CN108220480A - 一种用于特异性检测hpv18的rpa荧光定量引物对、探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针及试剂盒。本发明RPA荧光定量引物对是针对HPV18病毒的基因组中的L1区域设计筛选获得的，能够特异性扩增HPV18，且扩增效果好。本发明检测方法为基于RPA技术的荧光定量检测方法，可用于特异性检测HPV18，该方法操作简便，灵敏度高，反应条件温和(37℃‑42℃)，反应时间短，结合便携式的荧光检测仪即可进行病原微生物的快速定量检测。本发明检测方法的灵敏度可以达到10²拷贝。

Description

一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针及试 剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针及试剂盒。

背景技术

人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。流行病学和分子学研究证实了HPV感染是宫颈癌的病因。生殖道HPV感染是一种常见的性传播疾病。由于女性宫颈癌发生的主要原因是长期反复的高危型HPV感染，故HPV DNA的快速检测为预防和治疗宫颈癌的最有效手段之一。

核酸扩增PCR技术由于其灵敏度高和特异性强等方面的优势，已经成为科学研究和临床研究中的一个基础和必要的技术手段。然而，PCR技术通常需要特制的仪器以及复杂的反应程序，成本高，耗时长，对于需要实时、现场、快速的非实验室环境检测及分析通常难以实现。

近年来，基于模拟体内核酸复制、转录、修复机理发展起来的核酸体外等温扩增(Nucleic acid isothermal amplification，NCIA)技术的出现，解决了PCR技术上的局限，不仅简化了对仪器的要求，不需要昂贵的PCR仪，还缩短了反应时间，恒温条件下即可快速扩增出目标核酸片段。因其反应快速、灵敏度高、操作简便等优点而受到了多个领域的关注，尤其是体外诊断领域。目前，报道的NCIA技术有loop介导的体外恒温扩增(Loop-mediate isothermal amplification，LAMP)，核酸序列依赖扩增(Nucleic acid sequencebased amplification，NASBA)，链置换扩增(Strand displacement amplification，SDA)，滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)。但这些恒温扩增技术在反应条件、反应试剂、反应时间、仪器设备以及操作简便性等方面存在较大的弊端。如LAMP对引物要求高，设计复杂，且产物结构复杂。NASBA通常扩增时间较长(约2-3小时)，需要抽提RNA，且当模板是DNA时需要高温变性处理。SDA需要反应前对模板进行热变性处理，才能引发带有核酸内切位点引物的配对。RCA需要设计一段锁式探针，通常在100bp左右，合成费用较高，并且在RCA反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA或者RNA可能产生一些背景信号。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)能够在恒温条件下(37℃-42℃)实现对核酸的快速特异性扩增，且在20min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的可操作性，能够在非实验室条件下完成核酸检测，被称为是最具有可替代PCR潜力的核酸检测技术，且可以和琼脂糖凝胶检测、荧光检测技术结合实现实时、快速甚至定量检测。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针及试剂盒。

一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对，包括上游引物和下游引物，序列为

上游引物：5’-ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC-3’；

下游引物：5’-ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT-3’。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计，普通PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。

一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量探针，序列为：

5’-GCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAG-3’，探针的其中两个核苷酸上连接有荧光基团和淬灭基团，且位于这两个核苷酸之间的某一个核苷酸为缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，为脱碱基位点；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。在RPA体系中引入一个带有荧光标记的探针，一方面可以提高RPA检测的特异性，另一方面还能实现对RPA扩增进行实时监控。

探针长度通常在46-52bp之间，在探针上分别设计两个基团(一个荧光基团，一个淬灭基团)，两个基团之间设计一个脱碱基位点，该位点能被一核酸外切酶特异性识别，该酶具有3’-5’外切酶活性，可以使荧光基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。该酶只能特异性识别双链DNA，对单链DNA无活性，因而产生的荧光信号强度可与扩增产物同步增长。探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

