JP2016104039A

JP2016104039A - 粗製のマトリックスにおける核酸の検出

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Publication number: JP2016104039A
Application number: JP2016041035A
Authority: JP
Inventors: エー．アームズニオール; Niall A Armes
Original assignee: Alere San Diego Inc
Current assignee: Alere San Diego Inc
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2016-03-03
Publication date: 2016-06-09
Also published as: JP2013505723A; CN105524985A; EP2480681A1; US20130059290A1; US20170335379A1; CN102666872A; WO2011038197A1; BR112012006757A2; AU2010298202B2; CN105734169A; EP2480681A4; CN107739750A; AU2010298202A1; CN105671146A; AU2016200748A1; CA2775143A1

Abstract

【課題】粗製のマトリックスにおける核酸の検出の提供。【解決手段】粗製のマトリックスを、標的核酸種についての等温核酸増幅反応の成分と接触させ、それによって混合物を提供する工程；その混合物を、等温核酸増幅反応が進行するために十分な条件下でインキュベートし、それによって産物を提供する工程；および標的核酸種の指標が、その産物に存在するか否かを決定する工程を含む方法。本開示は、少なくとも部分的には、核酸抽出および／または精製を行わずに、様々な病原生物を、粗製のマトリックスにおいて検出し得るという発見に基づく。【選択図】なし

Description

（優先権の主張）
本出願は、２００９年９月２５日に出願された米国特許出願第６１／２４５，７５８号への優先権を主張し、上記米国特許出願の全容は、参照によって本明細書に援用される。

（技術分野）
本開示は、粗製のマトリックスにおける、増幅法による核酸の検出に関連する。

（背景）
等温増幅法は、数分の間に、微量レベルから、非常に高くそして検出可能なレベルまで、特異的な方式で核酸標的を増幅し得る。そのような等温法、例えばリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、核酸に基づく診断の適用を、ポイントオブケアテストならびにフィールドおよび消費者テストのような、新たな領域に拡大し得る。その技術の等温および広い温度範囲は、使用者が複雑な電力を必要とする器具使用を回避することを可能にし得る。

（概要）
本開示は、少なくとも部分的には、核酸抽出および／または精製を行わずに、様々な病原生物を、粗製のマトリックスにおいて検出し得るという発見に基づく。核酸抽出および／または精製を行わずに粗製のマトリックスを使用することは、上記で記載した等温核酸増幅法の利点に、簡単なサンプル調製の利点を加え得る。いくつかの場合には、アルカリ溶解または溶解酵素処理のような簡単な処理が、検出のために十分である。他のいくつかの場合には、その生物の標的核酸配列を、従来の溶解溶液でサンプルを前処理することをなんら必要とせずに、高い感度で検出し得る。代わりに、サンプルを等温増幅反応に接触させることが、その生物を高い感度で検出するために十分である。

１つの局面において、本開示は、粗製のマトリックスを、標的核酸種のための等温核酸増幅反応の成分と接触させて、それによって混合物を提供すること；その混合物を、等温核酸増幅反応が進行するために十分な条件下でインキュベートして、それによって産物を提供すること；およびその標的核酸種の指標が、その産物に存在するか否かを決定することを含む方法を特色とする。

別の局面において、本開示は、粗製のマトリックスを、標的核酸種のための核酸増幅反応の成分と接触させて、それによって混合物を提供すること；核酸増幅反応が進行することを可能にするために十分な時間にわたり、その混合物の温度を９５℃未満（例えば９０℃未満、８５℃未満、８０℃未満、７５℃未満、７０℃未満、６５℃未満、６０℃未満、５５℃未満、５０℃未満、４５℃未満、または４０℃未満）に維持して、それによって産物を提供すること；およびその標的核酸種の指標が、その産物に存在するか否かを決定することを含む方法を特色とする。

別の局面において、本開示は、粗製のマトリックスを、標的核酸種のための核酸増幅反応の成分と接触させて、それによって混合物を提供すること；核酸増幅反応が進行することを可能にするために十分な時間にわたり、その混合物のセ氏目盛り温度を３０％未満（例えば２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満）または２０℃未満（例えば１５℃未満、１０℃未満、５℃未満、２℃未満、または１℃未満）変化させて、それによって産物を提供すること；およびその標的核酸種の指標が、その産物に存在するか否かを決定することを含む方法を特色とする。

別の局面において、本開示は、混合物の等温反応を実施して産物を提供すること（その混合物は粗製のマトリックスおよび標的核酸種のための核酸増幅反応の成分を含む）；およびその標的核酸種の指標が、その産物に存在するか否かを決定することを含む方法を特色とする。

別の局面において、本開示は、最高で８０℃（例えば最高で７５℃、最高で７０℃、最高で６５℃、最高で６０℃、最高で５５℃、最高で５０℃、最高で４５℃、または最高で４０℃）の温度で混合物を反応させて産物を提供すること（その混合物は粗製のマトリックスおよび標的核酸種のための核酸増幅反応の成分を含む）；およびその標的核酸種の指標が、その産物に存在するか否かを決定することを含む方法を特色とする。

別の局面で、本開示は、その混合物のセ氏目盛り温度を最大３０％（例えば最大２５％、最大２０％、最大１５％、最大１０％、または最大５％）または最大２０℃（例えば最大１５℃、最大１０℃、最大５℃、最大２℃、または最大１℃）変化させる間、混合物を反応させて産物を提供すること（その混合物は粗製のマトリックスおよび標的核酸種のための核酸増幅反応の成分を含む）；およびその標的核酸種の指標が、その産物に存在するか否かを決定することを含む方法を特色とする。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスは、生物学的サンプル、例えば血液、尿、唾液、痰、リンパ液、血漿、射精液、肺吸引物、および脳脊髄液の少なくとも１つを含む。いくつかの実施態様において、その生物学的サンプルは、喉スワブ、鼻スワブ、膣スワブ、または直腸スワブから選択される、少なくとも１つのサンプルを含む。いくつかの実施態様において、その生物学的サンプルは、生検サンプルを含む。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスを、溶解処理に供さない。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスを、カオトロピック剤、界面活性剤、溶解酵素調製物で処理しない。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスを、高温（例えば８０℃以上、８５℃以上、９０℃以上、または９５℃以上）温度処理工程に供さない。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスを、溶解処理に供さず、そしてその標的核酸種は、ブドウ球菌（例えばＳ．ａｕｒｅｕｓまたはメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ））の核酸である。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスを、溶解処理に供さず、そしてその標的核酸種は、マイコプラズマの核酸である。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスを、溶解処理に供し得る。例えば、その粗製のマトリックスを、界面活性剤および／またはバクテリオファージ溶解素（例えば連鎖球菌Ｃ_１バクテリオファージ溶解素（ＰｌｙＣ））のような溶解酵素で処理する。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスを、溶解処理に供し、そしてその標的核酸種は、連鎖球菌（例えばＡ群連鎖球菌またはＢ群連鎖球菌）の核酸である。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスを、溶解処理に供し、そしてその標的核酸種は、サルモネラ（例えばＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の核酸である。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その標的核酸は細菌の核酸、例えばＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ、モビルンカス種、プレボテラ種、およびポルフィロモナス種から選択される細菌由来、または本明細書中で記載される別の細菌由来である。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その標的核酸は、哺乳動物の核酸であり、例えば核酸は腫瘍細胞と関連している。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その標的核酸は、ウイルスの核酸であり、例えばＨＩＶ、インフルエンザウイルス、またはデングウイルス由来、または本明細書中で記載される別のウイルス由来である。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その標的核酸は、真菌の核酸であり、例えばＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、または本明細書中で記載される別の真菌由来である。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その標的核酸は、原生動物の核酸であり、例えばトリコモナスまたは本明細書中で記載される別の原生動物由来である。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その等温核酸増幅反応は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅である。いくつかの実施態様において、その等温核酸増幅反応は、転写媒介増幅、核酸配列に基づく増幅、ＲＮＡのシグナル媒介増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル型増幅、ＤＮＡのループ媒介等温増幅、等温多重置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、シングルプライマー等温増幅法、環状ヘリカーゼ依存性増幅、またはニッキングおよび伸長増幅反応である。

