CN113755641A - 检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增用引物探针组和试剂盒 - Google Patents

检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增用引物探针组和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增用引物探针组和试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明提供的适用于人乳头瘤病毒16型和18型检测的等温核酸扩增用内源性内参的特异性引物对和探针可在等温条件下进行，可用于人乳头瘤病毒16型、18型以及内参DNA的扩增，反应时间在5～20min内，灵敏度高、特异性好、内源性内参的加入有效的降低了因标本取样、试剂盒失效或实验操作等原因导致的假阴性的发生，更适合应用于有大量样品的检测，便于临床上的应用，该方法适用于对人乳头瘤病毒16型和18型的快速检测。

Description

检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增用引物探针组 和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增用引物探针组和试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是一种环状DNA病毒，属乳头瘤病毒家族，可引起人类黏膜组织良性及恶性肿瘤。目前发现的HPV型别已超过150种。在临床上根据HPV不同亚型的致病力的大小和致癌的危险性的大小将HPV分为低危型和高危型两大类。高危型HPV感染可引起宫颈、阴道、肛门、阴茎和口咽部位的上皮内瘤变或癌变。HPV16和HPV18为感染率最高的亚型，因此，快速、准确的检测出HPV16和HPV18对宫颈癌的早期诊断、早期治疗和预防其流行等具有重要意义。
人乳头瘤病毒不能进行体外培养，目前HPV的实验室诊断方法主要有细胞学检查、分子生物学检查、阴道镜检查和病理学检查等。细胞学检查是诊断HPV感染的金标准。然而，传统的细胞学检查很难在早期区分病毒感染，因此假阴性的可能性很高。而且，巴氏染色的观察范围是有限的，达到了灵敏度的顶点。阴道镜检查和病理学检查对形态表现不典型者特异性较差，且易受到制片质量和阅片者主观因素的干扰。目前已经开发了各种用于HPV筛查的分子检测技术，如聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)、免疫层析测定(Immunochromatography)和原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)等。第二代杂交捕获(Hybrid captureП，HCП)技术被广泛用于HPV检测，对宫颈癌的筛查具有很高的特异性和敏感性，但其最大的缺点是不能特异性分型，并且会产生交叉反应。PCR只适用于特定的设施和实验室，因为它需要精确的温度控制设备和复杂的分析仪器，以及高水平的专业知识。而且所需的特殊设备和繁琐的过程仍然是现场检测的一个问题，限制了在基层的广泛采用。
由于现存HPV16和HPV18病毒检测方法的不足以满足HPV18病毒的快速检测的需求，因此研究一种能在基层应用，可在常温下快速检测HPV16和HPV18病毒的方法非常有必要。
重组酶介导扩增技术(Recombinase-aided amplification assay，RAA)是一种新型恒温核酸扩增检测技术。反应体系由大肠杆菌重组酶UvsX、单链结合蛋白、DNA聚合酶、缓冲液等组分组成，反应在39～42℃恒温下30min即可完成。在以往的RAA研究中，以往的RAA检测技术的一个主要缺点是它们使用的是外源性内参。外源性内参是需要添加单独的质粒片段，因此反应也会受到外源性内参因素的影响，降低检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增用引物探针组和试剂盒。本发明提供的内源性内参的特异性引物对和探针可在等温条件下进行，可用于人乳头瘤病毒16型、18型以及内参DNA的扩增，反应时间在5～20min内，灵敏度高、特异性好、内源性内参的加入有效的降低了因标本取样、试剂盒失效或实验操作等原因导致的假阴性的发生，更适合应用于有大量样品的检测，便于临床上的应用，该方法适用于对人乳头瘤病毒16型和18型的快速检测。
本发明提供了一组适用于人乳头瘤病毒16型和18型检测的等温核酸扩增用内源性内参的特异性引物对和探针，所述内源性内参的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.18和SEQ ID NO.19所示，内源性内参的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明还提供了检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增引物探针组，所述引物探针组包括检测人乳头瘤病毒16型的特异性引物对、探针，和检测人乳头瘤病毒18型的特异性引物对、探针；
所述检测人乳头瘤病毒16型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示，检测人乳头瘤病毒16型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述检测人乳头瘤病毒18型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示，检测人乳头瘤病毒18型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选的是，所述引物探针组还包括上述技术方案所述内源性内参的特异性引物对和探针。
优选的是，所述引物探针组中的探针标记荧光基团，不同探针标记不同荧光色的荧光基团。
优选的是，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA和VIC。
本发明还提供了检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组和反应液。
