JP7143596B2 - 核酸抽出および増幅試薬 - Google Patents

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Description

本発明は、簡便、迅速かつ高効率に核酸を抽出して増幅するための試薬、および前記試薬を用いた核酸抽出および増幅方法に関する。
感染症の臨床検査分野においては、簡便、迅速かつ高感度に病原体を検出することが重要であり、迅速検査キットが広く普及している。高感度に病原体を検出する方法として、核酸増幅法を利用した検出法が知られている。核酸増幅法を利用した検出法で病原体の検出を行なう際は、一般に病原体を含む試料から核酸を抽出する操作を事前に行なう。このとき、界面活性剤を用いて病原体から核酸を抽出した後、シクロデキストリンを用いて界面活性剤の核酸増幅反応に対する阻害作用を中和して核酸増幅工程に供する方法が知られている。
特許文献１では、官能基により修飾されたα、β、γ－シクロデキストリン誘導体が核酸増幅反応用試薬の成分として列挙され、官能基として炭素数１～４のヒドロキシアルキル基等が例示されている。また２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えてデオキシコール酸Ｎａ等の界面活性剤の共存下にＰＣＲを行い、シクロデキストリンの添加により阻害作用に対するＤＮＡポリメラーゼの耐性向上が記載されている。しかしながら、具体的にシクロデキストリンとして炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンは記載されていない。
特開２０１４－１９８０２９号公報
本発明の目的は、簡便、迅速および高効率に微生物等の核酸抽出対象核酸を抽出し、かつ該核酸増幅反応の阻害を最小限とすることを特徴とする、核酸抽出および増幅試薬を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の態様を包含する。
＜１＞以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む、核酸抽出対象を含む試料から当該核酸抽出対象の核酸を抽出および増幅するためのキットであって、
前記核酸抽出対象が、微生物、動物細胞、植物細胞、及び細胞外小胞から選択される、キット。
（ｉ）ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含む核酸抽出試薬
（ｉｉ）炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリン
（ｉｉｉ）核酸増幅試薬
＜２＞炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンが、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンである、＜１＞に記載のキット。
＜３＞炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンが核酸増幅試薬に含まれている、＜１＞又は＜２＞に記載のキット。
＜４＞炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンの濃度が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度の４倍以上である、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のキット。
＜５＞前記核酸抽出対象が、微生物である、＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のキット。
＜６＞以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の工程を含む、核酸抽出対象を含む試料から当該核酸抽出対象の核酸を抽出および増幅する方法であって、
前記核酸抽出対象が、微生物、動物細胞、植物細胞、及び細胞外小胞から選択される、方法。
（ｉ）核酸抽出対象を含む試料を、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含む核酸抽出試薬と接触させ、核酸抽出液を得る核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって得られた核酸抽出液を、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンと接触させる工程
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた溶液を核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程
＜７＞以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、核酸抽出対象を含む試料から当該核酸抽出対象の核酸を抽出および増幅する方法であって、
前記核酸抽出対象が、微生物、動物細胞、植物細胞、及び細胞外小胞から選択される、方法。
（ｉ）核酸抽出対象を含む試料を、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含む核酸抽出試薬と接触させ、核酸抽出液を得る核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって得られた核酸抽出液を、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程