上記の局面のいくつかの実施態様において、その反応の条件は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、例えば１％より高い濃度で含む。

別の局面において、本開示は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ種を検出する方法を特色とし、ここではサンプルを、カオトロピック剤、界面活性剤による事前の溶解処理を行わずに、高温温度処理工程を行わずに、または溶解酵素調製物無しで、反応再水和緩衝液または水和反応系に接触させ、そして検出可能なレベルまで増幅する。いくつかの実施態様において、その標的核酸種は、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓまたはＭＲＳＡのゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施態様において、その増幅方法は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）法である。いくつかの実施態様において、ポリエチレングリコールが、再水和緩衝液または完全に再水和した増幅環境に、１％より高い濃度で含まれる。

別の局面において、本開示は、等温核酸増幅反応の成分；および溶解酵素を含むキットを特色とする。等温核酸増幅反応の成分は、例えばリコンビナーゼを含み得る。いくつかの実施態様において、その溶解酵素は、バクテリオファージ溶解素、例えば連鎖球菌Ｃ_１バクテリオファージ溶解素（ＰｌｙＣ）を含む。

別の局面において、本開示は、等温核酸増幅反応の成分；および側方流動またはマイクロ流体デバイス（例えば反応産物の検出のための）を含むキットを特色とする。等温核酸増幅反応の成分は、例えばリコンビナーゼを含み得る。

別の局面において、本開示は、等温核酸増幅反応の成分；およびスワブ（例えば生物学的サンプルを得るための）を含むキットを特色とする。等温核酸増幅反応の成分は、例えばリコンビナーゼを含み得る。

上記のキットのいずれかのいくつかの実施態様において、そのキットは核酸精製または抽出のための試薬、例えばカオトロピック剤および／または核酸結合媒質（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇｍｅｄｉｕｍ）を含まない。

本明細書中で使用される場合、「粗製のマトリックス」は、生物学的供給源由来の核酸を含むマトリックスであり、ここでそのマトリックスは、核酸抽出および／または精製に供していない。いくつかの実施態様において、その生物学的供給源は、細胞および／または生物学的サンプル（例えば患者由来）および／または環境サンプルを含む。その細胞および／または生物学的サンプルおよび／または環境サンプルは、溶解されていない場合があり、または溶解工程に供され得る。

本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかとなる。
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
粗製のマトリックスを、標的核酸種のための等温核酸増幅反応の成分と接触させて、混合物を提供する工程；
該混合物を、該等温核酸増幅反応が進行するために十分な条件下でインキュベートして、産物を提供する工程；および
該標的核酸種の指標が、該産物に存在するか否かを決定する工程
を含む、方法。
（項目２）
粗製のマトリックスを、標的核酸種のための核酸増幅反応の成分と接触させて、混合物を提供する工程；
該核酸増幅反応が進行することを可能にするために十分な時間にわたり、該混合物の温度を８０℃未満に維持して、産物を提供する工程；および
該標的核酸種の指標が、該産物に存在するか否かを決定する工程
を含む、方法。
（項目３）
粗製のマトリックスを、標的核酸種のための核酸増幅反応の成分と接触させて、混合物を提供する工程；
該核酸増幅反応が進行することを可能にするために十分な時間にわたり、該混合物のセ氏目盛り温度を２５％未満または１５℃未満変化させて、産物を提供する工程；および
該標的核酸種の指標が、該産物に存在するか否かを決定する工程
を含む、方法。
（項目４）
混合物の等温反応を実施して産物を提供する工程であって、該混合物は粗製のマトリックスおよび標的核酸種のための核酸増幅反応の成分を含む、工程；および
該標的核酸種の指標が、該産物に存在するか否かを決定する工程
を含む、方法。
（項目５）
最高で８０℃の温度で混合物を反応させて産物を提供する工程であって、該混合物は粗製のマトリックスおよび標的核酸種のための核酸増幅反応の成分を含む、工程；および
該標的核酸種の指標が、該産物に存在するか否かを決定する工程
を含む、方法。
（項目６）
混合物のセ氏目盛り温度を最大２５％または最大１５℃変化させる間、該混合物を反応させて産物を提供する工程であって、該混合物は粗製のマトリックスおよび標的核酸種のための核酸増幅反応の成分を含む、工程；および
該標的核酸種の指標が、該産物に存在するか否かを決定する工程
を含む、方法。
（項目７）
前記粗製のマトリックスが、生物学的サンプルである、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記生物学的サンプルが、血液、尿、唾液、痰、リンパ液、血漿、射精液、肺吸引物、および脳脊髄液からなる群より選択される少なくとも１つのサンプルを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記生物学的サンプルが、喉スワブ、鼻スワブ、膣スワブ、または直腸スワブからなる群より選択される少なくとも１つのサンプルを含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記生物学的サンプルが、生検サンプルを含む、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記粗製のマトリックスが、溶解処理に供されない、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記粗製のマトリックスが、カオトロピック剤、界面活性剤、または溶解酵素調製物で処理されない、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記粗製のマトリックスが、高温温度処理工程に供されない、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記標的核酸種が、ブドウ球菌の核酸である、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ブドウ球菌が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓが、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記標的核酸種が、マイコプラズマの核酸である、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記粗製のマトリックスが、溶解処理に供される、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記溶解処理が、前記粗製のマトリックスを界面活性剤で処理する工程を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記溶解処理が、前記粗製のマトリックスを溶解酵素で処理する工程を含む、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記溶解酵素が、ＰｌｙＣである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記標的核酸種が、連鎖球菌の核酸である、項目１〜１０および１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記連鎖球菌が、Ａ群連鎖球菌（ＳｔｒｅｐＡ）である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記標的核酸種が、サルモネラの核酸である、項目１〜１０および１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記サルモネラが、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記標的核酸が、細菌の核酸である、項目１〜１３および１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記細菌が、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ
ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ、モビルンカス種、プレボテラ種、およびポルフィロモナス種からなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記標的核酸が、哺乳動物の核酸である、項目１〜１３および１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記標的核酸が、腫瘍細胞と関連している、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記標的核酸が、ウイルスの核酸である、項目１〜１３および１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記ウイルスが、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、およびデングウイルスからなる群より選択される、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
前記標的核酸が、真菌の核酸である、項目１〜１３および１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記真菌が、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記標的核酸が、原生動物の核酸である、項目１〜１３および１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記原生動物が、トリコモナスである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記等温核酸増幅反応が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅である、項目１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記等温核酸増幅反応が、転写媒介増幅、核酸配列に基づく増幅、ＲＮＡのシグナル媒介増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル型増幅、ＤＮＡのループ媒介等温増幅、等温多重置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、シングルプライマー等温増幅法、環状ヘリカーゼ依存性増幅、ならびにニッキングおよび伸長増幅反応からなる群より選択される、項目１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記反応の条件が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
ＰＥＧが、１％より高い濃度で前記反応の条件中に存在する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
特異的ＤＮＡ種または特異的ＲＮＡ種を検出するための方法であって、サンプルを、カオトロピック剤、界面活性剤による事前の溶解処理を行わずに、高温温度処理工程を行わずに、または溶解酵素調製物無しで、反応再水和緩衝液または水和反応系に接触させ、そして検出可能なレベルまで増幅させる、方法。
（項目４１）
前記標的核酸種が、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓまたはＭＲＳＡのゲノムＤＮＡを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記増幅の方法が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）法である、項目４０または４１に記載の方法。
（項目４３）
ポリエチレングリコールが、前記再水和緩衝液または完全に再水和した増幅環境に１％より高い濃度で含まれる、項目４０または４１に記載の方法。
（項目４４）
等温核酸増幅反応の成分；および
溶解酵素
を含む、キット。
（項目４５）
前記等温核酸増幅反応の成分が、リコンビナーゼを含む、項目４４に記載のキット。
（項目４６）
前記溶解酵素が、バクテリオファージ溶解素を含む、項目４４または４５に記載のキット。
（項目４７）
前記バクテリオファージ溶解素が、連鎖球菌Ｃ_１バクテリオファージ溶解素（ＰｌｙＣ）を含む、項目４６に記載のキット。
（項目４８）
等温核酸増幅反応の成分；および
側方流動デバイス
を含む、キット。
（項目４９）
前記等温核酸増幅反応の成分が、リコンビナーゼを含む、項目４８に記載のキット。
（項目５０）
等温核酸増幅反応の成分；および
スワブ
を含む、キット。
（項目５１）
前記等温核酸増幅反応の成分が、リコンビナーゼを含む、項目５０に記載のキット。
（項目５２）
核酸精製または抽出のための試薬を含まない、項目４４〜５１のいずれか一項に記載のキット。
（項目５３）
核酸精製または抽出のための前記試薬が、カオトロピック剤を含む、項目５２に記載のキット。
（項目５４）
項目４４〜５３のいずれか一項に記載のキットであって、核酸精製または抽出の工程を行わずに、等温核酸増幅の方法において該キットを使用するための説明書をさらに含む、キット。

