CN107937614B - 克里米亚-刚果出血热病毒检测方法及引物探针组 - Google Patents

Abstract

本公开公开了重组酶聚合酶扩增检测克里米亚‑刚果出血热病毒用引物探针组和试剂盒及检测方法，包括具有SEQ ID NO.1‑2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针。本公开还提供了一种重组酶聚合酶扩增检测克里米亚‑刚果出血热病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案本公开显著地提高了对克里米亚‑刚果出血热病毒检测的敏感性、特异性和简便性。

Description

克里米亚-刚果出血热病毒检测方法及引物探针组

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种克里米亚-刚果出血热病毒检测方法及引物探针组。

背景技术

克里米亚-刚果出血热是由克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congohemorrhagic fever virus)引起的，经蜱媒传播的具有高病死率的急性病毒传染病，人群普遍易感，也是欧、亚、非三大洲都有分布的蜱媒自然疫源性病毒疾病。在中国国内首先发现与新疆巴楚，所以在中国也称新疆出血热。

克里米亚-刚果出血热是目前我国存在的唯一被证实有自然暴发流行的生物安全四级(Laboratory Biosafety Level 4，BSL-4)病原体。已在新疆发生数次局部暴发流行。本病以皮肤、黏膜和内脏出血为主要病变特征，临床表现与其他型出血热相似，惟肾脏的损伤较为轻微。患者入院时多呈重症，病死率高达50％，本病因医院内感染而造成的暴发流行高达70％，通过患者带病毒血液传播感染的机会比气溶胶途径为多。国内也曾发生过医务人员在抢救患者中被感染发病以致死亡的事例。

克里米亚-刚果出血热需要通过实验室手段确诊，常用的方法有病毒分离、电镜观察、常规PCR和ELISA等方法。传统检测方法中，病毒分离培养是检测金标准，但同时存在以下缺点：1、克里米亚-刚果出血热病毒培养须在P4实验室进行，对实验条件要求高；2、细胞培养检测结果受主观因素干扰较大；3、从接种病毒到出现明显的细胞病变需要较长时间；4、有些病毒无法进行细胞培养或者不出现明显的细胞病变，或者根据细胞病变无法确定型别；5、同一时期无法处理大量样本。而免疫学检测中，其检测的灵敏度较低，且难以避免“窗口期”问题，不能反映病毒早期感染，复制状态及预后信息，常造成大量的漏检情况，延误病情。同时病毒易变异、不同型别病原体间的交叉反应均有可能影响检测结果。

所以建立快速、准确、简便、特异的克里米亚-刚果出血热病毒检测技术，对病例的快速识别和疫情的传播控制具有重要意义。

发明内容

本公开的目的是解决现有技术中不能对克里米亚-刚果出血热病毒进行快速、灵敏和特异的检测的缺陷，提供一种克里米亚-刚果出血热病毒的检测引物探针和试剂盒，并建立一种基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术的克里米亚-刚果出血热病毒的快速、灵敏、特异，简便的检测方法。

为了实现上述目的，本公开的第一个方面提供重组酶聚合酶扩增检测克里米亚-刚果出血热病毒用引物探针组，其中，包括具有SEQ ID NO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针；

其中，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有FAM发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1，3’末端标记有磷酸盐基团。

可选的，还包括具有SEQ ID NO.4-5所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ IDNO.6所示核苷酸序列的探针；其中，SEQ ID NO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3，3’末端标记有磷酸盐基团。

本公开的第二个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测克里米亚-刚果出血热病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA；

(2)以所述总RNA为模板，并使用本公开第一个方面所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；

(3)收集FAM检测通道荧光信号，得到检测结果；

若FAM荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有克里米亚-刚果出血热病毒。

可选的，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.08-0.15μM。

可选的，重组酶聚合酶扩增反应的条件包括在37-42℃下恒温扩增15-25min。

可选的，扩增反应的体系中包括浓度为150-250U/μL的逆转录酶，2-3U/μL的重组酶，0.5-0.75U/μL的聚合酶，10-20mmol/L的醋酸镁，1-10⁵拷贝/μL的RNA模板

本公开的第三个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测克里米亚-刚果出血热病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。

本发明的有益效果在于：

本公开建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测克里米亚-刚果出血热病毒的检测方法，能够实现形态学、免疫学以及实时荧光检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：

(一)耗时短

逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)不需将RNA转化为cDNA再进行扩增反应，只需要将RPA体系与逆转录酶混合，构建RT-RPA反应体系，就可直接以RNA为模板，实现逆转录与检测过程的一体化。整个反应20min即可完成，而RT-PCR、Real-time PCR、LAMP等技术仅逆转录过程就需要30min的时间，整个反应需要60-90min才可完成。