优选的，所述的RPA荧光定量探针，序列为：

5’-GCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTAT_FGHAT_QAGCAGTATTTTAG-3’，其中T_F表示连接有荧光基团的T，T_Q表示连接有淬灭基团的T，H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。由于RPA荧光定量探针相对于普通荧光定量PCR探针来说，序列较长，如果将荧光基团和淬灭基团连接的两端，则效果相对于这样靠近设计来说，淬灭基团的对荧光基团的淬灭效果可能稍差。根据探针设计的常规要求，荧光基团不能连接到G上，因为G会淬灭荧光；而A与C连接荧光基团后，不如连接在T上稳定，所以选择将荧光基团连接到T上。

优选的，所述荧光基团为FAM、TET、JOE、HEX或TAMRA，所述淬灭基团为BHQ。本发明对荧光基团和淬灭基团的选择并没有特殊性，常用的用于荧光定量PCR的荧光基团和淬灭基团均可使用。

优选的，所述修饰基团为磷酸基。普通引物序列3’没有磷酸基团而是-OH，只有3’末端是-OH的片段才可以被聚合酶延伸，但3’修饰了磷酸基后，所得探针只能结合到模板上而不能扩增。

本发明还公开了一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量试剂盒，包含所述的RPA荧光定量引物对和所述的RPA荧光定量探针。

优选的，所述的RPA荧光定量试剂盒，包括核酸外切酶ExoⅢ。外切酶ExoⅢ可作用于平末端或3'凹陷末端双链DNA 3'→5'外切酶活性。对单链DNA及3'突出末端双链DNA无活性。外切酶ExoⅢ也有RNase H、3'磷酸酶和脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性。本发明就是基于外切酶ExoⅢ的脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性，即AP(Apurinic/apyrimidinic)位点内切酶活性功能设计。

更优选的，所述核酸外切酶ExoⅢ的使用浓度为0.5～3U/μL。

优选的，所述的RPA荧光定量试剂盒，包括试剂盒 Liquid exo/exo RTQuick Kit中的所有试剂。

优选的，所述的RPA荧光定量试剂盒，包括浓度已知的标准品，所述标准品为包含如SEQ ID No.2所示序列的质粒。如SEQ ID No.2所示序列为上述引物对扩增HPV18的L1区域所获得的片段，大小为220bp。

本发明还提供了一种特异性检测HPV18的方法，使用所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)提取样本DNA作为模板；

(2)分别使用所述RPA荧光定量引物对及RPA荧光定量探针对步骤(1)所得模板及标准品进行RPA荧光定量扩增；

(3)对比样本与标准品的荧光定量信号得出样本中HPV18的含量。

该方法可以用于离体检测HPV18，而并非一定要用于检测疾病。离体检测可以是环境样品的检测、实验室或医院消毒后材料检测是否残留HPV18，或者可以对输血或输液制品进行检测以确保没有HPV18污染等。

本发明RPA荧光定量引物对是针对HPV18病毒的基因组中的L1区域设计筛选获得的，能够特异性扩增HPV18，且扩增效果好。

本发明检测方法为基于RPA技术的荧光定量检测方法，可用于特异性检测HPV18，该方法操作简便，灵敏度高，反应条件温和(37℃-42℃)，反应时间短，结合便携式的荧光检测仪即可进行病原微生物的快速定量检测。本发明检测方法的灵敏度可以达到10²拷贝。

附图说明

图1为引物筛选电泳结果图，其中泳道M为标准分子量Marker，条带从上到下分别为500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp，50bp；泳道1～8分别为引物对1～8。

图2为RPA-探针设计原理图。

图3为外切酶ExoⅢ使用浓度优化结果图，其中曲线1～4分别对应ExoⅢ使用浓度0.5U/μL，2U/μL，3U/μL，4U/μL。

图4为灵敏度检测结果图，其中曲线1～7分别对应模板拷贝数10⁶拷贝、10⁵拷贝、10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝、10拷贝、0拷贝。