本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかとなる。

図１Ａ−Ｂは、溶解無し（１Ａ）またはアルカリ溶解後（１Ｂ）の、１０，０００、１０００、および１００ｃｆｕにおけるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの検出を示す線グラフである。図２は、溶解無し（溶解無し）、ムタノリシンおよびリゾチームで処理（ＭＬ／ＬＺ）、ＰｌｙＣで処理（ＰＬＹＣ）、またはムタノリシン、リゾチーム、およびＰｌｙＣで処理（ＭＬ／ＬＺ／ＰＬＹＣ）した、ＳｔｒｅｐＡの検出を示す線グラフである。図３は、０、１、２、または３ユニットのリソスタフィンで処理した患者サンプルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓの検出を示す線グラフである。図４は、４５分間沸騰させたか（沸騰）、リソスタフィンで処理し、そして５分間沸騰させたか（リソスタフィン）、または室温で４５分間、水中でインキュベートした患者サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓの検出を示す線グラフである。サンプルを、５０または１０００コピーの標的核酸を含むポジティブコントロールと比較した。図５は、溶解されていない（溶解されていない）、またはリソスタフィンで溶解させ、そして抽出した（浄化）患者サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓの検出を示す線グラフである。サンプルを、５０または１０００コピーの標的核酸を含むポジティブコントロールと比較した。図６は、約１０（１０細菌）または約１００（１００細菌）の生物を有する、溶解されていないメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）サンプルの検出を示す線グラフである。サンプルを、５０コピーの標的核酸（５０コピーのＰＣＴ産物）を有するポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとしての水（ＮＴＣ）と比較した。図７は、５０、１００、または１０００ｃｆｕの溶解されていないマイコプラズマまたは培地コントロールの検出を示す線グラフである。

（詳細な説明）
本開示は、核酸標的の検出のための、粗製のマトリックスにおける核酸の等温増幅の方法を提供する。

いくつかの実施態様において、粗製のマトリックスを、標的核酸種のための等温核酸増幅反応（例えばＲＰＡ）の成分と接触させて、混合物を提供する。次いでその混合物を、増幅反応が進行し、そして産物を産生するために十分な条件下でインキュベートし、その産物を評価して標的核酸種の指標が存在するか否かを決定する。標的核酸種の指標がその産物中に見出される場合、その標的核酸種がもとの粗製のマトリックスに存在したことを推測し得る。

いくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスは、生物学的サンプル、例えば植物または動物被験体から得たサンプルを含む。本明細書中で使用される場合、生物学的サンプルは、細胞、組織（例えば肺、肝臓および腎臓）、骨髄吸引物、体液（例えば血液、血液の誘導体および画分（血清またはバフィーコートなど）、尿、リンパ液、涙、前立腺液、脳脊髄液、気管吸引物、痰、膿、鼻咽頭吸引物、口腔咽頭吸引物、唾液）、目スワブ、頸部スワブ、膣スワブ、直腸スワブ、便および便懸濁物を含むがこれに限らない、被験者における核酸の検出のために有用なあらゆる臨床サンプルを含む。他の適当なサンプルは、中耳液、気管支肺胞洗浄物、気管吸引物、痰、鼻咽頭吸引物、口腔咽頭吸引物、または唾液から得られたサンプルを含む。特定の実施態様において、その生物学的サンプルを、動物被験体から得る。そのようなサンプルを得るための標準的な技術が利用可能である。例えば、Ｓｃｈｌｕｇｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１３２７−３３（１９９２）；Ｂｉｇｂｙら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３３：５１５−１８（１９８６）；Ｋｏｖａｃｓら、ＮＥＪＭ３１８：５８９−９３（１９８８）；およびＯｇｎｉｂｅｎｅら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１２９：９２９−３２（１９８４）を参照のこと。

いくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスは、環境サンプル、例えば表面サンプル（例えば拭き取りまたはバキューム（ｖａｃｕｕｍｉｎｇ）によって得る）、空気サンプル、または水サンプルを含む。

いくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスは、単離された細胞、例えば動物、細菌、真菌（例えば酵母）、または植物細胞、および／またはウイルスを含む。単離細胞を、培養する細胞の型に適当な、従来の方法および条件を用いて培養し得る。

その粗製のマトリックスを、実質的にそのまま核酸増幅成分と接触させることができ、または核酸抽出および／または精製を含まない、１つまたはそれ以上の前処理工程に供することができる。いくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスを、例えば界面活性剤および／または溶解酵素調製物による溶解に供する。いくつかの実施態様において、その粗製のマトリックスを、カオトロピック剤、界面活性剤、または溶解酵素調製物による処理に供さず、およびその粗製のマトリックスを高温（例えば８０℃より高い、８５℃より高い、９０℃より高い、または９５℃より高い）に供さない。上記の条件のいずれかまたは全ての下で、その粗製のマトリックスに存在する標的核酸は、等温核酸増幅機構に利用でき、増幅が起こり得る。

例えばリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、転写媒介増幅、核酸配列に基づく増幅、ＲＮＡのシグナル媒介増幅技術、鎖置換増幅、ローリングサークル型増幅、ＤＮＡのループ媒介等温増幅、等温多重置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、シングルプライマー等温増幅、環状ヘリカーゼ依存性増幅、ならびにニッキングおよび伸長増幅反応を含む、多くの核酸増幅技術が公知である（ＵＳ２００９／００１７４５３を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応は、最も広く知られた方法であるが、核酸鎖の分離を引き起こすために温度サイクルの使用が必要である点で異なる。これらおよび他の増幅方法が、例えばＶａｎＮｅｓｓら、ＰＮＡＳ２００３、第１００巻第８号、４５０４−４５０９頁；Ｔａｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５、７７、７９８４−７９９２；Ｌｉｚａｒｄら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１９９８、６、１１９７−１２０２；Ｎｏｔｏｍｉら、ＮＡＲ２０００、２８、１２、ｅ６３；およびＫｕｒｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００５、５１：１０、１９７３−１９８１において議論される。これらの一般的な増幅技術に関する他の参考文献は、例えば米国特許第７，１１２，４２３号；同５，４５５，１６６号；同５，７１２，１２４号；同５，７４４，３１１号；同５，９１６，７７９号；同５，５５６，７５１号；同５，７３３，７３３号；同５，８３４，２０２号；同５，３５４，６６８号；同５，５９１，６０９号；同５，６１４，３８９号；同５，９４２，３９１号；および米国特許公開番号ＵＳ２００３００８２５９０；ＵＳ２００３０１３８８００；ＵＳ２００４００５８３７８；およびＵＳ２００６０１５４２８６を含む。上記の文書は全て、本明細書中で参考として組み込まれる。

ＲＰＡは、核酸の等温増幅の１つの例示的な方法である。ＲＰＡは、リコンビナーゼとして公知である酵素を利用し、それは２本鎖ＤＮＡ中の相同的な配列とオリゴヌクレオチドプライマーを対にし得る。この方法において、ＤＮＡ合成は、サンプルＤＮＡ中の規定された点に向けられる。２つの遺伝子特異的プライマーを使用して、標的配列が存在する場合、指数的な増幅反応が開始される。その反応は迅速に進行し、そして２０〜４０分程度の短い間に、わずか少数の標的コピーから検出可能なレベルまでの特異的な増幅を引き起こす。ＲＰＡ法は、例えばＵＳ７，２７０，９８１；ＵＳ７，３９９，５９０；ＵＳ７，７７７，９５８；ＵＳ７，４３５，５６１；ＵＳ２００９／００２９４２１；およびＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３７６１１において開示され、それらは全て本明細書中で参考として組み込まれる。

ＲＰＡ反応は、系の組換えエレメントの活性を支持するために必要なタンパク質および他の因子、ならびに相補的な基質と対になったオリゴヌクレオチドの３’末端からのＤＮＡ合成を支持するために必要なタンパク質および他の因子の両方のブレンドを含む。その組換え系の重要なタンパク質成分は、リコンビナーゼ自体であり、それは原核生物、ウイルス、または真核生物起源由来であり得る。しかし、さらに、その反応において進行中の様々な交換トランザクション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ）の間に核酸を安定化させるために、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の必要性が存在する。具体的に、多くの基質は性質として、依然として部分的に２本鎖であるので、鎖置換性質を有するポリメラーゼが必要である。その反応が微量レベルの核酸から増幅できるいくつかの実施態様において、クラウディング剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇａｇｅｎｔ）（例えばポリエチレングリコール）およびローディングタンパク質の使用を含むインビトロ条件を使用し得る。バクテリオファージＴ４ＵｖｓＸリコンビナーゼ、バクテリオファージＴ４ＵｖｓＹローディング剤、バクテリオファージＴ４ｇｐ３２およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓポリメラーゼＩラージフラグメントを含む例示的な系が報告された。

等温増幅反応の成分を、溶液および／または乾燥（例えば凍結乾燥）形式で提供し得る。１つまたはそれ以上の成分が乾燥形式で提供される場合、再懸濁または再構成緩衝液も使用し得る。

増幅反応の特定の型に基づいて、その反応混合物は、緩衝液、塩、ヌクレオチド、および反応が進行するために必要な他の成分を含み得る。その反応混合物を、反応に適当な特定の温度でインキュベートし得る。いくつかの実施態様において、その温度を８０℃以下、例えば７０℃以下、６０℃以下、５０℃以下、４０℃以下、３７℃以下、または３０℃以下に維持する。いくつかの実施態様において、その反応混合物を室温に維持する。いくつかの実施態様において、その混合物のセ氏目盛り温度は、反応時間を通して、２５％未満（例えば２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満）変化するか、および／またはその混合物の温度は、反応時間を通して、１５℃未満（例えば１０℃未満、５℃未満、２℃未満、または１℃未満）変化する。

その標的核酸は、動物（例えばヒト）、植物、真菌（例えば酵母）、原生動物、細菌、またはウイルス種に存在する核酸であり得る。例えば、その標的核酸は、目的の生物のゲノムに（例えば染色体に）、または染色体外の核酸に存在し得る。いくつかの実施態様において、その標的核酸は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡである。特定の実施態様において、その標的核酸は、目的の生物に特異的である。すなわち、その標的核酸は、他の生物において見出されないか、または目的の生物に類似の生物において見出されない。

その標的核酸は、細菌、例えばグラム陽性またはグラム陰性細菌に存在し得る。例示的な細菌種は、アシネトバクター種株ＡＴＣＣ５４５９、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、コリネバクテリウム種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｆａｅｃａｌｉｓ（例えばＡＴＣＣ２９２１２）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（例えばＡＴＣＣ２５９２７）、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えばＡＴＣＣ４９２４７）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（例えばＡＴＣＣ３３４９５）、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（例えばＡＴＣＣ７６４８）、ミクロコッカス種株ＡＴＣＣ１４３９６、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ（例えばＡＴＣＣ６２５０）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｏｌｉｇｅｌｌａｕｒｅｔｈｒａｌｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（例えばＡＴＣＣ１０１４５）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ、サルモネラ種株ＡＴＣＣ３１１９４、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（例えばＡＴＣＣ８１０１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（例えばＡＴＣＣ２５９２３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（例えばＡＴＣＣ１２２２８）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えばＡＴＣＣ４９６１９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ（例えばＡＴＣＣ１３８１３）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍａ、緑色連鎖球菌群（例えばＡＴＣＣ１０５５６）、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ（ＧＡＯ１−２８１０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（ＬＶＳＢ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＰＢ１／＋）、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｏ：９血清型、またはＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ（Ｐ１４−）を含む。いくつかの実施態様において、その標的核酸は、アシネトバクター、アエロコッカス、バクテロイデス、ボルデテラ、カンピロバクター、クロストリジウム、コリネバクテリウム、クラミジア、シトロバクター、エンテロバクター、エンテロコッカス、エシェリキア、ヘリコバクター、ヘモフィルス、クレブシエラ、レジオネラ、リステリア、ミクロコッカス、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｉｎｃｕｓ）、モラクセラ、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、オリゲラ、パスツレラ、プレボテラ、ポルフィロモナス、シュードモナス、プロピオニバクテリウム、プロテウス、サルモネラ、セラチア、ブドウ球菌、連鎖球菌、トレポネーマ、バチルス、フランシセラ、またはエルシニアから選択される細菌属の種に存在する。いくつかの実施態様において、その標的核酸は、Ａ群連鎖球菌またはＢ群連鎖球菌において見出される。