优选的是，所述反应液中包括Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、DNA聚合酶和核酸外切酶。
优选的是，所述试剂盒的反应体系包括：Tris缓冲液0～60mM、醋酸钾50～150mM、醋酸镁5～30mM、二硫苏糖醇1～10mM、聚乙二醇1.5％～7.8％、ATP 1～5mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、单链结合蛋白500～1000ng/μL、重组酶50～400ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、DNA聚合酶30～150ng/μL、核酸外切酶30～200ng/μL、探针50～150nM和引物对各引物300～600nM。
优选的是，所述试剂盒的扩增程序为39～42℃，15～30min。
本发明提供了一组适用于人乳头瘤病毒16型和18型检测的等温核酸扩增用内源性内参的特异性引物对和探针。本发明设计了针对人管家基因RNaseP的内源性内参探针和引物对，并分别通过对人乳头瘤病毒16型(HPV16)和18型(HPV18)基因测序和比对，分别设计了用于检测人乳头瘤病毒16型和18型的特异性引物对和探针，进一步构建了用于检测人乳头瘤病毒16型和18型的试剂盒。本发明所述内源性内参的特异性引物对和探针能够用于人乳头瘤病毒16型和18型准确可靠、灵敏、特异、快速的检测，检测靶基因的灵敏度均可达到10拷贝/μl，能检测出CT值大于35的弱阳性临床标本；对其他型别的人乳头瘤病毒检测均无交叉反应，特异性好，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的筛选HPV16的最佳引物探针组合实验结果图，图中1指代SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3组合的扩增荧光信号；2指代SEQ ID NO.1，SEQID NO.2，SEQ ID NO.6组合的扩增荧光信号；3指代SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.7组合的扩增荧光信号；4指代SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3组合的扩增荧光信号；5指代SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.6组合的扩增荧光信号；6指代SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.7组合的扩增荧光信号；7指代SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.3组合的扩增荧光信号；8指代SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6组合的扩增荧光信号；9指代SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.7组合的扩增荧光信号；阴性：阴性对照。
图2为本发明实施例1提供的筛选HPV18的最佳引物探针组合实验结果图，图中1指代SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11组合的扩增荧光信号；2指代SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.14组合的扩增荧光信号；3指代SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQID NO.15组合的扩增荧光信号；4指代SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.11组合的扩增荧光信号；5指代SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.14组合的扩增荧光信号；6指代SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.15组合的扩增荧光信号；7指代SEQ ID NO.9，SEQID NO.13，SEQ ID NO.11组合的扩增荧光信号；8指代SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.13，SEQ IDNO.14组合的扩增荧光信号；9指代SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.15组合的扩增荧光信号；阴性：阴性对照；
图3A为本发明实施例2提供的HPV16的实时荧光检测扩增曲线图；
图3B为本发明实施例2提供的HPV18的实时荧光检测扩增曲线图；
图3C为本发明实施例2提供的内参DNA的实时荧光检测扩增曲线图；
图4A为本发明实施例3提供的HPV16的实时荧光检测扩增曲线图；
图4B为本发明实施例3提供的HPV18的实时荧光检测扩增曲线图；
图4C为本发明实施例3提供的内参DNA的实时荧光检测扩增曲线图；
图5A为本发明实施例4提供的不同浓度(10copy/μl～105copy/μl)的HPV16的实时荧光检测扩增曲线图；
图5B为本发明实施例4提供的不同浓度(10copy/μl～105copy/μl)的HPV18的实时荧光检测扩增曲线图；
图5C为本发明实施例4提供的不同浓度(10copy/μl～105copy/μl)的内参DNA的实时荧光检测扩增曲线图；
图6A为本发明实施例4提供的HPV16、HPV18及其他型别人乳头瘤病毒包括HPV 6、11、31、33、35、39、42、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和81型别(包括多种型别混合感染)的样本进行检测的HPV16通道结果图；其中，1为HPV16扩增曲线；2为HPV18扩增曲线；3为其他型别人乳头瘤病毒扩增曲线；阴性为阴性对照扩增曲线；
图6B为本发明实施例4提供的HPV16、HPV18及其他型别人乳头瘤病毒包括HPV 6、11、31、33、35、39、42、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和81型别(包括多种型别混合感染)的样本进行检测的HPV18通道结果图；其中，1为HPV16扩增曲线；2为HPV18扩增曲线；3为其他型别人乳头瘤病毒扩增曲线；阴性为阴性对照扩增曲线；