＜８＞前記核酸抽出対象が、微生物である、＜６＞または＜７＞に記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においてステロイド骨格を有する界面活性剤とは、シクロペンタノペルヒドロフェナントレン構造を有する化合物であり、界面活性作用を有するものである。天然に存在するステロイド骨格を有する界面活性剤としては、胆汁酸が例示される。胆汁酸はコラン酸骨格を持つステロイド誘導体であり、しばしばグリシンやタウリンと結合して抱合胆汁酸を形成する。天然に存在する胆汁酸および胆汁酸誘導体の一例として、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びそれらの塩等が例示できる。塩としては特に限定されるものではないが、例えばナトリウム塩等をあげることができる。また、本発明における界面活性剤は天然に存在するステロイド誘導体や胆汁酸誘導体に限らず、人工的に合成したステロイド骨格やコラン酸骨格を有する界面活性剤でもよい。中でも、本発明における好適な界面活性剤としてコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸及びそれらの塩が、より好ましくはコール酸及びその塩、特にコール酸ナトリウムが例示される。なお、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度については特に限定しないが、微生物等の核酸抽出対象から核酸を抽出する際の濃度は、好ましくは０．４（ｗ／ｗ）％以上、より好ましくは１．０（ｗ／ｗ）％以上、さらに好ましくは１．５（ｗ／ｗ）％以上である。また上限は特に限定されるものではないが、好ましくは１０．０（ｗ／ｗ）％以下、より好ましくは５．０（ｗ／ｗ）％以下、更に好ましくは３．０（ｗ／ｗ）％以下である。
本発明の核酸抽出対象は、微生物、動物細胞、植物細胞、及び細胞外小胞等が挙げられ、生物に限定されず、核酸が膜に包まれた状態のものを広く包含する。とりわけ、ステロイド骨格を有する界面活性剤により抽出されるものが好ましい。さらに抽出の際に細胞壁分解酵素や、タンパク質分解酵素、リン脂質分解酵素等を用いて抽出を促進してもよく、さらにジルコニア粉末や加熱、pH変化、浸透圧等の物理的な作用により抽出を促進することも好ましい。
ここで核酸はＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよく、膜はカプシド、細胞壁の他、エンベロープ、細胞膜等の脂質二重膜等が挙げられる。また、微生物としては、ウイルス、マイコプラズマ、細菌、菌等が挙げられる。抽出対象として好ましくはウイルス及びマイコプラズマが挙げられる。ウイルスは、カプシドと呼ばれるタンパク質の殻により核酸が包接された構造を有し、構造上、従来の抽出法では核酸抽出が困難であったが、本発明の抽出法を適用することで簡便かつ迅速に核酸抽出を行うことができる。抽出対象のウイルスの種類は限定されないが、好ましい抽出対象の一例として、エンベロープを有するウイルスや一本鎖ＲＮＡを有するウイルスが例示される。エンベロープを有するウイルスとは、ウイルスカプシドが主に脂質から構成されるエンベロープにより覆われたウイルスのことをいい、一例として、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）があげられる。一本鎖ＲＮＡを有するウイルスとは、ボルティモア分類における第４群（１本鎖ＲＮＡ ＋鎖）、第５群（１本鎖ＲＮＡ －鎖）、第６群（１本鎖ＲＮＡ 逆転写）に属するウイルスであり、一例として、コロナウイルス、ＲＳウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、インフルエンザウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）があげられる。一本鎖ＲＮＡを有するウイルスは、ＴＲＣ法等のＲＮＡを出発物質とする核酸増幅法に適する点で好ましい。中でもインフルエンザウイルスは、本発明の抽出試薬における抽出対象ウイルスとして特に好ましい。
本発明中においてマイコプラズマとは、マイコプラズマ属に属するものでありマイコプラズマ・ハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アコレプラズマ・レイドロウイ（Ａｃｈｅｌｏｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・オラーレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ）、スピロプラズマ・シトリ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｃｉｔｒｉ）、マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、およびマイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）等が例示できる。
本発明においてマイコプラズマ核酸とは、マイコプラズマの持つ核酸をいい、ゲノム、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ等が例示できる。１細胞当りのコピー数と配列特異性から特にｒＲＮＡが好ましく、２３Ｓ ｒＲＮＡが最も好ましい。
本発明において核酸抽出対象を含む試料とは、単に核酸抽出対象を水、生理食塩水や緩衝液に溶解したものや、核酸抽出対象を含んだ生体試料そのものや、前記生体試料を含んだ濾紙、スワブ等があげられる。前記生体試料の一例として、血液、糞便、尿、痰、リンパ液、血漿、射精液、肺吸引物、脳脊髄液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、うがい液、唾液、涙液があげられる。
