람직하다. 이는 상술한 단계별 시간과 순환 횟수의 범위에서 주형 RNA가 cDNA로 전환되어 궁극적으로 DNA의 수득 효율을 높이기 때문이다.

역전사 반응을 위한 역전사용 프라이머는 일반적으로 랜덤 프라이머(random primer) 또는 dT 프라이머(dT primer)를 사용할 수 있는데, 통상 랜덤 프라이머는 5~15머(mer) 정도, dT 올리고 프라이머는 14~23머 정도를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 랜덤 6머의 경우 G, A, T, C의 염기서열이 정해지지 않고 임의로 합성되므로 특정 염기서열만 반복되어 합성된 올리고머도 있을 수 있다. 예를 들면 T만 6개로 합성된 올리고머와 G만 6개로 합성된 올리고머도 있을 수 있는데, 이들의 경우 각각 어닐링 온도가 12℃와 24℃ 정도로 10℃ 이상의 온도 차이를 나타낸다. 랜덤 프라이머는 그 염기서열의 다양한 조합만큼의 여러 어닐링 온도를 갖는다. 기존의 단일 온도 반응의 경우, 그 반응온도보다 낮거나 다양한 어닐링 온도를 갖는 역전사 프라이머를 사용하면 반응 효율이 떨어질 수 있다. 이에 본 발명에서는 10~40℃의 어닐링 반응 단계를 거쳐 반응온도보다 낮거나 다양한 어닐링 온도를 갖는 프라이머들이 충분히 어닐링할 수 있도록 함으로써 반응의 효율을 극대화할 수 있다.

또한, 안정화제를 사용하는 경우 상기 42~55℃ 단계를 42~50℃ 미만 단계와 50~55℃ 단계를 순차적으로 수행함으로써 RNA에서 cDNA로 전환되는 효율을 더욱 증가시킬 수 있다. 이는 RNA 의존 DNA 폴리머라제의 열안정성을 안정화제에 의해 보완하였으나 유전적으로 내열성을 갖는 효소가 아니므로 고온에서 바로 반응시키는 것 보다는 중간 단계인 42℃~50℃ 미만에서 역전사 반응을 거치게 하는 것이 바람직하기 때문이다. 상기 방법에서, 한 주기는 10~40℃ 단계 10초~5분, 42℃~50℃ 미만 단계 10초~5분 및 50~55℃ 단계 10초~5분을 한 주기로 하여 1~20회로 순환하는 것이 보다 바람직하다.

한편, 안정화제를 사용하지 않는 경우에는, 상기 10~40℃ 단계를 10~25℃에서 상기 42~55℃ 단계를 42~50℃ 미만의 온도에서 각각 수행하는 것이 바람직하다. 상기 방법에서, 한 주기는 10~25℃ 단계 10초~5분 및 42℃~50℃ 미만 단계 10초~5분을 한 주기로 하여 1~20회로 순환하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 온도범위는 종래 RNA 의존 DNA 폴리머라제의 일반적인 반응 온도(42℃ 전후)를 기준으로 비교하여 임의 설정한 것이다. 하지만, 본 발명에 따른 역전사 반응은 상기 언급된 온도 조건이나 조건별 시간에 국한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합할 수 있는 것이라면 온도 조건이나 온도조건별 수행 시간은 변경될 수 있다. 이는 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명한 사항이라 할 수 있는 것이다.

본 발명에서 주형 RNA는 DNA로 증폭하고자 하는 RNA를 말하는 것으로, 시료에서 추출한 총 RNA나 mRNA를 의미한다.

또한, 본 발명에서 RNA 의존 DNA 폴리머라제는 역전사 효소를 말하는 것으 로, 구체적으로 아비안 미엘로블라스토시스 바이러스(avian myeloblastosis virus; AMV), 몰로니 무린 류케미아 바이러스(Moloney murine leukemia virus; MMLV) 및 인간면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus; HIV) 유래의 역전사 효소를 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 50~55℃의 온도에서는 반응을 할 수 없었던 MMLV 역전사 효소가 상기 온도범위에서 반응할 수 있도록 안정화제를 첨가하여 반응 효율을 극대화하고, 반응의 민감도를 높일 수 있게 한 것이다. 안정화제를 사용하지 않는 경우에는 42~50℃ 미만의 온도에서 역전사 효소의 반응을 수행하는 것이 바람직하다.