具体实施方式

实施例1

RPA技术的关键在于扩增引物和探针的设计，引物的设计与选择对RPA的扩增结果至关重要。

HPV染色体上L1区域的多样性与其亚型有关，不同亚型其L1区域的碱基序列具有特异性。根据HPV18亚型染色体的L1区域(序列如SEQ ID No.1所示)设计等温扩增引物对，共设计8对，如表1所示。

表1

实施例2

将实施例1中8对引物对HPV18亚型进行等温扩增以检测特异性。

采用Twistdx公司的通用试剂盒—— Basic Kit进行引物筛选。反应体系如表2所示。

表2

上游引物(10μM)	2.4μL
		下游引物(10μM)	2.4μL
Rehydration Buffer	29.5μL
		模板和ddH2O	13.2μL
总体积	47.5μL

将上表各试剂混匀后，加入至试剂盒的反应管中，并充分混匀，每个反应管中最后加入2.5μL乙酸镁(280mM)。模板为HPV18亚型基因片段混合物，基因片段混合物覆盖了整个基因组的序列(HPV18的基因组序列为GeneBank No.X 05015.1)。

反应条件为：反应温度37℃，反应时间为30min。

反应完成后，跑核酸胶进行鉴定，结构如图1所示，其中引物对18-8-S、18-8-AS对HPV18亚型具有非常强的特异性。

实施例3

RPA技术的关键在于扩增引物和探针的设计，引物的设计与选择对RPA的扩增结果至关重要。在RPA体系中引入一个带有荧光标记的探针，一方面可以提高RPA检测的特异性，另一方面还能实现对RPA扩增进行实时监控。如图2所示，该探针长度通常在46-52bp之间，在探针中部的两个T碱基位置处分别设计两个基团(一个荧光基团，一个淬灭基团)，两个基团之间设计一个脱碱基位点，该位点能被一核酸外切酶特异性识别，该酶具有3’-5’外切酶活性，可以使荧光基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。该酶只能特异性识别双链DNA，对单链DNA无活性，因而产生的荧光信号强度可与扩增产物同步增长。探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(本实施例中为磷酸基团)。结合一个便携式的荧光扩增检测仪便可实现非实验室环境下快速检测到荧光曲线。

探针18-P，序列为：

5’-GCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTAT_FGHAT_QAGCAGTATTTTAG-3’，

其中T_F表示胸腺嘧啶脱氧核糖核酸(dT)连接有荧光基团FAM，即FAM-dT，T_Q表示胸腺嘧啶脱氧核糖核酸(dT)连接有淬灭基团BHQ，即BHQ-dT，H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸，即脱碱基位点(THF)。

实施例4

实时定量扩增中外切酶选用ExoⅢ。外切酶使用浓度进行优化。反应体系如表3所示。

表3

10μM上游引物	2.1μL
		10μM下游引物	2.1μL
10μM探针	0.6μL
		2×Reaction Buffer	25μL
10mM dNTP	1.5μL
		10×Probe E-mix	5μL
20×Core Reaction Mix	2.5μL
		ExoⅢ	1μL
模板和ddH2O	7.7μL
		总体积	47.5μL

其中，2×Reaction Buffer、10×Probe E-mix和20×Core Reaction Mix来自 Liquid exo/exo RT Quick Kit。

ExoⅢ的终浓度分别为：0.5U/μL，2U/μL，3U/μL，4U/μL。置于荧光定量PCR仪中检测。反应条件：反应温度37℃，反应时间为30min。检测结果如图3所示，其中ExoⅢ用量为2U/μL时扩增曲线信号值最高。

实施例5

灵敏度检测。

在上述优化后的条件下，检测RPA-荧光定量检测的灵敏度。将模板HPV18质粒用水分别稀释至0拷贝、10拷贝、10²拷贝、10³拷贝、10⁴拷贝、10⁵拷贝、10⁶拷贝。反应体系如表4所示。