(二)对仪器平台要求低

RPA反应可在常温下进行，不需要配备专门的热循环扩增仪，更好的实现了克里米亚-刚果出血热病毒的现场应急检测。

(三)特异性好

RPA可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力，而LAMP和普通Real-time PCR则无法识别SNP，这使得RPA检测的特异性明显优于LAMP和Real-timePCR。本发明所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性。所有引物探针都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括汉坦病毒、汉城病毒、安第斯病毒、辛德毕斯病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒等的核酸，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。

(四)最低检出限

本发明所建立的检测方法的最低检出限可达到5拷贝/反应。

(五)成本较低

本发明所建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测克里米亚-刚果出血热病毒的方法在操作性上降低了人力成本和时间成本。该方法无需复杂高端仪器，反应条件仅为一步39度，无需复杂操作。

(六)预防假阴性结果

本发明反应体系中添加的IAC，可以有效的提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开的一种实施方式提供了重组酶聚合酶扩增检测克里米亚-刚果出血热病毒用引物探针组，其中，包括具有SEQ ID NO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ IDNO.3所示核苷酸序列的探针；

其中，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有FAM发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1，3’末端标记有磷酸盐基团。

本公开的引物探针组选择特异性的检测基因或保守序列，需要保证引物探针区段分别能够全面覆盖克里米亚-刚果出血热病毒。而且设计过程中要充分考虑避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，而由于RPA对引物长度要求为30-38nt，探针最长45nt，这样的序列容易在恒温条件下产生大量的引物二聚体从而影响实验效果，因此也对引物的设计提出了更高的要求。最终获得本公开提供的一套特异的引物探针序列(详见表1)。

表1克里米亚-刚果出血热病毒RPA检测引物探针汇总表

检测克里米亚-刚果出血热病毒的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

检测阳性内对照的上下游引物和探针的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示。自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3，3’末端标记有磷酸盐基团。

在本公开的一种实施方式中，涉及一种重组酶聚合酶扩增(PRA)检测克里米亚-刚果出血热病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA；

(2)以所述总RNA为模板，并使用本公开所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；

(3)收集FAM检测通道荧光信号，得到检测结果；

a)若FAM荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有克里米亚-刚果出血热病毒。

b)若内质控样本探针的荧光通道无明显扩增曲线，则判定为非特异性扩增。

在本公开的一种实施方式中，用于进行内质控样本检测的引物探针为SEQ IDNO.4-5所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的探针；并且，SEQID NO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3，3’末端标记有磷酸盐基团。依据CY5荧光通道有无扩增曲线，判断是否为非特异性扩增。

PRA引物探针浓度及反应体系配置如下：

总体系50μL，缓冲液(25μL)，包括150-200U/μL的逆转录酶，2-3U/μL的重组酶，0.5-0.75U/μL的聚合酶，10-20mmol/L的醋酸镁，1-105拷贝/μL的RNA模板，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.08-0.15μM。

在本公开的一种实施方式中，RPA反应的条件包括在37-42℃下恒温扩增15-25min。在本公开的一种特别优选的实施方式中，为了提高反应的灵敏度及特异性，RPA反应的条件包括在39℃下恒温扩增20min。

本公开的检测方法的直接目的不是获得诊断结果和健康状况，而只是对已经脱离人体或动物体的样品进行检测，所获得的仅仅是作为中间结果的信息。

本公开还提供了一种含有前述RPA检测引物探针组的试剂盒。

优选的，所述试剂盒中还含有内质控序列模板。

在本公开的一种实施方式中，所述试剂盒还包括5×反应体系缓冲液、冻干重组酶粉、冻干聚合酶粉、逆转录酶、10×引物探针混合物、阳性对照和超纯水。

以下，通过实施例进一步详细说明本公开。

实施例1

本实施例用于说明克里米亚-刚果出血热病毒特异性引物探针验证试验。

委托试剂公司合成表2所示的克里米亚-刚果出血热病毒引物探针组以及内质控引物探针组。

表2

SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有FAM发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1，3’末端标记有磷酸盐基团。

SEQ ID NO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3，3’末端标记有磷酸盐基团。

对比例1

委托试剂公司合成表3所示的用于扩增检测克里米亚-刚果出血热病毒的对比引物探针1和2。

表3

测试例1

克里米亚-刚果出血热病毒特异性引物探针验证试验

对实施例1和对比例1中设计的三套克里米亚-刚果出血热病毒特异性引物对和探针进行评估和验证，主要评估特异性、最低检出限和覆盖度。

(1)特异性评估：选择体外转录的埃博拉病毒(苏丹型，扎伊尔型)、SAS病毒、MERS病毒、伊波拉病毒、甲型H7N9病毒、登革热病毒Ⅰ～Ⅳ型、黄热病毒、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、柯萨奇病毒、克里米亚-刚果核酸作为特异性评估样本，进行核酸提取。每种核酸模板取10μL等体积混合，综合核酸作为特异性评估模板。