本発明の核酸抽出試薬は、ステロイド骨格を有する界面活性剤の他に、種々の成分をさらに含んでいてもよい。後の核酸増幅反応に必要な成分、例えば酵素や、マグネシウム塩、カリウム塩等の塩類や、トレハロース等の糖類や、グリセロール等の糖アルコールや、核酸成分や、有機溶媒等を含むことは、核酸抽出工程から核酸増幅工程に至る操作を簡略化できる意味で好ましい。中でも有機溶媒は、核酸の抽出を促進させる効果を有している点で特に好ましい。本発明の抽出試薬にさらに含ませる有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を例示できる。また、ステロイド骨格を有する界面活性剤の他に、さらに１種類以上の界面活性剤やタンパク質変性剤を、核酸増幅反応を妨害しない範囲で添加することもできる。添加する界面活性剤の一例として、ＳＤＳ等の陰イオン界面活性剤や、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）等の両イオン界面活性剤や、Ｓｐａｎ ２０（シグマアルドリッチ製）、ＭＥＧＡ－８（シグマアルドリッチ製）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ ２０（シグマアルドリッチ製）、Ｔｗｅｅｎ ４０（シグマアルドリッチ製）、Ｔｗｅｅｎ ６０（シグマアルドリッチ製）、Ｔｗｅｅｎ ８０（シグマアルドリッチ製）等）等の非イオン性界面活性剤があげられる。中でも非イオン性界面活性剤は、核酸の抽出を促進する効果を有する点や、核酸増幅反応への影響が少ない点で好ましい。添加する界面活性剤の一例として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ２０（シグマアルドリッチ製）を例示できる。
本発明の核酸抽出試薬を用いて、核酸抽出対象を含む試料から当該核酸抽出対象の核酸を抽出するには、単に本発明の核酸抽出試薬と核酸抽出対象を含む試料とを接触させればよい。接触時間は核酸抽出対象を含む試料の性状、試料中の核酸抽出対象濃度、核酸抽出試薬に含まれる成分等を考慮し、適宜決定すればよいが、多くの場合接触後４分以内で十分に核酸抽出対象核酸を抽出でき、接触後すぐにシクロデキストリン誘導体と接触させる工程等の後工程へ供することもできる。
本発明の核酸抽出及び増幅方法において、核酸抽出対象の核酸抽出液は、核酸抽出対象を含む試料と核酸抽出試薬を用いることによって得られる。次いで、該核酸抽出液と、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンと接触させることで、核酸抽出液中のステロイド骨格を有する界面活性剤が炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンに包接され、核酸増幅反応への阻害作用が緩和される。従って、本発明の核酸抽出および増幅方法によれば、核酸抽出工程で得られた核酸抽出液を、簡便に増幅工程に供することができる。
炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンとしては、特に限定はされないが、例えば
１－ヒドロキシメチル基
１－ヒドロキシエチル基
２－ヒドロキシエチル基
１－ヒドロキシプロピル基
２－ヒドロキシプロピル基
３－ヒドロキシプロピル基
２－ヒドロキシ－１－メチル－エチル基
１－ヒドロキシブチル基
２－ヒドロキシブチル基
３－ヒドロキシブチル基
４－ヒドロキシブチル基
１－ヒドロキシ－２－メチル－プロピル基
２－ヒドロキシ－１－メチル－プロピル基
３－ヒドロキシ－１－メチル－プロピル基
１－ヒドロキシ－２－メチル－エチル基
２－ヒドロキシ－１，２－ジメチル－エチル基
１，２－ジヒドロキシ－エチル基
１，２－ジヒドロキシ－プロピル基
２，３－ジヒドロキシ－プロピル基
１，２－ジヒドロキシ－ブチル基
２，３－ジヒドロキシ－ブチル基
３，４－ジヒドロキシ－ブチル基
１，２，３－トリヒドロキシ－ブチル基
２，３－ジヒドロキシ－１－メチル－プロピル基
等を有するγ－シクロデキストリンがあげられる。中でも１－ヒドロキシプロピル基、２－ヒドロキシプロピル基、３－ヒドロキシプロピル基が好ましく、とりわけ２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンが好ましい。
また、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンは、溶液状や固体状等、いずれの性状であってもよい。さらに、本発明の核酸抽出液と炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンを接触させる際には、同時に、他の種々の成分をも接触させてもよい。
炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンは、微生物核酸抽出試薬と核酸抽出対象を含む試料とを接触させた後得られた核酸抽出液に接触させるが、核酸増幅試薬と接触させる前に、またはそれと同時に接触させればよく、必要な抽出効率に応じて上述の範囲内で適宜選択することができる。特に本発明の好適な実施形態の一例として炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンと核酸抽出液との接触を、核酸増幅試薬と接触させるのと同時に行う方法が例示できる。さらに、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンは、核酸増幅試薬と同時に加えられることは操作を簡便にする観点からさらに好ましいため、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬を用いることも出来る。
なお、核酸増幅試薬には、核酸増幅反応に必要な成分が含まれ、例えば酵素、マグネシウム塩、カリウム塩等の塩類、トレハロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、核酸成分、有機溶媒、プライマーやプローブ等の核酸類、緩衝液成分等を含むことができる。本発明の好適な実施形態の一例として、ステロイド骨格を有する界面活性剤を含む核酸抽出試薬により核酸抽出対象の核酸を抽出し、得られた核酸抽出液を炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬へ添加することで核酸増幅反応を行う試薬があげられる。なお、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンの濃度については特に限定しないが、好ましくはステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度の４倍以上、より好ましくは５倍以上である。上限は特に限定されるものではないが、好ましくは１３倍以下、更に好ましくは８倍以下である。
