CN117551817A - 一种检测甲型流感病毒的靶基因、引物探针组合以及试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测甲型流感病毒的靶基因、引物探针组合以及试剂盒和应用，标志物的序列具有SEQ ID NO.1所示序列或特异性片段。本发明所提供的双重IAV检测方法，检测用时短、仪器设备简单、实验成本低、无需变温条件，而且本发明方法中含有了内参引物对和内参探针排除了假阴性和无效结果，具有良好的特异性和灵敏性，分析灵敏度达到1拷贝/μL，适用于大量样本检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其是涉及一种检测甲型流感病毒的靶基因、引物探针组合以及试剂盒和应用。
背景技术
呼吸道病毒是一组能够通过呼吸道感染引起呼吸系统和其他系统疾病的病毒，呼吸道病毒感染是人类最常见的疾病之一，对人类健康以及全球公共卫生造成巨大威胁。常见的呼吸道病毒有甲型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、腺病毒、冠状病毒等。其中，甲型流感病毒（Influenza A virus， IAV）感染导致的流感是一种呼吸系统疾病，具有高度传染性，其爆发严重影响公共卫生安全。
当前，甲型流感病毒检测方法主要包括核酸检测和抗原抗体检测，其中核酸检测被认为是检测的金标准。目前，应用最为广泛的是基于实时荧光RT-PCR的分子检测技术。但是该技术需要配套精密的温控仪器、复杂的实验程序，以及专业的技术人员，其检测成本高，且检测时间较长（一般为2 h）。
重组酶聚合酶扩增技术 (Recombinase polymerase amplification，RPA) 是近年来发展迅速的核酸体外扩增检测技术，其区别于常规PCR扩增技术的关键在于扩增反应的温度不同，其扩增在37-42℃的恒温条件下，20 min内即可实现对目的基因的指数级扩增，具有快速、灵敏、操作简便、成本低等特点。
此外，在以往重组酶聚合酶扩增检测技术的一个主要缺点是它们不包含内参。内参是存在于同一管样品管中的非靶核酸序列，可作为重要的质控。阴性反应（没有信号或检测条带）可能是没有靶序列。但是，这也可能是由于采样问题、样本运输或储存不当、核酸酶污染、RPA反应体系不正确、样本基质干扰或检测操作失误等，导致了假阴性结果。相反，在含有内参的RPA反应中，即使没有靶序列，也应该始终产生质控信号。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种检测结果准确、无假阴性的快速、高灵敏、高特异的检测甲型流感病毒的方法。
为实现以上目的，经过序列比对和筛选，本发明首先提供一条用于检测甲型流感病毒的标志物，标志物具有SEQ ID NO.1所示序列或特异性片段。
进一步地，根据上述标志物设计了多条特异性的引物对和靶探针，对其进行筛选确定最优的引物序列对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-4所示。本发明探针类型为AP位点核酸内切酶探针，分别于四氢呋喃THF两侧标记荧光基团和淬灭基团，且两基团之间间隔1-5bp。
进一步地，本发明设计的内参引物对和内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-7所示。该内参探针类型为AP位点核酸内切酶探针，分别于四氢呋喃THF两侧标记荧光基团和淬灭基团，且两基团之间间隔1-5bp。
本发明还提供了所述的标志物在重组酶介导的恒温核酸扩增技术检测甲型流感病毒中的应用。
具体地，本发明还提供了一种适用于重组酶介导的恒温核酸扩增技术检测甲型流感病毒的引物探针组合，该组合含有一对特异性引物对和一条靶探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，所述靶探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
本发明基于RPA技术，在反应体系中加入了内源的内参，实现对样本采集到检测结果的全过程监测，进一步确保了检测结果的准确性。
优选地，本发明还提供了含有所述引物探针组合中还含有一对内参引物对和内参探针，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
本发明还提供了一种含有上述引物探针组合的重组酶介导的恒温核酸扩增体系。
本发明通过利用蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段、蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA等组分构建重组酶介导的恒温核酸扩增体系，用于甲型流感病毒检测。