图6C为本发明实施例4提供的HPV16、HPV18及其他型别人乳头瘤病毒包括HPV 6、11、31、33、35、39、42、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和81型别(包括多种型别混合感染)的样本进行检测的内参DNA通道结果图；其中，1为HPV16扩增曲线；2为HPV18扩增曲线；3为其他型别人乳头瘤病毒扩增曲线；阴性为阴性对照扩增曲线。
具体实施方式
本发明提供了一组适用于人乳头瘤病毒16型和18型检测的等温核酸扩增用内源性内参的特异性引物对和探针，所述内源性内参的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.18(GCTTAAAATGTGTTCTAGCCTTGGCGTTCA)和SEQ ID NO.19(TCCAGAGGTTCAGTCTCTAAATTTTCCCCA)所示，内源性内参的探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.17(ATGGTACACTTAAACTGGGGACTCTGGGGATGATGGCTCTTACTTCGT)所示。本发明所述内源性内参的特异性引物对和探针是针对于人管家基因RNasep基因片段设计，内源性内参的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示(CCCGGCTCAGTGAGAGAATCGCCCCCGTCATTGGCTTAAAATGTGTTCTAGCCTTGGCGTTCAAAAAGAACACCACTGACTTTGTGGACGAAGTAAGAGCCATCATCCCCAGAGTCCCCAGTTTAAGTGTACCATGGCTTCAAGACAGAATTGAAGATTCTGGGGAAAATTTAGAGACTGAACCTCTGGAAAGCCAAGACAGAGAGCTTTTGGACACTTCATTTGAAGAT)。本发明内源性内参的特异性引物对和探针内源性内参能够有效降低因标本取样、试剂盒失效或实验操作等原因导致的假阴性的发生，更适合应用于有大量样品的检测，便于临床上的应用。
本发明还提供了检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增引物探针组，所述引物探针组包括检测人乳头瘤病毒16型的特异性引物对、探针，和检测人乳头瘤病毒18型的特异性引物对、探针；
所述检测人乳头瘤病毒16型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示，检测人乳头瘤病毒16型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述检测人乳头瘤病毒18型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示，检测人乳头瘤病毒18型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明分别根据HPV16病毒基因组序列和HPV18病毒基因组序列，寻找同源性高的保守序列，设计适用于等温核酸扩增技术的特异性引物对和靶探针。经过对比和筛选，本发明提供了一条用于检测人乳头瘤病毒16型的靶序列，其具有SEQ ID NO.8所示的序列或其特异性片段，其在GenBank登录号NC 001526.4公开的序列第7400～7710bp位。和一条用于检测人乳头瘤病毒18型的靶序列，其具有SEQ ID NO.16所示的序列或其特异性片段。其在GenBank登录号NC 001357.1公开的序列第7010～7350bp位。本发明根据上述靶序列分别设计了特异性引物对和靶探针，如上文所述。
在本发明中，所述引物探针组优选还包括上述技术方案所述内源性内参的特异性引物对和探针。本发明所述内源性内参能更好的实现对反应体系及反应过程进行监测，进一步确保检测结果的准确性。
在本发明中，所述引物探针组中的探针标记荧光基团，不同探针标记不同荧光色的荧光基团。在本发明中，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA和VIC。本发明所有探针的类型优选为exo探针，5'标记荧光基团，3'标记淬灭基团。在本发明中，每个探针5'端标记的荧光基团优选荧光颜色不同。在本发明具体实施例中，检测人乳头瘤病毒16型的探针标记FAM荧光基团，检测人乳头瘤病毒18型的探针标记HEX荧光基团，内源性内参的探针标记FAM荧光基团。
本发明还提供了检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组和反应液。
在本发明中，所述反应液中包括Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、DNA聚合酶和核酸外切酶。
在本发明中，所述试剂盒的反应体系包括：Tris缓冲液0～60mM、醋酸钾50～150mM、醋酸镁5～30mM、二硫苏糖醇1～10mM、聚乙二醇1.5％～7.8％(w/v)、ATP 1～5mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、单链结合蛋白500～1000ng/μL、重组酶50～400ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、DNA聚合酶30～150ng/μL、核酸外切酶30～200ng/μL、探针50～150nM和引物对各引物300～600nM。所述试剂盒在工作时，在等温核酸扩增体系中只需要加入样品DNA，混合均匀后进行等温核酸扩增检测。在本发明中，所述试剂盒的扩增程序优选为39～42℃，15～30min，更优选为39℃，30min。
本发明利用所述试剂盒在快速检测人乳头瘤病毒16型和18型(含内参)时，进行双重等温核酸扩增方法，所述双重等温核酸扩增方法以内源性内参的特异性引物对和探针、人乳头瘤病毒16型的特异性引物对和探针，和检测人乳头瘤病毒18型的特异性引物对和探针对待测样品模板进行等温核酸扩增检测。本发明所述等温核酸扩增检测的反应体系和扩增程序优选如上文所述。在本发明中，所述待测样品模板优选为待测样品DNA。