상기 반응용 완충용액은 사용하는 RNA 의존 DNA 폴리머라제에 적합한 공지된 완충용액을 사용하는 것이 바람직하다. 구체적인 실례로 MMLV 역전사효소에 대한 반응용 완충용액은 Tris-HCl, MgCl₂, DTT(dithiothreitol), KCl를 사용할 수 있다. 하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 따라 RNA 의존 DNA 폴리머라제의 활성 및 안정성에 영향을 미치지 않는 어떠한 종류의 반응용 완충용액을 사용해도 무방하다.

이하, 본 발명은 다음의 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 트랜스페린 수용체 유전자의 길이별 증폭

랜덤 12머(400pmoles/20㎕ 반응액), MMLV 역전사 효소((주)바이오니아; 800U/20㎕ 반응액), 10× 반응 완충용액(2㎕), RNasin(프로메가(Promega); 15U/20㎕ 반응액), 트레할로스(플루카(Fluka); 400mM/20㎕ 반응액), α-MG(메틸-α-D-글루코피라노사이드)(시그마(Sigma); 200mM/20㎕ 반응액) 및 dNTPs(25mM/20㎕ 반응액)을 2× 용액으로 예비혼합하여 스냅스트립 8-스트립 PCR 튜브(SnapStrip 8-strip PCR Tube)(SSI)에 10㎕씩 분주하였다. 이를 감압건조기(센트라 이베퍼레이터(CENTRA Evaporator)™; (주)바이오니아)를 사용하여 실온에서 80분간 건조시켜 튜브 밑면에 랜덤 프라이머를 함유하는 역전사 반응용 건조물을 얻었다. 또한, dT 20머((주)바이오니아; 70pmoles/20㎕ 반응액)를 함유하는 역전사 반응용 건조물을 상기와 동일한 방법으로 제조하였다.

상기와 같이 제조된 랜덤 프라이머를 함유하는 역전사 반응 건조물과 dT 프라이머를 함유하는 역전사 반응 건조물에 각각 HeLa 세포에서 (주)바이오니아의 아큐프렙 티슈 RNA 프렙메이트(AccuPrep Tissue RNA Prepmate)로 분리 정제한 총 RNA 900ng를 가하고, 0.1% DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리한 증류수를 가하여 총 부피 20㎕가 되도록 재수화하여 역전사 반응액을 제조하였다. 제조된 역전사 반응액을 이용하여 기존의 반응 조건 42℃ 30분 및 고온 반응 55℃ 30분, 37℃ 2분, 50℃ 3분을 한 주기로 하여 6회 순환 반응, 37℃ 1분, 47℃ 3분, 55℃ 1분을 한 주기로 하여 6회 순환 반응으로 역전사 반응을 수행하였다. 상기 역전사 반응으로 생성된 cDNA 3㎕를 주형으로 PCR 반응을 수행하여 길이별 트랜스페린 수용체 유전자(800bp, 1.5kb, 2.0kb, 2.6kb)를 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머 서열은 다음 과 같다.

① 800bp

F: 5'-GTG GCG TAT AGT AAG GCT GCA ACA GTT ACT-3'(서열번호 1),

R: 5'-TGC TGG TAC CAA GAA CCG CTT TAT CCA GAT-3'(서열번호 2);

② 1.5kb

F: 5'-GTG GCA GTT CAG AAT GAT GGA TCA AG-3'(서열번호 3),

R: 5'-TGC TGG TAC CAA GAA CCG CTT TAT CCA GAT-3'(서열번호 2);

③ 2.0kb

F: 5'-GTG GCG TAT AGT AAG GCT GCA ACA GTT ACT-3'(서열번호 1),

R: 5'-ACC ACT TAC AAC CTT CAG CAG AGA C-3'(서열번호 4),

④ 2.6kb

F: 5'-GTG GCA GTT CAG AAT GAT GGA TCA AG-3'(서열번호 3),

R: 5'-ACC ACT TAC AAC CTT CAG CAG AGA C-3'(서열번호 4).

PCR 반응은 94℃ 5분 후, 94℃ 40초, 60℃ 40초, 72℃ 1분 30초로 40사이클 후 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다.

이의 결과, 도 1에 도시한 바와 같이, 랜덤 프라이머를 사용한 경우와 dT 프라이머를 사용한 경우 모두 기존의 단일 온도 반응 조건보다, 순환 역전사 반응을 수행한 쪽이 증폭율이 높았고 민감도 면에서도 더 나은 결과를 보였다. 또한, 염기서열의 길이가 긴 경우에도 증폭율과 민감도 면에서 기존의 단일 온도 조건에서 보다 순환적 온도 조건으로 수행한 것이 더 나은 결과를 나타냄을 알 수 있다. 표 1 에 도 1에 대한 설명을 기재하였다.