本发明提出的重组酶介导的恒温核酸扩增体系包括：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段、蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA、T4噬菌体单链DNA结合蛋白，T4噬菌体重组调节蛋白、AP位点核酸内切酶、逆转录酶、肌酸激酶、Tirs缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐（TCEP）、海藻糖、聚乙二醇20000、dNTP、ATP、磷酸肌酸、精氨酸盐酸盐、核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的正向引物、核苷酸序列如SEQID NO. 3所示的反向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的靶探针、核苷酸序列如SEQID NO. 5所示的内参正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内参反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示的内参探针。
进一步的，所述重组酶介导的恒温核酸扩增体系中各个组分的浓度为：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段 10-100 ng/μL；
蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA 60-300 ng/μL；
T4噬菌体单链DNA结合蛋白 200-1000 ng/μL；
T4噬菌体重组调节蛋白 30-200 ng/μL；
AP位点核酸内切酶 30-200 ng/μL；
逆转录酶 5-50 U/μL；
肌酸激酶 100-1000 ng/μL；
Tirs缓冲液 50-200 mM；
醋酸钾 100-400 mM；
醋酸镁 20-100 mM；
三(2-羰基乙基)磷盐酸盐 10-40 mM；
海藻糖 2%-10 %；
聚乙二醇20000 2%-10 %；
dNTP 20-300 µM ；
ATP 2-50 mM；
磷酸肌酸 20-100 mM；
精氨酸盐酸盐 1-20 mM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的正向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的反向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的靶探针 50-400 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的内参正向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内参反向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示的内参探针 50-400 nM。
该体系中，所述靶探针和内参探针中分别标记不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TET、JOE、Cy5、Cy3、TAMRA。
本发明还提供了所述的引物探针组合在制备快速检测甲型流感病毒试剂盒中的应用。
进一步的，本发明的试剂盒含有上述重组酶介导的恒温核酸扩增体系。
结果判读：将反应管置于恒温荧光检测仪、酶标仪或荧光PCR仪中，读取荧光信号，根据IAV靶标和内参序列检测结果进行判断：
IAV靶标和内参基因检测结果均出现荧光信号增强，检测结果为阳性。
IAV靶标检测结果未出现荧光信号增强，内参基因检测结果出现荧光信号增强，检测结果为阴性。
IAV靶标检测结果出现荧光信号增强，内参基因检测结果未出现荧光信号增强，检测结果可能是假阳性，建议重复实验或者重新采样进行检测。
IAV靶标和内参基因检测结果均未出现荧光信号增强，检测结果可能是假阴性，建议重复实验或者重新采样进行检测。
本领域技术人员可以理解，基于非疾病诊断目的，本发明还提供了一种快速检测甲型流感病毒的含内参双重恒温核酸快速扩增方法，以本发明上述含有内参引物对和内参探针组合对待测样本模板进行恒温核酸扩增检测，所述待测样本模板为待测样本的RNA或DNA。
本发明所提供的双重IAV检测方法，检测用时短、仪器设备简单、实验成本低、无需变温条件，而且本发明方法中含有了内参引物对和内参探针排除了假阴性和无效结果，具有良好的特异性和灵敏性，分析灵敏度达到1拷贝/μL，适用于大量样本检测。
附图说明
图1为实施例1的重组酶介导恒温扩增体系有效性验证结果（其中A为重组酶介导恒温扩增体系中关键蛋白表达纯化结果，B和C为重组酶介导恒温扩增体系扩增活性验证结果）。
图2为实施例2的方法对甲型流感病毒扩增引物对的筛选结果。
图3为实施例2的方法对甲型流感病毒和内参基因实时荧光恒温扩增双重检测扩增曲线。
图4为实施例3对不同浓度梯度的甲型流感病毒RNA实时荧光恒温扩增检测结果。
图5为本发明检测试剂盒对甲型流感病毒检测灵敏度分析结果。
图6为本发明检测试剂盒对甲型流感病毒实时荧光恒温扩增检测技术特异性分析。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1 重组酶介导的恒温扩增体系的构建