本发明所述方法的结果判读如下：置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据HPV16靶标或HPV18靶标和内参DNA检测结果进行判断:
HPV16靶标或HPV18靶标和内源性内参靶标检测结果均出现扩增荧光信号，检测结果为靶标阳性；
HPV16靶标或HPV18靶标检测结果未出现扩增荧光信号内源性内参靶标检测结果出现扩增荧光信号，检测结果为靶标阴性；
HPV16靶标或HPV18靶标检测结果出现扩增荧光信号内源性内参靶标检测结果未出现扩增荧光信号，检测结果为靶标阳性；
HPV16靶标或HPV18靶标和内源性内参靶标检测结果均未出现扩增荧光信号，检测结果为可能为假阴性，建议重复实验或重新提取DNA进行检测。
本发明所述方法检测靶基因的灵敏度均可达到10拷贝/μl，能检测出CT值大于35的弱阳性临床标本；对其他型别的人乳头瘤病毒检测均无交叉反应，特异性好，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
下面结合具体实施例对本发明所述的检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增用引物探针组和试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
用于等温核酸扩增检测HPV16和HPV18病毒的特异性引物对、靶探针、内参探针、内参引物对的设计和确定
分别下载全部HPV16和HPV18病毒全基因组序列，进行序列比对，寻找同源性高的保守区域，确定一条适用于检测HPV16病毒的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；和一条适用于检测HPV18病毒的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。在保守区域设计多条特异性引物和靶探针。RAA引物设计原则：一是引物长度，RAA引物比典型的PCR引物更长，一般要求为30～35bp；二是引物序列，5’端(3～5bp)避免出现重复G，最好为C或T；3’端(后3个碱基)最好有G和C；GC含量不要大于70％或小于30％；引物间避免形成二级结构、引物二聚体等。RAA探针设计原则：RAA荧光探针(exo探针)主要包括四个特殊部分，3’末端的阻断物(通常为C3-spacer)，脱碱基核苷酸类似物(四氢呋喃[THF]残基，有时称为“dSpacer”)及位于THF两侧的荧光基团(dT-荧光基团)和淬灭基团(dT-淬灭基团)，且两基团之间相距约2～5bp。探针一般为46～52个碱基，5’端到THF位点至少要30个碱基，THF位点到3’端至少要15个碱基。
本发明经过大量实验发现并非只要满足引物、探针设计原则所设计出的引物、探针进行扩增效果就必然好，在研究对比中，本发明发现有非常符合上述设计原则的引物探针组合并没有出现很好的扩增效果，反倒是不符合以上引物探针设计原则的引物探针组合反而扩增的效果很好。因此在满足上述一般设计原则的基础上，本发明进行了优化设计和大量引物探针组合的筛选对比，以下为本申请设计的大量候选引物探针组合的部分罗列及效果说明。
HPV16候选的引物核苷酸序列见SEQ ID NO.2～7。使用HPV16病毒阳性临床样本筛选灵敏度高、特异性好的最佳引物和探针组合，根据起峰时间和荧光强度进行筛选，筛选结果图1。
HPV16探针序列：
5’-ATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAATCATGCATGGAG ATA-3’，(SEQ ID NO.1)；
HPV16基因正向引物：
5’-CTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGC-3’，(SEQ ID NO.2)；
5’-CACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTG-3’，(SEQ ID NO.4)；
5’-GAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAG-3’，(SEQ ID NO.5)；
HPV16基因反向引物：
5’-GAGATCAGTTGTCTCTGGTTGCAAATCTAACA-3’，(SEQ ID NO.3)；
5’-CATCCTCCTCCTCTGAGCTGTCATTTAATTGC-3’，(SEQ ID NO.6)；
5’-CCATCTATTTCATCCTCCTCCTCTGAGCTGTC-3’，(SEQ ID NO.7)；
对以下靶基因探针引物组合进行筛选：
第一组：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组合；
第二组：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6组合；
第三组：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.7组合；
第四组：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.3组合；
第五组：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6组合；
第六组：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7组合；
第七组：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.3组合；
第八组：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组合；
第九组：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7组合；
在图1可以看出，在相同的条件下，SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的引物探针组合，阳性阈值时间及荧光信号值优于其他组合，阳性阈值时间早，荧光强度高，因此本发明将该组合选为最佳引物探针组合。最终确定本发明适用于等温核酸扩增方法的检测HPV16病毒的引物和探针如下：