<실시예 2> dT 프라이머와 주형 RNA의 농도별 순환 역전사 반응 후, GAPDH와 β-액틴의 증폭

dT 프라이머((주)바이오니아; 70pmoles/20㎕ 반응액)를 사용하고 HeLa 세포로부터 분리 정제된 총 RNA를 각각 100ng, 10ng, 1ng 및 100pg으로 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법에 따라 역전사 반응액을 제조하였다. 제조된 역전사 반응액을 이용하여 기존의 단일 온도 조건 42℃ 및 55℃ 1시간 반응, 37℃ 2분, 50℃ 3분을 한 주기로 하여 12회 순환 반응, 37℃ 1분, 47℃ 3분, 55℃ 1분을 한 주기로 하여 12회 순환 반응으로 역전사 반응을 수행하였다. 생성된 cDNA를 2㎕ 취해 PCR 반응의 주형으로 사용하였고 이때 사용한 1kb GAPDH 프라이머와 300bp β-액틴 프라이머의 서열은 다음과 같다.

① 1kb GAPDH

F: 5'-GGA AGG TGA AGG TCG GAG TC-3'(서열번호 5),

R: 5'-CCT GTT CCT GTA GCC AAA TTC G-3'(서열번호 6);

② 300bp β-액틴

F: 5'-GAA GAG CTA CGA GCT GCC TGA C-3'(서열번호 7),

R: 5'-GAG TAC TTG CGC TCA GGA GGA G-3'(서열번호 8).

PCR 반응은 94℃ 5분 후, 94℃ 40초, 57℃ 40초, 72℃ 1분의 35 사이클 후, 72℃ 5분을 수행하였다.

이의 결과, 도 2에 도시한 바와 같이, 기존의 단일 온도 조건 반응보다 순환 역전사 반응 조건에서 더 나은 결과를 보였다. 표 2에 도 2에 대한 설명을 기재하였다.

<실시예 3> 랜덤 프라이머와 주형 RNA의 농도별 순환 역전사 반응 후, GAPDH와 β-액틴의 증폭

랜덤 프라이머((주)바이오니아; 400pmoles/20㎕ 반응액)를 사용하고 HeLa 세포로부터 분리 정제된 총 RNA를 각각 100ng, 10ng, 1ng 및 100pg으로 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법에 따라 역전사 반응액을 제조하였다. 제조된 역전사 반응액을 이용하여 기존의 단일 온도 조건인 42℃ 및 55℃ 1시간 반응, 37℃ 2분, 50℃ 3분을 한 주기로 하여 12회 순환 반응, 37℃ 1분, 47℃ 3분, 55℃ 1분을 한 주기로 하여 12회 순환 반응으로 역전사 반응을 수행하였다. 생성된 cDNA를 2㎕ 취해 PCR 반응의 주형으로 사용하였고 이때 사용한 1kb GAPDH 프라이머와 300bp β-액틴 프라이머의 서열은 실시예 2에서와 같다.

PCR 반응은 94℃ 5분 후, 94℃ 40초, 57℃ 40초, 72℃ 1분의 35 사이클 후 72℃ 5분을 수행하였다.

이의 결과, 도 3에 도시한 바와 같이, 기존의 단일 온도 조건 반응보다 순환 역전사 반응 조건에서 더 나은 결과를 보였다. 표 3에 도 3에 대한 설명을 기재하였다.

<실시예 4> dT20 프라이머와 주형 RNA의 반응시간별 순환 역전사 반응 후, 6kb 인간 ELAVL1 유전자의 5'쪽 600bp 증폭

실시예 1에서와 동일한 방법으로 분리, 정제한 총 RNA 10ng, dT20 프라이머((주)바이오니아; 100pmoles/20㎕ 반응액), MMLV 역전사효소((주)바이오니아; 200U/20㎕ 반응액), 10× 반응 완충용액 2㎕, RNasin(프로메가(Promega); 15U/20㎕ 반응액) 및 베타인(시그마(Sigma); 500mM/20㎕ 반응액)을 혼합하여 역전사 반응액을 제조하였다. 제조된 역전사 반응액을 이용하여 기존의 단일 온도 조건인 42℃ 및 52℃에서, 10분, 20분, 40분, 60분 반응과 37℃ 2분, 50℃ 3분을 한 주기로 하여 2회, 4회, 8회, 12회 순환 반응, 37℃ 1분, 47℃ 3분, 55℃ 1분을 한 주기로 하여 2회, 4회, 8회, 12회 순환 반응으로 역전사 반응을 수행하였다. 생성된 cDNA를 4㎕ 취해 PCR 반응의 주형으로 사용하였고 이때 사용한 ELAVL1 프라이머 서열은 다음과 같다.