通过氨基酸序列检索比对以及AlphaFold蛋白结构数据库筛查，挖掘出蜡状芽孢杆菌DNA聚合酶大片段、蜡状芽孢杆菌DNA重组酶，T4 噬菌体单链DNA结合蛋白和重组调节蛋白，通过基因合成构建表达质粒，表达纯化4种蛋白质，通过恒温扩增反应进行反应体系活性验证，结果如图1A和图1B所示。DNA聚合酶大片段、DNA重组酶、重组调节蛋白和DNA结合蛋白都存在时，可进行扩增反应；当缺失其中任何一个蛋白时，则无法高效扩增（如图1C所示）。
具体反应体系为：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段 30 ng/μL；
蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA 180 ng/μL；
T4噬菌体重组调节蛋白UvsY 60 ng/μL；
T4噬菌体单链DNA结合蛋白Gp32 600 ng/μL；
逆转录酶M-MLV 10 U/μL；
RNase inhibitor 1 U/μL；
Tirs缓冲液 80 mM；
KAc 200 mM；
TCEP 20 mM；
PEG20000 5%（w/v）；
dNTP 100 µM；
ATP 10 mM；
磷酸肌酸 50 mM；
肌酸激酶 1 µg/µL；
海藻糖 5%（w/v）；
精氨酸盐酸盐 10 mM；
醋酸镁 280mM。
实施例2 用于恒温核酸扩增检测的甲型流感病毒特异性引物对、靶探针以及内源RNase P内参引物对和内参探针的设计、筛选和确定
下载全部甲型流感病毒全基因组序列，进行序列比对，筛选同源性高的保守序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：5’-ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTTTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTGGAAAGTGTCTTTGCAGGAAAGAACACAGATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAAATGGGAATGGGGACCCG-3’。
在该保守区域设计多条特异性引物和靶探针，经过实验验证，最终筛选确定扩增效果最好的一套引物探针。根据人基因组保守序列，筛选靶向人核糖核酸酶RNase P基因的内参引物对和内参探针。通过对甲型流感病毒引物对筛选，筛选结果如图2所示，最终确定SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为最优组合。
表1 甲型流感病毒恒温扩增引物组合
表2 内参基因引物序列
实施例2检测甲型流感病毒的含内参双重恒温核酸扩增方法
1. 甲型流感病毒RNA的提取
采用病毒RNA提取试剂盒提取甲型流感病毒阳性的咽拭子样本总RNA。
2. 扩增体系配置（终体积为50μL）：
DNA聚合酶大片段 30 ng/μL；
DNA重组酶 180 ng/μL；
重组调节蛋白UvsY 60 ng/μL；
DNA结合蛋白Gp32 600 ng/μL；
逆转录酶M-MLV 10 U/μL；
RNase inhibitor 1 U/μL；
Tris Ac 80 mM；
KAc 200 mM；
MgAc 50 mM；
TCEP 20 mM；
PEG20000 5%；
dNTPs 100 µM；
ATP 10 mM；
磷酸肌酸 50 mM；
肌酸激酶 1 µg/µL；
海藻糖 5%；
精氨酸盐酸盐 10 mM；
激活剂MgAc 280mM；
靶探针 200 nM；
正向引物 400 nM；
反向引物 400 nM；
内参探针 200 nM；
内参正向引物 400 nM；
内参反向引物 400 nM。
以上配置好的恒温扩增体系可以直接进行扩增反应，也可冷冻干燥成为粉末状扩增体系。
3. IAV检测
将提取的样本RNA 2 μL加入到反应体系中，42°C反应，利用荧光PCR仪进行荧光信号实时检测，甲型流感病毒和内参基因实时荧光恒温扩增双重检测扩增曲线如图3所示。结果显示，在3 min之后开始显示扩增的荧光信号，且每一个反应管均检测到IAV扩增信号和内参基因扩增信号，从而排除了假阴性和无效结果。
实施例3 灵敏度、特异性和重复性分析
1.灵敏度分析
将甲型流感病毒RNA进行梯度稀释（100拷贝/微升-1010拷贝/微升），以蒸馏水作为阴性对照，2 μL RNA样本加入到扩增反应体系中，进行恒温扩增检测实验，实验重复3次，统计分析检测结果如图4-图5所示，结果显示检测灵敏度达到100拷贝/微升（相当于2拷贝/反应）。
2. 特异性评价
利用本发明所建立的甲型流感病毒检测方法对其他常见呼吸道病毒（例如呼吸道合胞病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒）以及细菌、人基因组进行检测，结果如图6所示，仅甲型流感病毒样本有显著扩增信号，而其他呼吸道病毒以及细菌无扩增信号，说明检测本发明所建立的甲型流感病毒特异性地甲型流感病毒。
本发明甲型流感病毒检测方法较已报道的甲型流感病毒恒温扩增检测方法具有更高的灵敏度和特异性，具体比较结果请见表3和表4。
表3 甲型流感病毒恒温扩增检测方法比较一
表4 甲型流感病毒恒温扩增检测方法比较二