表4

10μM上游引物	2.1μL
		10μM下游引物	2.1μL
10μM探针	0.6μL
		2×Reaction Buffer	25μL
10mM dNTP	1.5μL
		10×Probe E-mix	5μL
20×Core Reaction Mix	2.5μL
		100U/μL ExoⅢ	1μL
模板和ddH2O	7.7μL
		总体积	47.5μL

其中，2×Reaction Buffer、10×Probe E-mix和20×Core Reaction Mix来自 Liquid exo/exo RT Quick Kit。

将上表各试剂充分混匀，最后加入2.5μL乙酸镁(280mM)。置于荧光定量PCR仪中检测。反应条件为37℃，恒温反应40min。检测结果见图4，最低可检测的拷贝数为10²拷贝。表明，本发明检测方法的灵敏度较高。

序列表

<110> 杭州德同生物技术有限公司

<120> 一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针及试剂盒

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人类乳头状瘤病毒18型(Human papillomavirus type 18)

<400> 1

atgtgcctgt atacacgggt cctgatatta cattaccatc tactacctct gtatggccca 60

ttgtatcacc cacggcccct gcctctacac agtatattgg tatacatggt acacattatt 120

atttgtggcc attatattat tttattccta agaaacgtaa acgtgttccc tatttttttg 180

cagatggctt tgtggcggcc tagtgacaat accgtatatc ttccacctcc ttctgtggca 240

agagttgtaa ataccgatga ttatgtgact cccacaagca tattttatca tgctggcagc 300

tctagattat taactgttgg taatccatat tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag 360

caggatattc ctaaggtttc tgcataccaa tatagagtat ttagggtgca gttacctgac 420

ccaaataaat ttggtttacc tgatactagt atttataatc ctgaaacaca acgtttagtg 480

tgggcctgtg ctggagtgga aattggccgt ggtcagcctt taggtgttgg ccttagtggg 540

catccatttt ataataaatt agatgacact gaaagttccc atgccgccac gtctaatgtt 600

tctgaggacg ttagggacaa tgtgtctgta gattataagc agacacagtt atgtattttg 660

ggctgtgccc ctgctattgg ggaacactgg gctaaaggca ctgcttgtaa atcgcgtcct 720

ttatcacagg gcgattgccc ccctttagaa cttaaaaaca cagttttgga agatggtgat 780

atggtagata ctggatatgg tgccatggac tttagtacat tgcaagatac taaatgtgag 840

gtaccattgg atatttgtca gtctatttgt aaatatcctg attatttaca aatgtctgca 900

gatccttatg gggattccat gtttttttgc ttacggcgtg agcagctttt tgctaggcat 960

ttttggaata gagcaggtac tatgggtgac actgtgcctc aatccttata tattaaaggc 1020

acaggtatgc ctgcttcacc tggcagctgt gtgtattctc cctctccaag tggctctatt 1080

gttacctctg actcccagtt gtttaataaa ccatattggt tacataaggc acagggtcat 1140

aacaatggtg tttgctggca taatcaatta tttgttactg tggtagatac cactcccagt 1200

accaatttaa caatatgtgc ttctacacag tctcctgtac ctgggcaata tgatgctacc 1260

aaatttaagc agtatagcag acatgttgag gaatatgatt tgcagtttat ttttcagttg 1320

tgtactatta ctttaactgc agatgttatg tcctatattc atagtatgaa tagcagtatt 1380

ttagaggatt ggaactttgg tgttcccccc cccccaacta ctagtttggt ggatacatat 1440

cgttttgtac aatctgttgc tattacctgt caaaaggatg ctgcaccggc tgaaaataag 1500

gatccctatg ataagttaaa gttttggaat gtggatttaa aggaaaagtt ttctttagac 1560

ttagatcaat atccccttgg acgtaaattt ttggttcagg ctggattgcg tcgcaagccc 1620

accataggcc ctcgcaaacg ttctgctcca tctgccacta cgtcttctaa acctgccaag 1680

cgtgtgcgtg tacgtgccag gaagtaa 1707

<210> 2

<211> 220

<212> DNA

<213> 人类乳头状瘤病毒18型(Human papillomavirus type18)