HPV16探针序列：
5’-ATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAATCATGCATGGAG ATA-3’，(SEQ ID NO.1)；
HPV16基因正向引物：
5’-CTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGC-3’，(SEQ ID NO.2)；
HPV16基因反向引物：
5’-GAGATCAGTTGTCTCTGGTTGCAAATCTAACA-3’，(SEQ ID NO.3)；
HPV16的靶序列如SEQ ID NO.8所示：AACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAATCATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGA。
HPV18候选的引物核苷酸序列见SEQ ID NO.9～15。使用HPV18病毒阳性临床样本筛选灵敏度高、特异性好的最佳引物和探针组合，根据起峰时间和荧光强度进行筛选，筛选结果图2。
HPV18探针序列：
5’-ATTTCATCGTTTTCTTCCTCTGAGTCGCTTAATTGCTCGTGACATA-3’，(SEQ ID NO.9)；
HPV18基因正向引物：
5’-TCTGGCTTCACACTTACAACACATACACAAC-3’，(SEQ ID NO.10)；
5’-GCTCAATTCTGGCTTCACACTTACAACACAT-3’，(SEQ ID NO.12)；
5’-TCGTCGGGCTGGTAAATGTTGATGATTAACT-3’，(SEQ ID NO.13)；
HPV18基因反向引物：
5’-ACTCCAACGACGCAGAGAAACACAAGTATAA-3’，(SEQ ID NO.11)；
5’-TAGAGCCCCAAAATGAAATTCCGGTTGACCT-3’，(SEQ ID NO.14)；
5’-TGGACCTAAGGCAACATTGCAAGACATTGTA-3’，(SEQ ID NO.15)；
对以下靶基因探针引物组合进行筛选：
第一组：SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11组合；
第二组：SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.14组合；
第三组：SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.15组合；
第四组：SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.11组合；
第五组：SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.14组合；
第六组：SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.15组合；
第七组：SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.11组合；
第八组：SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组合；
第九组：SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15组合；
在图2可以看出，在相同的条件下，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的引物探针组合，阳性阈值时间及荧光信号值优于其他组合，阳性阈值时间早，荧光强度高，因此本发明将该组合选为最佳引物探针组合。最终确定本发明适用于等温核酸扩增方法的检测HPV16病毒的引物和探针如下：
HPV18探针序列：
5’-ATTTCATCGTTTTCTTCCTCTGAGTCGCTTAATTGCTCGTGACATA-3’，(SEQ ID NO.9)；
HPV18基因正向引物：
5’-TCTGGCTTCACACTTACAACACATACACAAC-3’，(SEQ ID NO.10)；
HPV18基因反向引物：
5’-ACTCCAACGACGCAGAGAAACACAAGTATAA-3’，(SEQ ID NO.11)；
HPV18的靶序列如SEQ ID NO.16所示：GGAATGCTCGAAGGTCGTCTGCTGAGCTTTCTACTACTAGCTCAATTCTGGCTTCACACTTACAACACATACACAACATTGTGTGACGTTGTGGTTCGGCTCGTCGGGCTGGTAAATGTTGATGATTAACTCCATCTATTTCATCGTTTTCTTCCTCTGAGTCGCTTAATTGCTCGTGACATAGAAGGTCAACCGGAATTTCATTTTGGGGCTCTAAATGCAATACAATGTCTTGCAATGTTGCCTTAGGTCCATGCATACTTAATATTATACTTGTGTTTCTCTGCGTCGTTGGAGTCGTTCCTGTCGTGCTCGGTTGCAGCACGAATGGCACTGGCCTC。
实施例2
检测HPV16和HPV18的含内参双重等温核酸扩增方法
1、样品来源及HPV16和HPV18的DNA提取
病毒样品系唐山市工人医院从不同患者宫颈脱落细胞样本中收集的含有HPV16和HPV18活病毒的标本，DNA提取采用天隆提取试剂盒，DNA提取设备为天隆全自动核酸提取仪。
2、探针和引物采用实施例1确定的适用于等温核酸扩增方法的检测HPV16病毒的探针和引物(SEQ ID NO.1～3)、检测HPV18病毒的探针和引物(SEQ ID NO.9～11)和检测内源性内参的探针和引物(SEQ ID NO.17～19)，HPV16+HPV18引物探针组中HPV16探针标记FAM荧光基团，HPV18探针标记HEX荧光基团，内源性内参组中内源性内参的探针标记FAM荧光基团。
3、配制扩增体系：在200μL离心管中按以下的配比进行等温核酸扩增体系配制(体积为50μL)：
Figure BDA0003203950710000131