例示的なクラミジア標的核酸は、クラミジア潜在プラスミドにおいて見出される配列を含む。

例示的なＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ標的核酸は、ＩＳ６１１０（ＵＳ５，７３１，１５０を参照のこと）および／またはＩＳ１０８１（Ｂａｈａｄｏｒら、２００５、Ｒｅｓ．Ｊ．Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１：１４２−１４５を参照のこと）において見出される配列を含む。

例示的なＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ標的核酸は、ＮＧＯ０４６９（Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら、２００７、ＢＭＣＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：６６を参照のこと）およびＮＧＯ０４７０において見出される配列を含む。

例示的なＡ群連鎖球菌標的配列は、Ｓｐｙ１２５８（Ｌｉｕら、２００５、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５６：５６４−５６７を参照のこと）、Ｓｐｙ０１９３、ｌｙｔＡ、ｐｓａＡ、およびｐｌｙ（ＵＳ２０１０／０２３４２４５を参照のこと）において見出される配列を含む。

例示的なＢ群連鎖球菌標的核酸は、ｃｆｂ遺伝子（Ｐｏｄｂｉｅｌｓｋｉら、１９９４、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：２３９−２５６を参照のこと）において見出される配列を含む。

いくつかの実施態様において、その標的核酸は、ウイルスの核酸である。例えば、そのウイルスの核酸を、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、またはデングウイルスにおいて見出し得る。例示的なＨＩＶ標的核酸は、Ｐｏｌ領域において見出される配列を含む。

いくつかの実施態様において、その標的核酸は、原生動物の核酸である。例えば、その原生動物の核酸を、プラスモジウム種、リーシュマニア種、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、エントアメーバ種、トキソプラズマ種、膣トリコモナス、およびＧｉａｒｄｉａｄｕｏｄｅｎａｌｉｓにおいて見出し得る。

いくつかの実施態様において、その標的核酸は、哺乳動物（例えばヒト）核酸である。例えば、その哺乳動物の核酸を、循環腫瘍細胞、上皮細胞、または線維芽細胞において見出し得る。

いくつかの実施態様において、その標的核酸は、真菌（例えば酵母）核酸である。例えば、その真菌の核酸を、カンジダ種（例えばＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）において見出し得る。

増幅産物の検出は、典型的には、その標的核酸に対応する増幅産物に十分相補的であり、かつハイブリダイズする、標識プローブの使用を含む。従って、増幅産物の存在、量、および／または同一性を、増幅産物に相補的な、蛍光標識プローブのような標識プローブをハイブリダイズすることによって検出し得る。いくつかの実施態様において、目的の標的核酸配列の検出は、等温増幅法および標識プローブを組み合わせて使用して、産物をリアルタイムで測定することを含む。別の実施態様において、目的の増幅標的核酸配列の検出は、増幅した標的核酸を膜のような固体支持体へ移すこと、およびその膜を、増幅標的核酸配列に相補的なプローブ、例えば標識プローブでプロービングすることを含む。さらに別の実施態様において、目的の増幅標的核酸配列の検出は、アドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）位置を有する所与のアレイに並べられている、その増幅標的核酸に相補的なプローブへの、標識増幅標的核酸のハイブリダイゼーションを含む。

典型的には、増幅反応において１つまたはそれ以上のプライマーを利用する。標的核酸の増幅は、標的核酸を、標的核酸にハイブリダイズし、その増幅を指示し得る１つまたはそれ以上のプライマーに接触させることを含む。いくつかの実施態様において、そのサンプルを、前向きおよび逆向きプライマー（それらはどちらも標的核酸にハイブリダイズする）を含むプライマーのペアと接触させる。

リアルタイム増幅は、エンドポイントの検出と対照的に、増幅産物の産生の指標として反応の間に放出された蛍光をモニターする。いくつかの系において、反応のリアルタイムの進行を見ることができる。典型的には、リアルタイム法は、蛍光リポーターの検出を含む。典型的には、その蛍光リポーターのシグナルは、反応における増幅産物の量と正比例して増加する。各サイクルにおける蛍光発光の量を記録することによって、指数期の間の増幅反応をモニターすることができ、ここで増幅産物の量の最初の有意な増加は、標的鋳型の最初の量と関連する。核酸標的の開始コピー数が多いほど、蛍光の有意な増加がより早く観察される。

いくつかの実施態様において、その蛍光標識プローブは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、またはサンプルの蛍光発光波長の変化（リアルタイムでＤＮＡプローブの増幅標的核酸に対するハイブリダイゼーションを検出する方法として）に依存する。例えば、異なるプローブにおける蛍光発生標識間で（例えばＨｙｂＰｒｏｂｅｓを用いて）、または同じプローブにおけるフルオロフォアと非蛍光消光剤との間で（例えば分子ビーコンまたはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを用いて）起こるＦＲＥＴは、目的のＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを同定し得、そしてこの方法においてサンプル中の標的核酸の存在、および／または量を検出し得る。いくつかの実施態様において、増幅産物を同定するために使用される蛍光標識ＤＮＡプローブは、スペクトルが違う発光波長を有し、従って例えば複数の反応において、同じ反応チューブ内でそれらを区別することを可能にする。例えば、複数の反応は、２つまたはそれ以上の標的核酸（コントロール核酸のような別の核酸でも）の増幅産物の同時検出を可能にする。

いくつかの実施態様において、標的核酸に特異的なプローブを、同位体または非同位体標識のいずれかで検出可能に標識する；代替の実施態様において、増幅標的核酸を標識する。そのプローブを、標的核酸種の指標として検出し得る（例えば、標的核酸種の増幅産物）。非同位体標識は、例えば蛍光もしくは発光分子、または酵素、補助因子、酵素基質、またはハプテンを含み得る。そのプローブを、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または両方の混合物の、１本鎖または２本鎖調製物とインキュベートし、そしてハイブリダイゼーションを決定し得る。いくつかの実施例において、そのハイブリダイゼーションは、例えば標識プローブからのシグナルの増加または減少のような、シグナルの検出可能な変化を引き起こす。従って、ハイブリダイゼーションの検出は、ハイブリダイゼーション前の標識からのシグナルと比較して、ハイブリダイゼーション中または後の標識プローブからのシグナルにおける変化を検出することを含む。

いくつかの方法において、その増幅産物を、フローストリップを用いて検出し得る。いくつかの実施態様において、１つの検出可能な標識は色を生じ、そして２番目の標識は固定化した抗体によって認識されるエピトープである。両方の標識を有する産物は、固定化抗体に結合し、そしてその固定化抗体の位置で色を生じる。この検出方法に基づくアッセイは、例えばフローストリップ（ディップスティック）であり得、これを等温増幅反応全体に適用し得る。陽性の増幅は、標的核酸種の増幅の指標として、フローストリップにバンドを生じ、一方陰性の増幅は、色のバンドを生じない。