按照如下操作配制反应体系：总体系50μL，向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmpExo反应管(货号：TAEXO02KIT)中加入再水化缓冲液29.5μL，醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)，引物各2μL(10μM)，探针0.5μL(10μM)，逆转录酶1μL(200U/μL)，模板5μL，剩余用水补足；

RPA反应的反应条件：选择FAM作为报告基团，RPA反应程序如下：39℃10s，39℃10s，39℃10s(收集荧光)，40个循环。

(2)最低检出限评估：用限制性内切酶SpeI和PvuII酶切重组有克里米亚-刚果出血热病毒基因序列的标准品质粒，将其线性化并进行体外转录；选取初始浓度为10⁵拷贝/μL转录产物梯度稀释，体系配制和RPA反应条件同特异性评估。

实施例1的引物探针组和对比引物探针组1可以检测到1拷贝/μL的模板，相当于每个体系检测出5拷贝克里米亚-刚果出血热病毒模板。对比引物探针组2可以检测到20拷贝/μL的模板，相当于每个体系检测出100拷贝克里米亚-刚果出血热病毒模板。

(3)覆盖度验证：选择10株体外转录的克里米亚-刚果出血热病毒核酸作为覆盖度评估用模板。体系配制和RPA反应条件同特异性评估。

实验表明所设计实施例1的引物探针组和对比引物探针组1对克里米亚-刚果出血热病毒核酸均可检出

测试例2

克里米亚-刚果出血热病毒特异性引物、探针和内对照特异性引物、探针的匹配

将实施例1中的克里米亚-刚果出血热病毒特异性引物探针、对比例1中的对比引物探针1分别与表2中的内质控引物探针同时加入到反应体系中，进行评估和验证，主要评估特异性、最低检出限和覆盖度。

特异性评估模板、反应体系配制、RPA反应条件同测试例1。

最低检出限评估：用限制性内切酶SpeI和PvuII酶切重组有克里米亚-刚果出血热病毒基因序列的标准品质粒，将其线性化并进行体外转录；选取初始浓度为10⁵拷贝/μL转录产物梯度稀释，体系配制和RPA反应条件同测试例1。

在实施例1的引物探针组的双重反应体系中加入混合模板，里米亚-刚果出血热病毒的最低检出限为5拷贝/反应；

在对比例的引物探针组1的双重反应体系中加入混合模板，克里米亚-刚果出血热病毒的最低检出限为100拷贝/反应。

实验表明，实施例1的克里米亚-刚果出血热病毒引物探针组与内质控引物探针组进行配合，最低检出限与单重体系相当，不干扰相互的扩增。而当对比引物探针组1与其混合时，最低检出限较单重体系下降了一个数量级。

实施例2

一种重组酶聚合酶扩增检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物、探针及试剂盒的组建

该试剂盒含有2×RT-RPA缓冲液、冻干酶粉、引物各2μL(10μmol/L)，探针0.5μL(10μmol/L)、逆转录酶1μL(200U/μL)、阳性对照、超纯水。

试剂盒检测的反应体系为50μL，其配制如下：2×RT-RPA缓冲液25μL；冻干酶粉；引物各2μL(10μmol/L)，探针0.5μL(10μmol/L)；逆转录酶1μL(200U/μL)；模板5μL，超纯水15μL。

实施例3

试剂盒的操作和结果判断

1.病毒核酸的提取

采用商品化提取试剂提取体外转录RNA。

2.反应体系的配制

取200μL的RPA管配制50μL的反应体系，其配制如下:2×RT-RPA缓冲液25μL；冻干酶粉；引物各2μL(10μmol/L)，探针0.5μL(10μmol/L)；逆转录酶1μL(200U/μL)；模板5μL，超纯水15μL。

3.RPA反应

将RPA管放入实时荧光RPA仪中，选择FAM和CY5作为报告基团，RPA反应程序如下：39℃10s，39℃10s，39℃10s(收集荧光)，40个循环。

4、结果判断

空白对照和阴阳性对照成立，否则视实验结果无效。若样本有扩增曲线，根据扩增曲线颜色进行结果判定。FAM通道有扩增曲线判定为克里米亚-刚果出血热病毒阳性，CY5通道检测人的RP基因，质控样本采集、提取的质量。

测试例3

试剂盒的保存期试验

以100拷贝/μL的克里米亚-刚果出血热病毒体外转录RNA作为评估用模板。

在第0天时，分装成10份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。保存期检测结果如表4所示。

表4保存期试验结果

保存期	克里米亚-刚果出血热病毒
		第0天	+
第10天	+
		第15天	+
第30天	+
		第60天	+
第90天	+
		第120天	+
第150天	+
		第180天	+
第360天	+