本発明における核酸増幅法は、いずれの核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法）であってもよい。等温で核酸増幅を行う方法は、温度の昇降を行う比較的複雑な装置が不要である点で好ましい。このような核酸増幅法として、核酸抽出対象の核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、核酸抽出対象の核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、標的核酸を増幅する方法であって、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応したプロモーター配列を付加している方法（例えば、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法）が例示される。当該方法は一本鎖ＲＮＡを標的として核酸増幅する方法であるが、特開２０１５－１１６３６号公報等に開示される方法を用いることで、二本鎖ＤＮＡ等を増幅することもできる。
本発明における核酸増幅試薬は、乾燥形態であってもよい。核酸増幅試薬には酵素が含まれるため、乾燥状態にすることで液状の場合よりも保存期間を延ばし、保存に適する温度もより室温に近い状態にすることが出来る。さらに乾燥状態にすることで輸送や使う際に操作し易いという利点がある。
乾燥形態とする方法としては酵素の活性を失わない方法であればいずれの方法であってもよく、凍結乾燥法、蒸発乾燥法等を例示できる。
本発明により、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基を有するγ－シクロデキストリンと界面活性剤を接触させることで、他のシクロデキストリン誘導体と接触させた場合と比べて、極めて高い効率で界面活性剤による酵素反応への阻害作用を低減させることができる。従って、本発明の核酸抽出および増幅方法によれば、核酸抽出工程で得られた核酸抽出液を、簡便に増幅工程に供することができる。
以下、核酸抽出対象としてインフルエンザウイルスまたはマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を用いたときの実施例および参考例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら例により限定されるものではない。
実施例１ 標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したプライマー、インフルエンザウイルスＲＮＡ（以下、標準ＲＮＡと表記）及びインターカレーター性蛍光色素標準核酸プローブは特開２０１６－１３１４９８号公報に記載の方法で調製した。
実施例２ シクロデキストリン誘導体の包摂効果
以下の方法により、シクロデキストリン誘導体による界面活性剤の包接効果を調べた。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを、注射用水を用いて１０３コピー／２．５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）（１）で調製したＲＮＡ試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４４．４ｍＭ 塩化マグネシウム
１１０ｍＭ 塩化カリウム
２．４％ グリセロール
２２．０％ ＤＭＳＯ
０．１％ （ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０
１．５％ （ｗ／ｗ）コール酸ナトリウム。
（３）以下の組成からなるシクロデキストリン誘導体を含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表１に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表１に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号３）が付加されている。
Figure 0007143596000001
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．７ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製）
表１に記載の濃度の第一のプライマー（Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）用）
表１に記載の濃度の第二のプライマー（Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）用）
表２から表１１にそれぞれ記載の濃度のシクロデキストリン誘導体。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ－１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。試薬混合時を０分として、陽性判定が得られるまでに要した時間を検出時間とした。
結果を表２から表１１に示す。
Figure 0007143596000002
Figure 0007143596000003
Figure 0007143596000004
Figure 0007143596000005
Figure 0007143596000006
Figure 0007143596000007
Figure 0007143596000008
Figure 0007143596000009
Figure 0007143596000010
Figure 0007143596000011
表２，３の２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンでは６．８％（ｗ／ｗ）以上で包接効果が認められ、１０％（ｗ／ｗ）が陽性判定となる時間が最も短く効果が高いことが認められ、８％（ｗ／ｗ）においても６．８％（ｗ／ｗ）γ－シクロデキストリンよりも高い効果が認められた。