いくつかの実施態様において、標的核酸の量（例えばコピー数）を、本明細書中で開示した方法を用いておおよそ定量化し得る。例えば、既知の量の標的核酸を、並行する反応において増幅し得、そしてサンプルから得られた増幅産物の量を、並行する反応において得られた増幅産物の量と比較し得る。いくつかの実施態様において、いくつかの既知の量の標的核酸を、複数の並行する反応において増幅し得、そしてサンプルから得られた増幅産物の量を、並行する反応において得られた増幅産物の量と比較し得る。サンプル中の標的核酸が、並行する反応における標的核酸と同様に、反応成分にとって利用可能であると仮定して、サンプル中の標的核酸の量を、これらの方法を用いておおよそ定量化し得る。

本明細書中で開示された方法の反応成分を、標的核酸の検出において使用するためのキットの形式で供給し得る。そのようなキットにおいて、適当な量の１つまたはそれ以上の反応成分が、１つまたはそれ以上の容器で提供されるか、または支持層上に保持される。標的核酸に特異的な核酸プローブおよび／またはプライマーも提供され得る。その反応成分、核酸プローブ、および／またはプライマーを、例えば水溶液に懸濁することができ、またはそれらは、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）もしくは凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）粉末、ペレット、またはビーズであり得る。その成分等が供給される容器は、供給される形式を保持し得るあらゆる従来の容器、例えば、微量遠心管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅｔｕｂｅ）、アンプル、もしくはボトル、またはマイクロ流体デバイス、側方流動、もしくは他の同様なデバイスのような一体型試験デバイスであり得る。そのキットは、標的核酸の検出において使用するために、標識または非標識核酸プローブのいずれかを含み得る。いくつかの実施態様において、そのキットはさらに、本明細書中で記載した方法、例えば核酸抽出および／または精製を行わずに粗製のマトリックスを用いる方法において、その成分を使用するための説明書を含み得る。

いくつかの適用において、個々の、典型的には使い捨てのチューブまたは等価な容器において、前もって測定した単回使用量で、１つまたはそれ以上の反応成分を提供し得る。そのような準備を用いて、標的核酸の存在に関して試験するサンプルを、個々のチューブに加え得、そして増幅を直接行い得る。

キットにおいて供給される成分の量は、任意の適当な量であり得、そしてその製品が向けられる標的の市場に依存し得る。適当な量を決定するための一般的なガイドラインを、Ｉｎｎｉｓら、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌらにおいて見出し得る。

（実施例１．粗製のマトリックスにおける細菌の検出）
粗製のサンプルにおいて核酸を増幅する能力を調査した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを、ＬＢブロスで増殖させた。指数期中期の培養物を、１μｌ中１００、１０００、または１０，０００ｃｆｕに希釈した。そのサンプルを２．５μｌの０．２ＮａＯＨ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００と５分間混合し、続いて１μｌの１Ｍ酢酸で中和することによって、その希釈した培養物を溶解した。コントロール培養物（溶解無し）を、増幅のために再懸濁緩衝液と混合した。２００コピーのｉｎｖＡＰＣＲ産物を、ポジティブコントロールとして使用し、そしてＬＢ培地をネガティブコントロールとして使用した。各サンプルに、それぞれ３．５μｌの前向きおよび逆向き増幅プライマー（ＩＮＶＡＦ２、ｃｃｇｔｇｇｔｃｃａｇｔｔｔａｔｃｇｔｔａｔｔａｃｃａａａｇｇｔ、配列番号１およびＩＮＶＡＲ２、ｃｃｃｔｔｔｃｃａｇｔａｃｇｃｔｔｃｇｃｃｇｔｔｃｇｃｇｃｇｃｇ、配列番号２）の６μＭ溶液、８．５μｌの２０％ＰＥＧ３５Ｋ、２．５μｌの酢酸マグネシウム（２８０ｍＭ）、凍結乾燥反応ペレット（１．２５μｇのクレアチンキナーゼ、２３μｇのＵｖｓＸ、５μｇのＵｖｓＹ、２４．２５μｇのＧｐ３２、６．６５μｇのＥｘｏＩＩＩ、１４．６５μｇのＰｏｌＩ、ＰＥＧ３５０００（最終濃度５．５％ｗ／ｖ）、ＴｒｉｓｐＨ８．３（最終濃度５０ｍＭ）、ＤＴＴ（最終濃度５ｍＭ）、ホスホクレアチン（最終濃度５０ｍＭ）、ＡＴＰ（最終濃度２．５ｍＭ）、トレハロース（最終濃度５．７％ｗ／ｖ）、およびｄＮＴＰ（それぞれ最終濃度３００ｍＭ）を含む）、検出プローブａｔｔｔｔｃｔｃｔｇｇａｔｇｇｔａｔｇｃｃｃｇｇｔａａａｃａｇａＱｇＨｇＦａｔｔｇａｔｇｃｃｇａｔｔ（Ｑ＝ＢＨＱ−１−ｄＴ；Ｈ＝ＴＨＦ；Ｆ＝フルオレセイン−ｄＴ；３’＝ビオチン−ＴＥＧ（１５原子トリエチレングリコールスペーサー）；配列番号３）を加え、さらに水を５０μｌの全反応容積まで加えた。溶解したサンプルにおいて、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを細胞の数に依存して、全てのサンプルで検出した（図１Ｂ）。１０００ｃｆｕによるシグナル強度は、２００コピーで使用したコントロール標的ＤＮＡより非常に強く、一方１００ｃｆｕのサンプルは、コントロールよりわずかに弱かった。このデータは、全てではないにしても、ほとんどの細菌がその処理によって溶解し、そしてそのＤＮＡが増幅反応において、鋳型としての作用に関して、完全に利用可能であったことを強く示唆する。溶解工程の非存在下で（図１Ａ）、１０，０００ｃｆｕを用いた場合に１つの例で標的の増幅を検出したが（おそらくめったにない溶解による偶然のゲノムＤＮＡの混入による）、他ではなかった。この実施例は、直接的なアルカリ溶解後に、増殖培地から高感度で細菌を直接検出し得ることを示す。

（実施例２．単純な溶解後の唾液における細菌の検出）
この実施例は、核酸抽出の必要無しに検出し得る、別の標的およびサンプルを示す。この実験において、連鎖球菌Ａ遺伝子の検出のために開発したプライマーおよびプローブ

を使用して、唾液サンプルから直接ＳｔｒｅｐＡを検出する能力を調査した。ＳｔｅｒｐＡを有することが公知である多くの個体から唾液をプールし、そして唾液の１０００ｃｆｕ／ｍｌの標的コピー数で使用した。２０μｌの唾液（１０００ｃｆｕ／ｍｌ）を、１μｌの０．１％ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、およびａ）水、ｂ）１μｌのムタノリシン（５０Ｕ／μｌ）および０．５μｌのリゾチーム（１００ｍｇ／ｍｌ）、ｃ）２μｌのＰｌｙＣ（２．２ｍｇ／ｍｌ）（Ｎｅｌｓｏｎら、２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：１０７６５−７０）、またはｄ）ムタノリシン、リゾチームおよびＰｌｙＣ（ｂおよびｃと同じ量）と混合した。上記反応物を、１００μｌの容積であること以外は実施例１と同様に調製した。サンプルを、ＳｔｒｅｐＡに対して溶解効果を有することが公知であるＰｌｙＣ酵素とインキュベートした場合、ＳｔｒｅｐＡを、唾液中で直接検出できた（図２）。これは、反応物の５分の１（１００μｌの最終反応容積中２０μｌ）が唾液からなる場合でもあてはまり、そしてこの場合、反応物中に約５０の微生物のみを含み得る。この実施例は、２０％の唾液を含む粗製のマトリックス中で、核酸精製無しでも、ＲＰＡはすぐれた感度および堅調な動態を提供し得ることを示す。