인간 ELAVL1

F:　５'-TTT GTT CTG GTT GGG GTT GG-3'(서열번호 9)

R:　５'-CCC GCA TCC AGA TTT TTG AA-3'(서열번호 10)

PCR 반응은 94℃ 5분 후, 94℃ 1분 57℃ 분 72℃ 1분의 40 사이클 후 72℃ 5분을 수행하였다.

이의 결과, 도 4에 도시한 바와 같이, ELAVL1과 같은 긴 길이의 인간 cDNA 합성에 있어 기존의 단일 온도 조건 반응보다 순환적 역전사 반응이 비특이적 PCR 밴드 생성이 적고 증폭양도 더 많은 결과를 보였다. 표 4에 도 4에 대한 설명을 나타내었다.

<실시예 5> dT20 프라이머와 주형 RNA의 반응시간별 순환 역전사 반응 후, 인간 GAPDH 유전자의 증폭

실시예 1에서와 동일한 방법으로 분리, 정제한 총 RNA 10ng, dT20 프라이머((주)바이오니아; 100pmoles/20㎕ 반응액), MMLV 역전사효소((주)바이오니아; 200U/20㎕ 반응액), 10× 반응 완충용액 2㎕, RNasin(프로메가(Promega); 15U/20㎕ 반응액) 및 베타인(시그마(Sigma); 500mM/20㎕ 반응액)을 혼합하여 역전사 반응액을 제조하였다. 제조된 역전사 반응액을 이용하여 기존의 단일 온도 조건인 42℃ 10분, 20분, 40분, 60분 반응과 37℃ 30초, 42℃ 4분, 47℃ 5분, 55℃ 30초를 한 주기로 1회, 2회, 4회, 6회 순환 역전사 반응한 후, 반응물 2㎕를 취하여 인간 GAPDH 프라이머 세트로 PCR 반응하였다. PCR 반응은 94℃ 5분 후, 94℃ 40초, 57℃ 40초, 72℃ 1분을 25 사이클로 한 후, 72℃ 5분 반응하였다. 이때 사용한 GAPDH 프라이머의 서열은 실시예 2에서와 같다.

이의 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, 기존의 단일 온도 반응인 42℃ 1시간 반응보다 설정한 순환 역전사 반응이 짧은 반응 시간 및 소량의 주형 RNA에서도 높은 증폭율을 보였다. 표 5a에 도 5a에 대한 설명을 기재하고, 표 5b에 도 5b에 대한 설명을 기재하였다.

<실시예 6> 랜덤 6머, 랜덤 9머 및 dT15 프라이머와 주형 RNA의 반응시간별 순환 역전사 반응 후, 인간 GAPDH 유전자의 증폭

MMLV 역전사 효소((주)바이오니아; 200U/20㎕ 반응액), 10× 반응 완충용액(2㎕), RNasin(프로메가; 15U/20㎕ 반응액) 및 dNTPs(25mM/20㎕ 반응액)을 2× 용액으로 예비 혼합하여 스냅스트립 8-스트립 PCR 튜브(SSI)에 10㎕씩 분주하였다. 이를 감압건조기(센트라 이베퍼레이터™; (주)바이오니아)를 사용하여 실온에서 80분간 건조시켜 튜브 밑면에 역전사 반응용 건조물을 얻었다. 역전사 반응용 프라이머로 랜덤 6머, 랜덤 9머 및 dT15((주)바이오니아; 랜덤 프라이머 200pmoles/20㎕ 반응액, dT15 프라이머 100pmole/20㎕ 반응액)를 사용하고 HeLa 세포로부터 분리 정제된 총 RNA를 각각 100ng, 10ng, 1ng 및 100pg로 희석하고 이들을 주형으로 사용하여 건조물을 재수화하였다. 재수화한 역전사 반응액을 이용하여 기존의 단일 온도 조건인 42℃ 1시간 반응과 12℃ 1분, 42℃ 4분을 한 주기로 하여 12회 순환 반응으로 역전사 반응을 수행하였다. 생성된 cDNA 2㎕를 PCR 반응의 주형으로 사용하였고 이때 사용한 1kb GAPDH 프라이머의 서열은 실시예 2에서와 같다.