表４の２－ヒドロキシエチル－β－シクロデキストリンでは、１２％（ｗ／ｗ）以上で包接効果が認められ、１４％（ｗ／ｗ）が陽性判定となる時間が最も短く効果が高いことが認められたが、６．８％（ｗ／ｗ） γ－シクロデキストリンよりも陽性判定時間が短くなることは無かった。
表５の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンでは１０％（ｗ／ｗ）以上で包接効果が認められ、１４％（ｗ／ｗ）が陽性判定となる時間が最も短く効果が高いことが認められたが６．８％（ｗ／ｗ） γ－シクロデキストリンよりも陽性判定時間が短くなることは無かった。
表６のメチル－β－シクロデキストリン、表７の２－ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン、表８のモノアセチル－β－シクロデキストリン、表９の３Ａ－アミノ－３Ａ－デオキシ－（２ＡＳ，３ＡＳ）－γ－シクロデキストリン、表１０のモノ－２－Ｏ－（ｐ－トルエンスルホニル）－γ－シクロデキストリン、および表１１のγ－シクロデキストリンフォスフェートでは各表記載のいずれの濃度でも包接効果が認められなかった。
実施例３ 蒸発乾燥増幅試薬の調製方法
以下の組成からなる２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンを含む試薬液１８．５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、Ｖｉｒｔｉｓ ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｐｌｕｓにて、２５℃ １００ｔｏｒｒ１６時間、５０℃ １．５時間、２５℃ で庫内温度が落ち着くまで蒸発乾燥した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表１に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを適宜用いた。具体的には、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）検出用試薬の作成においては配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用い、Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）検出用試薬の作成においては配列番号４の塩基配列からなるプライマーと配列番号５の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用い、Ｂ型検出用試薬の作成においては配列番号６の塩基配列からなるプライマーと配列番号７の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表１に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号３）が付加されている。乾燥後の増幅試薬は密栓した上で乾燥剤と共に４℃で保存した。
試薬液の組成：濃度はＴＲＣ反応（３０μＬ中）の最終濃度
６ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．７ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
１９８．９ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製）
表１に記載の濃度の第一のプライマー
表１に記載の濃度の第二のプライマー
５．２％（ｗ／ｗ）、６．７％（ｗ／ｗ）、８．２％（ｗ／ｗ）、９．７％（ｗ／ｗ）、１１．２％（ｗ／ｗ）、１２．７％（ｗ／ｗ）の各濃度の２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン。
実施例４ 蒸発乾燥増幅試薬の評価
以下の方法により、本発明におけるシクロデキストリン誘導体を含んだ蒸発乾燥増幅試薬の評価を実施した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを、注射用水を用いて１０３コピー／２．５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）（１）で調製したＲＮＡ試料 ２．５μＬを、以下の組成からなるウイルス抽出液 ２７．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温した。
ウイルス抽出液の組成： 濃度はＲＮＡ試料２．５μＬを加えた時（３０μＬ中）の最終濃度
２２．２ｍＭ 塩化マグネシウム
５５．０ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１１．０％ ＤＭＳＯ
０．０５％ （ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０
１．５％ （ｗ／ｗ）コール酸ナトリウム
５４ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
４ｍＭ Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
３ｍＭ ＫＯＨ
（３）（２）のウイルス抽出液を実施例３で作製した蒸発乾燥増幅試薬（Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）用）に３０μＬ添加、混合した。
（４）実施例２（４）と同様にして測定した。結果を表１２に示す。
Figure 0007143596000012
蒸発乾燥増幅試薬は５．２％以上の２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン濃度においてＴＲＣ反応が確認でき、８．２％が最も早い検出時間を示した。
実施例５ 蒸発乾燥増幅試薬によるインフルエンザウイルスの検出感度
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬を用いて、各種インフルエンザウイルスの検出を行った。