（実施例３．溶解されていないサンプルにおける細菌の検出）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓｎｕｃ遺伝子を検出するために開発したプライマーおよびプローブを用いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を検出した。公知のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓキャリアの鼻孔前方からサンプルを採取するために、フロックスワブ（Ｃｏｐａｎ♯５０３ＣＳ０１）を用いた。そのスワブを、５００μｌの再懸濁緩衝液に浸し、そして次いで廃棄した。このスワブ液の４６．５μｌのアリコートを、１μｌの０、１、２、および３ユニットのリソスタフィンに加えた。次いで４７．５μｌのスワブ液／リソスタフィンを、実施例１で記載したような、凍結乾燥「ｎｕｃ」ＲＰＡ反応物を再懸濁するために使用し、そして反応物は、プライマー

ここでＲ＝ＴａｍｒａｄＴ、Ｈ＝ＴＨＦまたはＤ−スペーサー（脱塩基部位を模倣）、Ｑ＝ＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ２ｄＴ、３’＝ビオチン−ＴＥＧ、配列番号９）も含んだ。２．５μｌの２８０ｍＭＭｇＡｃを、各反応物に、反応を開始させるために同時に加えた。反応を３８℃で２０分間行い、サンプルを４分後ボルテックスすることによって撹拌した。驚くべきことに、最も強いシグナルは、サンプルにリソスタフィンを全く加えなかった場合に観察された（図３）。リソスタフィンの添加は、全シグナル強度のわずかな抑制を引き起こしたかもしれない。この実施例は、ある状況では、溶解は必ずしも増幅のために必要ではない場合があることを示す。

（実施例４．増幅反応のために熱処理は必ずしも必要でない）
公知のＳ．ａｕｒｅｕｓキャリアの鼻孔前方からサンプルを採取するために、フロックスワブ（Ｃｏｐａｎ♯５１６ＣＳ０１）を用いた。そのスワブを、３５０μｌの水に浸し、そして次いで廃棄した。次いでそのスワブ液を混合し、そして９９μｌの３ロットのアリコートに分けた。２つのアリコートに１．６５μｌの水を加え、そして３番目に１．６５μｌのリソスタフィン（４３ユニット／μｌ）を加えた。水を加えたアリコートを、４５分間沸騰させるか、または室温で４５分間放置した。リソスタフィンアリコートを、３７℃で４０分間加熱し、そして次いで５分間沸騰させて任意のヌクレアーゼを破壊した。９１．５μｌの各アリコートを、２７μｌの２０％ＰＥＧ、９μｌのｎｕｃＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ１０（配列番号７）、９μｌのｎｕｃＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ６（配列番号８）および３μｌのｎｕｃプローブ１（配列番号９）に加えて、反応混合物を作製した。次いで２連で、４６．５μｌの各反応混合物を、実施例１で記載したような凍結乾燥ＰｒｉｍｅｒＦｒｅｅＲＰＡ反応物を再懸濁するために使用した。２．５μｌの２８０ｍＭＭｇＡｃを、各反応物に反応を開始させるために同時に加えた。反応を３８℃で２０分間行い、サンプルを４分後にボルテックスすることによって撹拌した。同じプライマーおよびプローブならびに公知のコピー数のｎｕｃＰＣＲ産物を用いた２つのポジティブコントロール反応も行った。興味深いことに、この場合、最も強いシグナルは、沸騰にも、リソスタフィン処理に続く沸騰にも供さなかったサンプルで見出された（図４）。この場合、おそらくＤＮＡの損傷または何らかの阻害成分の放出のために、沸騰行為は実際に、全体的感度を低下させた。さらに、短い沸騰の前にリソスタフィンと共にいくらかの時間インキュベートすることは、さらに感度を低下させた。沸騰のみの場合、開始の時間は溶解されていないサンプルと同様であり、このことは、利用可能なコピー数は同じであるが、おそらく最終的な蛍光シグナルの強度を抑える何らかのインヒビターが放出されたことを示す。リソスタフィン前処理の場合は、さらに、シグナルが遅く、おそらくインキュベーションの間のＤＮＡ分解のために、利用可能な標的コピー数が減少したことを示唆する。まとめて考えると、これらのデータは、サンプルをＲＰＡ反応物に入れたときに、ほとんどまたは全ての潜在的な標的ＤＮＡがＲＰＡ試薬にとって利用可能であり、そしてどちらかといえば、加熱または酵素による予備的溶解は、利用可能なコピー数を減少させるか、または望ましくないインヒビターを放出するだけであることを示す。この実施例はさらに、ＲＰＡは、最初の変性を必要とする他の技術と比較して、生物学的サンプルにおいてＳ．ａｕｒｅｕｓを直接検出するために適当な技術であり得ることを示す。

（実施例５．増幅反応のために、ＤＮＡの精製は必ずしも必要でない）
公知のＳ．ａｕｒｅｕｓキャリアの鼻孔前方からサンプルを採取するために、フロックスワブ（Ｃｏｐａｎ♯５１６ＣＳ０１）を用いた。そのスワブを、３００μｌの水に浸し、そして次いで廃棄した。次いでそのスワブ液を混合し、そして１００μｌの２ロットのアリコートに分けた。最初のアリコートに２μｌのリソスタフィン（４３ユニット／μｌ）を加え、２番目のロットはそのままにした。リソスタフィンアリコートを、３７℃で４５分間加熱し、そして次いで５分間沸騰させて任意のヌクレアーゼを破壊した。３μｇのヒトゲノムＤＮＡ（キャリアＤＮＡ）を、溶解させたスワブ液に加え、そして次いで全てのＤＮＡをＱＩＡｇｅｎ’ｓＤｎｅａｓｙＭｉｎｉプロトコールを用いて抽出し、そして１００μｌの水に溶出した。３０．５μｌの溶解されていないアリコートおよび溶解アリコートを、９μｌの２０％ＰＥＧ、３μｌのｎｕｃＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ１０（配列番号７）、３μｌのｎｕｃＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ６（配列番号８）および１μｌのｎｕｃプローブ１（配列番号９）に加えて、反応混合物を作製した。次いで４６．５μｌの各反応混合物を、実施例１で記載したような凍結乾燥ＰｒｉｍｅｒＦｒｅｅＲＰＡ反応物を再懸濁するために使用した。２．５μｌの２８０ｍＭＭｇＡｃを、各反応物に、反応を開始させるために同時に加えた。その反応を３８℃で２０分間行い、サンプルを４分後にボルテックスすることによって撹拌した。同じプライマーおよびプローブならびに公知のコピー数のｎｕｃＰＣＲ産物を用いた２連のポジティブコントロール反応も行った。精製および溶出したＤＮＡは、溶解されていない／未処理サンプルと同様に機能した（わずかに遅い開始であり、低いコピー数を示すが）（図５）。浄化工程が、沸騰単独で示された不十分な増幅曲線を排除したので、このことは、沸騰がＳ．ａｕｒｅｕｓからインヒビターを放出し得、それを続いて浄化プロトコールによって除去し得ることを示唆する。しかし、以前の実験において示されたように、ＲＰＡ反応においてサンプルを直接使用する場合、この損傷試薬には単純に遭遇せず、同時に標的ＤＮＡは完全に利用可能なようである。なぜならば、ＤＮＡ抽出後の遅い開始によって示されるように、処理をした場合にコピー数が減少するようであるからである。