이의 결과, 도 6에 도시한 바와 같이, 기존의 단일 온도 조건 반응보다 순환 역전사 반응 조건에서 더 나은 결과를 보였다. 표 6에 도 6에 대한 설명을 기재하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 기존의 단일 온도 조건의 역전사 반응 온도 조건보다 프라이머가 어닐링할 수 있는 온도 조건과 주형 RNA의 2차 구조를 해소하고 역전사 효소가 반응할 수 있는 온도 조건을 주기로 순환 역전사 반응을 하는 것이 반응의 효율을 극대화하여 반응의 민감도 및 증폭율을 증가시켰다.

<110> BIONEER CORPORATION <120> Cyclic reverse transcription method <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for transferrin receptor gene <400> 1 gtggcgtata gtaaggctgc aacagttact 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for transferrin receptor gene <400> 2 tgctggtacc aagaaccgct ttatccagat 30 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for transferrin receptor gene <400> 3 gtggcagttc agaatgatgg atcaag 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for transferrin receptor gene <400> 4 accacttaca accttcagca gagac 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH gene <400> 5 ggaaggtgaa ggtcggagtc 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH gene <400> 6 cctgttcctg tagccaaatt cg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for b-actin gene <400> 7 gaagagctac gagctgcctg ac 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for b-actin gene <400> 8 gagtacttgc gctcaggagg ag 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ELAVL1 gene <400> 9 tttgttctgg ttggggttgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ELAVL1 gene <400> 10 cccgcatcca gatttttgaa 20

Claims

(ⅰ) 주형 RNA, RNA 의존 DNA 폴리머라제, 반응용 완충용액, 역전사 반응용 프라이머, 및 dNTPs를 포함하는 역전사 반응액을 이용하여 10~40℃의 온도에서 반응을 수행하는 단계; 및

(ⅱ) 상기 반응을 수행한 반응액을 이용하여 42~55℃의 온도에서 반응을 수행하는 단계:

를 포함하는 주기로 역전사 반응을 수행하되, 상기 주기를 2회 이상 수행하는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 1 항에 있어서,

역전사 반응액이 안정화제를 포함하는 경우, 단계 (ⅱ)에서 50~55℃의 온도에서 반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 2 항에 있어서,

10~40℃ 반응 10초~5분 및 50~55℃ 반응 10초~5분의 주기를 2~20회로 수행하는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 2 항에 있어서,

단계 (ⅱ)에서 42~50℃ 미만 반응 및 50~55℃ 반응을 순차적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 4 항에 있어서, 10~40℃ 반응 10초~5분, 42~50℃ 미만 반응 10초~5분 및 50~55℃ 반응 10초~5분의 주기를 2~20회로 수행하는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 1 항에 있어서,

단계 (ⅰ)에서 10~25℃의 온도에서 반응을 수행하고, 단계 (ⅱ)에서 42~50℃ 미만의 온도에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 6 항에 있어서,

10~25℃ 반응 10초~5분 및 42~50℃ 미만 반응 10초~5분의 주기를 2~20회로 수행하는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 RNA 의존 DNA 폴리머라제는 몰로니 무린 류케미아 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus; MMLV) 역전사 효소인 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 역전사 반응용 프라이머는 5~15머의 랜덤 프라이머 또는 14~23머의 dT 프라이머인 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 1 항에 있어서,

역전사 반응액이 수용액 상으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 10 항에 있어서,

안정화제가 트레할로스, 디메틸설폭사이드, 베타인, 우혈청알부민 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 1 항에 있어서,

역전사 반응액이 주형 RNA를 제외한 성분들을 혼합하여 건조한 후, 건조물에 주형 RNA와 안정화제를 가하여 재수화하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 1 항에 있어서,

역전사 반응액이 주형 RNA를 제외하고 추가로 RNA 의존 DNA 폴리머라제, 반응용 완충용액, 역전사 반응용 프라이머, dNTPs 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 성분을 제외한 성분들을 혼합하여 건조한 후, 건조물에 상기 제외된 성분들과 안정화제를 가하여 재수화하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
제 2 항에 있어서,

안정화제가 트레할로스를 포함하는 것을 특징으로 하는, 순환적 역전사 방법.
(ⅰ) 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 순환적 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 제조하는 단계; 및

(ⅱ) 주형으로 상기 cDNA를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계:

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 역전사 중합효소연쇄반응 방법.