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于检测甲型流感病毒的标志物，其特征在于：所述标志物具有SEQ ID NO.1所示序列或特异性片段。
2.权利要求1所述的标志物在采用重组酶介导的恒温核酸扩增技术检测甲型流感病毒中的应用。
3.用于检测甲型流感病毒的引物探针组合，其特征在于：包括一对引物对和靶探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，所述靶探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于：还包括有一对内参引物对和内参探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
5.根据权利要求4所述的引物探针组合，其特征在于：所述靶探针和内参均为AP位点核酸内切酶探针，均分别于四氢呋喃两侧标记荧光基团和淬灭基团，且两基团之间间隔1-5bp；所述靶探针、内参探针中分别标记不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TET、JOE、Cy5、Cy3、TAMRA。
6.权利要求3-5任一所述的引物探针组合在采用重组酶介导的恒温核酸扩增技术检测甲型流感病毒中的应用。
7.一种重组酶介导的恒温核酸扩增体系，其特征在于：所述重组酶介导的恒温核酸扩增体系包括：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段、蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA、T4噬菌体单链DNA结合蛋白，T4噬菌体重组调节蛋白、AP位点核酸内切酶、逆转录酶、肌酸激酶、Tirs缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、海藻糖、聚乙二醇20000、dNTP、ATP、磷酸肌酸、精氨酸盐酸盐、核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的反向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的靶探针、核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的内参正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内参反向引物和核苷酸序列如SEQID NO. 7所示的内参探针。
8.根据权利要求7所述的重组酶介导的恒温核酸扩增体系，其特征在于：所述重组酶介导的恒温核酸扩增体系中各个组分的浓度为：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段 10-100 ng/μL；
蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA 60-300 ng/μL；
T4噬菌体单链DNA结合蛋白 200-1000 ng/μL；
T4噬菌体重组调节蛋白 30-200 ng/μL；
AP位点核酸内切酶 30-200 ng/μL；
逆转录酶 5-50 U/μL；
肌酸激酶 100-1000 ng/μL；
Tirs缓冲液 50-200 mM；
醋酸钾 100-400 mM；
醋酸镁 20-100 mM；
三(2-羰基乙基)磷盐酸盐 10-40 mM；
海藻糖 2%-10 %；
聚乙二醇20000 2%-10 %；
dNTP 20-300 µM ；
ATP 2-50 mM；
磷酸肌酸 20-100 mM；
精氨酸盐酸盐 1-20 mM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的正向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的反向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的靶探针 50-400 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的内参正向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内参反向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示的内参探针 50-400 nM。
9.权利要求3-5任一所述的引物探针组合在制备快速检测甲型流感病毒试剂盒中的应用。
10.一种快速检测甲型流感病毒试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求7或8所述的重组酶介导的恒温核酸扩增体系。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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