将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉未状扩增体系。也可现配现用。
4、HPV16和HPV18检测
向离心管中加入终浓度为6％(w/v)的，分子量为35000的聚乙二醇作为反应缓冲液将体系重新溶解成为48μl。再加入2μL步骤1中提取的HPV16或HPV18活病毒标本的DNA，使用奇天仪器恒温振荡混匀仪均匀混合4min，瞬时离心，放入到可检测FAM和HEX荧光的仪器中，在39℃反应20min。(注：为确保实验准确性，设置不加模板的体系作为阴性对照)。结果显示，HPV16+HPV18组中，HPV16通道，在1min之后开始显示扩增的荧光信号。如图3A所示。HPV18通道，在1min之后开始显示扩增的荧光信号。如图3B所示。内源性内参基因组中内参通道，在1min之后开始显示扩增的荧光信号，如图3C所示。重复以上实施例，均能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。
实施例3
检测HPV16和HPV18病毒的含内参双重等温核酸扩增方法
方法参见实施例2，不同之处在于50μL的等温核酸扩增体系中，正、反向引物的浓度分别为300nM，其他参数、步骤与实施例2相同。结果显示，在3min后开始显示扩增的荧光信号，不同的是靶序列扩增曲线的峰值有稍微的降低，HPV16如图4A，HPV18如图4B所示，内源性内参基因如图4C所示，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。
实施例4
本发明检测方法的灵敏度、特异度及检出限评价
1.灵敏度评价
将靶基因阳性质粒DNA进行10倍系列稀释，浓度范围为10～105拷贝/μl，用系列稀释后的DNA模板参照实施例2的方法进行扩增，同时检测不同浓度的靶基因，HPV16基因结果如图5A所示，HPV18基因结果如图5B所示，内源性内参基因结果如图5C所示，重复8次试验，计算出本发明检测方法的靶基因(HPV16基因、HPV18基因和内源性内参基因)灵敏度均为10拷贝/μl。
2.特异度评价
用实施例1筛选出的引物和探针分别检测HPV16、HPV18和其他型别(包括HPV 6、11、31、33、35、39、42、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和81)的HPV，选取的是来自于医院的标本，经过商业HPV分型RT-RCR试剂盒检测的结果确定，一例标本含33、39、42、53、59和68型HPV；一例含35和58型；一例含44、45和56型；一例含6、11和66型；一例含31、51和45型；一例含81和52型。检测结果如图6A～图6C所示，图6C中，内参图上仅标记了16阳性和18阳性。检测结果显示本发明方法能特异性检测HPV16和HPV18病毒，并不与其他病毒发生交叉反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120> 检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增用引物探针组和试剂盒
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcaagaaca cgtagagaaa cccagctgta atcatgcatg gagata 46
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtcaaaag ccactgtgtc ctgaagaaaa gc 32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagatcagtt gtctctggtt gcaaatctaa ca 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cactgtgtcc tgaagaaaag caaagacatc tg 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa ag 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catcctcctc ctctgagctg tcatttaatt gc 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccatctattt catcctcctc ctctgagctg tc 32
<210> 8
<211> 311
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacaacatta gaacagcaat acaacaaacc gttgtgtgat ttgttaatta ggtgtattaa 60
ctgtcaaaag ccactgtgtc ctgaagaaaa gcaaagacat ctggacaaaa agcaaagatt 120
ccataatata aggggtcggt ggaccggtcg atgtatgtct tgttgcagat catcaagaac 180
acgtagagaa acccagctgt aatcatgcat ggagatacac ctacattgca tgaatatatg 240
ttagatttgc aaccagagac aactgatctc tactgttatg agcaattaaa tgacagctca 300
gaggaggagg a 311
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atttcatcgt tttcttcctc tgagtcgctt aattgctcgt gacata 46
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tctggcttca cacttacaac acatacacaa c 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actccaacga cgcagagaaa cacaagtata a 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctcaattct ggcttcacac ttacaacaca t 31