<400> 2

atatgatttg cagtttattt ttcagttgtg tactattact ttaactgcag atgttatgtc 60

ctatattcat agtatgaata gcagtatttt agaggattgg aactttggtg ttcccccccc 120

cccaactact agtttggtgg atacatatcg ttttgtacaa tctgttgcta ttacctgtca 180

aaaggatgct gcaccggctg aaaataagga tccctatgat 220

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ctctgtatgg cccattgtat cacccacggc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tcctgcttat tgccaccacc tgcaggaacc 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gggttcctgc aggtggtggc aataagcagg a 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

cagaaacatt agacgtggcg gcatgggaac 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

cactgcttgt aaatcgcgtc ctttatcac 29

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

cacacagctg ccaggtgaag caggcatacc tg 32

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

caggtatgcc tgcttcacct ggcagctgtg tg 32

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

cccaggtaca ggagactgtg tagaagcaca tattg 35

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

tgtttgctgg cataatcaat tatttgttac tgtggtagat ac 42

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

accaaaaatt tacgtccaag gggatattga tctaagtcta 40

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

gctggcataa tcaattattt gttactgtgg tagataccac tcgca 45

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

aaaatttacg tccaagggga tattgatcta agtctaaaga aa 42

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 15

aatcaattat ttgttactgt ggtagatacc actcgcagta c 41

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 16

acgtccaagg ggatattgat ctaagtctaa agaaa 35

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 17

atatgatttg cagtttattt ttcagttgtg tac 33

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 18

atcataggga tccttatttt cagccggtgc agcat 35

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 19

gcagatgtta tgtcctatat tcatagtatg aatagcagta ttttag 46

Claims (10)

1.一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，序列为

上游引物：5’-ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC-3’；

下游引物：5’-ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT-3’。

2.一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量探针，其特征在于，序列为：

5’-GCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAG-3’，探针的其中两个核苷酸上连接有荧光基团和淬灭基团，且位于这两个核苷酸之间的某一个核苷酸为缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，为脱碱基位点；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

3.如权利要求2所述的RPA荧光定量探针，其特征在于，序列为：

5’-GCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTAT_FGHAT_QAGCAGTATTTTAG-3’，其中T_F表示连接有荧光基团的T，T_Q表示连接有淬灭基团的T，H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

4.如权利要求2所述的RPA荧光定量探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM、TET、JOE、HEX或TAMRA，所述淬灭基团为BHQ。

5.如权利要求2所述的RPA荧光定量探针，其特征在于，所述修饰基团为磷酸基。

6.一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的RPA荧光定量引物对和如权利要求2～5任一所述的RPA荧光定量探针。

7.如权利要求5所述的RPA荧光定量试剂盒，其特征在于，包括核酸外切酶ExoⅢ。

8.如权利要求5所述的RPA荧光定量试剂盒，其特征在于，包括试剂盒Liquid exo/exo RT Quick Kit中的所有试剂。

9.如权利要求5所述的RPA荧光定量试剂盒，其特征在于，包括浓度已知的标准品，所述标准品为包含如SEQ ID No.2所示序列的质粒。

10.一种特异性检测HPV18的方法，其特征在于，使用如权利要求9所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)提取样本DNA作为模板；

(2)分别使用所述RPA荧光定量引物对及RPA荧光定量探针对步骤(1)所得模板及标准品进行RPA荧光定量扩增；

(3)对比样本与标准品的荧光定量信号得出样本中HPV18的含量。