由表4可知，试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，实验结果表明该试剂盒的保存期至少为一年。

测试例4

试剂盒检测与文献方法的比较

评价本发明试剂盒与文献报道(ASimple-Probe real-time PCR assay forgenotyping reassorted andnon-reassorted isolates of Crimean-Congo hemorrhagicfever virus in southern Africa)效果比较，主要从检测时间、操作便捷性、样品耐受程度、最低检出限、特异性和覆盖度等方面进行比较。

评价用阳性样本：克里米亚-刚果出血热病毒体外转录RNA模板各10株。

评价用阴性样本：选择体外转录的埃博拉病毒(苏丹型，扎伊尔型)、SAS病毒、MERS病毒、伊波拉病毒、甲型H7N9病毒、登革热病毒Ⅰ～Ⅳ型、黄热病毒、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、柯萨奇病毒、克里米亚-刚果的核酸作为特异性验证模板，等比例混合成一个的特异性评估模板。

检测所需时间评估：评价从体系扩增到结果判定所需要的时间。

可操作性评估：评估检测所需配制反应管数，实验操作繁琐程度。

结果判定方式评估：评价结果判定方式是否简便、直观，是否会接触危险物质。

特异性评估：按照本发明测试例2和文献方法进行特异性评估操作。

覆盖度评估：采用本发明测试例2和文献方法分别检测19株评价用阳性核酸样本。

样本耐受性评估：评估采用乙醇沉淀法提取核酸(如沉淀法之类的简单方法，根据样本自行组织语言)是否满足检测要求。检测方法参照覆盖度评估。

最低检出限评估：采用本发明测试例2和文献方法分别检测梯度稀释的克里米亚-刚果出血热病毒体外转录RNA。

比较结果：本发明试剂盒只需要配制1管反应体系，20min完成一步法RT-RPA反应，文献报道108min完成PCR扩增，本发明试剂盒显著缩短了检测时间。本发明试剂盒通过观察扩增曲线判定结果，简单快速直接。而文献报道方法采用溶解曲线看结果，操作时间长。

本发明试剂盒和文献报道方法检测阴性样本结果均为阴性，表明均具有较好的特异性。

本发明试剂盒检测评价用阳性样本，均获得阳性结果，而文献报道方法有19株克里米亚-刚果出血热病毒，有2株克里米亚-刚果出血热病毒的漏检。

采用乙醇沉淀法简单处理样本，本发明试剂盒检测评价阳性样本，均获得阳性结果，而文献报道方法有3株克里米亚-刚果出血热病毒和6株克里米亚-刚果出血热病毒的漏检。说明本发明试剂盒对模板的耐受度高，无需复杂的样本提取，更适合现场应急检测。

本发明试剂盒和文献报道方法的最低检出限对比如下表5。

表5本发明与文献报道方法最低检出限对比

检测目标名称	本发明最低检出限	文献报道最低检出限
			克里米亚-刚果出血热病毒	5拷贝/反应	100拷贝/反应

由上表可知，对于样本中痕量的克里米亚-刚果出血热病毒，本发明试剂盒比文献报道有更强的检测能力。本发明试剂盒的最低检出限显著优于文献报道方法。

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司

<120> 克里米亚-刚果出血热病毒检测方法及引物探针组

<130> 7075ABT

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gtggaggaaa gacataggtt tccgtgtcaa tgcaaac 37

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tacaccactc cacatgttca cggctgactg ggc 33

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gttcctggcg aaattgtaat gtctgttaaa tgatgatgtt gtcaga 46

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ctatcaaaga ctccacaatg agaaggtata caatt 35

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ttcttttcag ccctcacact tggctttctt ggaa 34

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

caaggctgcg gtgtccacca actgccgagc tagtcgcttc tccat 45

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ttgaggagtt caagaagggg aatggacttg tggacac 37

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

agtcccttct tgacaatgcc agtggagcta gcc 33

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tctacgcatc tgctctggtg gaagcaacca aatttttgtt gcacctat 48

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

agctgaaagt tgaagttccc aaaatagaac aa 32

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

cacatgttca cggctgactg ggccgcgtgg gtt 33

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ctggcgaaat tgtaatgtct gttaaagaga tgtttgttca gatatgat 48

Claims (3)

1.重组酶聚合酶扩增检测克里米亚-刚果出血热病毒用引物探针组，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针；

其中，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有FAM发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1，3’末端标记有磷酸盐基团。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其中，还包括如SEQ ID NO.4-5所示核苷酸序列的引物，以及，如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的探针；其中，SEQ ID NO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3，3’末端标记有磷酸盐基团。

3.重组酶聚合酶扩增检测克里米亚-刚果出血热病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。