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcgtcgggct ggtaaatgtt gatgattaac t 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tagagcccca aaatgaaatt ccggttgacc t 31
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggacctaag gcaacattgc aagacattgt a 31
<210> 16
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggaatgctcg aaggtcgtct gctgagcttt ctactactag ctcaattctg gcttcacact 60
tacaacacat acacaacatt gtgtgacgtt gtggttcggc tcgtcgggct ggtaaatgtt 120
gatgattaac tccatctatt tcatcgtttt cttcctctga gtcgcttaat tgctcgtgac 180
atagaaggtc aaccggaatt tcattttggg gctctaaatg caatacaatg tcttgcaatg 240
ttgccttagg tccatgcata cttaatatta tacttgtgtt tctctgcgtc gttggagtcg 300
ttcctgtcgt gctcggttgc agcacgaatg gcactggcct c 341
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggtacact taaactgggg actctgggga tgatggctct tacttcgt 48
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcttaaaatg tgttctagcc ttggcgttca 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tccagaggtt cagtctctaa attttcccca 30
<210> 20
<211> 230
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cccggctcag tgagagaatc gcccccgtca ttggcttaaa atgtgttcta gccttggcgt 60
tcaaaaagaa caccactgac tttgtggacg aagtaagagc catcatcccc agagtcccca 120
gtttaagtgt accatggctt caagacagaa ttgaagattc tggggaaaat ttagagactg 180
aacctctgga aagccaagac agagagcttt tggacacttc atttgaagat 230

Claims (9)

1.一组适用于人乳头瘤病毒16型和18型检测的等温核酸扩增用内源性内参的特异性引物对和探针，所述内源性内参的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.19所示，内源性内参的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
2.检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括检测人乳头瘤病毒16型的特异性引物对、探针，和检测人乳头瘤病毒18型的特异性引物对、探针；
所述检测人乳头瘤病毒16型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示，检测人乳头瘤病毒16型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述检测人乳头瘤病毒18型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11所示，检测人乳头瘤病毒18型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括权利要求1所述内源性内参的特异性引物对和探针。
4.根据权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组中的探针标记荧光基团，不同探针标记不同荧光色的荧光基团。
5.根据权利要求4所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA和VIC。
6.检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增试剂盒，其特征在于，包括权利要求2～5任一项所述的引物探针组和反应液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液中包括Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、DNA聚合酶和核酸外切酶。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系包括：Tris缓冲液0～60mM、醋酸钾50～150mM、醋酸镁5～30mM、二硫苏糖醇1～10mM、聚乙二醇1.5％～7.8％、ATP 1～5mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、单链结合蛋白500～1000ng/μL、重组酶50～400ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、DNA聚合酶30～150ng/μL、核酸外切酶30～200ng/μL、探针50～150nM和引物对各引物300～600nM。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为39～42℃，15～30min。
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