（実施例６．溶解されていない細胞における核酸の検出）
ＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌｆｏｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓパネル由来の、不活性化メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を希釈し、そして公知の量でＲＰＡ反応物に直接加えた。２７．５μｌの水、１μｌのＤＮＡ／細菌／Ｈ_２Ｏ、９μｌの２０％ＰＥＧ、

ここでｆ＝ＦａｍｄＴ、ｘ＝ＴＨＦまたはＤ−スペーサー（脱塩基部位を模倣）、ｂ＝ＢＨＱ１ｄＴ、および３’＝ビオチン−ＴＥＧ、配列番号１５）（全て１．６μＭで）を用いて、実施例１で記載したような凍結乾燥ＰｒｉｍｅｒＦｒｅｅＲＰＡ反応物を再懸濁した。２．５μｌの２８０ｍＭＭｇＡｃを、各反応物に反応を開始させるために同時に加えた。反応を３８℃で２０分間行い、サンプルを４分後にボルテックスすることによって撹拌した。１００個の細菌標的が含まれる場合に、標的核酸は常に検出され、そして１０個の細菌標的が含まれる場合には散発的に検出された（図６）。これらのデータは、サンプル中のほとんどまたは全ての潜在的なＤＮＡ標的が利用可能であるという考えと一致する。実際、１００個の標的からのシグナルは、５０コピーの鋳型コントロールよりも早く開始し、そして１０コピーはわずかに遅く開始し、従って全ての標的が利用可能であったようである。１つの１０標的サンプルの失敗は、抽出無しでの、任意の標的の存在または不在に影響を与える細菌の凝集のため、またはｎｕｃに関するこのＲＰＡテストの全体的なカットオフ感度が約１０コピーであるためであり得る。

（実施例７．溶解無しでのマイコプラズマの核酸の検出）
図７は、任意の最初の溶解処理無しでの、別の細菌標的の直接検出を示す。この場合、ブタマイコプラズマを検出するために開発されたプライマーおよびプローブ

を用いて、それらがマイコプラズマを検出する能力を評価した。アガロースに存在する（力価測定された（ｔｉｔｒｅｄ））、熱不活性化マイコプラズマＭＥＶＴＷ６１を、ＭｙｃｏｐｌａｓｍａＥｘｐｅｒｉｅｎｃｅＵＫから得た。フロックスワブを使用して、サンプルを採取し、それをＲＰＡ再水和緩衝液中に直接浸した。その緩衝液を１０００、１００および５０ｃｆｕのマイコプラズマに希釈し、そして特異的なマイコプラズマ標的を増幅するために構成した、実施例１で記載したようなＲＰＡ反応物を再水和するために使用した。反応環境に入れた人工的なプラスミド配列を標的とする、別の蛍光チャネルで測定した内部コントロールをこの実験に含めた。全ての場合において、そして５０ｃｆｕの感度に下げても、そのテストはブタマイコプラズマ配列を効率的に検出し得た（図７）。

（実施例８．Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検出）
患者においてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの存在を試験するために、患者から痰サンプルを得て、それを再懸濁緩衝液と混合する。その混合物をそのまま使用するか、または溶解に供する。その混合物を、ＲＰＡ反応に供し、ＩＳ６１１０（ＵＳ５，７３１，１５０を参照のこと）および／またはＩＳ１０８１（Ｂａｈａｄｏｒら、２００５、Ｒｅｓ．Ｊ．Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１：１４２−１４５を参照のこと）に対応する核酸種を増幅する。ＩＳ６１１０またはＩＳ１０８１に対応する増幅産物の検出は、患者サンプルにおけるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの存在を示す。

（実施例９．Ａ群連鎖球菌の検出）
患者においてＡ群連鎖球菌の存在を試験するために、患者から喉スワブまたは唾液サンプルを得て、それを再懸濁緩衝液と混合する。その混合物をそのまま使用するか、または溶解に供する。その混合物を、ＲＰＡ反応に供し、Ｓｐｙ１２５８（Ｌｉｕら、２００５、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５６：５６４−５６７を参照のこと）および／またはＳｐｙ０１９３に対応する核酸種を増幅する。Ｓｐｙ１２５８またはＳｐｙ０１９３に対応する増幅産物の検出は、患者サンプルにおけるＡ群連鎖球菌の存在を示す。

（実施例１０．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａの検出）
患者においてＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａの存在を試験するために、患者から膣スワブまたは尿サンプルを得て、それを再懸濁緩衝液と混合する。その混合物をそのまま使用するか、または溶解に供する。その混合物を、ＲＰＡ反応に供し、ＮＧＯ０４６９（Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら、２００７、ＢＭＣＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：６６を参照のこと）および／またはＮＧＯ０４７０に対応する核酸種を増幅する。ＮＧＯ０４６９またはＮＧＯ０４７０に対応する増幅産物の検出は、患者サンプルにおけるＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａの存在を示す。

（実施例１１．クラミジアの検出）
患者においてクラミジアの存在を試験するために、患者から膣スワブまたは尿サンプルを得て、それを再懸濁緩衝液と混合する。その混合物をそのまま使用するか、または溶解に供する。その混合物を、ＲＰＡ反応に供し、クラミジア潜在プラスミド（Ｈａｔｔら、１９８８、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：４０５３−６７を参照のこと）に対応する核酸種を増幅する。潜在プラスミドに対応する増幅産物の検出は、患者サンプルにおけるクラミジアの存在を示す。

（実施例１２．Ｂ群連鎖球菌の検出）
患者においてＢ群連鎖球菌の存在を試験するために、患者から膣または直腸スワブを得て、それを再懸濁緩衝液と混合する。その混合物をそのまま使用するか、または溶解に供する。その混合物を、ＲＰＡ反応に供し、ｃｆｂ遺伝子（Ｐｏｄｂｉｅｌｓｋｉら、１９９４、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：２３９−２５６を参照のこと）に対応する核酸種を増幅する。ｃｆｂ遺伝子に対応する増幅産物の検出は、患者サンプルにおけるＢ群連鎖球菌の存在を示す。

（実施例１３．ＨＩＶの検出）
患者においてＨＩＶの存在を試験するために、患者から血液サンプル（例えば全血またはバフィーコート）を得て、それを再懸濁緩衝液と混合する。その混合物をそのまま使用するか、または溶解に供する。その混合物を、ＲＰＡ反応に供し、Ｐｏｌ領域に対応する核酸種を増幅する。Ｐｏｌ領域に対応する増幅産物の検出は、患者サンプルにおけるＨＩＶの存在を示す。

（他の実施態様）
本発明の多くの実施態様が記載された。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から離れることなく、様々な修飾を行い得ることが理解される。よって、他の実施態様が、以下の特許請求の範囲内である。

Claims

明細書に記載された発明。