（１）表１３に示すインフルエンザウイルスを、注射用水で表１４に記載の濃度に希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料５０μＬを、以下の組成からなるウイルス抽出液１０００μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温した。
ウイルス抽出液の組成：
２２．２ｍＭ 塩化マグネシウム
７５．０ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１１．０％ ＤＭＳＯ
０．０５％ （ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０
１．５％ （ｗ／ｗ）コール酸ナトリウム
５４ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
４ｍＭ Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ３ｍＭ ＫＯＨ
（３）（２）のウイルス抽出液を実施例３で作製した８．２％の２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンを含む蒸発乾燥試薬（Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）検出用試薬、Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）検出用試薬、およびＢ型検出用試薬）に３０μＬ添加、混合した。
（４）実施例２（４）と同様にして測定した。結果を表１４に示す。
Figure 0007143596000013
Figure 0007143596000014
その結果、本発明の核酸抽出／増幅試薬を用いて、各種インフルエンザウイルスを検出できることが示された。
実施例６ シクロデキストリン誘導体の性能比較
以下の方法により、本発明におけるシクロデキストリン誘導体の性能を比較した。
（１）実施例３に記載の方法で８．２％の２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンを含む蒸発乾燥試薬を調製した。また、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンの代わりに８．２％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む蒸発乾燥試薬、及び２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンの代わりに８．２％の２－ヒドロキシエチル－β－シクロデキストリンを含む蒸発乾燥試薬をそれぞれ調製した。
（２）実施例５（１）および（２）に記載の方法でＨ１Ｎ１のウイルス抽出液を調整した。
（３）上記のウイルス抽出液を（１）の３種類の蒸発乾燥試薬にそれぞれ３０μＬずつ添加、混合した。
（４）実施例２（４）と同様に測定した。
結果を表１５に示す。
Figure 0007143596000015
その結果、２－ヒドロキシエチル－β－シクロデキストリンでは包摂効果は確認できず検出ができない結果であった。２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンは検出が確認できた。３分台で検出できたウイルス濃度は、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンが１０００ ＴＣＩＤ５０／ｍＬなのに対し、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンは１００ ＴＣＩＤ５０／ｍＬと１０倍優れた検出性能を示した。
実施例７ 標準ＲＮＡ調製
後述の実施例で使用する、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の標準試料を以下に示す方法で調製した。
マイコプラズマ・ニューモニエ培養液
「マイコプラズマ肺炎検査マニュアル」（国立感染症研究所、平成23年9月）に記載の方法に従ってブドウ糖添加Ｈａｙｆｌｉｃｋ辺法液体培地を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを培養した。培養液は無菌的に分注し－８０℃で保存した。調整した培養液はブドウ糖添加Ｈａｙｆｌｉｃｋ辺法寒天培地を用いてＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／ｍＬを算出した。
実施例８ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００－３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１９３番目から２２０８番目までの塩基配列）のオリゴヌクレオチドの５’末端から４番目のグアニンと５番目のシトシンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。
実施例９ マイコプラズマ・ニューモニエの検出
表１６に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせを用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１６に記載のＩＮＡＦプローブは実施例８で作製したプローブである。
（１）実施例７で調製した標準試料を表１７に示した終濃度（ＣＦＵ／テスト）になるように、それぞれ生理食塩水で希釈し、これらを検出試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
増幅試薬の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
１５０ｍＭ トレハロース
各０．４８ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２ ．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．２ｍＭ ＩＴＰ
０．２μＭ 第一のプライマー（配列番号９）
０．２μＭ 第二のプライマー（配列番号１０）
１００ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
８．２％（ｗ／ｖ）２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン
（３）（１）で調製した検体試料 １μＬを、以下の組成からなるマイコプラズマ抽出液 ２９μＬに添加、撹拌し、４６℃で１分間保温した。
マイコプラズマ抽出液の組成： 濃度は検出試料１μＬを加えた時（３０μＬ中）の最終濃度
２１．０ｍＭ 塩化マグネシウム
５０．０ｍＭ 塩化カリウム
１０．０７％ ＤＭＳＯ
０．０５％ （ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０
１．５％ （ｗ／ｗ）コール酸ナトリウム
（４）（３）のマイコプラズマ抽出液を（２）で作製した蒸発乾燥増幅試薬（マイコプラズマ・ニューモニエ用）に３０μＬ添加、混合した。
（５）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。
マイコプラズマ抽出液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１７に示す。表１７の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．５以下（陰性判定）であったことを意味する。
その結果、本法を用いてマイコプラズマ・ニューモニエの２３Ｓ ｒＲＮＡを迅速かつ高感度に検出可能であることが示された。
Figure 0007143596000016
Figure 0007143596000017
比較例１ マイコプラズマ・ニューモニエの検出におけるシクロデキストリン誘導体の検討
２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンの代わりに、表１８に示すシクロデキストリン誘導体を用いた以外は、実施例９と同様に、表１６に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせを用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１６に記載のＩＮＡＦプローブは実施例８で作製したプローブである。
（１）実施例７で調製した標準試料を表１７に示した終濃度（ＣＦＵ／テスト）になるように、それぞれ生理食塩水で希釈し、これらを検出試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
増幅試薬の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
１５０ｍＭ トレハロース
各０．４８ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２ ．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．２ｍＭ ＩＴＰ
０．２μＭ 第一のプライマー（配列番号９）
０．２μＭ 第二のプライマー（配列番号１０）
１００ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
表１８に示すシクロデキストリン誘導体
（３）（１）で調製した検体試料 １μＬ（１０００CFU/テスト）を、以下の組成からなるマイコプラズマ抽出液 ２９μＬに添加、撹拌し、４６℃で１分間保温した。
マイコプラズマ抽出液の組成： 濃度は検出試料１μＬを加えた時（３０μＬ中）の最終濃度
２１．０ｍＭ 塩化マグネシウム
５０．０ｍＭ 塩化カリウム
１０．０７％ ＤＭＳＯ
０．０５％ （ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０
１．５％ （ｗ／ｗ）コール酸ナトリウム
（４）（３）のマイコプラズマ抽出液を（２）で作製した蒸発乾燥増幅試薬（マイコプラズマ・ニューモニエ用）に３０μＬ添加、混合した。
（５）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。
マイコプラズマ抽出液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１８に示す。表１８の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．５以下（陰性判定）であったことを意味する。
その結果、γ－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ以外では陰性判定となり測定できなかった。γ－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎの検出時間は８．８９分と２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンと比較して効果が低いことが判った。
Figure 0007143596000018
実施例１０ リアルタイムＰＣＲ
以下の方法により、リアルタイムＰＣＲにおけるコール酸ナトリウムによる反応阻害と２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンによる反応阻害からの回復を評価した。
（１）表１９に記載の反応組成で試薬を９６ウェルのＰＣＲプレート（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上に調整し８ｃａｐ ｓｔｒｉｐ（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で密閉した。
（２）次にＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ５（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、９５℃で３０秒加熱後、４０サイクル（９５℃で１０秒、６０℃で３４℃）の増幅反応を行いＣｔ値を算出した。その結果を表２０に示した。
その結果、コール酸ナトリウムは少なくとも０．５％以上含まれた場合、リアルタイムＰＣＲを完全に阻害した。一方で１．５％のコール酸ナトリウムを加えた場合でも８．２％の２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンを加えることで反応阻害が軽減されリアルタイムＰＣＲが実施可能であることが示された。
以上の結果から、本発明における核酸増幅がリアルタイムＰＣＲにも適応できることを確認した。
Figure 0007143596000019
Figure 0007143596000020
実施例１１ ウイルスを用いたリアルタイムＰＣＲ
以下の方法により、ウイルスを用いてリアルタイムＰＣＲにおけるコール酸ナトリウムによる反応阻害と２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンによる反応阻害からの回復を評価した。
（１）表１３に示すインフルエンザウイルスのうち、Ｈ３Ｎ２型（濃度１０５．３９ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）１０μＬを、１０００μＬのコール酸ナトリウム水溶液（濃度３０．６％（ｗ／ｗ））に混合し、ウイルス抽出液とした。
（２）続いて表２１に記載の反応組成で試薬を９６ウェルのＰＣＲプレート（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上に調整し８ｃａｐ ｓｔｒｉｐ（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で密閉した。
（３）次にＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ５（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、４２℃で５分加熱後、９５℃で１０秒加熱後、４０サイクル（９５℃で１０秒、６０℃で３４℃）の増幅反応を行いＣｔ値を算出した。その結果を表２２に示した。
その結果、ウイルスからコール酸ナトリウムにより核酸を抽出した場合、ワンステップリアルタイムＰＣＲは阻害されるが、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンを加えることで反応阻害から回復することが示された。
以上の結果から、本発明における核酸増幅がリアルタイムＰＣＲにも適応できることを確認した。
Figure 0007143596000021
Figure 0007143596000022

Claims (7)

  1. 以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む、核酸抽出対象を含む試料から当該核酸
    抽出対象の核酸を抽出および増幅するためのキットであって、
    前記核酸抽出対象が、微生物、動物細胞、植物細胞、及び細胞外小胞から選択される、
    キット。
    （ｉ）ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含む核酸抽出試薬
    （ｉｉ）２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン
    （ｉｉｉ）核酸増幅試薬
  2. ２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンが核酸増幅試薬に含まれている、請求項１に記載のキット。
  3. ２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンの濃度が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度の４倍以上である、請求項１から２のいずれか１項に記載のキット。
  4. 前記核酸抽出対象が、微生物である、請求項１から３のいずれか１項に記載のキット。
  5. 以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の工程を含む、核酸抽出対象を含む試料から当該核酸抽出対象の核酸を抽出および増幅する方法であって、
    前記核酸抽出対象が、微生物、動物細胞、植物細胞、及び細胞外小胞から選択される、
    方法。
    （ｉ）核酸抽出対象を含む試料を、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含む
    核酸抽出試薬と接触させ、核酸抽出液を得る核酸抽出工程
    （ｉｉ）（ｉ）によって得られた核酸抽出液を、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンと接触させる工程
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた溶液を核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程
  6. 以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、核酸抽出対象を含む試料から当該核酸抽出対象の核酸を抽出および増幅する方法であって、
    前記核酸抽出対象が、微生物、動物細胞、植物細胞、及び細胞外小胞から選択される、
    方法。
    （ｉ）核酸抽出対象を含む試料を、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含む
    核酸抽出試薬と接触させ、核酸抽出液を得る核酸抽出工程
    （ｉｉ）（ｉ）によって得られた核酸抽出液を、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程
  7. 前記核酸抽出対象が、微生物である、請求項５または６に記載の方法。
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